JPH0390033A - 呼吸器疾患治療用ポリペプチドおよびそれを含有する医薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規なポリペプチドおよび該ポリペプチドの
呼吸器疾患治療剤としての使用に関する。

本発明は、新規な組成物およびこれら組成物を用いた呼
吸障害の治療法に関する。本発明はまた、リン脂質の表
面活性物質様の性質を高めるポリペプチド（タンパク質
断片）の使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、Ｓ
Ｐ−Ｂとして知られる天然低分子量疎水性表面活性物質
関連タンパク質の断片レプリカ（ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｒ
ｅｐｌｉｃａｓ）および該断片レプリカの類似体からな
る新規なポリペプチド、肺表面張力の確立、変更および
維持に有用な新規な医薬の調合に該ポリペプチドを使用
することに関する。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）本発
明の背景に関しては、下記明細書の教示および開示が参
考になる。

１、米国特許出願第８６０，２３９号明細書（１９８６
年５月６日出願） ２、米国特許出願第０６０，７１９号明細書く１９８７
年６月１０日出願） ３、米国特許出願第１０１．６８０号明細書（１９８７
年１０月１日出願） ４、米国特許山開第１７５，７４１号明細書く１９８８
年３月３１日出願）および ５、米国特許出願第８９７．１８３号明細書（１９８６
年８月１５日出願） さらに、米国特許第４，６５９，８０５号明細書（ＳＰ
−Ａとして知られる低分子量表面活性タンパク質を開示
している）もまた参考のため本明細書中に引用される。

これら文献は、天然に存在する一群の哺乳動物表面活性
物質関連タンパク質の発見、単離方法、特徴付けおよび
使′用を開示している。この群を槽底する成員はＳＰ−
Ａ、ＳＰ−Ｂおよび５ｐ−ｃと称されている。これらの
タンパク質は、天然および合成の両リン脂質の表面活性
物質様作用に影響を与えることが知られている。関連す
る科学文献では、ＳＰ−Ｂを５ＡＰ−Ｂ、ＳＡＰ　−（
Ｐｈｅ）、５ＡＰ−６（Ｐｈｅ）およびＳＰＬ（Ｐｈｅ
）とも称していることに注意すべきである。５ｐ−ｃも
また先行文献において５ＡＰ−ＣＳＳＡＰ−（Ｖａｌ）
、ＳＡＰ　　６（Ｖａｌ）およびＳＰＬ（Ｖａｌ）とも
称されている。これら２つのタンパク質（ＳＰ−Ｂおよ
び５ＡＰ−Ｃ）は、独特のアミノ酸配列を有する別の遺
伝子産物である。両タンパク質は、肺胞タイプ■上皮細
胞によって合成されるより大きな前駆体タンパク質のタ
ンパク分解によって生じる。

ＳＰ−Ｂは、一般に前駆体タンパク質のグルタミンーフ
・エニルアラニンベブチド結合での開裂によって生じ、
その結果、７８のアミノ酸残基からなる天然タンパク質
が得られ、そのＮ−末端残基はフェニルアラニンであり
単純分子量は約８，７００である。ヒト肺から単離され
たＳＰ−Ｂは、スルフヒドリル還元後に相対分子量（Ｍ
ｒ）が７〜８、　ＯＯＯの存在としてポリアクリルアミ
ドゲル上を移動する。スルフヒドリル還元をしないと、
この天然に存在するタンパク質はまた大きなオリゴマー
として観察される。Ｓ　Ｐ−Ｂは極めて疎水性が大きく
、このことは、インビボでリン脂質と強力に会合するこ
と、およびクロロホルムやメタノールなどの有機溶媒に
溶解することと一致する物理的性質である。

５ｐ−ｃは、アミノ末端グリシン残基、約３゜７００の
分子量、ポリバリン配列を有し、ＳＰ−Ｂのように極め
て疎水性が高い。加えて、両タンパク質（ＳＰ−Ｂおよ
び５ｐ−ｃ）は、プロテアーゼ（トリプシン、キモトリ
プシンおよびスタヒロコッカスヌクレオチドＶ　−８（
ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　
Ｖ　−８）など）、エンドグリコシダーゼＦおよびコラ
−ゲナーゼによる酵素的分解に対して実質的に抵抗性で
ある。ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃのいずれも、これらの酵
素で処理した後で分子量分布の劣化ないし変更を示さな
い。このような所作において、またアミノ酸配列の情報
に基づき、これらタンパク質は、−層親水性で高分子量
のタンパク質であるＳＰ−Ａ（ＳＡＰ−３５としても知
られる）とは明らかに異なるものである。

ＳＰ−Ａは天然の肺表面活性物質中に存在し、３０〜３
６．０００の還元分子量を有する。５ｐ−Ａは、内部に
グリシンおよびヒドロキシプロリンに富んだコラーゲン
様領域を含む糖タンパク質である。このタンパク質は、
Ｎ−結合複合炭水化物、およびＣ−末端球状ドメイン中
にカルシウム結合部位を有している。ＳＰ−Ａはリン脂
質と結合することが知られており、界面活性脂質に重要
な構造的構成を付与すると思われる。このタンパク質は
また、血漿または他のタンパク質による肺胞表面活性の
抑制を防ぐ役割を有すると思われている。

ＳＰ−Ｂおよび５ｐ−ｃの完全なアミノ酸配列は、アミ
ノ酸分析から決定され、これらタンパク質をコードする
＋ａＲＮＡから得たｃＤＮＡから導かれている。ＳＰ−
Ｂおよび５ｐ−ｃタンパク質は、気管支肺胞の肺洗浄液
や細かく刻んだ肺組織などの天然源からの単離物として
、または組換えＤＮＡ法を適用することにより得られた
生成物とじて入手可能である。リン脂質（合成リン脂質
を含む）とともに調合したときには、これらのタンパク
質から肺疾患の治療に有用な組成物が得られる。

生物学的に活性な物質の場合にしばしばそうであるよう
に、疎水性ＳＰ−Ｂおよび５ｐ−ｃタンパク質の場合も
、これらタンパク質を天然源から実質量を単離すること
は費用がかかり、労力も大変である。同様に、これらタ
ンパク質を組換えＤＮＡ法により産生ずる場合も、設計
の観点から、最適の宿主／ベクター発現系を達成して該
タンパク質の産生を容易にするために非常な努力が必要
となる。加えて、不必要な物質から所望の発現タンパク
質を単離精製するために有効な単離法を開発するための
かなりの努力が要求される。特にＳＰ−Ｂタンパク質の
場合は、低分子量であり、極めて疎水性が大きく、また
システィン残基の数が多いため、有効な発現および／ま
たは単離法を商業的に開発することは極めて困難である
。

このような問題があるため、天然源からの単離によりＳ
Ｐ−Ｂを商業的に生産すること、または組換えＤＮＡ法
により該タンパク質を発現させることは困難である。医
学界では商業的量のＳＰ−Ｂが必要とされており、本発
明は、有効な肺表面活性物質を調合するためにはＳＰ−
Ｂタンパク質分子の一部のみが必要であるという発見に
より、そのような要求を満たすものである。

天然に存在するＳＰ−Ｂおよび５ｐ−ｃタンパク質の有
用性は、リン脂質混合物の表面張力低下能および再分散
能を著しく改善する能力にある。

天然のＳＰ−Ｂおよび５ｐ−ｃは、それら単独またはそ
れらの組合わせで、リン脂質の表面活性剤様作用を改善
するのを容易にすることが示されている。し・かじなが
ら、この最適の条件を達成するためにタンパク質配列の
全体が必要なのかどうか、またはこれらタンパク質のあ
る領域もしくは断片のみが単独かまたはある種の組合わ
せで同じ結果を達成することができるのかどうかは、こ
れまで確立されていなかった。従来技術では、本発明の
発見を示唆し、開示し、または想起することができなか
った。さらに、当業者は、どの断片が有用性を示すのか
、またはそのある種の断片が完全な天然タンパク質より
も優れた活性を有することをアプリオリに決定すること
はできない。

レゾ１ツカ断片または該レプリカ断片の類似体の合成に
より、全配列の化学的または組換え合成に数多くの利点
が得られることは明らかである。これらの利点としては
、低コスト、生産、単離および精製の容易さが含まれる
。

（課題を解決するための手段） 本発明により、リン脂質と混合したときに表面活性能を
示すＳＰ−Ｂタンパク質の少なくとも一つの断片を含む
組成物であって、該断片が、少なくとも末端アミノ酸配
列を含むＳＰ−Ｂタンパク質部分、またはその置換、欠
失、反復（ｒｅｐｌ　１ｃａｔｅ）および付加類似体で
あることを特徴とする組成物が開示される。

本発明により、さらに上記ＳＰ−Ｂ断片またはその類似
体と少なくとも１種の脂質との組合わせからなる組成物
が開示される。脂質は、合成リン脂質、天然リン脂質、
中性脂肪、コレステロール、コレステロールエステル、
ホスファチジルコリン、ジ飽和（ｄｉｓａｔｕｒａｔｅ
ｄ）ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロー
ル、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチ
ジルイニソチル（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｉｓｏ
ｔｙｌ）およびそれらの混合物よりなる群から選ばれた
ものである。

最も好ましい脂質は、ジパルミトイル−５ｎ−ホスファ
チジルコリン（ＤＰＰＣ）、卵ホスファチジルグリセロ
ール（Ｐ　Ｇ）およびパルミチン酸からなる混合物であ
る。

さらに、少なくとも末端アミノ酸配列を含む少なくとも
一つのＳＰ−Ｂ断片と少なくとも１種の脂質と力１らな
る表面活性組成物からなることを特徴とする、肺表面活
性物質の不足状態（たとえば、ヒアリン膜症（硝子膜症
：　１１ｙＢｌｉｎｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅｄｉｓｅａｓ
ｅ）など）および／または異常な表面活性状態（たとえ
ば、呼吸障害症候群など）の治療および予防用剤が開示
される。

さらに、天然ＳＰ−Ｂ上の抗原決定基に特異的なポリク
ローナルまたはモノクローナル抗体の製遣方法であって
、ＳＰ−Ｂタンパク質の少なくとも一つの断片であって
、少なくとも末端アミノ酸配列を含むＳＰ−Ｂタンパク
質部分、またはその置換、欠失、反復および付加類似体
である断片と適当な担体および／またはアジュバントか
らなる組成物の有効量で免疫することを特徴とする方法
が開示される。

本発明により、新規で天然には存在しない合成ペプチド
が開示され、該ペプチドは天然および／または合成リン
脂質の表面活性物質様作用を著しく増強する能力を有す
る。本発明の合成ポリペプチドは、天然に存在するＳＰ
−Ｂの公知の連続したアミノ酸配列の部分（断片）のレ
プリカ（これはリン脂質単独と組み合わせてよいし、ま
た２またはそれ以上のＳＰ−Ｂ類似体レプリカと組み合
わせてもよい）、および／または１またはそれ以上のＳ
Ｐ−Ｂ類似体レプリカと天然、合成もしくは組換え５ｐ
−ｃおよび／またはＳＰ−Ａとの組合わせからなる。本
発明のポリペプチド断片は、化学的方法または組換え法
により容易に、また経済的に合成することができ、天然
または合成リン脂質とともに調合して混合物を得ること
ができ、該混合物はリン脂質混合物単独に比べて顕著に
増強された表面活性物質様作用を示す。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。

天然のＳＰ−Ｂタンパク質の種々の領域に対応する種々
の長さの多数のポリペプチドを、固相ペプチド合成法に
より合成した。しかしながら、同一または類似の断片も
また、公知の組換えＤＮＡ法により製造することができ
た。本発明は、組換え法を用いて種々のＳＰ−Ｂ断片を
製造することができること、ある種のサイズ（アミノ酸
配列の長さ）の断片はこの方法により一層容易に製造さ
れるであろうことを当業者が評価するであろうことを想
定している。従って、本発明の範囲は、末端アミノ酸配
列を含み、表面活性物質様作用を示し、かつ組換え法に
より容易に製造することのできるＳＰ−Ｂ断片をすべて
包含することを意図している。

下記第１表は、種々の合成ＳＰ−Ｂ断片の分子質量（ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓ）、位置、およびそれらを
構成しているアミノ酸数、並びに本発明の目的のための
命名を示す。

第１表（合成ＳＰ−Ｂペプチド断片の命名、分子質量、
位置およびア礼）酸残基数）ケ負　　　分子質量　塗置
　　アミノ酸数ＳＰ−Ｂ（１−７８）　　８６６３．４
　　１−７８　７８（完全タンパク質） ＳＰ−Ｂ（１−２０）　　２４０２．１　　１−２０　
　　２０ＳＰ−Ｂ（１−４０）　　４５０４．９　　１
−４０　　　４０ＳＰ−Ｂ（１−６０）　　６６１１．
６　　１−６０　　　６０ＳＰ−Ｂ（３０−６０）　　
３２６１．１　３０−６０　　　３０ＳＰ−Ｂ（１２−
６０）　　５２７７．８　１２−６０　　　４９ＳＰ−
８（２７−７８）　　５６８２．４　２７−７８　　　
５２ＳＰ−Ｂ（５３−７８）　　２９７５．９　５３−
７８　　　２６調合実験並びに試験（以下で記載）の結
果、これら断片のうちのあるものはリン脂質混合物の表
面活性能を容易に高める、予測しなかった並外れた驚く
べき能力を示すことが本発明者らにより見出された。

本発明の最も好ましいポリペプチドとしては、以下のも
のが挙げられる。

（ａ）Ｓ　Ｐ−Ｂ（１−２０）：　　下記アミノ酸配列
を有し、ＳＰ−Ｂタンパク質のアミ７末端側の最初の２
０個のアミノ酸残基のレプリカを構成していることがわ
かる。

ＮＨ＊−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ　−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−
Ｐｒ。

−Ｔ　ｙｒ　−Ｃｙｓ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｃ
ｙｓ　−Ａ　ｒｇ　−Ａ　ｌａ　−０ Ｌｅｕ　−Ｉ　ｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ　−１１ｅ−Ｇｌ
ｎ−Ａｌａ　−０ ０Ｈ，および （ｂ）ＳＰ−Ｂ（５３−７８）：　　下記アミノ酸配列
を有し、ＳＰ−Ｂタンパク質のカルボキシル末端側の最
後の２６個のアミノ酸残基であることがわかる。

ＮＨ＊−Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ｖａｔ　−Ｉ　Ｌｅ　−Ｌｅ
ｕ　−Ｌｅｕ　−３ Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｍ
ｅｔ　−０ Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｖ
　ａｌ　−Ｃｙｓ　−Ａ　ｒｇ　−０ Ｌｅｕ−Ｖａｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−３ｅｒ−Ｏ
Ｈ；８ 本発明のポリペプチドには、付加類似体（所定のＳＰ−
Ｂ配列において、天然には存在しないｌまたは２以上の
アミノ酸残基が合戊ボリベプチド中の末端または中間位
に加えられたもの）、欠失類似体（天然の配列から１ま
たは２以上のアミノ酸残基が欠失したもの）、置換類似
体（１または２以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基
で置きかわったもの）および反復類似体く天然の配列中
の１または２以上の残基が反復され、複製されたもの）
も包含される。とりわけ、天然に存在するＳＰ−Ｂタン
パク質の２以上の種（すなわち、ヒト、イヌ、ウシ、ブ
タなど）の混成レプリカからなる種間ハイブリッド類似
体、およびＤ−アミノ酸が天然のし一アミノ酸に置きか
わった類似体も包含される。本発明のポリペプチドはＳ
Ｐ−Ｂタンパク質の全体的な疎水性の性質を保持してい
るのが好ましく、また二次および三次フンホメーション
の実質要素を保持していることも望まれる。

天然のＳＰ−Ｂ（完全なタンパク質）の場合と同様に、
本発明のポリペプチドも天然かまたは合成リン脂質とと
もに調合して、肺表面活性物質不足（たとえば、ヒアリ
ン膜症など）および／または異常な表面活性状態（たと
えば、呼吸障害症候群（ＲＤＳ）など）の治療、および
肺医薬送り出しシステムに有用な混合物を容易に得るこ
とができる。本発明の合成断片はまた、天然のＳＰ−Ｂ
上に存在する抗原決定基に対して特異性を示すポリクロ
ーナルおよびモノクローナル抗体の調製においてかなり
の有用性を有することが期待され、それゆえ、臨床免疫
診断における免疫精製および／またはＳＰ−Ｂタンパク
質の定量評価に特に有用である。

本発明の他の側面および利点は、下記例示的な態様の詳
細な記載を考慮に入れると明らかであろう。

つぎに、本発明を実施例に基づきさらに詳しく説明する
・が、本発明はこれらに限られるものではない。

叉舅： 下記実施例は、本発明のポリペプチドの合成および試験
に関する。さらに詳しくは、実施例１〜３は、ヒトＳＰ
−Ｂタンパク質について全アミノ酸配列上でパターン化
したポリペプチドの合成に関する。第１表（上掲）は、
種々の合成ＳＰ−Ｂ断片の位置、分子量および該断片を
構成するアミノ酸敗を示す。すべての断片を合成し、開
裂し、精製した。実施例４および５は、ポリペプチド／
リン脂質混合物の調合および試験に関する。そのデータ
の示すところによれば、本発明のペプチドと組み合わせ
たときに担体リン脂質の表面活性物質様作用が著しく改
善された。

本発明の化合物はまた、部分固相合成法、断片縮合法、
および「ペプタイド・シンセンス（ｐｅｐｔｉｄｅ　５
ｙｎｔｈｅｓｉｓ）Ｊ、第二版、ボダンスキー（Ｍ。

Ｂ　ｏｄａｎｓｋｙ）、クラウスナー（Ｙ、　Ｓ、　Ｋ
　１ａｕｓｎｅｒ）およびオンデッティ（Ｍ、　Ａ、　
Ｏｎｄｅｔｔｉ）（１９７６）に記載の方法に代表され
る古典的な溶液法によって調製することができる。

実施例１ Ｓ　Ｐ’−Ｂ（１−７８）の合成： 天然ヒトＳＰ−Ｂタンパク賃の全７８アミノ酸残基配列
のレプリカを得るために、下記配列：Ｎ　Ｈ、−Ｐｈｅ
　−Ｐ　ｒｏ　−Ｔ　ｌｅ　−Ｐ　ｒｏ−１、ｅｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｔ　ｙｒ　−Ｃｙｓ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｌ　ｅｕ　
−Ｃｙｓ　−Ａ　ｒｇ　−Ａ　ｌａ　−Ｌｅｕ　−１１
ｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ　−Ｔ　１ｅ−Ｇｉｎ−Ａｌａ　−
０ Ｍｅｔ　−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−
Ｌｅｕ　−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−
Ｇｉｎ−Ｖａｌ　−０ Ｃｙｓ　−Ａ　ｒｇ　−Ｖ　ａｌ　−Ｖ　ａｌ＝　Ｐ　
ｒｏ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｖ　ａ１０ Ａｌａ−ｃｉｙ−Ｇｌｙ　−Ｉ　１ｅ−Ｃｙｓ−Ｇｉｎ
−Ｃｙｓ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ａ
　ｒｇ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｖ　ａｌ　−０ １１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｅｕ０ Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−
Ｌｅｕ　−Ｖ　ａｌ　−Ｃｙｓ　−Ａ　ｒｇ　−Ｌ　ｅ
ｕ　−Ｖ　ａｌ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｒｇ　−０ Ｃｙｓ−３ｅｒ−ＯＨ； ８ を有する分子を調製した。このポリペプチドを、バラニ
ー（Ｂａｒａｎｙ、Ｇ、）およびメリフィールド（Ｍｅ
ｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｒ，）により「ザ・ペプタイド（
ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅｓ）Ｊ、グロス（Ｇ　ｒｏｓｓ、
　Ｅ　、）およびマイネンホーフ（Ｍｅｉｎｅｎｈｏｆ
ｅ、　Ｊ　、）ｔｉＡｓ　２．１〜２８４、アカデミツ
クプレス、ニューヨーク、Ｎ、Ｙ、、１９８０に記載の
一般的方法に従い、段階固相合成法（カルボキシル末端
残基から開始する）によりフェニルアセトアミドメチル
（ＰＡＭ）樹脂支持体上で組み立てた。Ｃ末端アミノ酸
残基のセリン（Ｓｅｔ）を、ＰＡＭ樹脂の高められた酸
安定性（トリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）での長期にわ
たる処理の間、改善された安定性を保証する）によって
、オキシメチルフェニルアセトアミドメチル（ＯＭＰＡ
）結合を介してＰＡＭ樹脂支持体にカップリングした。

Ｃ末端Ｓｅｔカップリングの後、この樹脂（０，７２モ
ル／９．０．７０９）をアプライド・バイオシステムズ
・ペプチド・シンセサイザー・（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚ
ｅｒ）モデル４３０Ａの反応容器に移した。次の８個の
アミノ酸を、７６位と７２位にあるアルギニンの付加を
Ｎ、Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）／
ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）化学を用い
て二重カップリングした他は、前以て生成した対称無水
物カップリングプロトコールを用いて段階的にカップリ
ングした。ついで、これ以後のすべてのアミノ酸につい
ては、二重カップリングプロトコールを用いて合成を続
けた。すべてのアミノ末端残基は、ｔ−ブチルオキシカ
ルボニル（１−ＢＯＣ）結合により保護した。第一のカ
ップリングにおいて、アスパラギン、グルタミンおよび
アルギニン以外の保護アミノ酸は、ＤＭＦ中に溶解した
前以て生成した対称無水物を用いてカップリングした。

個々のアミノ酸の対称無水物を塩化メチレン中で生成さ
せ、ついで溶媒をＤＭＦに交換した後ペプチドシンセサ
イザーの反応容器に移した。対称無水物の第二のカップ
リングは、塩化メチレン中で行った。アミノ酸のグルタ
ミンおよびアスパラギンは、ＤＣＣ／ＨＯＢＴプロトコ
ールを用いてカップリングした。６５位にメチオニンを
導入した後、インドール（１％ｗ／ｖ）およびエタンジ
オ・−ル（０，２５％ｖ／ｖ）をＴＦＡに加えた。

この変性溶液を、以下におけるＮα　Ｂｏａ保護基のす
べての除去に用いた。

種々のアミノ酸残基の官能性側鎖を以下の基により保護
した。

Ａｒｇ−Ｔｏｅ　　　　　　（トシル）Ｌｙｓ　　２Ｃ
ＬＺ　　　（２−クロロヘンシルオキシカルボニル） Ｔｈｒ、５ｅｒ−Ｂｚｌ　　　（ベンジル〉Ｔｙｒ−２
ＢｒＺ　　　　（２−ブロモベンジルオキシカルボニル
） Ｃｙｓ−４ＭｅＢｚｌ　　　（４−メチルベンジル）Ａ
ｓｐ、Ｃ；１ｕ−ＯＢｚｌ　　（０−ベンジル）アミノ
酸のメチオニンおよびトリプトファンは、側鎖を保護す
ることなく用いた。

チロシンおよびロイシンをそれぞれ５３位および２７位
にカップリングした後、少量のペプチド−樹脂（０，６
９）を除いた。樹脂支持体上で組み立てたペプチド配列
の完全さ（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）は、該ペプチド断片の
固相シーフェンシングにより、また合成完了時にはＡＢ
Ｉ　　４７０Ａガス相シークエンサー上で証明された。

充分に保護したペプチド−樹脂（３３０Ｑ）を塩化メチ
レン中で５分間膨潤させた。Ｎα−ＢＯＣ保護基を、上
記１％（ｗ／Ｖ）インドールおよび０゜１％（Ｖ／Ｖ）
エタンジオールを含有するＴＦＡを用いて開裂させた。

ついで、このブロックしていない膨潤ペプチド−樹脂を
、ｐ−クレゾール（１籾）、ｐ−チオクレゾール（０，
２ｙ）およびジメチルスルホ牛シト（ＤＭＳ）（１村）
を添加した無水フッ化水素（ＨＦ）（１１ｚＱ＞で、Ｏ
ｏＣにて６０分間処理した。

この処理の結果、タンパク質またはペプチドが支持体樹
脂から開裂した。

ＨＦ／ＤＭＳを真空下、ＯｏＣにて留去した。この開裂
したペプチドおよび樹脂を冷ジエチルエーテルのＬ５Ｒ
Ｑアリコートで３回洗浄し、ついで遊離のペプチドを冷
ＴＦＡの１０．ｗ１２洗浄液で３回洗浄することにより
抽出した。この洗浄液を直ちに濾過し、氷冷水（１２０
〜１５０ｉ（りを加えて粗製のペプチドを沈澱させた。

ついで、この粗製のペプチドを、１０００ｇ、０°Ｃに
て３０分間遠心分離にかけることによりペレット化した
固体として回収した。このペレットをジエチルエーテル
（１５１１２）で洗浄し、ついで遠心分離した。この洗
浄工程を、３回はジエチルエーテルを用い、Ｌ回は酢酸
エチルを用い、２回は蒸留水を用いて繰り返した。

この粗製のペプチド（１７０！？、収率８２％）を、溶
媒系として０．１％ＴＦＡ（Ａ）および１００％アセト
ニトリル（Ｂ）を用いたＣ４カラム［ビダック（Ｖ　ｙ
ｄａｃ）、カタログ＃２１４−ＴＰ−５４コ上の逆相高
速液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）により分析し精
製した。ペプチド精製に用いた溶媒勾配は、５２％Ｂ溶
媒から開始した。このカラムを５２％Ｂにて３分間保持
し、ついで直線勾配を用い７２％Ｂまで２０分間かけて
増加させた。最後に、このカラムを１分間で５２％Ｂに
戻した。

溶出１夜中のペプチドの存在を２２５　ｎｍおよび２８
０ｎｍでモニターした。この精製ペプチドのアミノ酸組
成を、５％（Ｖ／Ｖ）チオグリコール酸を含む１２Ｎ　
ＨＣ１／ＴＦＡ（２：１、ｖ／ｖ）で真空下、１５０°
Ｃにて４時間酸加水分解することにより決定した。酸を
除いた後、加水分解生成物をベックマン６３００アミ／
酸アナライザーで分析した。

この精製ペプチドをｎ−プロパツール中に溶解し、ベッ
クマンＤＢ分光光度計上の２１０ｎｎおよび３３０ｎｍ
からＵＶスペクトルも得られた。

実施例２ ＳＰ−Ｂ（１−２０）の合成： 実施例１に記載の合成法と同様の方法を用い、下記配列
： ＮＨ，−Ｐｈｅ　−Ｐｒｏ　−１１ｅ　−Ｐｒｏ−Ｌｅ
ｕ−Ｐｒ。

−Ｔ　ｙｒ　−Ｃｙｓ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｃ
ｙｓ　−Ａ　ｒｇ　−Ａ　ｌａ　−０ Ｌｅｕ　−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ　−１１ｅ−Ｇｌｎ
−Ａｌａ　−０ ０Ｈ。

を有する完全に保護されたペプチドを固体支持体上で組
み立てた。樹脂からのＨＦ開裂および開裂ＳＰ−Ｂ（１
−２０）ペプチドの精製は、本質的に実施例１に記載の
ようにして行った。ｐ−クレゾール（０，５ｘＱ）およ
びチオクレゾール（０，５９）を添加した無水ＨＦ（９
１１２）を用い、０°Ｃにて１時間、ペプチドを樹脂か
ら開裂させた。ＨＦおよび他の揮発成分を除いた後、開
裂ペプチドおよび樹脂を上記のようにしてエーテルで洗
浄した。このペプチドを、（１）１５％酢酸水溶液の１
５ｉ（アリコートで３回、（２）４０％酢酸水溶液で３
回抽出した。

水性抽出物を集め、凍結乾燥させて粗製のペプチドを得
た。これを、実施例１に記載と同様の方法で精製した。

叉施舅ユ ＳＰ−Ｂ（５３−７８）の合成： 実施例１に記載の合成法と同様の方法を用い、下記配列
： ＮＨ，−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｖａｌ　−１１ｅ−Ｌｅｕ−
Ｌｅｕ　−３ Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｍ
ｅｔ　−０ Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−
Ａｒｇ０ Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｏ
Ｈ；８ を有する完全に保護されたペプチドを固体支持体上で組
み立てた。チオクレゾールの代わりにエタンジチオール
を用いた他は、樹脂からのＨＦ開裂および開裂ＳＰ−Ｂ
（５３−７８）ペプチドの精製は、本質的に実施例１に
記載のようにして行った。

上記の詳述した断片に加え、下記断片をもまた調製し、
試験した。方法は実施例１に記載と同様である。

Ｓ　Ｐ−Ｂ（１−４０）： ＮＨｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ　−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−
Ｐｒ。

−Ｔ　ｙｒ　−Ｃｙｓ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｃ
ｙｓ　−Ａ　ｒｇ−Ａ　ｌａ　−０ Ｌｅｕ　−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ　−１１ｅ−Ｇｉｎ
−Ａｌａ　−０ Ｍｅｔ　−１１ｅ　−Ｐｒｏ　−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌ
ａ　−Ｌｅｕ　−Ａ　ｒｇ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　ｌａ　
−Ｖ　ａｌ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ　−
０ Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ　−Ｌｅｕ
−ＯＨ；０ Ｓ　Ｐ−Ｂ（１−６０）： ＮＨ！　−Ｐｈｅ　−Ｐｒｏ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｐ　ｒｏ
　−Ｌｅｕ　−Ｐｒ。

−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−
Ａｌａｌ０ Ｌｅｕ　−Ｉ　ｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ　−１１ｅ−Ｇｉ
ｎ−Ａｌａｌ０ Ｍｅｔ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌ
ａ−Ｌｅｕ　−Ａ　ｒｇ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　ｌａ　−
Ｖ　ａｌ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ　−０ Ｃｙｓ　−Ａ　ｒｇ　−Ｖ　ａｔ　−Ｖ　ａｌ　−Ｐ　
ｒｏ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｖ　ａ１０ Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｇｉｎ−
Ｃｙｓ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　
ｒｇ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｖ　ａｌ　−０ １１ｅ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｓｐ　−Ｔ　
ｈｒ−〇Ｈ；０ Ｓ　Ｐ−Ｂ（１２−６０） ＮＨｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ　−Ｉ　ｌｅ−Ｌｙｓ
−Ａｒｇ−Ｉ　１ｅ−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｌａ−Ｍｅｔ　
−１１ｅ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｌｙｓ２〇 −Ｇｌｙ−Ａｌａ　−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ
−Ｖａ１０ −Ａｌａ−Ｃ；Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｖａｔ
−ＶａｌＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇａｙ−Ｇ
ｌｙ　−Ｉ　ｌｅ０ −Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ　−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ
−Ａ’ｒｇ０ −Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ　−Ｉ　１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ−ＡｓｐＴｈｒ−ＯＨ； ０ ＳＰ−Ｂ（３０−６０）： Ｎ　Ｈｔ　−Ａ　ｌａ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ
　Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ　−Ｃｙｓ０ Ａ　ｒｇ　−Ｖ　ａｌ　−Ｖ　ａｌ　−Ｐ　ｒｏ−Ｌ　
ｅｕ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　ｌａ０ Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　−Ｉ　ｌｅ−Ｃｙｓ−Ｇｉｎ−Ｃｙｓ
−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−
Ｖａｌ　−１１ｅ０ −Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−ＯＨ；０ Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　−１１ｅ−
Ｃｙｓ　−０ Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔ
ｙｒ　−０ Ｓｅｒ−Ｖａｌ　−Ｉ　１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ
−Ｔｈｒ　−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ
−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ　−Ｇ　ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｖ　ａ
ｔ　−Ｃｙｓ　−Ａ　ｒｇ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｖ　ａｌ　
−０ Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−３ｅｒ−ＯＨ８ 精製した単独の各合成ペプチド断片かまたは種々の断片
の組合わせを合成リン脂質とインビトロで組み合わせた
混合物について、その生物物理（表面）活性を決定する
ための試験を行った。

実施例４ 合成ペプチド混合物の調合： 表面活性を試験する前に、合成ペプチド断片を脂質と混
合した。脂質をクロロホルム：メタノール（２：　１　
）中に溶解することにより、６８重量％Ｌ２−シバルミ
トイルーｓｎ−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、２
２重量％卵ホスファチジルグリセロール（Ｐ　Ｃ）およ
び９重量％バルミチン酸からなる脂質混合物を調製した
。ペプチド断片の必要量をメタノール中に溶解し、６０
’Ｃに１０分間加熱し、ついで４５°Ｃに冷却した。つ
いで、このペプチド溶液を前取て４５℃に温めておいた
脂質混合物に加えた。試料をプツチロータパブ（Ｂｕｃ
ｃｈｉ　ｒｏｔａｖａｐ）上で穏やかに渦巻混和させる
ことにより４５°Ｃにて混合した。ついで、真空（６０
０トル）を適用することにより、有機溶媒を４５°Ｃに
て蒸発させた。蒸発後、穏やかな浴超音波処理を施しな
がら、固体を脱イオン蒸留水中の１０％エタノール中に
懸濁した。この超音波処理した懸濁液を４５°Ｃにて３
０分分間中かに混合したその後、真空（１５０トル）を
適用することによりエタノールを除去した。エタノール
を完全に除去した後、懸濁液を０．１５Ｍ　ＮａＣ１で
希釈し、リンＩ１ｗ質濃度が２５　ｍｙ／　ｄの混合物
を得た。調合後試験前４８時間の間、この混合物を４℃
にて貯蔵した。　合成ペプチド断片は、脂質とのみ混合
するか、第１表に示した他のペプチド断片と脂質の両方
と混合するか、または他の低分子量表面活性タンパク質
の断片、ＳＰ−Ｃ（すなわち合成ＳＰ−Ｃ（１−６０）
または５ｐ−ｃ（６−４１））と混合した。全６ｓｐ−
ｃ断片は、アミノ酸配列を天然の５ｐ−ｃのアミノ酸配
列に基づいた他は実施例１に記載と同様の方法により調
製した。

ペプチド２／脂質混合物を、最終的なペプチド濃度が０
　、５　ｍ９／　ｘＱ、（、固形分濃度が２％と等価）
となるように生成した。混合物に２種以上のペプチドを
用いた場合には、合計の最終的なペプチド濃度を常に０
．５１９／ｘＱ＜固形分２％）に維持した。２種のペプ
チドを用いた場合には、それぞれの最終濃度を０．２５
麓９／ｘＱとした。

これら混合物の相対的な表面活性を決定するために、こ
れらを市販の天然表面活性剤［サーファクタントＴ　Ａ
（Ｓ　ｕｒ４ａｃｔａｎｔ　Ｔ　Ａ）、アボット・ラボ
ラトリーズ；サーフアクテン（Ｓ　ｕｒｆａｃｔｅｎ）
、トーキジ−タナベコ、市販の合成表面活性剤［エクソ
サーフ（Ｅ　ｘｏｓｕｒｆ）、バラーーウエルカム（Ｂ
　ｕｒｒｏｕｇｈｓ−Ｗｅｌｃｏｍｅ）］および合成脂
質混合物標準と比較した。市販の表面活性剤は、容認さ
れたものを用いた。修正ウイルヘルミーバランス（ｍｏ
ｄｉｆｉｅｄ　Ｗｉｌｈｅｌｍｙ　ｂａｌａｎｃｅ）［
ラングミュアトラフ（Ｌａｎｇｍｕｉｒ　Ｔｒｏｕｇｈ
）］系および脈動泡表面活性計（ｐｕｌｓａｔｉｎｇ　
ｂｕｂｂｌｅ　ｓｕｒｆａｃｔｏｍｅｔｅｒ）（Ｐ　Ｂ
　Ｓ　）の両者を用いて生物物理試験をアッセイした。

明解にするため、これら方法を下記に簡単に記載する。

修正ウイルヘルミー表面バランス （ａ）表面張力ｖｓ圧縮表面積： 修正ウイルヘルミー表面バランス（ラングミュアトラフ
）を用い、ペプチド／脂質混合物の動的表面張力低下能
を調べた。この装置は、全テフロントラフと、変動表面
積を含み定める可動のテフロンリボン（ダム）バリアー
システムからなっている。表面積は、このテフロンバリ
アーを駆動する定速可逆３相モーターを使用することに
より変化させた。液体−空気界面の表面張力を決定する
ために、サンドブラストをかけた１Ｇ！プラチナプレー
トおよびステンレス鋼吊り下げワイヤを備えたカーノ（
Ｃａｈｎ）２０００電気バランス［カーノ・インスツル
メンツ（Ｃａｈｎ　Ｉ　ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、セリ
トス（Ｃｅｒｉｔｔｏｓ）、ＣＡコを用いた。装置全体
を４５°Ｃにセットしたサーモスフシトインキュベータ
ー中に置いた。表面積−表面張力の測定は、０．１５Ｍ
　ＮａＣ１（９５０ｉｆ２）をトラフに加えることによ
り行った。測定の間、下相（ｓｕｂｐｈａｓｅ）温度を
３６〜３８℃に制御した。

各実験について、ペプチド／脂質混合物（２７μ１２）
をランダムな配列の１３（！＝、２μＱ）小滴にて温度
制御下相の表面に加え、３分間自然に広がらせた。（２
７μＱの添加は６７５μ９のリン脂質に対応する）つい
で、トラフの表面積を、３サイクル／分（圧縮比２．５
：１）の循環速度で最大表面積（４４５ＣＩ”）から最
小表面積（１７８ｃ＋’）へ、さらに最大表面積へと循
環させた。各適用について、７回の完全な圧縮−伸張循
環に対して動的表面張力ｖｓ表面積を記録した。

（ｂ）吸収度（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｒａｔｅ）＋拡
散抵抗の存在しないときの吸収度を決定するために、ノ
ツター（Ｎｏｔｔｅｒ）ら［Ｐ　ｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｒ
ｅｓ、　。

Ｌｉ、５１５〜５１９（１９８２）］により記載された
のと同様の方法を用いた。上記修正ウイルヘルミー表面
バランスを用いた。しかしながら、ラングミュアトラフ
の代わりに円形テフロン皿（５゜ＩＣｊ！直径）を用い
た。下相、０．１５Ｍ　ＮａＣＩ（７０村）をインキュ
ベーター中、３７℃にて平衡化し、テフロンコーティン
グマグネチックスターラーで絶えず撹拌した。全リン脂
質（５１９）を含有するペプチド／脂質断片混合物のア
リコートを、１０秒間撹拌することによりＱ、　１５Ｍ
　ＮａＣＩ（１０ｉｃ）中に分散させた。ついで、この
分散液を食塩水下相に加えた。電気バランス出力に接続
したストリップチャートレコーダーを用い、表面張力低
下能をモニターした。

これら方法の詳細は、ノツターらのＰ　ｅｄｉａｔｒｔ
ｃＲｅｓ、、１５．５１５〜５１９（１９８２）；ノツ
ターらのＣｈｅｍ、　Ｐ　ｈｙｓ、　Ｌ　１ｐｉｄｓ　
３３．６７〜８０（１９８３）；エガン（Ｅ　ｇａｎ）
らのＪ　、　Ａ　ｐｐｌｉｅｄ　Ｐ　ｈｙｓｉｏｌ。

５５．８７５〜８８３（１９８３）；バーメル（Ｂ　ｅ
ｒｍｅｌ）らのＬｕｎｇ１６２．９９〜１１３（１９８
４）：ノツタ・−らのＰ　ｈｙｓ　ｉｏｌ、　Ｒｅｓ、
　＋　２０．５６９〜５７７（１９８５）；ホルム（Ｈ
ｏ１ｍ）らのＣｈｅｍＰｈｙｓ　Ｌｉｐｉｄｓ失炙、２
８７〜２９８（１９８５）に記載されている。

使用したＰＢＳ装置［エレクトロネティソクス（Ｅ　１
ｅｃｔｒｏｎｅｔ　１ｃｓ）、バッファーロー、−’−
ｘ−〇Ｉ−クコは、エンホーニング（Ｇ、　Ｅ　ｎｈｏ
ｒｎｉｎｇ）のＪ。

Ａｐｐｌｄ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　４３．１９８〜２０
３（１９７７）に詳細に記載されたものと本質的に同じ
ものであった。記録は、小さな空気泡の壁の圧力勾配に
ついて行った。この空気泡は、狭い煙突スタック（ｃｈ
ｉｍｎｅｙ　５ｔａｃｋ）により周囲の空気とつながっ
ているが、それ以外はペプチド／脂質混合物（４０μの
によって完全に囲まれている。これらの研究に用いた混
合物の濃度は１１１９／ｍ（ｌ全リン脂質（０、０２１
９／　ｚＱ全ペプチド）であり、希釈液は０．１５ＭＮ
ｉＣ１であった。試料チェンバに負荷する直前に、上記
希釈試料を１５秒間超音波処理してガス核を除いた。

空気−水界面での圧力降下を圧力変換器により脈動の間
に測定し、対応する表面張力をヤングの法則およびラプ
ラスの等式を適用することにより決定した。測定はすべ
て３７°Ｃにて行い、それぞれ最大（１，１ｆｆりおよ
び最小（０，８ｍ）泡直径が得られるように泡を２０サ
イクル／分、で脈動させた。

（この圧縮／伸張は、空気−水界面の表面積の５０％の
変化に対応する） 動的表面張力および吸収の容易さ（ａｂｓｏｒｐｔ　１
ｏｎｆａｃｉｌｉｔｙ）を第２表にまとめである。第２
表は、ウイルヘルミーバランスーラングミュアトラフシ
ステム上で種々のペプチド−脂質混合物について得られ
た動的表面張力および吸収データをまとめたものである
。低い最小動的表面張力値および減少した吸収表面張力
値が良好な表面活性剤調合物の望ましい性質であること
は当業者には明らかであろう。

上記第２表に示したデータから、単独かまたは他のＳＰ
−Ｂ断片もしくは５ｐ−ｃペプチドと組合わせた各合成
ＳＰ−Ｂ断片混合物は、天然の表面活性剤（たとえばサ
ーファクタントＴＡ）により示されるものに匹敵するか
またはそれよりも優れた程度で最小動的表面張力を有意
に減少させることが明らかである。ただ１つの例外を除
いて、すべてのペプチド断片および２ペプチド混合物の
動的表面張力値はｌダイン／ｃａｙ未満であり、それに
対して天然の表面活性剤（たとえばサーフ１クタントＴ
’Ａ）の最小動的表面張力値は約８ダイン／ｃｍである
。

第３表は、脈動泡表面計上で種々のペプチド混合物につ
いて得られた空気−水界面での最小表面張力値をまとめ
たものである。ウイルヘルミーバランスの場合と同様、
低い表面張力値が良好な表面活性混合物の望ましい性質
であることは当業者には明らかであろう。

筆旦老（脈動泡表面計で５分間の脈動（ｔｏｏｔイクル
）（注）ａ： ｂ： Ｃ： すべての試料はＩ　Ｒ９／ＭＱリン脂質の濃度で試験を
行った。使用した希釈液は、ガラス蒸留脱イオン水中の
０．１５Ｍ　ＮａＣｌであった。温度は３７℃、脈動サ
イクルは２０サイクル／分。

報告値は、５分間の脈動時間、すなわち１００回の脈動
後に得られたものである。

全ペプチド濃度は、すべての場合に２％リン脂質（０，
５叶／ｌｌｌ１２）である。

第３表に示したデータから、各ＳＰ−Ｂ断片が担体脂質
の表面張力低下能を有意に高めることが調べられた。さ
らに、末端アミノ酸配列を含む断片、とりわけ断片ＳＰ
−Ｂ（１−２０）およびＳＰ−Ｂ（５３−７８）が低い
表面張力値を容易にするのに特に有効であることも明ら
かである。この発見は予期しないものであると同時に驚
くべきことであり、部分的に本発明の基礎を形成するも
のである。

第２表および第３表の画表に示したデータは、最小表面
張力値により明示されるように、本発明のリン脂質とペ
プチド断片の混合物が、合成脂質のみを含有する混合物
と比較して著しく向上した表面活性能を示し、２つの市
販の調合物であるサーファクタントＴＡおよびサーフア
クテンに匹敵するものであることを示している。この２
つの末端ペプチド断片Ｓ　Ｐ−Ｂ（１−２０）および５
ｐ−Ｂ（！５３−７８）は、表面張力低下能において特
に有効である。

実施例５ 第２表および第３表に示すように、第１表に示したペプ
チド断片は単独かまたは種々の組合わせで担体脂質の最
小表面張力を有意に低下させることができる。それゆえ
、種々の断片のうちのどれが優れた活性を示すかを決定
し、さらに種々のペプチド断片（実施例４に記載した標
準脂質混合物と混合したもの）の相対表面活性を定める
ために、０．５ｍ９／ｘ（！（２％固形分）のペプチド
濃度を下げていって、表面活性を示す最低のペプチド濃
度を（修正ウイルヘルミー表面バランス上で）確立した
。

この比較の目的のために、「表面活性」を以下のように
定義する。すなわち、すべての所定のペプチド濃度につ
いて、混合物は、７回の連続的伸張／圧縮サイクルの各
サイクルにおいて５ダイン／ｃｍ未満の最小動的表面張
力となることが必要である。

すべての場合に脂質濃度を２５ｖｉ／ｌＱに維持できる
ように、混合物を実施例４に記載した合成脂質混合物で
希釈した。これらの研究のため、２７μＱの標準容量（
全リン脂質６７５μ２に相当）を最大面積が４４５ｃ１
のラングミュアトラフに加えた。この研究の結果を下記
第４表に示す。

第４表に示したデータを解釈するためには、層有効な（
すなわち表面活性な）ＳＰ−Ｂ断片が一層低いペプチド
濃度で所定の標準を満足するであろうこと、すなわち、
所定の表面活性標準を満たすのに必要なペプチド濃度が
低ければ低いほど、そのペプチド断片の表面活性は優れ
ていることを認識する必要がある。第４表では、脂質コ
ントロールはタンパク質（ペプチド）が含まれていない
のでデータとして掲げていない。

箪４Ｈ（修正ウイルヘルミーバランスーラングミュアト
ラフ上で行った希釈研究により決定された、（注）ａ： ｂ： すべての場合において６７５μ９のリン脂質を最大伸張
（４４５ｃｍ”）のラングミュアトラフに加えた。すべ
ての場合において、リン脂質濃度を２５　ｏ／叶に維持
できるようにペプチド試料を脂質混合物で希釈した。下
相は、ガラス蒸留脱イオン水中の０．１５Ｍ　ＮａＣ１
であった。

スヘての所定のペプチド濃度について、混合物は、７回
の連続的伸張／圧縮サイクルの各サイクルにおいて５ダ
イン／ＣＪＩ未満の最小動的表面張力となることが必要
である。

第４表に示すデータは、これら希釈研究により示される
ように、種々のペプチド断片が表面活性を異なる種々の
程度で示すことを明らかに示している。特に、カルボキ
シル末端およびアミノ末端を含む断片ＳＰ−Ｂ（１−２
０）およびＳＰ−Ｂ（５３７８）が、全ＳＰ−Ｂタンパ
ク質配列、すなわちＳ　Ｐ−Ｂ（１−７８）と等価また
はより以上の生物物理表面活性を示すことは驚くべきこ
とである。

第３表および第４表に示すデータから、本発明のＳＰ−
Ｂペプチド断片が、合成脂質単独または合成脂質と他の
ペプチド断片との組合わせに比べて顕著に高められた表
面活性を有することが明らかである。上記２つの末端断
片ＳＰ−Ｂ（１−２０）およびＳＰ−Ｂ（５３−７８）
により示された並外れた表面活性は、驚くべきであると
同時に予期しないことである。

工業的利用可能性： 本発明は、天然、合成または組換えＳ　Ｐ−Ｂ（１−７
８）に伴う多くの問題を克服するもの′である。

ｓ　ｐ−Ｂ（１−７８）分子のＣ−および／またはＮ−
末端のみを製造することが、肺表面活性生成物の商業的
生産を向上させ促進することは極めて明白である。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）リン脂質と混合したときに表面活性能を示すＳＰ
   −Ｂタンパク質の少なくとも一つの断片を含む組成物で
   あって、該断片が、少なくとも末端アミノ酸配列を含む
   ＳＰ−Ｂタンパク質部分、またはその置換、欠失、反復
   および付加類似体であることを特徴とする組成物。
2. （２）ＳＰ−Ｂタンパク質の断片が、 （ａ）【遺伝子配列があります】 （ｂ）【遺伝子配列があります】 （ｃ）【遺伝子配列があります】 （ｄ）【遺伝子配列があります】 （ｅ）【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （ｆ）【遺伝子配列があります】 （ｇ）【遺伝子配列があります】 （ｈ）およびそれらの置換、欠失および付加類似体より
   なる群から選ばれたものである請求項（１）に記載の組
   成物。
3. （３）ＳＰ−Ｃ、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｃの断片、ＳＰ−Ａ
   の断片およびそれらの混合物よりなる群から選ばれた化
   合物の少なくとも一つをさらに含む、請求項（１）に記
   載の組成物。
4. （４）請求項（１）に記載の組成物と少なくとも１種の
   脂質とからなることを特徴とする組成物。
5. （５）脂質が、合成リン脂質、天然リン脂質、中性脂肪
   、コレステロール、コレステロールエステル、ホスファ
   チジルコリン、ジ飽和ホスファチジルコリン、ホスファ
   チジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルコ
   リン、ホスファチジルイニソチルおよびそれらの混合物
   よりなる群から選ばれたものである請求項（４）に記載
   の組成物。
6. （６）請求項（１）に記載の組成物が下記アミノ酸配列
   ； 【遺伝子配列があります】；および 【遺伝子配列があります】 を有する断片の混合物である、請求項（４）に記載の組
   成物。
7. （７）少なくとも末端アミノ酸配列を含む少なくとも一
   つのＳＰ−Ｂ断片と少なくとも１種の脂質とからなる表
   面活性組成物からなることを特徴とする、ヒアリン膜症
   または表面活性物質の不足もしくは異常に伴う他の症状
   の治療および予防用剤。
8. （８）（ａ）ＳＰ−Ｂタンパク質の少なくとも一つの断
   片であって、少なくとも末端アミノ酸配列を含むＳＰ−
   Ｂタンパク質の部分である断片、（ｂ）少なくとも１種
   の脂質、および （ｃ）ＳＰ−Ｃおよび／またはＳＰ−Ａまたはそれらの
   機能性断片 からなることを特徴とする、ヒアリン膜症および表面活
   性物質の不足もしくは異常に伴う他の症状の治療および
   予防用剤。