JPH01121299A

JPH01121299A - ヒト肺サーファクタントアポ蛋白質

Info

Publication number: JPH01121299A
Application number: JP27816887A
Authority: JP
Inventors: Toyoaki Akino; 秋野　豊明; Masahiko Mizumoto; 水本　雅彦; Hideaki Adachi; 英明足立; Kenji Kataoka; 片岡　賢治
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1987-11-05
Filing date: 1987-11-05
Publication date: 1989-05-12

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】肺サーファクタントは、肺胞表面の気−液界面にあって
その表面張力を低下させることにより、肺の虚脱を防ぐ
役割を担っている。肺サーフｊ７りタントの約９０％は
、ジパルミトイル・ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）
、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）を主成分とする
リン脂質であるが、また蛋白質を約１０％含んでいる。

この蛋白質は肺サーファクタント固有の蛋白質からなり
、肺サーファクタントアポ蛋白質（ｐｕ　ｌ　ｍｏｎａ
　ｒｙｓｕｒｆａｃｔａｎｔ　　ａｐｏｐｒｏｔｅ＋ｎ
）　　（以下ＳＰという）と呼ばれている。ＳＰには数
種類の蛋白質が含まれていることが報告されているが、
主′たるＳＰは３６ＫＤａ糖蛋白質（ＳＰ３６）である
。しかし最近、肺サーファクタント機能に直接関与して
いるアポ蛋白質として、極めて疎水性の高い小分子最の
蛋白質（ＳＰ６）が注目されるようになった。このＳＰ
６は脂質抽出操作によって脂質と同一挙動を示すので、
脂質にとり囲まれた状態で存在する疎水性蛋白質、つま
りプロテオリビトとして存在すると考えられている。従
ってＳＰ６の分離は、有機溶媒を用いで行われ、また極
めて微量のためにその分離精製は非常に困難であった。

ＳＰ６はリン脂質との結合性が極めて高く、肺サーファ
クタント機能発現に重要な因子として注目されているに
拘らず、その−次構造および細胞内代謝動態については
まだ解明されていない。

本発明者らは、肺サーファクタントが大量蓄積すること
が知られている肺胞蛋白症患者の気管支肺胞洗浄液から
、ヒトＳＰ６を分離精製し、その全アミノ酸配列を初め
て決定した。

即ち、本発明は、下記式［Ｉ］で表わされるアミノ酸配
列又はそれと生物学的に同等のアミノ酸配列を有し、そ
の他の肺サーファクタントアポ蛋白質を実質的に含まな
い、分子量約６２００のヒト肺サーファクタントアポ蛋
白質、好ましくはヒト肺サーファクタントアポ蛋白質Ｓ
Ｐ６である。

本発明において、ヒト肺サーファクタントアポ蛋白質Ｓ
Ｐ６は、上記式［Ｉ］で表わされるアミノ酸配列を有す
るが、式［Ｉ］と生物学的に同等のアミノ酸配列を有す
る、分子量約６２００のアポ蛋白質も本発明の範囲に含
まれる。生物学的に同等のアミノ酸配列とは、１又は２
以上のアミノ酸分子が異なるにも拘わらず、アポ蛋白質
ＳＰ６と、ヒト肺サーファクタントアポ蛋白質として生
物学的に同等の作用又は機能を有する、合成された又は
天然から調製された蛋白質のアミノ酸配列を意味する。

例えば、式［Ｉ］のアミノ酸配列の４８番目のｌｅｕが
Ｃｙｓに置換されたアポ蛋白質がある。

また、本発明のヒト肺サーファクタントアポ蛋白質は、
その他のアポ蛋白質を実質的に含まない点で、従来、混
合物の形で得られていたアポ蛋白質ＳＰ６とは区別され
る。実質的に含まないとは、アポ蛋白質ＳＰ６単独の場
合と同様な作用又は機能が、発現している状態を意味す
る。

本発明のヒト肺サーファクタントアポ蛋白質は、肺サー
ファクタント機能に直接関与している蛋白質なので、新
生児呼吸窮迫症候群等の予防又は治療剤として利用でき
る。また、ヒト肺サーファクタントの測定に用いられる
モノクローナル抗体を得るための、免疫抗原としても有
利に利用することができる。

本発明のヒト肺サーファクタントアポ蛋白質の調製法、
精製法２分析法等について、ＳＰ６の例をとって、以下
に説明する。しかし、本発明の蛋白質を得る方法は、以
下の方法に限定されるものでないことは云うまでもない
。

実施例１（アポ蛋白質ＳＰ６の調製）肺胞蛋白症患者の気管支肺胞洗浄液を、５００Ｘ（１，
１０分間遠心した沈渣画分をＦ　ｒ（ｌｓＯｌｏｎｏら
の方法で不連続ショ糖密度勾配遠心して、粗肺サーファ
クタント画分を分離した。そして、この粗肺サーファク
タント画分は、−４０℃に凍結保存した。

凍結保存した肺胞蛋白症患者の気管支肺胞洗浄液粗肺サ
ーファクタント画分を、解凍後、Ｂ１１ａｈａｎｄ　［
）ｙｅｒ法（Ｃａｎａｄ、Ｊ、３ｉｏｃｈｅｍ、ｐｈｙ
ｓｔｏｌ。

３７、　９１１〜９１７　（１９５９）　）に準じてク
ロロホルム／メタノール混液を加えて撹拌後、４℃にて
２４時間静置、７００Ｘ（］で１１０分間心して水層お
よび有機溶媒層に分離した。この有機溶媒層を窒素気流
で蒸発乾固後、クロロホルム２０７に溶解した。一方、
活性化珪酸（Ｕｎｉｓｉｌ、　１００−１００−２Ｏ０
，Ｃ１ａｒｋｓｏｎＣｈｅｍ、社）を１１０℃、１時間
活性化した後、カラム（１，５ｘ３５ｃｍ）に充填し、
クロロホルムを５倍カラム容量流して平衡化した。これ
に前記クロロホルムに溶解した試料を注加後、クロロホ
ルム、クロロホルム／メタノール（Ｃ／Ｍ）比２０：１
．９：１．４：１．３：２．１　：　４　（Ｖ／Ｖ）で
順次各５倍カラム容量ずつステップワイズに溶出し、！
Ｍ／チューブごとに回収した。

上記の珪酸カラムクロマトグラフィーで得られたＣ／Ｍ
　（３：　２）画分を窒素気流にて蒸発乾固後、クロロ
ホルム／メタノール１０．１Ｎ　　ＨＣｊ（１：１：５
％、Ｖ／Ｖ／Ｖ）混合液５ｍＡに溶解し、上記混合液に
て平衡化したＳ　ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｌ　Ｈ−２０（Ｐ
　ｈａｒｍａｃｉａ社）ゲル濾過カラム（１，５×８５
ｃｍ　）にて流速８ｍｅ／時間、２ｄ／チユーブの条件
下に溶出した。

Ｓ　ｅｐｈｄｅｘ　　Ｌ　Ｈ−２０ゲル濾過で得られた
蛋白質画分を遠心型エバポレーター（ＲＤ−３１型、ヤ
マト科学）にて減圧乾固後、８Ｍ尿素、５０１１１ＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｆ　（１１Ｈ９，０）緩衝液に溶解し、ソ
ジウム　ドテシルサルフェート　アクリルアミドゲル電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（１５％ポリアクリルアミ
ド）にて３０　ｍＡ、４時間電気泳動した。

クマジー　ブリリアント　ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ
Ｂ　ｒｉｌｌｉａｎｔ　　３１ｕｅ　）染色にＴ６ＫＤ
ａ蛋白（ＳＦ３）部分を確認し、この部分のゲルを切り
出し、マックスフィールドＧＰ蛋白質回収装置（アトー
社）を用いて０．１％５ＤＳ１２５　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｆ。

１９２　ｍＭグリシンを緩衝液とし１．３００Ｖ、３時
間泳動した。回収カップより取り出した蛋白質溶液をセ
ファロース透析チューブ（Ｍ、　Ｗ、　ｃｕｔ　ｏｆｆ
ｌｏｏｏ、　Ｓ　ｐｅｃｔｒａｐｏｒ社）を用いて脱イ
オン水にて透析した後、凍結乾燥をおこなった。

実施例２（アポ蛋白質ＳＰ６のアミノ酸配列の決定）実施例１で
分離精製されたヒトＳＰ６のアミノ酸分析の結果を第１
表に示した。ＳＦ３はロイシン、バリンを多く含み、非
極性アミノ酸の割合は７０％であった。つぎにＳＦ３を
ｌ　ｙｓｙ　ｌ　ｅｎｄｏ−ｐｅｐｔｉｃｌａｓｅ　　
（Ａ　ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｌｉｔｉｃｕｓプロテ
ア−ゼ■、和光純薬工業）で処理すると、数個のペプチ
ド断片に切断された。処理は、分離精製したＳ２６を８
Ｍ尿素、５０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ　（ＤＨ８，
０）Ｍ’ｌＥＨにＷＪ解した後、５０　ｍＭ　　Ｔｒｉ
ｓ　−Ｈ（Ｊ（１）８８．０）緩衝液を加えて尿素濃度
を４Ｍとし、Ｉｙｓｙｌｅｎｄｏｐｅｐｔ　１ｄａｓｅ
を基質−酵素比５０：　１　（ｗ／Ｗ）になるように加
え、３７℃で１６時間反応させることによって行なった
。

第１表Ｖａｌ　　　　１０，２　　　　　Ａｓｐ　　　　４．
ＩＬｅｕ　　　　１７．５　　　　　Ｇｌｕ　　　　８
．６Ｉ　ｌｅ　　　　７．２　　　　　ｃｙｓ　　　２
．３Ｍｅｔ　　　　３．３　　　　　Ｓｅｒ　　　４．
２Ｐｒｏ７．２　　　　　Ａｒｏ　　　　８，６Ｐｈｅ
　　　　１，３　　　　　Ｔｈｒ　　　　１．８Ａｌａ
　　　　９．８　　　　　Ｈｉｓ　　　Ｏ，５Ｇｌｙ　
　　　８．３ｃｙｓ　　　　２．６Ｔｙｒ　　　　２．６ｒｒＶＮ、　Ｄ、※）全非極性（Ｔｏｔａｌ　　ｎｏｎｐｏｌａｒ）　＝７０
．０　　　　　全極性（Ｔｏｔａｌ　　ｘｌａｒ　）＝
３０．１※）検出できなイ（ｎｏｔ　ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ｅｄ）この酵素分解ペプチド断片を、Ｃ８逆層カラムを
用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により
分離した。すなわち、０．１％トリフルオロ酢酸を含む
アセトニトリル／２−プロパツール（２：１．ｖ／ｖ）
混液の５％から９５％までのグラジェント溶出を行った
。この結果は第１図に示すように、このＨＰＬＧにより
ＡからＧまでの７つのビークに分離された。各ビークの
電気泳動の結果、ビークＡは未分解のＳＦ３、ビークＢ
はＩｙｓｙｌｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅであり、ビー
クＣからＧまでは断片ペプチドであった（以下、これら
のペプチド断片をフラグメントＣ１フラグメントＤ１フ
ラグメントＥ１フラグメントＦ１フラグメントＧとと呼
ぶ）。

つぎにＳＦ３およびＨＰＬＣで分離されたフラグメント
Ｃ，Ｄ、ＥのＮＨ２−末端からのアミノ酸配列をペプチ
ドシークエンサーにより分析し、結果を第２表に示した
。フラグメントＦ、Ｇは微量のため分析できなかった。

第２表から明らかなように各フラグメントのアミノ酸配
列はＳＦ３のアミノ酸配列の一部分とよく一致した。こ
れによりＮＨ２末端はフェニルアラニン、２０番目はア
ラニン、４１番目はバリン、４４番目はグリシンである
ことが判明した。８番目、１１番目、３５番目、４６番
目は、ＳＦ３および各フラグメントの分析でともに検出
されなかった。このようにして得られたヒトＳＰ６のア
ミノ酸配列は、イヌ５Ｐ１８のＣＤＮＡの塩基配列から
決定されたアミノ酸−次構造と非常に似ていることが明
らかとなった。そして、このイヌ５Ｐ１８の一次構造の
、ヒトＳＰ６不明部分に相当する部分は、全てシスティ
ンであった。

アミノ酸シークエンス分析で通常システィンは検出され
ず、ＳＨ基を化学修飾することによってはじめて検出さ
れるので、この不明の４残基はシスティンであろうと推
定された。

第２表サイクル　ＳＦ３　　フラグメントＣフラグメントＤ　
フラグメントＥ３４　　　Ｖａｌ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　Ｖａ１４７　　　Ｇｌｎ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｇ１ｎ４８　　　
１ｅｕ４９　　　１ｅｕ５０　　　　Ａｌａ５１　　　　Ｑｌｕ５２　　　　Ａｒ（１５３Ｔｙｒ５４　　　　Ｔｈｒ５５　　　　Ｖａｔなお、アミノ酸シークエンス分析は、試料を０．１％ト
リフルオロ酢酸、４０％アセトニトリルに溶解し、４７
０Ａ型ガスフエーズシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　
　３ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にて自動Ｅｄｌｌｌａｎ分
解を行ない、切断されたフェニルヒダントイン化したア
ミノ酸を、ＰＴＨアナライザー１２０Ａ（Ａ　ｐｐｌ　
ｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にて同定した。

Ｃ０ＯＨ末端アミノ酸を決定するために、Ｓ２Ｏをｃａ
ｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ　　Ｙ　（３ｉｇｍａ社
）で処理し、遊離するアミノ酸量を自動アミノ酸分析装
置で測定した。反応１５分でロイシンはペプチド当り２
モル、バリンは０．９モル遊離した。反応３０分ではロ
イシンはペプチド当り２モル、バリンは１モル、ついで
スレオニンを０．４７モル認めた。反応時間１時間でロ
イシン、バリンは変わらないが、スレオニンもペプチド
当り１モルに達した。以上の結果よりヒトＳＰ６のＣ０
ＯＨ末端のアミノ酸配列は、−Ｔｈｒ−Ｖａｌ　−Ｌ　
ｅｕ　−Ｌｅｕと決定した。なお反応時間３時間では、
アルギニン、グルタミン酸。

チロシン、アラニンがペプチド当り約１モル出現し、ま
たロイシンも約２．５モルに上昇した。この結果は、第
２表に示したＳ２Ｏのアミノ酸配列を反映しており、従
ってＳ２Ｏの全アミノ酸残基数は、５７個と同定された
。

以上の結果から、ヒトＳＰ６の一次構造は、下記式［Ｉ
］のアミノ酸配列をもつことが確認された。そして、分
子量は６２２１と計算される。

なお、Ｃ０ＯＨ末端アミノ酸の決定は、試料を１００１
ｎＭ　　ＭＥＳ　（２−［Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ　
］ｅｔｈａｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ、　　Ｓ　ｉ
ｇｍａ社）、１％ＳＤＳに溶解し、０ａｒｂＯＸＶＤｅ
ＤｔｌｄａＳｅ　　Ｙを基質−酵素比１０：１　（ｍｏ
ｌ／ｍｏｌ　）　Ｆ加え、室温にて０分、１５分、３０
分、６０分間反応させた。その後、０．０２ＭＨＣｆを
加えて反応を停止後、５ｏｏｘａ　５分間遠心し、不溶
物を除去した後、上記の自動アミノ酸分析装置を用いて
遊離したアミノ酸を同定した。

実施例３（アポ蛋白質ＳＰ６に対する抗体（抗ヒトＳＰ
６抗体）の作成）珪酸カラムクロマトグラフィーで得られたクロロホルム
／メタノール（４：１）画分（１００μｇの蛋白質ＳＰ
６含有）を、窒素気流にて乾固後、生理食塩水５００μ
文にて懸濁液とし、Ｆｒｅｕｎｄ　’　Ｓ　　Ｃ０ＩＩ
ｌｌｅ！Ｘ　　ａｄｊｕＶａｎｔ　　５００μＭととも
にＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に投与した。その後−週
ごとに２０μ９蛋白質を計３回免疫し、常法により抗血
清を得た。

マウスを用いて作製した抗ヒトＳＰ６抗体によりＷｅｓ
ｔｅｒｎ　　ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果、抗ヒトＳＰ６抗
体はヒトＳＰ６を認識するが、ヒト３ｐ３６とヒト血清
蛋白に対してはまったく反応しなかった。

なお、ｗｅｓｔｅｒｎ　　ｂｌｏｔｔｉｎｇは、ＴＯＷ
ｂｉｎらの方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、　ＵＳＡ、　７６、４３５０−４３５４　（１９７
９）　）に準じて電気泳動後のゲルをニトロセルロース
膜（東洋濾紙、孔径０．４５μｙｎ、）にトランスブロ
ッティング装置（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）を用いて、２５　
ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　、　　１９２　ｍＭグリシン、２０
％メタノールの緩衝液中にて６０Ｖ、４時間トランスプ
ロットした。転写後のシートをスキムミルク緩衝液（１
％スキムミルク、１％ＴｒｉｔＯｎ　Ｘ−１００，５０
ｍＭリン酸緩衝液、１））−１７，４）にて１時間処理
した後、抗ヒトＳＰ６抗体く２００倍希釈）をシート上
にマウントし、３７℃、１時間反応させた。ついでスキ
ムミルク緩衝液にて洗浄、ビオチニル化抗マウス１ｇＧ
抗体（Ｖｅｃｔｏｒ社）を２μｇ／ｄの濃度で、３７℃
、１時間反応させた後、再び洗浄した。次にホースラデ
イツシュ　パーオキシダーゼアビジンＤ　（Ｖｅｃｔｏ
ｒ社）を１．５μｇ／ｄの濃度で室温下に２０分間反応
させた。洗浄後、３−３’　　−ジアミノベンジジン　
テトラハイドロクロライドを基質として５０　ｍＭリン
酸緩衝液（１）Ｈ７，４）、０．１％Ｈ２０２溶液中に
て発色させた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のアポ蛋白ＳＰ６を１ｙｓｙｌｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅで処理して得ら
れる種々のペプチド混合物の、高速液体クロマトグラフ
ィーによる分離状態を示す。特許出願人　帝　人　株　式　会　社

Claims

【特許請求の範囲】１、下記式［ I ］で表わされるアミノ酸配列又はそれ
と生物学的に同等のアミノ酸配列を有し、その他の肺サ
ーファクタントアポ蛋白質を実質的に含まない、分子量
約６２００のヒト肺サーファクタントアポ蛋白質。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ）２、アポ蛋白質がヒト肺サーファクタントアポ蛋白質Ｓ
Ｐ６である、特許請求の範囲第１項記載のヒト肺サーフ
ァクタントアポ蛋白質。