JPH10265400A - ペプチドと薬剤 - Google Patents
ペプチドと薬剤Info
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- JPH10265400A JPH10265400A JP9066445A JP6644597A JPH10265400A JP H10265400 A JPH10265400 A JP H10265400A JP 9066445 A JP9066445 A JP 9066445A JP 6644597 A JP6644597 A JP 6644597A JP H10265400 A JPH10265400 A JP H10265400A
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- amino
- corneal epithelial
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＩＬ−１の様々な生理活性領域から角膜上皮
細胞の増殖促進作用を有するペプチド部分を単離し、こ
のペプチドを薬剤として提供する。 【解決手段】 配列番号１のアミノ酸配列からなるペプ
チドと、このペプチド、その誘導体、その薬理学的に許
容される塩類、またはそれらの２以上の混合物を有効成
分として含有する角膜上皮損傷の治癒促進剤。
細胞の増殖促進作用を有するペプチド部分を単離し、こ
のペプチドを薬剤として提供する。 【解決手段】 配列番号１のアミノ酸配列からなるペプ
チドと、このペプチド、その誘導体、その薬理学的に許
容される塩類、またはそれらの２以上の混合物を有効成
分として含有する角膜上皮損傷の治癒促進剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、角膜上皮細胞の
増殖促進作用を有するペプチドと、このペプチドを含有
する薬剤に関するものである。
増殖促進作用を有するペプチドと、このペプチドを含有
する薬剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】インターロイキンは免疫反応に関連する
細胞間相互作用を媒介するポリペプチド性物質であり、
インターロイキン１から１５まで１０数種類のものが知
られている。このうちインターロイキン１（以下「ＩＬ
−１」と記載することがある）は、免疫反応に関与する
マクロファージから分泌され、インターロイキン２の産
生を誘導して免疫反応を促進するとともに、好中球走化
因子や単球走化活性化因子の産生を刺激するなどの様々
な生理活性作用を有することが明らかになっている (BB
CR, vol.160, p.1403, 1989)。
細胞間相互作用を媒介するポリペプチド性物質であり、
インターロイキン１から１５まで１０数種類のものが知
られている。このうちインターロイキン１（以下「ＩＬ
−１」と記載することがある）は、免疫反応に関与する
マクロファージから分泌され、インターロイキン２の産
生を誘導して免疫反応を促進するとともに、好中球走化
因子や単球走化活性化因子の産生を刺激するなどの様々
な生理活性作用を有することが明らかになっている (BB
CR, vol.160, p.1403, 1989)。
【０００３】このＩＬ−１は同一遺伝子から発現される
α（アミノ酸159個）とβ（アミノ酸153個）の２つのサ
ブタイプがあり、1985年頃にはαとβがクローン化さ
れ、ＩＬ−１αは抗ガン剤、あるいはガンの化学療法ま
たは放射線療法の副作用防止剤として、またＩＬ−１β
はガンおよび血球減少症を対象とした治療薬剤として開
発が進められている。
α（アミノ酸159個）とβ（アミノ酸153個）の２つのサ
ブタイプがあり、1985年頃にはαとβがクローン化さ
れ、ＩＬ−１αは抗ガン剤、あるいはガンの化学療法ま
たは放射線療法の副作用防止剤として、またＩＬ−１β
はガンおよび血球減少症を対象とした治療薬剤として開
発が進められている。
【０００４】しかしながら、ＩＬ−１はまた炎症反応の
作用物質であり、薬剤として投与した場合に発熱や炎症
を誘発し、あるいはその抗原性によって好ましくない免
疫反応を生じさせるなどの副作用が問題となっていた。
作用物質であり、薬剤として投与した場合に発熱や炎症
を誘発し、あるいはその抗原性によって好ましくない免
疫反応を生じさせるなどの副作用が問題となっていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記のとおり、ＩＬ−
１は多様な生理活性作用によって様々な疾患に対する治
療薬剤としての利用が期待される一方でその副作用が問
題となっている。このことはＩＬ−１が多様な生理活性
を担うペプチド部分と副作用に関連するペプチド部分と
が混在したポリペプチドであることによるものと考えら
れる。そこで、ＩＬ−１を構成する各ペプチド領域の作
用を特定することができれば、所望の生理活性のみを有
し、副作用のない薬剤が提供されるものと期待される。
１は多様な生理活性作用によって様々な疾患に対する治
療薬剤としての利用が期待される一方でその副作用が問
題となっている。このことはＩＬ−１が多様な生理活性
を担うペプチド部分と副作用に関連するペプチド部分と
が混在したポリペプチドであることによるものと考えら
れる。そこで、ＩＬ−１を構成する各ペプチド領域の作
用を特定することができれば、所望の生理活性のみを有
し、副作用のない薬剤が提供されるものと期待される。
【０００６】この発明は、以上のとおりの事情に鑑みて
なされたものであって、ＩＬ−１の様々な生理活性領域
から角膜上皮細胞の増殖促進作用を有するペプチド部分
を単離し、このペプチドを薬剤として提供することを目
的としている。
なされたものであって、ＩＬ−１の様々な生理活性領域
から角膜上皮細胞の増殖促進作用を有するペプチド部分
を単離し、このペプチドを薬剤として提供することを目
的としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、配列番号１のアミノ酸配列から
なり、角膜上皮細胞の増殖促進作用を有することを特徴
とするペプチドを提供する。またこの発明は、配列番号
１のアミノ酸配列からなるペプチド、その誘導体、その
薬理学的に許容される塩類、またはこれら２以上の混合
物を有効成分として含有することを特徴とする角膜上皮
損傷の治癒促進剤をも提供する。
を解決するものとして、配列番号１のアミノ酸配列から
なり、角膜上皮細胞の増殖促進作用を有することを特徴
とするペプチドを提供する。またこの発明は、配列番号
１のアミノ酸配列からなるペプチド、その誘導体、その
薬理学的に許容される塩類、またはこれら２以上の混合
物を有効成分として含有することを特徴とする角膜上皮
損傷の治癒促進剤をも提供する。
【０００８】なお、配列番号１は、公知のＩＬ−１αの
アミノ酸配列中に存在するテトラペプチドである。すな
わち、この配列番号１のアミノ酸配列は、ヒトＩＬ−１
α（Nature, vol.315, p642, 1985)の202-205番目アミ
ノ酸残基、マウスＩＬ−１α（Nature, vol.312, p460,
1985)の205-208番目アミノ酸残基、およびウシＩＬ−
１α（Nucleic Acids Research, vol .16, p9053, 198
8) の202-205番目アミノ酸残基にそれぞれ相当する。
アミノ酸配列中に存在するテトラペプチドである。すな
わち、この配列番号１のアミノ酸配列は、ヒトＩＬ−１
α（Nature, vol.315, p642, 1985)の202-205番目アミ
ノ酸残基、マウスＩＬ−１α（Nature, vol.312, p460,
1985)の205-208番目アミノ酸残基、およびウシＩＬ−
１α（Nucleic Acids Research, vol .16, p9053, 198
8) の202-205番目アミノ酸残基にそれぞれ相当する。
【０００９】
【発明の実施の形態】この発明のペプチドは、配列番号
１に記載したアミノ酸配列を有するテトラペプチドであ
って、例えば公知の固相ペプチド合成法（Jounal of Ch
emical Society Perkin I, 538, 1981）等によって化学
的に合成することができる。すなわちアミノ基およびカ
ルボキシル基を保護したアミノ酸の無水物を生成し、ペ
プチド鎖のＣ−末端のアミノ酸残基に相当するリジン
（Ｌys）無水物を樹脂に固定し、この樹脂を洗浄してＣ
−末端アミノ酸のアミノ保護基を除去する。次いで、ペ
プチド鎖のアミノ酸配列のＣ−末端の２番目のアミノ酸
残基に相当するロイシン（Ｌue）無水物を既に固定され
た１番目のアミノ酸のアミン基にカップリングさせる。
以下同様にして順次４番目までのアミノ酸を固定する。
全てのアミノ酸のカップリングが終了し、目的のアミノ
酸配列のペプチド鎖が形成されたのち、溶媒でアセトア
ミドメチル以外の保護基の除去およびペプチドの脱離を
行い、液体クロマトグラフィー等によりペプチドを精製
する。
１に記載したアミノ酸配列を有するテトラペプチドであ
って、例えば公知の固相ペプチド合成法（Jounal of Ch
emical Society Perkin I, 538, 1981）等によって化学
的に合成することができる。すなわちアミノ基およびカ
ルボキシル基を保護したアミノ酸の無水物を生成し、ペ
プチド鎖のＣ−末端のアミノ酸残基に相当するリジン
（Ｌys）無水物を樹脂に固定し、この樹脂を洗浄してＣ
−末端アミノ酸のアミノ保護基を除去する。次いで、ペ
プチド鎖のアミノ酸配列のＣ−末端の２番目のアミノ酸
残基に相当するロイシン（Ｌue）無水物を既に固定され
た１番目のアミノ酸のアミン基にカップリングさせる。
以下同様にして順次４番目までのアミノ酸を固定する。
全てのアミノ酸のカップリングが終了し、目的のアミノ
酸配列のペプチド鎖が形成されたのち、溶媒でアセトア
ミドメチル以外の保護基の除去およびペプチドの脱離を
行い、液体クロマトグラフィー等によりペプチドを精製
する。
【００１０】あるいはまた、この発明のペプチドは、Ｉ
Ｌ−１を酵素によって加水分解し、その活性成分をクロ
マトグラフィー等により分離・精製して得ることもでき
る。次に、この発明の角膜上皮損傷治癒促進剤は、上記
の方法によって生成したペプチド、その誘導体、薬理学
的に許容される塩類、またはこれらの２以上の混合物を
有効成分として製造することができる。このうち、ペプ
チドの誘導体は例えばＮ−末端をアミド化したもの、あ
るいはＯＨ−末端をエステル化したもの等であり、公知
の方法によって任意に生成することができる。また、薬
理学的に許容される塩類は、例えば、塩酸、臭化水素
酸、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸などの無機鎖酸、ある
いはギ酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸、シ
ュウ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、乳酸、リン
ゴ酸、クエン酸、サルチル酸等の有機酸等を用いて生成
することができる。
Ｌ−１を酵素によって加水分解し、その活性成分をクロ
マトグラフィー等により分離・精製して得ることもでき
る。次に、この発明の角膜上皮損傷治癒促進剤は、上記
の方法によって生成したペプチド、その誘導体、薬理学
的に許容される塩類、またはこれらの２以上の混合物を
有効成分として製造することができる。このうち、ペプ
チドの誘導体は例えばＮ−末端をアミド化したもの、あ
るいはＯＨ−末端をエステル化したもの等であり、公知
の方法によって任意に生成することができる。また、薬
理学的に許容される塩類は、例えば、塩酸、臭化水素
酸、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸などの無機鎖酸、ある
いはギ酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸、シ
ュウ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、乳酸、リン
ゴ酸、クエン酸、サルチル酸等の有機酸等を用いて生成
することができる。
【００１１】この発明の薬剤は、上記の有効成分の他
に、例えば薬理学的に許容される賦形剤や溶媒等を混合
して製剤化することができる。また、製剤化する場合の
上記有効成分の含有量は、10μg 〜 1000μg/ml程度と
することができる。以下、実施例を示してこの発明をさ
らに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例
に限定されるものではない。
に、例えば薬理学的に許容される賦形剤や溶媒等を混合
して製剤化することができる。また、製剤化する場合の
上記有効成分の含有量は、10μg 〜 1000μg/ml程度と
することができる。以下、実施例を示してこの発明をさ
らに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例
に限定されるものではない。
【００１２】
実施例１：ペプチドの合成例 ｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂoc）でアミノ基を保
護し、ベンジル基（Ｂzl）でカルボキシル基を保護した
Ｂoc−Ｌys（Ｂzl）−ＯＨをジメチルホルムアミド溶液
に溶解し、トリエチルアミンと共にポリマー樹脂に加
え、Ｂoc−Ｌys（Ｂzl）を樹脂に固定させたのち、トリ
フルオロ酢酸にてアミノ保護基を除去した。次いで、Ｂ
oc−Ｌue−ＯＨとジイソプロピルカルボジイミドを加
え、既に固定したＬysのアミノ基にＬueをカップリング
した。同様にして、Ｂoc−Ｌue−ＯＨ、Ｂoc−Ｖal−Ｏ
Ｈを順次結合し、樹脂上に目的とするテトラペプチドを
合成した。合成ののち、フッ素化水素によりペプチドを
樹脂から脱離し、逆相液体クロマトグラフィー（２回）
によりペプチドを精製した。
護し、ベンジル基（Ｂzl）でカルボキシル基を保護した
Ｂoc−Ｌys（Ｂzl）−ＯＨをジメチルホルムアミド溶液
に溶解し、トリエチルアミンと共にポリマー樹脂に加
え、Ｂoc−Ｌys（Ｂzl）を樹脂に固定させたのち、トリ
フルオロ酢酸にてアミノ保護基を除去した。次いで、Ｂ
oc−Ｌue−ＯＨとジイソプロピルカルボジイミドを加
え、既に固定したＬysのアミノ基にＬueをカップリング
した。同様にして、Ｂoc−Ｌue−ＯＨ、Ｂoc−Ｖal−Ｏ
Ｈを順次結合し、樹脂上に目的とするテトラペプチドを
合成した。合成ののち、フッ素化水素によりペプチドを
樹脂から脱離し、逆相液体クロマトグラフィー（２回）
によりペプチドを精製した。
【００１３】得られたペプチドの物理化学的性質は以下
のとおりであった。 (1) 性状：白色粉末 (2) 分子量：５２５ダルトン (3) 溶解性：水（生理食塩水）に可溶、エタノールに
不溶 また、得られたペプチド（50nmol）を 110℃で24時間、
６Ｎ塩酸にて加水分解し、アミノ酸分析計によりアミノ
酸組成を分析した。結果は以下のとおりである（数値は
モル比を示し、カッコ内は理論値を示す）。
のとおりであった。 (1) 性状：白色粉末 (2) 分子量：５２５ダルトン (3) 溶解性：水（生理食塩水）に可溶、エタノールに
不溶 また、得られたペプチド（50nmol）を 110℃で24時間、
６Ｎ塩酸にて加水分解し、アミノ酸分析計によりアミノ
酸組成を分析した。結果は以下のとおりである（数値は
モル比を示し、カッコ内は理論値を示す）。
【００１４】 Ｖal：0.91 (1) Ｌue：2.05 (2) Ｌys：1.03 (1) 実施例２：角膜上皮細胞に対する増殖作用の試験例 (1) 材料 ペプチドは実施例１で合成したペプチドを使用した。角
膜上皮細胞は以下の方法で調製したウサギ角膜上皮細胞
を使用した。
膜上皮細胞は以下の方法で調製したウサギ角膜上皮細胞
を使用した。
【００１５】ウサギ角膜片を単離し、実体顕微鏡下にて
角膜を上層と実質層に分け、上層を0.2%ディスパーゼ溶
液に入れ、37℃で45分間反応させたのち、上皮層を剥離
して細切し、0.1%トリプシン溶液内で15分間37℃にて反
応させたのち、15% 牛胎児血清含有の Dulbecco's modi
fied Eagles Mediumを加え、遠心分離（800rpm :４分間
×２回）して細胞を回収し、ＲＧＣＭ培養液（クラボウ
社製）にて３日間培養した。 (2) 試験方法 ＲＧＣＭ培養液中の細胞数が104個／mlとなるように調
整し、24ウエル培養プレートの各ウエルに分注したの
ち、ペプチドを表１の割合で添加し、5%CO2存在下、37
℃で４日間培養した。次いで、3Ｈ−チミジン（0.8μCi
/ウエル）を加えてさらに６時間培養したのち、細胞を
トリプシン処理し、セルハーベスターにより回収し、細
胞のＤＮＡ中に取り込まれた3Ｈ−チミジンからの放射
線量を液体シンチレーションカウンターで計測すること
によって角膜上皮細胞の増殖の程度を評価した。 (3) 結果 この試験の結果は表１に示したとおりであり、ペプチド
の添加量に依存してシンチレーション計測値が増加し、
ペプチド100μg/mlを添加した場合にはコントロール(0
μg/ml)に比較して3.1 倍もの増加が認められた。この
ような3Ｈ−チミジンの増加は、細胞複製による新たな
ＤＮＡ合成が多く生じていることを意味するものであ
り、この発明のペプチドが角膜上皮細胞に対して顕著な
増殖促進作用を有することが確認された。
角膜を上層と実質層に分け、上層を0.2%ディスパーゼ溶
液に入れ、37℃で45分間反応させたのち、上皮層を剥離
して細切し、0.1%トリプシン溶液内で15分間37℃にて反
応させたのち、15% 牛胎児血清含有の Dulbecco's modi
fied Eagles Mediumを加え、遠心分離（800rpm :４分間
×２回）して細胞を回収し、ＲＧＣＭ培養液（クラボウ
社製）にて３日間培養した。 (2) 試験方法 ＲＧＣＭ培養液中の細胞数が104個／mlとなるように調
整し、24ウエル培養プレートの各ウエルに分注したの
ち、ペプチドを表１の割合で添加し、5%CO2存在下、37
℃で４日間培養した。次いで、3Ｈ−チミジン（0.8μCi
/ウエル）を加えてさらに６時間培養したのち、細胞を
トリプシン処理し、セルハーベスターにより回収し、細
胞のＤＮＡ中に取り込まれた3Ｈ−チミジンからの放射
線量を液体シンチレーションカウンターで計測すること
によって角膜上皮細胞の増殖の程度を評価した。 (3) 結果 この試験の結果は表１に示したとおりであり、ペプチド
の添加量に依存してシンチレーション計測値が増加し、
ペプチド100μg/mlを添加した場合にはコントロール(0
μg/ml)に比較して3.1 倍もの増加が認められた。この
ような3Ｈ−チミジンの増加は、細胞複製による新たな
ＤＮＡ合成が多く生じていることを意味するものであ
り、この発明のペプチドが角膜上皮細胞に対して顕著な
増殖促進作用を有することが確認された。
【００１６】
【表１】
【００１７】実施例３：角膜上皮損傷に対する治癒促進
作用の試験例 (1) 材料 実施例１で合成したペプチドを100μg/mlおよび10μg/m
lの割合で生理食塩水に溶解し、各々、点眼薬Ａおよび
Ｂを調製した。また、市販のヒアルロン酸ナトリウム0.
3%溶液を点眼薬Ｃとして使用し、生理食塩水をコントロ
ールとした。 (2) 試験方法 １２匹のウサギを３匹づつ４群に分け、各ウサギの角膜
上皮層に直径７mmの穴を開けたのち、角膜上皮を剥離し
た。剥離直後から角膜上皮層に点眼薬Ａ、Ｂ、Ｃまたは
生理食塩水を１２時間間隔で２日間点眼し、点眼後の角
膜上皮層をフルオレセイン染色し、染色面積を画像解析
して創傷面積を計測した。 (3) 結果 この試験の結果は表２に示したとおりであり、この発明
のペプチドを含有する点眼薬ＡおよびＢを処置した角膜
上皮層は、ヒアルロン酸ナトリウムを含む点眼薬Ｃおよ
び生理食塩水を処置した群よりも有意に早く創傷面積が
縮小した。このことから、この発明のペプチドが角膜上
皮損傷に対して優れた治癒促進効果を有することが確認
された。
作用の試験例 (1) 材料 実施例１で合成したペプチドを100μg/mlおよび10μg/m
lの割合で生理食塩水に溶解し、各々、点眼薬Ａおよび
Ｂを調製した。また、市販のヒアルロン酸ナトリウム0.
3%溶液を点眼薬Ｃとして使用し、生理食塩水をコントロ
ールとした。 (2) 試験方法 １２匹のウサギを３匹づつ４群に分け、各ウサギの角膜
上皮層に直径７mmの穴を開けたのち、角膜上皮を剥離し
た。剥離直後から角膜上皮層に点眼薬Ａ、Ｂ、Ｃまたは
生理食塩水を１２時間間隔で２日間点眼し、点眼後の角
膜上皮層をフルオレセイン染色し、染色面積を画像解析
して創傷面積を計測した。 (3) 結果 この試験の結果は表２に示したとおりであり、この発明
のペプチドを含有する点眼薬ＡおよびＢを処置した角膜
上皮層は、ヒアルロン酸ナトリウムを含む点眼薬Ｃおよ
び生理食塩水を処置した群よりも有意に早く創傷面積が
縮小した。このことから、この発明のペプチドが角膜上
皮損傷に対して優れた治癒促進効果を有することが確認
された。
【００１８】
【表２】
【００１９】実施例４：角膜上皮細胞に対する伸長促進
作用の試験例 (1) 試験方法 ウサギの角膜を２×５mmに切断し、生理食塩水 (40μl)
または実施例１のペプチド（100μg/mlまたは10μg/m
l）を添加したＴＣ-199培養液中に加え、5%CO2インキュ
ベーター内で20時間培養した。培養後、上皮細胞をヘマ
トキシリン・エオジン染色し、切片の側面を下方に向か
って伸長した上皮細胞の長さを画像解析によって計測し
た。 (2) 結果 この試験の結果は表３に示したとおりであり、この発明
のペプチドを含む培養液中で培養した上皮細胞は、生理
食塩水を添加した場合に比較して有意に細胞を伸長させ
た。このことから、この発明のペプチドが角膜上皮細胞
に対して優れた伸長促進作用を有することが確認され
た。
作用の試験例 (1) 試験方法 ウサギの角膜を２×５mmに切断し、生理食塩水 (40μl)
または実施例１のペプチド（100μg/mlまたは10μg/m
l）を添加したＴＣ-199培養液中に加え、5%CO2インキュ
ベーター内で20時間培養した。培養後、上皮細胞をヘマ
トキシリン・エオジン染色し、切片の側面を下方に向か
って伸長した上皮細胞の長さを画像解析によって計測し
た。 (2) 結果 この試験の結果は表３に示したとおりであり、この発明
のペプチドを含む培養液中で培養した上皮細胞は、生理
食塩水を添加した場合に比較して有意に細胞を伸長させ
た。このことから、この発明のペプチドが角膜上皮細胞
に対して優れた伸長促進作用を有することが確認され
た。
【００２０】
【表３】
【００２１】実施例５：ペプチドの発熱作用の試験例 (1) 材料 実施例１で合成したペプチドを表４に示した割合で日局
生理食塩水10mlに溶解し、ペプチド試料とした。また、
生理食塩水のみをコントロールとした。 (2) 試験方法 ウサギにペプチド試料または生理食塩水を投与し、日局
一般試験法「発熱性物質試験法」に準じて体温上昇値を
測定した。 (3) 結果 この試験の結果は表４に示したとおりであり、この発明
のペプチドを投与したウサギには発熱症状は観察されな
かった。この結果から、この発明のペプチドは、ＩＬ−
１の主要な副作用である発熱作用を有していないことが
確認された。
生理食塩水10mlに溶解し、ペプチド試料とした。また、
生理食塩水のみをコントロールとした。 (2) 試験方法 ウサギにペプチド試料または生理食塩水を投与し、日局
一般試験法「発熱性物質試験法」に準じて体温上昇値を
測定した。 (3) 結果 この試験の結果は表４に示したとおりであり、この発明
のペプチドを投与したウサギには発熱症状は観察されな
かった。この結果から、この発明のペプチドは、ＩＬ−
１の主要な副作用である発熱作用を有していないことが
確認された。
【００２２】
【表４】
【００２３】実施例６：点眼剤の調製例 ホウ酸20 g、パラオキシ安息香酸メチル0.26 g、パラオ
キシ安息香酸プロピル0.14 gを滅菌精製水に加え、全体
を1000mlとした。この溶液に、実施例１で合成したペプ
チドを、100 μg/mlとなるように溶解して点眼剤を調製
した。
キシ安息香酸プロピル0.14 gを滅菌精製水に加え、全体
を1000mlとした。この溶液に、実施例１で合成したペプ
チドを、100 μg/mlとなるように溶解して点眼剤を調製
した。
【００２４】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、角膜上皮細胞の増殖および伸長促進作用を有
し、角膜上皮の損傷に対して優れた治癒促進作用を有す
るとともに、副作用等の危険性のないペプチドと、この
ペプチドを有効成分として含有する安全な薬剤が提供さ
れる。
よって、角膜上皮細胞の増殖および伸長促進作用を有
し、角膜上皮の損傷に対して優れた治癒促進作用を有す
るとともに、副作用等の危険性のないペプチドと、この
ペプチドを有効成分として含有する安全な薬剤が提供さ
れる。
【００２５】
配列番号：１ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Val-Lue-Lue-Lys
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１０年６月１９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】
【発明の実施の形態】この発明のペプチドは、配列番号
１に記載したアミノ酸配列を有するテトラペプチドであ
って、例えば公知の固相ペプチド合成法（Jounal of Ch
emical Society Perkin I, 538, 1981）等によって化学
的に合成することができる。すなわちアミノ基およびカ
ルボキシル基を保護したアミノ酸の無水物を生成し、ペ
プチド鎖のＣ−末端のアミノ酸残基に相当するリジン
（Ｌys）無水物を樹脂に固定し、この樹脂を洗浄してＣ
−末端アミノ酸のアミノ保護基を除去する。次いで、ペ
プチド鎖のアミノ酸配列のＣ−末端の２番目のアミノ酸
残基に相当するロイシン（Ｌeu）無水物を既に固定され
た１番目のアミノ酸のアミン基にカップリングさせる。
以下同様にして順次４番目までのアミノ酸を固定する。
全てのアミノ酸のカップリングが終了し、目的のアミノ
酸配列のペプチド鎖が形成されたのち、溶媒でアセトア
ミドメチル以外の保護基の除去およびペプチドの脱離を
行い、液体クロマトグラフィー等によりペプチドを精製
する。
１に記載したアミノ酸配列を有するテトラペプチドであ
って、例えば公知の固相ペプチド合成法（Jounal of Ch
emical Society Perkin I, 538, 1981）等によって化学
的に合成することができる。すなわちアミノ基およびカ
ルボキシル基を保護したアミノ酸の無水物を生成し、ペ
プチド鎖のＣ−末端のアミノ酸残基に相当するリジン
（Ｌys）無水物を樹脂に固定し、この樹脂を洗浄してＣ
−末端アミノ酸のアミノ保護基を除去する。次いで、ペ
プチド鎖のアミノ酸配列のＣ−末端の２番目のアミノ酸
残基に相当するロイシン（Ｌeu）無水物を既に固定され
た１番目のアミノ酸のアミン基にカップリングさせる。
以下同様にして順次４番目までのアミノ酸を固定する。
全てのアミノ酸のカップリングが終了し、目的のアミノ
酸配列のペプチド鎖が形成されたのち、溶媒でアセトア
ミドメチル以外の保護基の除去およびペプチドの脱離を
行い、液体クロマトグラフィー等によりペプチドを精製
する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】
【実施例】 実施例１：ペプチドの合成例 ｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂoc）でアミノ基を保
護し、ベンジル基（Ｂzl）でカルボキシル基を保護した
Ｂoc−Ｌys（Ｂzl）−ＯＨをジメチルホルムアミド溶液
に溶解し、トリエチルアミンと共にポリマー樹脂に加
え、Ｂoc−Ｌys（Ｂzl）を樹脂に固定させたのち、トリ
フルオロ酢酸にてアミノ保護基を除去した。次いで、Ｂ
oc−Ｌeu−ＯＨとジイソプロピルカルボジイミドを加
え、既に固定したＬysのアミノ基にＬeuをカップリング
した。同様にして、Ｂoc−Ｌeu−ＯＨ、Ｂoc−Ｖal−Ｏ
Ｈを順次結合し、樹脂上に目的とするテトラペプチドを
合成した。合成ののち、フッ素化水素によりペプチドを
樹脂から脱離し、逆相液体クロマトグラフィー（２回）
によりペプチドを精製した。
護し、ベンジル基（Ｂzl）でカルボキシル基を保護した
Ｂoc−Ｌys（Ｂzl）−ＯＨをジメチルホルムアミド溶液
に溶解し、トリエチルアミンと共にポリマー樹脂に加
え、Ｂoc−Ｌys（Ｂzl）を樹脂に固定させたのち、トリ
フルオロ酢酸にてアミノ保護基を除去した。次いで、Ｂ
oc−Ｌeu−ＯＨとジイソプロピルカルボジイミドを加
え、既に固定したＬysのアミノ基にＬeuをカップリング
した。同様にして、Ｂoc−Ｌeu−ＯＨ、Ｂoc−Ｖal−Ｏ
Ｈを順次結合し、樹脂上に目的とするテトラペプチドを
合成した。合成ののち、フッ素化水素によりペプチドを
樹脂から脱離し、逆相液体クロマトグラフィー（２回）
によりペプチドを精製した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１４】Ｖal：0.91 (1) Ｌeu：2.05 (2) Ｌys：1.03 (1) 実施例２：角膜上皮細胞に対する増殖作用の試験例 (1) 材料 ペプチドは実施例１で合成したペプチドを使用した。角
膜上皮細胞は以下の方法で調製したウサギ角膜上皮細胞
を使用した。
膜上皮細胞は以下の方法で調製したウサギ角膜上皮細胞
を使用した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Val-Leu-Leu-Lys
Claims (2)
- 【請求項１】 配列番号１のアミノ酸配列からなり、角
膜上皮細胞の増殖促進作用を有することを特徴とするペ
プチド。 - 【請求項２】 配列番号１のアミノ酸配列からなるペプ
チド、その誘導体、その薬理学的に許容される塩類、ま
たはこれら２以上の混合物を有効成分として含有するこ
とを特徴とする角膜上皮損傷の治癒促進剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9066445A JPH10265400A (ja) | 1997-03-19 | 1997-03-19 | ペプチドと薬剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9066445A JPH10265400A (ja) | 1997-03-19 | 1997-03-19 | ペプチドと薬剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10265400A true JPH10265400A (ja) | 1998-10-06 |
Family
ID=13315989
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9066445A Pending JPH10265400A (ja) | 1997-03-19 | 1997-03-19 | ペプチドと薬剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10265400A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2382963A1 (en) * | 2010-04-29 | 2011-11-02 | Cognis IP Management GmbH | Cosmetic composition containing oligopeptides |
-
1997
- 1997-03-19 JP JP9066445A patent/JPH10265400A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2382963A1 (en) * | 2010-04-29 | 2011-11-02 | Cognis IP Management GmbH | Cosmetic composition containing oligopeptides |
| WO2011134568A1 (en) * | 2010-04-29 | 2011-11-03 | Cognis Ip Management Gmbh | Cosmetic composition containing oligopeptides |
| CN102869339A (zh) * | 2010-04-29 | 2013-01-09 | 考格尼斯知识产权管理有限责任公司 | 含有低聚肽的化妆品组合物 |
| JP2013525388A (ja) * | 2010-04-29 | 2013-06-20 | コグニス・アイピー・マネージメント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | オリゴペプチド含有化粧品組成物 |
| US8815814B2 (en) | 2010-04-29 | 2014-08-26 | Cognis Ip Management Gmbh | Cosmetic composition containing oligopeptides |
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