DE2954675C2

DE2954675C2 - Verwendung von Polypeptiden zur Bekämpfung von Krebs

Info

Publication number: DE2954675C2
Application number: DE19792954675
Authority: DE
Inventors: Kumao Toyoshima; Akira Hakura; Toshihiro Nakanishi; Hajime Yoshizumi
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1978-10-09
Filing date: 1979-10-05
Publication date: 1991-07-18
Anticipated expiration: 1999-10-06
Also published as: US4427657A; US4287185A; JPS6058960B2; JPS5550897A

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Polypeptiden zur Bekämpfung von Krebs in Säugetieren. Die Polypeptide enthalten 45 Aminosäurereste und besitzen eine eigenartige tetracyclische Struktur. Sie sind mit 4-Disulfidbindungen zwischen jedem Cystein-Molekülpaar überbrückt, wobei die Paare zwischen den 3. und 39., 4. und 31., 12. und 29. bzw. 16. und 25. Stellungen vorhanden sind.

Aus den Druckschriften A. S. Mak u. B. L. Jones, Canadian Journal of Biochemistry, Vol. 22 (1976), Seiten 835 bis 843; Shoko Ohtami et al., Agr. Biol. Chem., 39 (1975), Seiten 2269 bis 2270 und Toshihiro Nakanishi et al., Gann 70 (Juni 1979), Seiten 323 bis 326 ist die toxische Wirkung von Purothioninen bekannt. Insbesondere kann der letzten Druckschrift entnommen werden, daß Purothionin-A wenig Einfluß auf Kontakt-inhibierte Zellen hat, jedoch selektiv die Zellen abtötet, die sich in der S-Phase befinden oder die durch ein Virus transformiert werden (vgl. Seite 326 und die Diskussion).

Die Verwendung der in Rede stehenden Polypeptide zur Bekämpfung von Krebs in Säugetieren kann diesen Druckschriften nicht entnommen werden.

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Polypeptids der folgenden Formel:

worin die Symbole Ala, Arg, Asn, Cys, Gln, Gly, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr bzw. Val die Reste von linksdrehenden Formen von Alanin, Arginin, Asparagin, 1/2-Cystin, Glutamin, Glycin, Leucin, Lysin, Phenylalanin, Prolin, Seri, Threonin, Tyrosin und Valin bedeuten und worin R₁ bis R₅ (1) die Reste der L-Aminosäuren Lysin, Asparagin, Leucin, Threonin und Asparaginsäure bedeuten oder (2) R₁ Arginin bedeutet, R₂ und R₅ Glycin bedeuten, R₃ Isoleucin bedeutet und R₄ Serin bedeutet, die Symbole "" -S-S- Bindungen bedeuten und die arabischen Zahlen, die in der Strukturformel nahe bei bestimmten Aminosäureresten auftreten die Sequenzzahl der Aminsäuren, ausgehend von dem N-Terminus, bedeuten, zur Bekämpfung von Krebs in Säugetieren.

Das erste Analoge der erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide (das im folgenden als SP₁ bezeichnet wird) enthält bzw. besteht aus 45 Aminosäureresten und besitzt die folgende primäre Strukturformel:

worin alle die Symbole der entsprechenden Aminosäurereste gleich sind, wie zuvor beschrieben. Dieses Analoge besitzt eine eigenartige tetracyclische Struktur und ist mit vier Disulfidbindungen zwischen jedem Cystein-Molekülpaar überbrückt, wobei die Paare zwischen den 3. und 39., 4. und 31., 12. und 29. bzw. 16. und 25. Stellungen vorhanden sind.

Das zweite Analoge der erfindungsgemäßen neuen Polypeptide (das im folgenden als SP₂ bezeichnet wird) enthält ebenfalls 45 Aminosäuremolekülteile und besitzt die folgende primäre Strukturformel:

worin alle die Symbole für die entsprechenden Aminosäurereste die gleiche Bedeutung, wie oben beschrieben, aufweisen. Dieses Analoge besitzt ebenfalls eine eigenartige tetracyclische Struktur und ist mit Disulfidbindungen auf gleiche Weise, wie das Analoge SP₁, überbrückt.

Diese zwei Analoge können durch die folgenden physikalischen und chemischen Parameter charakterisiert werden:

SP₁:
Aussehen: Farblos, nadelartige Kristalle
Isoelektrischer Punkt: ca. pH 10
Molekulargewicht (MW): 4913, berechnet aus der Aminosäuresequenz. Entsprechend dem Sedimentations-Gleichgewichtsverfahren wird das MW weiter auf 5500 geschätzt. Die letztere Bestimmung erfolgt, in dem man die Probe in 0,05 M tris-HCl-Puffer, der 6M Guanidin·HCl in einer Konzentration von 1 bis 5 mg/l enthält, löst und bei 17 600 Upm mit einer Spinco Model E Ultrazentrifuge (Beckman Co.) mißt.
Zahl der Aminosäuremoleküle: 45
Aminosäuresequenz:

Die Abkürzungen und Zahlen haben die gleichen Bedeutungen, wie oben angegeben.

Elementaranalyse:
Ber.: C 49,56; H 6,84; N 19,07; S 5,21;
Gef.: C 49,32; H 6,94; N 18,92; S 5,34.

Ultraviolettes Absorptionsspektrum (Fig. 3):
Im Bereich von 278 nm wird eine charakteristische Absorption beobachtet, die auf die Peptide zurückzuführen ist. Proben von 2 mg/l werden mit einem Hitachi Two Wave Double-Beam Spectrophotometer (Typ 356) gemessen.

Infrarotabsorptionsspektrum (Fig. 4):
Im Bereich von 1600 cm^-1 wird eine charakteristische Absorption, die auf die Peptide zurückzuführen ist, beobachtet (bestimmt mit einem Hitachi Lattice Infrarot-Spectrophotometer).

Aminosäurezusammensetzung:
Diese Ergebnisse sind in Tabelle I aufgeführt. Die Proben werden mit 6N HCl bei 110°C in einem evakuierten abgeschmolzenen Rohr hydrolysiert und mit einem Aminosäureanalysator (Typ JLC 5 AH von Nippon Denshi Co., Ltd.).

Tabelle I

Gelelektrophorese:
Es wird eine einzige Bande bei der Polyacrylamidscheiben- Elektrophorese beobachtet. Diese Messung erfolgte in 7,5% Polyacrylamid-Gel bei pH 9,4 und 4,0. Die obere Elektrode ist mit der Anode verbunden und die Elektrophorese wird bei 25 mA/cm² bei 50 min bei Zimmertemperatur durchgeführt. Das Gel wird mit 0,02% Coomassie Brillantblau R angefärbt und dann mit 10%iger Trichloressigsäure entfärbt.

SP₂:
Molekulargewicht: 4812 (aus dem Ergebnis der Aminosäuresequenz). Jedoch wird das MW nach dem Sedimentationsgleichgewichtsverfahren auf 5500 geschätzt, wobei dieses Verfahren, wie bei SP₁ beschrieben, mit einer Ultrazentrifuge durchgeführt wird.
Zahl der Aminosäuremoleküle:
Aminosäuresequenz:

Die Abkürzungen und Zahlen besitzen die gleichen Bedeutungen, wie oben aufgeführt.

Elementaranalyse:
Ber.: C 49,34; H 6,94; N 19,77; S 5,32;
Gef.: C 49,21; H 6,52; N 19, 92; S 4,92.

Ultraviolettabsorptionsspektrum (Fig. 3):
In der Nachbarschaft von 278 nm wird eine charakteristische Absorption, die auf die Peptide zurückzuführen ist, beobachtet.

Infrarotabsorption (Fig. 4):
In der Nachbarschaft von 1600 cm^-1 wird eine charakteristische Absorption, die auf die Peptide zurückzuführen ist, beoabachtet.

Aminosäurezusammensetzung:
Die Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben. Die Analyse erfolgt auf gleiche Weise, wie oben bei Tabelle I beschrieben.

Tabelle II

Gelelektrophorese:
Bei der Polyacrylamidscheiben-Elektrophorese beobachtet man eine einzige Bande.

Aus den obigen Ergebnissen folgt, daß sich SP₁ und SP₂ beide physikalisch und chemisch sehr ähneln und somit ist eine Trennung der beiden voneinander aus einem Gemisch ohne Chromatographie mit einem kationenaustauschbaren Absorbens, wie Carboxymethyl-(CM)cellulose, schwierig.

SP₁ und SP₂ und ihre Analogen sind in Gerste und Weizen weit verbreitet.

Ein beispielhaftes Verfahren für die Herstellung von SP wird im folgenden erläutert.

4 kg Weizenmehl werden in 20 l 0,05N H₂SO₄ suspendiert und bei 30°C 3 h gehalten. Nach Entfernung des Niederschlags durch Zentrifugieren (3000 Upm, 10 min, Zimmertemperatur) wird die überstehende Lösung mit 10N NaOH neutralisiert und 12 h bei 50°C stehengelassen. Der entstehende Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt und die überstehende Lösung wird an einer CM-Cellulosesäule (2,5×80 cm), equilibriert mit 0,05M Phosphatpuffer, pH 7,2, chromatographiert und mit einem linearen Gradienten von 0,1 bis 0,8M NaCl in dem gleichen Puffer (700 ml in jedem Reservoir) bei Zimmertemperatur eluiert. Die Strömungsrate wird durch die Absorption bei 280 nm verfolgt. Gegebenenfalls wird das Eluat wieder in einer ähnlichen Säule (1,5×75 cm) chromatographiert und dann lyophilisiert. Ausbeute 120 mg.

120 mg des obigen getrockneten Materials werden auf eine CM- Cellulosesäure (3,1×33 cm), gepuffert mit 0,2M Ammoniumbicarbonatlösung, gegeben und dann mit einem Gradienten von 0,2 bis 0,8M Ammoniumbicarbonatlösung mit einer Geschwindigkeit von 66 ml/h eluiert. Das Eluat wird dann in jeweils 13 ml-Fraktionen fraktioniert, wobei jede durch die Absorption bei 280 rm analysiert wird. Man erhält so zwei Arten von Absorptionsfraktionen, die Fraktionen 63 bis 75 bzw. 80 bis 89.

Die Beispiele und die Zeichnungen erläutern die Erfindung näher.

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der Zellzahlen gegenüber der Züchtungszeit in Stunden für Zellen im Zustand einer Kontaktinhibierung.

Fig. 2A zeigt die Körpergewichte von Mäusen, die gegen die Zahl der Tage nach der Inokulation dargestellt sind.

Fig. 2B zeigt die Zahl der überlebenden Mäuse, die gegen die Zahl der Tage nach der Inokulation dargestellt ist.

Fig. 3 zeigt die ultravioletten Spektren von SP₁ und SP₂.

Fig. 4 zeigt die Infrarotspektren von SP₁ und SP₂.

Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, neue karzinostatische Mittel zur Verfügung zu stellen, die die oben beschriebenen neuen Polypeptide enthalten.

Es wurde bereits berichtet, daß bestimmte saure Peptide aus einigen Mikroorganismen Antitumoreigenschaften aufweisen. Beispielsweise haben Beerman et al (1977) kürzlich berichtet, daß Neokarzinostatin, dessen Aminosäuresequenz von Meinhofer et al (1972) bestimmt wurde, als Inhibitor gegen die Zellteilung wirkt, indem es sich mit den DNA-Doppelketten der Zellen verbindet und dann die Kette schneidet.

Andererseits wurde beobachtet, daß Tumorzellen sich in einigen Eigenschaften von normalen Zellen unterscheiden. Als besonders charakteristisches Merkmal der Tumorzellen soll die Abnahme in der Kontaktinhibierungsfähigkeit und die Variation in den Zellmembranen zusammen mit anderen Symptomen erwähnt werden. Beispielsweise kann ein Unterschied zwischen Tumorzellen und normalen Zellen durch in vitro-Kultivation beobachtet werden. Bei der letzteren wird das Wachstum der Zellen aufhören, wenn sie gewachsen sind und sich monolaminar an der Innenbodenfläche der Schale angeordnet haben. Im Gegensatz dazu wird bei den ersteren das Wachstum der Zellen nicht aufhören und geht weiter ohne Grenze über die monolaminare Stufe ohne solche Stagnation. Eines der charakteristischen Merkmale von Tumorzellen ist ihr grenzenloses Wachstum. Man kann daher annehmen, daß bei Tumorzellen ein wiederholter Zyklus von Zellwachstum beobachtet wird, der sich von dem normaler Zellen unterscheidet, und im Wachstum von Tumorzellen tritt somit der folgende Zyklus auf:

G₁: Vorbereitungsphase für die DNA-Synthese (Phase für die Prä-DNA-Synthese)
S: Phase für die DNA-Synthese
G₂: Vorbereitungszeitpunkt für die Segmentation (Phase für die Nach-DNA-Synthese)
M: Segmentationsphase
G₀: Stagnierende Phase der Segmentation

Dieser Zyklus geht mit Sicherheit durch die Phase für die DNA- Synthese.

Wie es von Ben-Or et al (Nature, 188, 1200; 1961) und anderen Forschern gezeigt wurde, ändert sich in der Oberfläche der Zellmembran (Oberflächenschicht) die Oberfläche hinsichtlich ihrer Ladungsdichte und wird stark negativ geladen, wenn die Zellen, insbesondere die Leberzellen, wachsen. Im Gegensatz dazu kann man annehmen, daß die Ursache für die Erhöhung in der Ladungsdichte auf der Oberfläche der Tumorzellen eine Beschleunigung der Vervielfältigungsfunktion (insbesondere der DNA-Synthesefunktion) ist.

Die Umwandlung der normalen Zellen in Tumorzellen kann durch einen Virus verursacht werden und weniger durch physiko-chemische Faktoren, wie chemische Substanzen, ultraviolette Strahlung, usw. Bei Zellen, die sich zu Tumorzellen durch Infektion mit einem Tumorvirus geändert haben, ist im allgemeinen erkennbar, daß ihre Oberflächenladungsbedingung negativer wird und daß sich ihre Oberflächenstruktur so ändert, daß sich die Zellen stark vervielfältigen; in anderen Worten, ein Zustand auftritt, der ähnlich ist wie der der 5-Phase in dem Zellzyklus. In der Tat wurde über einige karzinostatische Verbindungen berichtet, auf die solche Merkmale der Tumorzellen offensichtlich zutreffen. Als typische Verbindung unter diesen besitzt Poly-DL-Lysin (durchschnittlicher Polymerisationsgrad 240) eine anerkannt karzinostatische Wirkung.

Die Anmelderin hat Untersuchungen hinsichtlich der physiologischen Wirkungen neuer Polypeptide SP₁ und SP₂ (die allgemein als SP bezeichnet werden) durchgeführt. Die Verbindungen wurden, wie oben beschrieben, aus Weizenkörnern isoliert und ihre chemische Struktur wurde bestimmt. Es wurde gefunden, daß dieses SP eigenartig und selektiv bei Tierzellen bei der S-Phase (DNA-Synthesephase) wird und daß es Zellen tötet. Gegenüber anderen Zellen zeigt es zu irgendeinem Zeitpunkt, ausgenommen in der S-Phase, eine schwache Wirkung. Insbesondere wirkt SP nicht gegen normale Zellen im Zustand der Kontaktinhibierung.

Viele Zellen, die Tiergewebe enthalten, können allgemein als in der G_o-Phase angesehen werden. Das erfindungsgemäße SP ist gegenüber Zellen in der Segmentationsphase (Tumorzellen) in lebenden Körpern tödlich. Diese Verbindung beeinflußt normale Zellen im Zustand einer Kontaktinhibierung nicht. Überraschenderweise wurde gefunden, daß die neuen Grundproteine sehr selektiv sind und in besonderer Weise auf Zellen, die in einem speziellen Zustand vorliegen, einwirken und sie abtöten, so daß ein weiteres Tumorwachstum zum Stillstand gebracht oder inhibiert wird.

Insbesondere zeigt SP eine starke Zelltötungswirkung nur gegenüber Zellen in der Multiplikationsphase. Da es gut bekannt ist, daß eine Ähnlichkeit zwischen der Multiplikation von Tumorzellen und der von Tierzellen besteht, läßt die Tatsache, daß SP gegenüber Zellen in der S-Phase tödlich ist, die Möglichkeit zu, daß diese Substanz zur Bekämpfung von Krebs in Säugetieren verwendet werden kann. Diese Vermutung wird durch die in vivo-Versuche mit krebskranken Tieren bestätigt.

SP weist eine besondere Wirkung gegenüber Tierzellen innerhalb der Phase der DNA-Synthese und gegen virusinfizierte Zellen oder transformierte Zellen auf, die Grundlage, daß diese Substanz zur Bekämpfung von Krebs in Säugetieren verwendet werden kann. Diese Annahme wurde durch in vivo-Versuche gegenüber EAC (Ehrlich Ascites Carcinoma), Sarcoma 180A und lymphocytische Leukemia L 1210 der Maus bewiesen. Man beobachtete nämlich eine ausgeprägte Inhibierung gegenüber der Vervielfältigung der Tumorzellen von EAC bei einer Dosis von 1 bis 2,5 mg/kg SP. Weiterhin beobachtete man eine sichtbare Überlebungswirkung gegenüber Sarcoma 180A und lymphocytische Leukemia L 1210 bei einer Dosis von 0,5 bis 3 mg/kg SP.

Im folgenden werden die typischen Versuchsergebnisse erläutert, aus denen die obigen Erkenntnisse hauptsächlich abgeleitet wurden. Weiterhin werden die akuten Toxizitätsuntersuchungen von SP angegeben. Da die Wirkung und das Verhalten von SP₁ und SP₂ fast gleich sind, gelten die Werte und Tatsachen, die SP₁ betreffen, ebenfalls für SP₂.

(1) Eigenartiger Einfluß von SP auf einen Tierzellenzyklus (1a) Versuchsmaterialien

Zellen: A₃₁-Zellen (ein Clon, der von einem Mäuse-BALB/C (Stamm) stammt).
Kulturmedium: Adler-NEM, zu dem man 10%iges Rinderfetalserum zugegeben hatte.
Mittel: SP, das als Lösung in Phosphatpuffersalzlösung verwendet wurde (PBS).

(1b) Versuchsverfahren

Zur Synchronisierung des Zellzyklus werden die A₃₁-Zellen zuerst inkubiert, so daß eine Kontaktinhibierung verursacht wird. Dann wird ein Teil der Zellen mit Trypsin behandelt und eine festgesetzte Zahl der Zellen wird auf Kunststoffplatten ausgestrichen. Danach wird das Mittel dazu in einem Verhältnis von 4 μg oder 6 μg zu 1 ml Medium alle 4 h gegeben und die Zahl der lebenden Zellen (die durch Anfärben differenziert wurden), die DNA-Synthese und die Zahl der Metaphasezellen wird von Zeit zu Zeit bestimmt.

Zusätzlich zu diesem Versuch erfolgt die Messung der Menge an DNA zu jeder Stufe des Zellzyklus mittels eines Scintillationszählers (Beckman Typ LS 350). Diese Messung von DNA erfolgt, indem man 0,3 μci (3H)-Thymidin pro Platte zugibt, die Thymidinaufnahme innerhalb von 4 h mit einen Scintillationszähler zählt und mit der Menge an synthetisiertem Thymidin vergleicht. Die Zahl der lebenden Zellen wird nach dem Anfärben mit 0,05 ml 8% Neutralrot pro Platte berechnet, indem man mit Trypsin dispergiert, in PBS suspendiert und die Zahl der angefärbten Zellen (wobei die angefärbten als lebende Zellen betrachtet wurden) mit einem Türk-Bürker-Berechnungsgerät bzw. einer -Platte berechnet.

(1c) Ergebnis

Das Ergebnis dieses Versuchs ist in der beigefügten Fig. 1 dargestellt. Wie erläutert, bewirkt die Zugabe von 6 oder 12 μg/ml SP zu den Zellen während der DNA-Synthesephase nach 12 Std. von der Freigabe der Kontaktinhibierung den Tod der getesteten Zellen, sie beeinflußt jedoch nicht die Zellen innerhalb der G₁-Phase, solange nicht 12 h von der Freigabe der Kontaktinhibierung vergangen sind. Der Einfluß von SP wird schwach hinsichtlich der Zellen bei der G₂- oder M- Phase, die durch die S-Phase durchgegangen sind. Andererseits muß bemerkt werden, daß der Tod von Zellen, die in einer Kontaktinhibierungsart vorliegen, nicht nachgewiesen werden kann. Aus diesem Ergebnis ist offensichtlich, daß SP einen besonderen Einfluß gegenüber Zellen in der S- Phase besitzt und sie tötet.

Normalerweise werden im Verlauf der Zellenvervielfältigung bzw. Zellenmultiplikation vier Phasen, wie

wiederholt. Die Zellen stehen jedoch miteinander in Kontakt als Ergebnis dieser Multiplikation und können somit in den Zustand der Kontaktinhibierung eintreten. Man kann annehmen, daß SP die normalen Zellen nicht beeinflußt, sondern selektiv Tumorzellen während der S-Phase angreift. Diese Tatsache läßt weiter den Schluß zu, daß SP als eigenartiger Inhibitor gegen den Zellzyklus verfügbar ist, und daß es weiterhin als biologisches Mittel, d. h. als Synchronisierungsmittel für die Kultivation von Zellen, verwendet werden kann.

(2) Einfluß von SP auf transformierte Zellen (2a) Versuchsmaterialien

Zellen: A₃₁-Zellen (wie oben erwähnt), LP₁₄, PV 4 (Transformat von A₃₁ durch Polyoma-Virus).
Kulturmedium: gleich, wie bei (1a) oben beschrieben.
Mittel: gleich, wie bei (1a) oben beschrieben.

(2b) Versuchsverfahren

8,3×10⁴ individuelle Zellen pro Platte werden in einem Medium gleichzeitig unter Zugabe von SP in einer Menge von 2 μg pro ml Kultur dispergiert. Die Inkubation wird während 3 Tagen bei 37°C fortgeführt und dann wird das Kulturmedium durch ein neues ersetzt. Anschließend wird die gleiche Menge an SP zu dem Medium zugegeben und dann wird weitere 4 Tage inkubiert. Die Endkultur wird mit Trypsin dispergiert und in PBS suspendiert. Die Zahl der Zellen wird, wie oben unter (1a) beschrieben, berechnet.

(2c) Ergebnis

Das Ergebnis ist in der folgenden Tabelle III aufgeführt.

Tabelle III

(3) tödlicher Einfluß auf die mit Viren infizierten Zellen (3a) Versuchsmaterial

Zellen: gleich, wie bei (1a) oben beschrieben.
Viren: Murine Leukemia-Virus (Mo-LuLV), ein Molony-Stamm der Maus.
Kulturmedium: Adler-MEM mit 5% Fetalrinderserum.
Mittel: gleich, wie oben bei (1a) beschrieben.

(3b) Versuchsverfahren

3×10⁵ indivuduelle A₃₁-Zellen werden in dem Medium dispergiert, das gleichzeitig mit MuLV infiziert wird. Man inkubiert während 5 Tagen bei 37°C. Nach der Kontaktinhibierung, die auftritt, was mikroskopisch bestätigt wird, werden 10 μg/ml SP zu der Kultur zugegeben und die Inkubation wird weitere 4 h fortgeführt. Dann werden die Zellen mit Neutralrot angefärbt (die Endkonzentration beträgt 0,4%) und die Zahl der lebenden Zellen wird mit einem Türk-Bürker Kalkulationsgerät berechnet, verglichen mit den mit Virus infizierten A₃₁-Zellen (wobei die angefärbten Zellen als Parameter für die lebenden Zellen genommen wurden).

(3c) Ergebnis

Das Ergebnis ist in der folgenden Tabelle IV aufgeführt.

Tabelle IV

(4) Karzinostatische Einwirkung auf Tiere (4a) Versuchsmaterialien

Tier: Maus (Schweizer Albino)
Zellen: Ehrlich Ascites Carcinoma-Zellen (EAC)

(4b) Versuchsverfahren

Eine Reihe von Schweizer Albino-Mäusen (männlich, mittleres Körpergewicht 21,6 g, Alter 5 bis 6 Wochen) wird in 6 Gruppen geteilt. Jede Gruppe umfaßt 6 Mäuse und jede Maus wird intraperitoneal mit 0,1 ml Tumorzellensuspension inokuliert. Die Suspension enthält 3,5×10⁷ individuelle Tumorzellen/ml und wird hergestellt, indem man Asciten mit PBS verdünnt, das aus einer krebskranken Maus stammt, wobei die Entnahme 7 Tage nach der Inokulation mit EAC erfolgte. Vom nächsten auf die Inokulation folgenden Tag an werden 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 bzw. 3,0 mg/kg/0,2 ml SP intraperitoneal während 7 Tagen Tag für Tag verabreicht. Die Asciten, die sich 8 Tage nach der Inokulation entwickeln, werden gesammelt und das Zellverhältnis (T/C%) wird berechnet.

(4c) Ergebnis

Das Ergebnis dieses Versuchs ist in Tabelle V zusammengefaßt.

Tabelle V

Wie aus Tabelle V folgt, ist es offensichtlich, daß SP gegenüber dem Wachstum von Tumorzellen bei einer Dosis über 2,0 mg/kg gegenüber EAC der Maus hochaktiv ist.

(4′a): Versuchsmaterialien

Tier: Maus (ICR-Stamm, weiblich, mittleres Körpergewicht 23,0 g, 5 Wochen alt).
Zellen: Sarcoma 180A-Zellen.

(4′b): Versuchsverfahren

6 Mäuse werden zu einer organisierten Gruppe organisiert und jede Maus wird intraperitoneal mit 0,1 ml der Tumorzellsuspension inokuliert. Die Suspension enthält 1×10⁸ individuelle Versuchstumorzellen/ml. Vom Tag der Inokulation an werden 0,5 mg/kg Körpergewicht SP intraperitoneal 5mal täglich verabreicht.

(4′c) Ergebnis

Das Ergebnis ist in der beigefügten Fig. 2 dargestellt. Wie erläutert, ist die Abnahme im Körpergewicht der Versuchsmaus gering oder nimmt sogar ab, während die Verabreichung von SP weitergeführt wird. Nachdem die Verabreichung einmal beendigt wird, beobachtet man eine plötzliche Erhöhung des Körpergewichts und dann den gesamten Tod der Gruppe 31 Tage von dem Datum der Krebserzeugung. Im Gegensatz dazu beobachtet man bei der Kontrollgruppe, der kein SP verabreicht wurde, eine plötzliche Erhöhung des Körpergewichts und die Tiere starben alle 17 Tage nach der Krebserzeugung. Es ist daher eindeutig, daß SP eine ausgeprägte karzinostatische Wirkung gegen Tumorzellen von Sarcoma 180A aufweist.

(5) Akute Toxizität der Maus (5a): Versuchsmaterial

Tier: Maus (CF#1, Schweizer Albino und BDF₁)

(5b) Versuchsverfahren

CF#1 (männlich, mittleres Körpergewicht 26,2 g, 5 Wochen alt), Schweizer Albino (männlich, mittleres Körpergewicht 21,5 g, 5 bis 6 Wochen alt) und BDF₁ (weiblich, mittleres Körpergewicht 20,5 g, 5 bis 6 Wochen alt) - Mäuse werden in 4 Gruppen geteilt. Jede Gruppe umfaßt 6 Mäuse und bestimmte Mengen an SP, jeweils gelöst in 0,2 ml PBS, werden in das Intraperitoneum injiziert.

(5) Ergebnis

Das Ergebnis ist in Tabelle VI dargestellt. Die LD₅₀ von SP scheint etwa 3,5 mg/kg zu betragen. Dieser Wert sieht klein aus (d. h. die Toxizität von SP ist virulent) aber er ist fast gleich wie der von Neocarzinostatin (mit 109 Bestandsaminosäuren), das bereits als karzinostatisches Mittel klinisch verwendet wird. Da die verbleibende Toxizität von SP gering ist, ist, nachdem die Verabreichung beendigt wurde, der letzte Zustand der überlebenden Mäuse ähnlich dem normaler Mäuse. Man beobachtet keine chronische Toxizität.

Aus den obigen Ergebnissen folgt, daß die geeignete Dosis von SP nicht über 2,5 mg/kg liegen muß und bevorzugt 0,3 bis 1,0 mg/kg/Tag beträgt. Eine solche Dosis kann für längere Verabreichung mehrmals unterteilt werden.

Tabelle VI

Bei der Verwendung von SP zur Bekämpfung von Krebs in Säugetieren kann es in einheitlicher Form aus entweder reinem oder rohem SP₁ oder SP₂ oder als Gemische dieser Verbindungen verwendet werden. Die Verabreichung von SP kann durch Injektion, wie durch intravenöse, intramuskulare oder subkutane Injektion, oder durch orale Verabreichung in Form von Lösungen, Tabletten, Granulat, Lutschbonbons oder Mundeinlagen oder auf ähnliche Weise oder durch perkutane Verabreichung in Form von Suppositorien für die Vagina oder für den Anus oder als Salbe für die Haut erfolgen. Für Injektionszwecke ist es natürlich besser, das SP so weit wie möglich zu reinigen. Für diese pharmazeutischen Zubereitungen können irgendwelche pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel, Bindemittel, Verdickungsmittel, wie Vehicel und ähnliche, verwendet werden, die zweckdienlich für die Verarbeitung von Pharmazeutika verwendet werden. Alle diese Verbindungen kann man bei der Kompundierung von SP einsetzen. Nichttoxische Träger, wie flüssige Fette, sind für die Herstellung von SP- Suspensionen für Injektionszwecke geeignet.

SP kann in ein Säureadditionssalz mit einer physiologisch annehmbaren Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Bernsteinsäure und Glutarsäure oder ähnliche Säuren überführt werden.

Allgemein gesagt, liegt die geeignete Dosis von SP im Bereich von 0,5 bis 2,0 mg/kg Körpergewicht/Tag. Es ist offensichtlich, daß diese Dosen nicht beschränkend sein und die Dosismenge sollte daher in Abhängigkeit von dem Verfahren und/oder der Form der Verabreichung variiert werden.

Fig. 1 und 2, die, wie oben erwähnt, im Zusammenhang mit den Versuchen 1 und 4′ stehen, zeigen (1) das Verhalten von SP gegenüber jeder Stufe von A₃₁-Zellen, (2) die Überlebungswirkung und die Wirkung gegenüber der Erhöhung des Körpergewichts der krebskranken Maus, verursacht durch Vervielfältigung der Tumorzellen mit Sarcoma 180A (A ist der Anstieg und das Abfallen des mittleren Körpergewichts, B ist der Prozentgehalt an überlebenden Tieren). Fig. 3 und 4 wurden bereits oben erläutert.

Claims

1. Verwendung eines Polypeptids der folgenden Formel: worin die Symbole Ala, Arg, Asn, Cys, Gln, Gly, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr bzw. Val die Reste von linksdrehenden Formen von Alanin, Arginin, Asparagin, 1/2-Cystin, Glutamin, Glycin, Leucin, Lysin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tyrosin und Valin bedeuten und worin R₁ bis R₅ (1) die Reste der L-Aminosäuren Lysin, Asparagin, Leucin, Threonin und Asparaginsäure bedeuten oder (2) R₁ Arginin bedeutet, R₂ und R₅ Glycin bedeuten, R₃ Isoleucin bedeutet und R₄ Serin bedeutet, die Symbole "" -S-S- Bindungen bedeuten und die arabischen Zahlen, die in der Strukturformel nahe bei bestimmten Aminosäureresten auftreten, die Sequenzzahl der Aminosäuren, ausgehend von dem N-Terminus, bedeuten, zur Bekämpfung von Krebs an Säugetieren.

2. Verwendung eines Polypeptids der folgenden Formel: worin alle Symbole und Zahlen die gleiche Bedeutung wie in Anspruch 1 aufweisen, zur Bekämpfung von Krebs in Säugetieren.

3. Verwendung eines Polypeptids der folgenden Formel: worin alle Symbole und Zahlen die gleiche Bedeutung wie in Anspruch 1 aufweisen, zur Bekämpfung von Krebs in Säugetieren.