JPH02164900A - ヒト上皮細胞形質転換成長因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はヒト上皮細胞形質転換成長因子（以下、ｈ　　
ＴＧＦｅという）、有効量のｈ−ＴＧＦｅおよび医薬上
許容される担体または賦形剤よりなる医薬組成物、有効
量のｈ−ＴＧＦｅをそれを必要とするヒトに投与するこ
とによって該ヒトにおいて上皮細胞の増殖を刺激する方
法、ｈ−ＴＧＦｅの製法およびｈ−ＴＧＦｅの精製法に
関する。

発明の背景 ［形質転換成長因子（ＴＦＧ）Ｊと指称される多数の生
物学的に活性なポリペプチドが、適当な指標細胞の器壁
非依存性増殖を促進するそれらの能力によって同定、単
離されている。例としては、ＴＧＦ−（ｙ（マーカート
ら（Ｍａｒｑｕａｒｄｔ　ｅｔ　ａｌ、）、Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　）、ＵＳＡＸ
　８２，１１９〜１２３　（１９８５）］にもかかわら
ず、ＴＧＦ活性を検出するバイオアッセイにおける線維
芽細胞の使用の結果、主として間葉細胞に対して活性な
分子を発見する傾向がある。

ハルパーら０１ａｌｐｅｒ　ｅｔ、　ａｌ、）、キャン
サー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、
４３，１９７２−１９７９　（＋９８３）は、副腎皮質
のヒト腺癌白米のＳＷ１３細胞は低細胞密度で軟寒天中
に浮遊させると、少数の小さいコロニーしか形成しない
が、該コロニーの数およびサイズは、ＳＷＩ３細胞によ
って馴化された血清無しの培地で刺激すると、劇的に増
加することを報告しており、ハルパーらはかかる増加は
それらの悪性細胞における自動刺激の可能性を示すと主
張している。また、ハルパーら（Ｈａｌｐｅｒ　ａｔ、
　ａｌ、）は、３種のヒト癌細胞系（Ａ４３１．Ｄ５６
２およびＡ３４９）からの酸性エターノール抽出物およ
び馴化培地はＳＷ１３細胞を刺激して軟寒天中で次第に
増殖するコロニを形成せしめたことを報告している。ヒ
ト癌のサンエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２３，１０７
９−１０８３（１９７６）、表皮細胞成長因子に非常に
類縁の分子、およびＴＧＦ−β［７０リツクら（Ｆｒｏ
ｌｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、）、プロシーディングズ・オブ
・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　　ＵＳ
Ａ、　８０．３６７６−３６８０　（１９８３）］　、
ＴＦＧ−αから区別される物質、ならびに他の公知の成
長因子が挙げられる。これらのＴＧＦの活性を測定する
のに用いる指標細胞は線維芽細胞起源である（ＴＧＦ−
αおよびβについてはＮＨＫ−４９Ｆラツト腎臓線維芽
細胞、およびＴＧＦ−βのみについてはＡＫＲ−２Ｂマ
ウス胚線維芽細胞）。ＴＧＥ−σは哺乳動物上皮細胞の
増殖を刺激し［ペロトら（Ｐｅｒｒｏｔｅａｕ　ｅｔ　
ａｌ、）、アンティキャンサー・リサーチ（Ａｎｔｉｃ
ａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、６，３３９　（１９
８６）］、またＴＧＦ−βは多数の上皮細胞系の増殖を
抑制することが示されている［ロバーツら（Ｒｏｂｅｒ
ｔｓ　ｅｔ　ａｌ、）、プロシーディングズ・オブ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（酸性エタ
ーノール抽出物の活性成分の予備的キャラクタライゼー
ションにより、該活性成分は酸性であり、熱安定性であ
り、トリプシンまたはジチオスレイトールに対して感受
性であり、２０〜２２キロダルトンの見掛は分子質量を
有しており、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　
Ｃ）によってＴＧＦ−αまたはβ−様活性物から分離し
得ることが示された。酸性エターノール抽出物由来物質
の効果を模擬する活性が、新たに切り出したヒト癌３２
のうち２６（８０％）の酸性エターノル抽出物で検出さ
れたが、９の非−癌性腫瘍のうちただ１つで検出された
にすぎない。加えて、酸性エターノール抽出物由来物質
の効果を模擬する活性が非−腫瘍性ヒトおよびウシ腎臓
の抽出物で、およびそれよりも程度が低いがヒト肺およ
びマウス胚で検出された。ハルパーら（Ｈａｌｐｅｒ　
ａｔ、　ａｌ、）は該酸性エターノール抽出物由来物質
は上皮細胞起源であると主張している。

ハルパーら（Ｈａｌｐｅｒ　ｅｔ、　ａｌ、）は、キャ
ンサリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、４
７，４５５２−４５５９　（１９８７）、ウシ腎臓の酸
性エターノール抽出物から単離した形質転換成長因子の
精製およびキャラクタライゼーションを開示し、かかる
ウシ由来物質は（ａ）ＳＷ１３細胞のごときある種の上
皮細胞系；２種のヒト偏平細胞癌細胞系、Ａ４３１およ
びＤ５６２；マウス胚ＡＫＲ−２Ｂ細胞の軟寒天増殖を
刺激し、（ｂ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定し
て２３０００ないし２５０００の分子量を有し；　（ｃ
）ＢＨＫ２１細胞を用いるＦＣＦラジオレセプター結合
アッセイで測定するとＦＧＦレセプターに結合せず；（
ｄ）熱安定性であり；　　（ｅ））リプシンに対して不
安定であり：　（ｆ）おそらくは単一鎖ポリペプチドで
あり；　（ｇ）還元剤に対しては不完全な感受性にすぎ
ず：および（ｈ）ＴＧＦβまたはＥＧＦレセプターいず
れに対しても有意に結合しなかったと述べている。

発明の開示 本発明は、以下の特性： ｈ）ＳＷ１３、ＳＷ４０３、ＬＯＶＯ，ＮＲＫ５２Ｅ、
ＷＩ　ＤＲ，ＨＣＴ　−１５，５ＫＣＯ１およびＳＷ４
８細胞系によって産生され、人乳中で検出可能である； を有することを特徴とするヒト上皮細胞形質転換成長因
子（ｈ−ＴＧＦｅ）を提供するものである。

「オートクライン（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）様式で軟寒天
におけるＳＷ１３細胞の器壁非依存性増殖」なる語は軟
寒天におけるＳＷ１３細胞の器壁非依存性増殖がＳＷＩ
３細胞によって産生された成長因子によって刺激される
ことを意味する。かかる「軟寒天におけるＳＷ１３細胞
の器壁非依存性増殖」はハルパーら（Ｈａｌｐｅｒ　ｅ
ｔ、　ａｌ、）、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、４３．１９７２ｉ９７９（１９
８３）によって記載されている方法により測定される。

好ましくは、かかる方法は、基礎および上部層がＤＭＥ
Ｍ中各々０．５％および０．３％アガロース、ｌＯ％胎
児ウシ血清を含有し、かつ３ｃｍ皿当たり５０００個の
細胞を平板培養するように変形する。

ａ）オートクライン（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）様式で軟寒
天中のＳＷ１３細胞の器壁非依存性増殖を刺激し；ｂ）
ｐＨ２〜４．８Ｍ尿素および０．０１％ツイーン（Ｔｗ
ｅｅｎ）　８０に対して安定であるが、５０μｇ／ｍｌ
）リプシン、０．０６５Ｍジチオスレイトール、０．１
ｇ／ｌ　００ｍ＋２リン酸テトラブチルアンモニウムお
よび２％ドデシル硫酸ナトリウムに対して不安定であり
； Ｃ）ヘパリン−セファロース複合体に結合しないが、レ
ッド・セファロースには結合し；ｄ）単層培養における
胎児ウシ心臓内皮細胞の増殖を刺激せず； ｅ）８Ｍ尿素の存在下でサイズ排除ゲル浸透クロマトグ
ラフィーにより測定して約５９キロダルトン（ｋＤ）の
分子質量を有し； ｆ）８Ｍ尿素の存在下で陽イオン交換クロマトグラフィ
ーで測定して約８．５〜１０の等電点を有し、 ｇ）Ｃ１８逆相カラムから２０〜３０％アセトニトリル
で溶出し： 「レッド・セファロース」なる語は支持体用アガロース
ビーズに付着した赤色染料（プロジオン・レッドＨＥ−
３Ｂ）を意味する。レッド・セファロースはファルマシ
ア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ピススカタウエイ（Ｐｉｓ
ｃａｔａｗａｙ）、ニューシャーシー州から入手可能で
ある。セファロースはファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）によって販売されているアガロースビズのブランド
の商標である。

「単層培養における胎児ウシ心臓内皮細胞の増殖」なる
語はゴスポダロビッツら（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗ　１ｃ
ｚ）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）、２５０．２５
１５（１９７５）の方法によって測定したかかる細胞の
増殖を意味する。

また、本発明は、有効量のｈ−ＴＧＦｅおよび医薬上許
容される担体または賦形剤よりなる医薬組成物を提供す
るものである。

また、本発明は、上皮細胞刺激量のｈ−ＴＧＦｅをそれ
を必要とするヒトに投与することよりなる該ヒトにおい
て上皮細胞の増殖を刺激する方法を提供するものである
。

また、本発明は、ａ）血清不存在下の馴化培地でｈ−Ｔ
ＧＦｅを産生できる細胞または細胞系を血清不存在下で
培養し、 ｂ）該培養から産生されたｈ−ＴＧＦｅを単離すること
よりなるｈ−ＴＧＦｅの製法を提供するものである。

好ましくは、ｈ−ＴＧＦの製法は以下の工程：（ａ）血
清不存在下の馴化培地でｈ−ＴＧＦｅを産生できる細胞
または細胞系を血清の不存在下で培養し、 ｂ）好ましくは細胞が集密化まで増殖した後、工程ａで
産生された馴化培地を収集し：Ｃ）続いて、該馴化培地
を逆相クロマトグラフィ、サイズ排除ゲル浸透クロマト
グラフィーおよび陽イオン高速液体クロマトグラフィー
に付し：次いで、 ｄ）ｈ−ＴＧＦｅを含有する画分を収集する；を包含す
る。

さらに、本発明は、本発明の方法によって精製含む。「
天然ｈ−ＴＧＦｅコーディング配列の機能性突然変異体
および誘導体」なる語は、天然ｈＴＧＦｅと実質的に同
一の生物学的活性を有する蛋白、すなわち前記したごと
き上皮細胞の増殖の誘導能を有する蛋白をコード付けす
るいずれのコーディング配列も意味する。かかる天然ｈ
−ＴＧＦｅコーディング配列の機能性突然変異体および
誘導体はその化学的修飾形態、例えば、天然ｈＴＧＦｅ
と実質的に同一の生物学的活性を有するグリコジル化お
よびアルキル化形態を包含する。

また、それらは、■またはそれ以上のアミノ酸が再配置
、付加、欠失または置換された、あるいは異種ポリペプ
チドかそれに融合または複合した突然変異体および誘導
体も包含する。

また、本発明は、ｈ−ＴＧＦｅコーディング配列を含有
する合成ＤＮＡ分子を提供するものである。前記したご
とく、ｒｈ−ＴＧＦｅコーディング配列」なる語は野生
型ｈ−ＴＧＦｅコーディング配列ならびに天然ｈ−ＴＧ
Ｆｅコーディング配列のすへての機能性突然変異体およ
び誘導体を包されたｈ−ＴＧＦｅを提供するものである
。

また、本発明は、 ａ）好ましくは細胞が集密化するまで増殖させた後、ｈ
−ＴＧＦｅを産生できる細胞の馴化培地を収集し； ｂ）続いて、該馴化培地を逆相クロマトグラフィ、サイ
ズ排除ゲル浸透クロマトグラフィー、次いで陽イオン交
換液体高速クロマトグラフィーに付し；次いで、 ｃ）ｈ−ＴＧＦｅを含有する画分を収集することよりな
るｈ−ＴＧＦｅの精製法を提供するものである。

さらに、本発明は、本発明の方法により精製されたｈ　
　ＴＧＦｅを提供するものである。

また、本発明は、ｈ−ＴＧＦｅコーディング配列を含有
するｃＤＮＡのごとき組換体ＤＮＡ分子を提供するもの
である。「ｈ−ＴＧＦｅコーディング配列」なる語は野
生型ｈ　　ＴＧＦｅコーディング配列ならびに天然ｈ−
ＴＧＦｅコーディング配列のすべての機能性突然変異体
および誘導体を含する。「天然ｈ　　ＴＧＦｅコーディ
ング配列の機能性突然変異体および誘導体」なる語は天
然ｈ−ＴＧＦｅと実質的に同一の生物学的活性を有する
蛋白、すななわち上皮細胞の増殖の誘導能を有する蛋白
をコード付けするいずれのコーディング配列も意味する
。かかるｈ　　ＴＧＦｅコーディング配列の機能性突然
変異体および誘導体はその化学的修飾形態、例えば、天
然ｈ−ＴＧＦｅと実質的に同一の生物学的活性を有する
グリコジル化およびアルキル化形態を包含する。

また、本発明は、発現制御配列に作動可能に連結したｈ
−ＴＧＦｅコーディング配列を含有する組換体ＤＮＡベ
クターを提供するものである。

また、本発明は、本発明のベクターで形質転換した宿主
細胞、および所望の宿主細胞を本発明のベクターで形質
転換することよりなるかかる形質転換宿主の製法を提供
するものである。

また、本発明は、本発明の形質転換宿主を適当な培地中
で培養することよりなるさらにもう１つのｈ−ＴＧＦｅ
の製法を提供するものである。また、本発明は、かかる
方法によって産生じたｈＴＧＦｅを提供するものである
。

また、本発明は、好ましくはｈ−ＴＧＦｅの乳中への分
泌を指示するシグナル配列とともに本発明のコーディン
グ配列を哺乳動物胚に導入し、該胚を成体するまで成長
させ、それを乳を生産するるように誘導し、次いでかく
生産された蛋白を単離することよりなる本発明のコーデ
ィング配列によってコード付けされる蛋白の製法を提供
するものである。

また、本発明は、ｈ−ＴＧＦｅに対して反応性である多
クローンまたは単クローン抗体を提供するものである。

また、本発明は、ｈ−ＴＧＦ抗体に対して反応性である
多クローンまたは単クローン抗体を提供するものである
。かかる多クローンまたは単クロン抗体は、通常、アン
チ・イディオタイプ抗体という。

本発明は、他の公知成長因子から区別されるヒト上皮細
胞形質転換成長因子（ｈ−ＴＧＦｅ）にＳＷ１３細胞の
ｈ−ＴＧＦｅに対する増殖刺激応答は線維芽細胞成長因
子（ＦＧＦ）を除きいずれの公知成長因子によっても模
擬されない。ＦＧＦの商業的に入手可能な調製物を用い
てＦＧＦおよびｈ−ＴＧＦｅ間の差異を評価した。ＳＷ
１３細胞のそれへの応答を試験するために用いたＦＧＦ
の商業的調製物は不純であったので、該ＦＧＦ物質を逆
相ＨＰＬＣによって分画し、ＳＷ１３および胎児ウシ心
臓内皮細胞（ＦＢＨＥ）−刺激活性を観察し、ＳＷ１３
細胞は事実ＦＧＦに応答したが試料中の不純物には応答
しないこととが示唆された。ゴスポダロビッツら（Ｇｏ
ｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ　ｅｔ。

ａｌ、）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。Ｃｈｅｍ、）、２５０．２５
１５（１９７５）の方法に従って単層培養におけるＦＢ
ＨＥ細胞の増殖を行った。しかしながら、ＳＷ１３細胞
によって産生された因子（ｈ−ＴＧＦｅ）はＦＧＦと同
一ではなかった。というのは、それはＦＧＦのようには
ヘパリンに結合せず、それは酸安定性である一方でＦＧ
Ｆはそうではなく、か関する。ｈ−ＴＧＦｅは、オート
クライン（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）様式の軟寒天中でのＳ
Ｗ１３細胞の増殖を刺激することが判明した。該ＳＷ１
３細胞系は種々の源、例えば、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー０コレクシヨン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ
　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ロックビル
（Ｒｏｃｋｖ　ｉ　ｌ　Ｉｅ）、メリーランド州、米国
から受託番号ＣＣＬ　ｌ　０５の下で入手可能である。

ｈ−ＴＧＦｅ活性はヒト結腸癌の抽出物中でも見い出さ
れ、人乳の酸性抽出物およびそのほとんどが結腸癌由来
である以下の細胞系、すなわちＳＷ４０３、ＬＯＶＯｌ
ＮＲＫ−５２Ｅ、ＷＩＤＲ。

ＨＣＴ−１５，５ＫＣＯ１および５ｗ４８によって馴化
された血清無しの培地中にもやはり見い出される。前記
細胞系のすべては公に入手可能であり、例えば、かかる
細胞系のすべてはアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリ
ーランド州、米国から入手できる。これらの知見はｈ−
ＴＧＦｅ活性と上皮細胞および組織との関連を示唆する
。

つそれは共にＦＧＦに応答するＦＢＨＥまたは３Ｔ３細
胞の増殖を刺激しないからである。

ｈ−ＴＧＦｅの生物化学的キャラクタライゼーションに
より、ｈ−ＴＧＦｅは以下の各条件：ｐＨ２〜４．８Ｍ
尿素および０．０１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　８０に
対して安定であるが、ｈ−ＴＧＦｅは以下の各条件：２
％ドデシル硫酸ナトリウム、５０　ｕｇ／ｍｌ　トリプ
シン、０．１　ｇ／　１００ｍｌリン酸テトラブチルア
ンモニウムおよび０．０６５Ｍジチオスレイトールに対
しては不安定であることが示された。８Ｍ尿素の存在下
でのサイズ排除ゲル浸透クロマトグラフィーによって見
積もった分子質量は約５９キロダルトン（ｋＤ）である
。ｈ−ＴＧＦｅのドデシル硫酸ナトリウムに対する不安
定性は、ｈ−ＴＧＦｅの可能なウシ同等物についてなさ
れたように、ポリアクリルアミドゲルから活性物を溶出
させるいずれの試行も妨げる。ハルパー及びモーゼス（
Ｈａｌｐｅｒ　ａｎｄ　Ｍｏ５ｅｓ）、キャンサー・リ
サーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、４７．４
５５２１５５９　（１９８７）参照。しかしながらｈ−
ＴＧＦｅのドデシル硫酸ナトリウムに対する不安定性は
ｈ−ＴＧＦｅとハルバーおよびモーゼス（＋９８７）、
前掲、によって記載されているウシ分子間に構造的差異
が存在することを示唆する。

逆相（Ｃｌ　８）および陽イオン交換ＨＰＬＣ（カルボ
キシメチル）を用いて２５リツトルのＳＷ１３１１１１
化培地からのｈＴＧＦｅの予備精製を行った。活性物の
２個のピークは規模のより大きい０１８カラムから回収
されたが、第２のピーク（より疎水性）はＨＰＬＣ過程
での二次生成物のようである。というのは、８Ｍ尿素で
の処理およびＢｉｏＧｅｌ　Ｐ　６０カラム上での分画
に際し、第２のピークはピークＩ活性物と同時溶出する
からである。この結果は、ピーク■物質はｈ　−Ｔ　Ｇ
　Ｆ　ｅと未同定蛋白との集合体であることを示唆する
。ｈ−ＴＧＦｅのカルボキシメチル陽イオン交換カラム
上での挙動によりトリプシノーゲンと近い見掛けｐＩ（
約９．３）が示めされた。特に、８Ｍ尿素の存在下で陽
イオン交換クロマトグラフィーにを包含する。

また、本発明は、本発明の方法に従って産生したｈ−Ｔ
ＧＦｅを提供するものである。

概略を前記したごとく、本発明の精製プロセスは、ｈ−
ＴＧＦｅをその不純溶液から単離および精製するのに用
いることができる３個の工程よりなる。これらの工程は
： ａ）好ましくは、細胞を集密化するまで増殖させた後、
ｈ−ＴＧＦｅを産生できる細胞の馴化培地を収集し： ｂ）該馴化培地な逆相クロマトグラフィー、サイズ排除
クロマトグラフィーおよび陽イオン交換高速液体クロマ
トグラフィーに付し：次いで、ｃ）ｈ−ＴＧＦｅを含有
する画分を収集することよりなる。

本発明の産生および精製の各工程は、組換体または天然
、原核生物または真核生物、細胞培養物からｈ−ＴＧＦ
ｅを単離および精製する完全なプロセスに到達するため
の他のプロセス工程と組み合わせることができる。

よって測定したｈ−ＴＧＦｅのｐＩは約８．５〜１０で
あった。れれらの結果は、陽イオン交換および逆相法は
ｈ−ＴＧＦｅの精製に有用であることを示す。

また、本発明は、 ａ）血清不存在下の馴化培地でｈ−ＴＧＦｅを産生でき
る細胞または細胞系を血清不存在下で培養し、 ｂ）該培養から産生されたｈ−ＴＧＦｅを単離すること
よりなるｈ−ＴＧＦｅの製法を提供するものである。好
ましくは、ｈ−ＴＧＦｅの該製法は以下の工程： ａ）血清不存在下でｈＴＧＦｅを産生できる細胞または
細胞系を血清不存在下で培養し；ｂ）好ましくは、細胞
を集密化するまで増殖させた後に培地を収集し； Ｃ）続いて、該培地を逆相クロマトグラフィーサイズ排
除クロマトグラフィー、次いで陽イオン交換高速液体ク
ロマトグラフィーに付し；次いで、ｃｌ）ｈ−ＴＧＦｅ
を含有する画分を収集する；馴化培地は回分培養系から
デカンテーションによって、あるいは連続系から培地を
収集することによって収集（収穫）される。該培地は所
望により濾過および／または遠心などで清澄化してもよ
く、ｈ−ＴＧＦｅは最初に標準的な技術、例えば、選択
沈澱、または好ましくは吸着クロマトグラフィによって
単離する。この工程の結果、ｈ−ＴＧＦｅのほとんどが
単離されるが、さらなるプロセス用の培地容量は実質的
に減少する。吸着クロマトグラフィーでは、大容量の培
地を高速かつ高効率で扱うことができる固形物支持体を
使用する。

かかる吸着クロマトグラフィーの例は、多クローンまた
は単クローン抗体、Ｓ−セファロースのごとき陽イオン
交換体、金属キレート剤、麦芽凝集素、および種々の染
料のごときアフィニティー・リガンドを用いるクロマト
グラフィーである。好ましい収集工程はイオン交換クロ
マトグラフィである。支持体は、例えば、デキストラン
、アガロースまたはポリアクリルアミドゲルのごとき軟
らかいゲル、フラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）　（
商品名）ビニルポリマーゲル、３２〜６３μｍサイズ（
ピアス８ケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）
社、ロックフォト（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州）
またはｐＨ５以下で安定なｈ−ＴＧＦｅを吸着できる他
の支持体であり得る。

収集工程を行うにおいて、洗浄は好ましくはｐ　Ｈ２〜
５、好ましくはｐＨ４，０で行う。緩衝剤は水溶性の酸
／塩、例えば酢酸、アジピン酸、クエン酸、乳酸、酒石
酸、アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびにそれ
らの塩であり得る。

このましい緩衝剤は酢酸アンモニウムである。

ｈ−ＴＧＦｅを溶出させるためには、無機アリカリまた
はアルカリ土類金属塩あるいは＜ｐＨ５、例えばｐＨ４
，０のカオトロープ（ｃｈａｏＬｒｏｐｅ）の溶液を用
いる。好ましい溶出溶液は０．０５Ｍ酢酸アンモニウム
（ｐＨ４，０）中の０．５ないし２゜５Ｍ、好ましくは
２．０Ｍ塩化ナトリウムである。

収集工程から得た不純溶液は、好ましくは、逆相クロマ
トグラフィーに先立ってさらに部分的に精製する。該部
分的精製は、例えば選択沈澱、アフィニティークロマト
グラフィー、限外濾過、常相クロマトグラフィーおよび
サイズ排除クロマトグラフィー、あるいはこれららのま
たは他の工程の組合せを包含するいずれの手段によって
行うこともできる。好ましくは、該不純溶液は、ｈ−Ｔ
ＧＦｅの特異的活性が、逆相手順に先立ってのＳＷ１３
軟寒天アツセイにおける全蛋白含量および生物学的活性
に基づいて、出発物質の少なくとも約５倍、好ましくは
約１０ないし２０倍となるように部分的に精製したもの
である。

逆相手順に先立って所望の程度の精製を行うプロセス工
程の例は、例えばＹＭ５膜（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）
、デンバーズ（Ｄａｎｖｅｒｓ）、マサチューセッツ州
、米国）を用いる限外濾過、続いての、例えばＢｉｏＧ
ｅｌ　Ｐ　６０　（バイオ・ラド（Ｂｉｏ　Ｒａｄ）、
ロックビルセンター（Ｒｃｋｖｉｉｌｌｅ　Ｃｅｎｔｅ
ｒ）、ニュー　ヨーク、米国）上でのサイズ排除クロマ
トグラフィである。かかるクロマトグラフィーは４以下
のｐＨで行い、好ましくは酢酸（ＩＭ）を用い、８Ｍ尿
素のごときカオトロピック剤の存在下で行う。

溶出は同一条件下で行う。

本発明の好ましいプロセスにおいて、限外濾過およびサ
イズ排除クロマトグラフィー工程によって処理した収集
工程からの部分的精製溶液を次いで逆相クロマトグラフ
ィーによって処理する。

逆相クロマトグラフィーでは、水性溶媒から蛋白を吸着
する疎水性支持体、統いての極性有機溶媒、典型的には
アルコールルー水混合物での選択的溶出を利用する。該
極性有機溶媒はポリペプチド上の疎水性領域を置き換え
ることによって溶出を引き起こす。蛋白、特に活性がコ
ンフォメーション依存性である蛋白の活性喪失を引き起
こしかねない厳しい条件の使用のため、多くの蛋白はこ
のようにして精製できない。

いずれの疎水性支持体、例えばアルキル置換炭化水素ま
たはアルミナゲルも使用できるが、典型的にはアルキル
シリカ支持体を用いて逆相クロマトグラフィーを行う。

好ましい支持体はＣ２ないしＣ１８、好ましくはＣ４結
合ンリカである。他のシラン類はオクチルジメチル、オ
クタデシルジメチル、フエニルジメチル、アクチル、オ
クタデシルおよびフェニルシラン類を包含する。粒子サ
イズは５〜１００μｍ１好ましくは約１５〜２０μｍで
あり得る。典型的なポアサイズは２００ないし５００人
、好ましくは３００人である。。

好ましくは、逆相クロマトグラフィー工程に先立って、
例えば、ヘプタフルオロ酪酸、酢酸、リン酸またはトリ
フルオロ酢酸を用いて不純溶液をを非常に低いｐＨ，例
えば１．５ないし３．５に調整する。不純溶液にカオト
ロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）または有機溶媒、例えば
８Ｍ尿素を含ませるのはｈＴＧＦｅ集合体を見掛は上解
離させることによって分離を促進する。溶出は、典型的
には、疎水性相互作用を減少させるための漸次増加量の
有機溶媒、例えばアセトニトリル、ジオキサン、テトラ
ヒドロフランまたは水混和性アルコール、例えばエタノ
ール、メタノール、ｎ−プロパツールもしくはインプロ
パツールを添加することによって行う。好ましい溶出グ
ラジェントは０．０５％トリフルオロ酢酸を含有するＯ
〜５０％アセトニトリルである。

逆相クロマトグラフィーに続いて、より純粋なｈ　　Ｔ
ＧＦｅを生産するにはより多くの工程が望ましい。これ
らの工程は、好ましくはカオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏ
ｐｅ）存在下でのイオン交換クロマトグラフィー、好ま
しくはレッド・セファロースにおける逆相高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびアフィニティークロ
マトグラフィーである。

イオン交換工程はｈ−ＴＧＦｅを濃縮し、かつ有機溶媒
を除去するのに役立つ。好ましくは、この手順は０．０
５Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ）のごとき緩衝溶液および
８Ｍ尿素のごとき力オトロプで平衡化したカルボキシメ
チルまたはスルホプロピル支持体のような陽イオン交換
支持体を用いて行う。塩の濃度を例えばＯ，０５Ｍから
ＩＭに増加させ、一方力オトロープ濃度を一定に保ちつ
つ物質を支持体から溶出させる。アフィニティクロマト
グラフィーに先立ち、逆相工程により塩および尿素を除
去する。好ましい粒子サイズが５μｍでありかつ好まし
い固定相がフェニルシラ３工 り得ない他の工程と組み合わせることができる。

また、本発明はｈ−ＴＧＦｅコーディング配列を含有す
るｃＤＮＡのごとき組換体ＤＮＡ分子を提供するもので
ある。かかるｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは、ハンら（）ｔａｎ　ｅ
ｔ、ａｌ、）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）、λ見、１６１７−１６２５　（１９８７）
の方法のごとく、ｈ−ＴＧＦｅを産生する細胞または培
養物から常法によって単離したｍＲＮＡの逆転写のごと
き常法によって調製できる。前記したごとく、ｒｈ　　
ＴＧＦｅコーディング配列」なる語は野生型ｈ−ＴＧＦ
ｅコーディング配列ならびに天然ｈＴＧＦｅコーディン
グ配列のすべての機能性突然変異体および誘導体を含む
。「天然ｈ−ＴＧＦｅコーディング配列の機能性突然変
異体および誘導体」なる語はｈ−ＴＧＦｅコーディング
配列ノ別の蛋白コーディング配列への融合、ならびに天
然ｈ−ＴＧＦｅと実質的に同一の生物学的活性を有する
蛋白、すなわち上皮細胞の増殖の誘導能を有する蛋白を
コード付けするアミノ酸の置換、欠失または付加を含む
天然ｈ−ＴＧＦｅコープインンである以外は前記したご
とくに行うことができる。レッド・セファロース工程は
、逆相工程からの蛋白の凍結乾燥、続いての緩衝剤、例
えば、低濃度の塩、例えば０．３Ｍ塩化ナトリウムを含
有する０、０５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７）中での復
元によって行う。カラムは、典型的には、レッド・セフ
ァロース（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））１ｍ
４を含有する。復元されたｈ−ＴＧＦｅを負荷した後、
カラムを緩衝塩調製物、例えば０．０５Ｍリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ７）中の１Ｍ塩化ナトリウムによって洗浄す
る。次いで、高塩および有機溶媒の組合せ、例えば５０
％ｎ−グロパノール中の１Ｍ酢酸アンモニウムで溶出す
る前に、それを酸性溶液、例えば０．０５％トリプルオ
ロ酢酸で洗浄する。カラムから脱着したかも知れない塩
およびいずれの赤色染料も除去するために前記したごと
き逆相工程を用いて溶出物質をさらに精製するのがしば
しば望ましい。

前記にて注意を促したごとく、本発明の各プロセス工程
は本発明のプロセスとなり得るまたはなグ配列のごとき
いずれのｈ−ＴＧＦｅコーディング配列も意味する。か
かる機能性突然変異体および誘導体は、都合よくは、例
えば部位定方向化（ｓｉｔｅ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然
変異、ランダム突然変異、ヌクレオチドまたはペプチド
配列の化学的合成、天然ｈ−ＴＧＦｅについてのコーデ
ィング配列の一部の切断または欠失、前記のものの化学
的修飾またはｈＴＧＦｅコーディング配列の１以上のセ
グメントの連鎖状化を使用することによって当業者によ
り調製される。また、ｈ−ＴＧＦｅコーディング配列の
かかる機能性突然変異体および誘導体はその化学的修飾
形態、例えば天然ｈ　−ＴＧＦ　ｅと実質的に同一の生
物学的活性を有するグリコジル化およびアルキル化形態
を包含する。

本発明の組換体ＤＮＡ分子のさらなる具体例として、本
発明のコーディング配列よりなる組換体ＤＮＡペターが
提供される。このベクターは、好ましくは、適当な発現
制御配列に作動可能に連結した前記コーディング配列を
含有する。「適当な発現制御発現」とは構造遺伝子の転
写および翻訳を調節する配列を意味する。かかる発現制
御配列は当該分野でよく知られている。

本発明のなおさらなる態様は本発明のベクターで形質転
換した宿主細胞である。かかる宿主細胞は培地中で増殖
でき、本発明のコーディング配列を発現できる。かかる
宿主細胞は本発明の方法、すなわち、所望の宿主細胞を
本発明のベクターで形質転換することによって調製され
る。かかる形質転換は通常の形質転換技術を利用して実
行できる。適当であり得る宿主細胞は昆虫細胞、細菌細
胞、植物細胞および菌類細胞を包含するが、それらに限
定されるものではない。かくして、変発明はいずれの特
別な宿主細胞に限定されるものでもない。

また、本発明は、本発明の形質転換宿主を適当な培地中
で培養し、次いでかかる蛋白を単離かることよりなる本
発明のコーディング配列によってコード付けされる蛋白
の製法を提供するものである。「適当な培地」とは形質
転換宿主が生存するのを可能とし、かつかかる宿主が本
発明のコーディわち上皮細胞増殖の誘導能を有する蛋白
をコード付けするいずれのコーディング配列も意味する
。

ｈ−ＴＧＦｅコーディング配列のかかる機能性突然変異
体および誘導体はその化学的修飾形態、例えば天然ｈ−
ＴＧＦｅと実質的に同一の生物学的活性を有するグリコ
ンル化およびアルキル化形態も包含する。

また、本発明は、好ましくは、ｈ−ＴＧＦｅの乳への分
泌を指示するシグナル配列とともに、本発明のコーディ
ング配列を哺乳動物胚に導入し、該胚を成体まで成長さ
せ、それが乳を生産するように誘導し、次いでかく生産
された蛋白を単離することよりなる本発明のコーディン
グ配列によってコード付けされる蛋白の製法を提供する
ものである。前記方法は、ゴルダンら（Ｇｏｒｄａｎ　
ｅｔ、　ａｌ、）、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ）、５．１１８３−１１８７　（１９８
７）の方法のごとき公表された方法を用いて当業者によ
って実行される。

産生された蛋白は前記したのと同様の技術によって乳か
ら精製できる。

ング配列を回収可能な量で発現するのを可能とする培地
を意味する。当業者ならば、用いるべき適当な培地は用
いるべき宿主細胞に依存することを認識するであろう。

かく産生された蛋白の単離は、宿主の培養溶解物から、
適当には宿主の培養培地から直接に行い、かつ後記のご
とき通常の蛋白単離技術によって行う。

また、本発明は、ｈ−ＴＧＦｅコーディング配列を含有
する合成ＤＮＡ分子を提供するものである。「合成」な
る語は組換技術よりもむしろ合成技術によって調製され
たＤＮＡ分子を意味する。

かかる技術は商業的に入手可能なＤＮＡ合成器を用いる
ものが当該分野でよく知られている。前記したごとく、
　ｒｈ−ＴＧＦ　ｅコーディング配列」なる語は野生型
ｈ−ＴＧＦｅコーディング配列ならびに天然ｈ−ＴＧＦ
ｅコーディング配列のすべての機能性突然変異体および
誘導体を含む。「天然ｈ−ＴＧＦｅコーディング配列の
機能性突然変異体および誘導体」なる語は天然ｈ−ＴＧ
Ｆｅと実質的に同一の生物学的活性を有する蛋白、すな
また、本発明は、本発明のコーディング配列によってコ
ード付けされた蛋白を提供するものである。かかる蛋白
は本発明の方法によって調製できる。別法として、かか
る蛋白はオリゴヌクレオチド合成のごときいずれの通常
の蛋白調製技術によっても当業者が調製できる。

また、本発明は、ｈ−ＴＧＦｅに対して反応性であるい
ずれの多クローンまたは単クローン抗体にも関する。か
かる抗体は常法を利用して調製され、例えば多クローン
抗体はダブリュー・エイ・ベンジャミン・インコーポレ
ーション（Ｗ、　Ａ。

Ｂｅｎｊａｍｉｎ　Ｉｎｃ、）によって出版された［メ
ソッズ・イン・イミュノロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第３版、ジェイーガレイら
（Ｊ、　Ｇａｒｒｅｙ　ｅｔ、　ａｔ、）編、１８９〜
２１３頁（１９８７）に記載されている方法によって調
製でき、単クローン抗体はコーラ−およびミルスティン
（Ｋｏｌｈｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、ネイチ
ャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６．４９５　（１９７５
）の方法により調製できる。

また、本発明はいずれのｈ−ＴＧＦｅ多クローンまたは
単クローン抗体、すなわちいずれのアンティ・イディオ
タイプ抗体に対しても反応性であるいずれの多クローン
または単クローン抗体にも関する。アンティ・イディオ
タイプ抗体は、都合よくは、例えばクンケルら（Ｋｕｎ
ｋｅｌ　ｅｔ、　ａｌ、）、サンエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）、１４０、＋２１８−１２１９（１９８３）または
セージおよびペーターソン（Ｓｅｇｅ　ａｎｄ　Ｐｅｔ
ｅｒｓｏｎ）、プロシーディングズ・オブ・ナンヨナル
・アカデミ−・オブ・サンエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）肌Ｓ、Ａ、、７５．２
４４３−２４４７　（１９７８）の方法より、当業者に
よって調製される。

また、本発明は、上皮細胞刺激量のｈ−ＴＧＦｅをそれ
を必要とするヒトに投与することよりなる該ヒトにおい
て上皮細胞の増殖を刺激する方法を提供するものである
。ｈ−ＴＧＦｅはヒト上皮細胞の増殖を誘導できる物質
である。従って、上皮細胞の増殖が必要とされる臨床疾
患、例えば、負傷の治癒、潰瘍および火傷の治療、およ
び放射線治療後の組織の再上皮形成で特に有用である。

のひどさ、治療すべき表面積および治療すべき患者の年
令のごとき多数のファクターに依存するが、これらに限
定されないことを認識するであろう。

非経口投与については、約１ないし約１００ｍｇ／　Ｍ
２体表面／日の範囲の用量が適当である。当業者ならば
１日当たりのあるいは治療のコース当たりの非経口適用
数は治療すべき症状のひどさおよび治療すべき患者の年
令および体重のごとき多数のファクターに依存するがそ
れらに限定されないことを認識するであろう。粘膜を介
する投与については、適用当たり約０．０１ないし約１
０ｍｇの範囲の用量が適当である。当業者ならば１日当
たりのあるいは治療コース当たりの粘膜を介して投与す
る適用数は治療すべき症状のひどさおよび治療すべき患
者の年令および体重に依存するがそれらに限定されない
ことを認識するであろう。

また、本発明は、有効量のヒト上皮細胞形質転換成長因
子（ｈ−ＴＧＦｅ）および医薬上許容される担体または
賦形剤よりなる医薬組成物を提供するものである。かか
る組成物は非経口（皮下、ｈ−ＴＧＦｅはヒト線維芽細
胞、例えば３Ｔ３細胞の増殖を刺激しないので、本発明
の方法によるｈ−ＴＧＦｅの投与は望ましくない線維症
応答を生じることが予想されない。やはりヒト上皮細胞
の増殖を誘導し得るいくつかの他の成長因子、例えばＥ
ＧＦ、ＦＧＦおよび血小板−由来成長因子（ＰＤＧＦ）
は線維芽細胞を刺激し、かくして、それらの投与は望ま
しくない線維症応答を生じかねない。さらに、ｈ−ＴＧ
Ｆｅはヒト起源であり、従って、本発明の方法による投
与に際して望ましくない免疫応答を生じないようである
。ｈ−ＴＧＦｅの投与の態様は局所投与：非経口投与、
例えば静脈内注射、皮下注射または筋肉内注射：負傷組
織への直接適用を介して；粘膜を介して、例えばエアロ
ゾル吸入、鼻孔内、膣内、経直腸、腸内（腸の粘膜を介
する）、またはバッカル投与を包含する。局所投与には
、適用当たり約０．０１ないし約１０ｍｇ／Ｍ２体表面
の範囲の用量が適当である。当業者ならば、１日当たり
、または治療のコース当たりの局所適用数は、治療すべ
き症状筋肉内または静脈内）投与には液体の液剤または
懸濁剤；膣内または直腸投与用にはクリームおよび坐薬
のごとき半固体形態；または鼻孔内投与用には粉末また
は鼻孔点滴の形態で調製できる。

鼻孔内投与に適した本発明の医薬組成物の例としては、
いずれかの鼻孔内投与容器に前記した非経口医薬溶液を
充填することによって調製が行われる。都合よくは、該
組成物は単位投与形態で投与でき、例えばレミントンズ
・ファルマシューティカル・サンエンシズ（Ｒｅｍｉｎ
ｇｔｏｎ’ｓ　ＰｈａｒｍａｃｅｕＬｉｃａｌＳｃｉｅ
ｎｃｅｓ）、フック（Ｍａｃｋ）出版社、イーストン（
ＥａｓＬｏｎ）、ペンシルベニア州、１９７０に記載さ
れているごとく、医薬分野でよく知られているいずれの
方法によっても調製できる。非経口投与用製剤には通常
の賦形剤、滅菌水または生理食塩水、ポリエチレングリ
コールのごときポリアルキレングリコール、植物起源の
油、水添ナフタレン類などを含有させることができる。

膣内または直腸投与用製剤、例えば坐薬には、賦形剤と
して例えばポリアルキレンゲリコール、ペトロラタムゼ
リー、カカオバター等を含有させることができる。

鼻孔点滴の形態の投与用製剤。製剤は、クリーム、ロー
ションまたは徐放性マイクロカプセルの懸濁剤、（例え
ば角膜負傷による目への点眼注入用の）滅菌生理食塩水
中の液剤への一体化、吸着剤パッドおよび包帯の含浸ま
たは外科で用いるコラーゲン繊維またはパッドへの共有
結合架橋を包含する。

患部での作用持続を延長するために、製剤には（表皮成
長因子、形質転成長殖因子タイプアルファのごとき）他
の成長因子、腫瘍壊死因子、線維芽細胞成長因子および
インシュリン、ならびにプロテアーゼ抑制剤、血管収縮
剤を包含させることができる。例えば、本発明の局所医
薬組成物は所望量のｈ−ＴＧＦｅを水に溶解し、所要量
のメチルおよびプロピルパラベン、ライ−７８０および
ソＪレビトールを添加して溶液とし、かかる溶液を約５
０°Ｃで加熱し、鉱油に溶解した所要量のセチルアルコ
ール、ステアリルアルコールおよび５ｐａｎ２０を含有
する別々の溶液に添加し、また約５０°Ｃで加熱し、２
種の溶液を乳化が起こるまで混合し、セイ（ジエン・プ
ローブ（Ｇｅｎ　Ｐｒｏｂｅ）、サンジエゴ（Ｓａｎ　
Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州９２１２３）およびブ
ロス培地（マイクロバイオロジカル・アソーシエイツ（
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔ−
ｅｓ）、ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、メリーランド
州）を用い、マイクプラズマ汚染が無いことが示された
。イソ酵素分析により、ＳＷ１３細胞はヒト起源（コニ
ング・オーセンティキット（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ａｔｈｅ
ｎｔｉｋｉｔ）であることが証明された。マウス表皮細
胞成長因子（ＥＧＦ）　、ヒト血小板−由来成長因子（
ＰＤＧＦ）、ウシ下垂体線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）
およびラン・インシュリンはコルラポラテイブ・リサー
チ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）
、レキシントン（１，ｅｘｉｎｇｔｏｎ）、マサチュー
セッツ州０２１７３から供給された。合成ヒト・ガスト
リンおよびボンベシンはシグマ（Ｓｉｇｍａ）、セント
ルイス、ミズリー州から入手した。ヒト血小板ＴＧＦ−
βはアル・アソシアン（Ｒ，Ａｓ５ｏｓｉａｎ）博士、
コロンビア大学、ニューヨークから贈られた。ＥＧＦお
よびＴＧＦ−βの生物学的活性は、トダロら（７ｏｄａ
ｒ。

次いでそれを軟膏チューブまたはジャー（ｊａｒ）に充
填することによって調製できる。本発明の非経口医薬組
成物の例として、所望量のｈ−ＴＧＦ　ｅを注射用滅菌
水に溶解し、所要量の緩衝剤、例えばリン酸ナトリウム
を０．０５Ｍまでおよび塩化ナトリウムを添加してｐＨ
を７．４に調整し、溶液を等張とし、該溶液を無菌的に
充填し、次いで非経口投与に適したアングルに充填する
。鼻孔内投与に適した本発明の医薬組成物の例として、
いずれかの通常の鼻孔内投与容器に前記した非経口医薬
組成物を充填できる。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

犬嵐餞 用いたすべての細胞系はアメリカン・タイプ・カルチャ
ー会コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ
１ｔｕｒｅＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）、ロックビル（Ｒｏ
ｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州、米国から入手した
が、Ｇｅｎブローブアッ６ｔ、　ａｌ、）、プロシーデ
ィングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サン
エンシズ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、７７．５２５８
−５２６２（１９８０）に記載されているごとくに軟寒
天中のＮＲＫ−４９Ｆ細胞の増殖を用いて証明した。

ＰＤＧＦはポーウェンーポプら（ＢｏｗｅｎＰｏｐｅ　
ｅｔ。

ａｌ、）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリーＱ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）、２５７．５
１６１５１７１　（１９８２）によって記載されている
ＮＩＨ−３Ｔ３チミジン摂取アツセイにおいて活性であ
った。

２、馴化培地の収集 ローラーボトル中、ｌＯ％胎児ウシ血清を補足したダル
ベツコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ジブコ（Ｇｉ
ｂｃｏ）、グランド・アイランド（ＧｒａｎｄＩｓｌａ
ｎｄ）、ニューヨーク、１４０７２）中で細胞を集密化
するまで増殖させた。該細胞をリン酸緩衝生理食塩水（
Ｐ　Ｂ　Ｓ）で洗浄し、血清無しのＤＭＥＭ中で４〜５
時間インキュベートし、再びＰＢＳで洗浄した。各ロー
ラーボトルに、新たに調製した硫酸第一鉄および５％ｇ
／＋＋＋α（最終濃度）亜セレン酸ナトリウム（コルラ
ポラテイブ・リサチ（ＣｏｌｌａｂｏｒａＬｉｖｅ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ）、レキシントン（Ｌｅｘｉｇｔｏｎ）
、マサチューセッツ州）を補足した血清無し、フェノー
ルレッド無しのＲＰＭＩ　　１６４０培地（ジブコ（Ｇ
ｉｂｃｏ）、グランド・アイランド（Ｇｒａｎｄ　ｌ５
ｌａｎｄ）、ニューヨーク、１４０７２）２００ｍｌを
入れた。細胞を血清なしの培地で２日間インキュベート
し、培地を収集し、５ｍｌ／リットルのトリフルオロ酢
酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）で酸性比重　４°Ｃで保存した。酸性
化馴化培地を１５００ｘｇで１５分間遠心し、０．４５
μｍ膜（ゲルマン（Ｇｅｌｍａｎ）、アン・アーバー（
Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ）、ミシガン州、４８＋０６）を通
して濾過し、限外濾過（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）Ｙ　
Ｍ　５膜、５０００　Ｍ　ｒカットオフ、アミコン（Ａ
ｍｉｃｏｎ）、デンバーズ（Ｄａｎｖｅｒｓ）、マサチ
ューセッツ州、０１９２３）による濃縮の後、生物学的
活性を測定し、０．０５％ＴＦＡに対して透析を行った
。Ｍｒは相対分質量を意味する。以下の細胞系：ＳＷ１
３、ＳＷ４８、ＳＫＣＦＧＦ活性を測定した。２ｍｌ　
ＤＭＥＭ、１０％胎児ウン血清を含有する３ｃｍ皿に試
料を添加した。次いで、各型にＤＭＥＭ、１０％胎児ウ
シ血清中の５Ｘ１０’ＦＢＨＥ細胞の懸濁液１００μＱ
を加えた。培養物を５日間インキュベートし、１０％緩
衝ホルマリンで固定し、０．５％クリスタルバイオレッ
トで染色した。細胞増殖は画像解析による各型について
の合計コロニー領域の測定によって定量した。

４、人乳および組織抽出物におけるｈ−ＴＧＦｅ活性の
分析 エーテル抽出によって人乳を脱脂し、ＴＦＡ　（０，５
％最終濃度）で酸性化した。該酸性化物質を０．４５ｍ
μ膜を通して濾過し、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）Ｙ　Ｍ
　５膜を用いて５倍に濃縮した。濃縮物を０．０５％Ｔ
ＦＡに対して透析し、凍結乾燥し、もとの１０倍濃度で
復元し、ＳＷ１３細胞上でバイオアッセイを行った。

正常な隣接結腸の２種の試料と共に患者からの結腸癌組
織の試料を手術時に入手し、液体窒素中０　Ｌ　　ＬＯ
ＶＯｌＣＡＣＯ２、ＨＴ−２９、Ｃ０ＬＯ３２０ＤＭ１
　Ｃ０ＬＯ３２０ＨＲ３゜ＳＷ９４８、ＤＬＩ）−１，
ＮＲＫ−５２Ｅ、ＨＣＴｉ５、ＷＩＤＲ，ＳＷ４０３お
よびＳＷ７４２を活性の生成について試験した。

３、生物学的アッセイ 基礎および上部層がＤＭＥＭ中の各々０．５％および０
．３％アガロース、ｌＯ％胎児ウシ血清を含有し、かつ
５０００個の細胞を３ｃｍ皿当たりについて平板培養す
る以外はバブラーら（Ｈａｐｌｅｒ　ｅｔ、　ａｌ、）
、キャンザー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃ
ｈ）、４３．１９７２−１９７９　（１９８３）によっ
て記載されたごとくに軟寒天中の５Ｅ１３細胞の増殖を
用いてｈ−ＴＧＦｅの活性を測定した。

ゴスポダロビイツツら（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ　
ｅｔ。

ａｌ、）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｗｅｍ、）、２５０．
２５１５（１１９７５）の方法による単層培養における
胎児ウシ心臓内皮（ＦＢＨＥ）細胞の増殖を用いてでス
ナップ（５ｎａｐ）凍結した。１グラムの組織を解凍し
、ロバーツら（Ｒｏｂｅｒｔｓ　ｅＬ、　ａｌ、）、プ
ロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、）、８２．１１９〜１２３（１９８５）に
よって記載されているごとく、ペプスタチンおよびフッ
化フェニルメチルスルホニルを含有する酸性化エタノー
ル４智Ｏ，中でホモジネートした。該ホモジネートを１
２００ｘｇにて２５分間遠心し、上澄みを０゜０５％Ｔ
ＦＡに対して透析し、凍結乾燥した。抽出物をバイオア
ッセイ用に０．０５％Ｔ、Ｆ　Ａ　ｌ　ｍＯ。

中で復元した。

５０Ｅｇ／ｍｌトリプシン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を
含む５Ｅ１３馴化培地の１０倍濃縮物をｐ　Ｈ８、５，
３７°Ｃで２時間インキュベーションすることによって
ｈ−ＴＧＦｅのトリプシン感受性を検定した。

対照として、酵素処理開削に、試料１ｍｌ当たり５００
μｇ／ｍｌＣ最終濃度）ヒツジ・トリプシン抑制剤（シ
グマ（Ｓｉｇｍａ））を添加し、さらなる試料を抑制剤
のみで処理した。２時間後、トリプシン抑制剤の添加に
よって反応を停止し、試料をバイオアッセイに付した。

ｂ、ヘパリン親和性 ５０ｍＭ　ＮａＨ２Ｐｏｔ、０．２５Ｍ　ＮａＣｌ２ｐ
Ｈ７，０中で復元した粗製馴化培地をヘパリンセファロ
ース複合体（ファルルマシア（Ｐｂａｒｍａｃｉａ）、
ビス力タウエイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャ
ージ州０８８５４）１グラムを充填した０゜５ｘ３ｃｍ
カラムに通すことによってヘパリンについてのｈ−ＴＧ
Ｆｅの親和性を測定した。出発物質の試料およびカラム
流出液を５ＥＩ３細胞上のバイオアッセイに付した。対
照として、同緩衝液中の５０　ｎｇ／ｍｉ２　Ｆ　Ｇ　
Ｆを同カラムに通し、ＦＢＨＥ細胞を用いて試料をバイ
オアッセイに付した。ポーウエンーポベら（Ｂｏｗｅｎ
Ｐｏｐｅ　ｅｔ、　ａｌ、）、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ
、）、２５７．５１６１−５ィオラド（ＢｉｏＲａｄ）
、ロックビルセンター（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　Ｃｅｎｔ
ｅｒ）、ニューヨーク１１５７１）を含有する５ｘ８６
ｃｍカラム（７アルマンア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ビ
ス力タウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャー
ジ州）に適用した。液速は３６ｍｌ１時であり、２０ｍ
ｌずつの画分を収集し、１００μΩ分を０．０５％ＴＦ
Ａに対して透析して尿素を除去し、バイオアッセイに付
した。分子質量標準物はオバルミン（４３Ｋ）、キモト
リプシノーゲン（２５Ｋ）、リゾチーム（１４，３Ｋ）
　、インシュリン（６Ｋ）およびビタミンＢＩ２（１，
３Ｋ）であった。

Ｓ−セファロース（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ
ａ）、ビス力タウエイ（Ｐｉｓｃａｔａｅａｙ）、ニュ
ージャージ州）上への捕獲、２Ｍ塩化ナトリウムでの溶
出、透析および凍結乾燥によってＳＷ１３細胞培養物か
らの馴化培地を濃縮した。この物質を解離剤として８Ｍ
尿素を含有する０、０５Ｍ酢酸アンモニウム１７１（１
９８２）によって記載されているチミジン摂取アッセイ
を用い、陽性対照としてのＰＤＧＦと共に、ｈ−ＴＧＦ
ｅそれ自体を、ＦＢＨＥ細胞に対して、およびＮＩＨ−
３Ｔ３細胞上でバイオアッセイに付した。

Ｃ０変性剤感受性 粗製馴化培地濃縮物を０．１％ツイーン８０（シグマ（
Ｓｉｇｍａ））、２％ドデシル硫酸ナトリウム、０゜０
０５Ｍジチオスレイトールまたは８Ｍ尿素のうち１つと
共に１時間インキニーベートすることによってｈ−ＴＧ
Ｆｅの変性剤に対する感受性を試験した。未処理対照試
料と共に処理試料を０．０５％ＴＦＡに対して徹底的に
透析して変性剤を除去し、ＳＷ１３細胞上のバイオアッ
セイに付した。

ｄ３元五１ ８Ｍ尿素の存在下における馴化培地濃縮物のＢｉｏＧｅ
ｌ　Ｐ　６０カラム上でのゲル濾過クロマトグラフィー
によってｈ−ＴＧＦｅの分子質量を見積もった。凍結乾
燥濃縮物を０．０５％ＴＦＡ中の８Ｍ尿素２０ｍｌに溶
解し、ＢｉｏＧｅｌ　Ｐ　６０樹脂（バｐＨ４，０中で
復元し、前記した酢酸アンモニウム／８Ｍ尿素中で平衡
化したモノ（Ｍｏｎｏ）　Ｓ　（ファルマシア（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）、ビス力タウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａ
ｙ）、ニュージャージ州）の５ｘ０．５ｃｍカラム上に
負荷した。０．０１５Ｍ／分で増加させる８Ｍ尿素中の
０．０５〜０．５Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ４，０の直線
状グラジェントを用い、蛋白をカラムから溶出させた。

液速はｌ　ｍｌ１分であり、１ｍ１２ずつの画分を収集
した。各画分の一部（５μａ）を軟寒天アッセイにおい
てＳＷ１３細胞上の活性について検定した。同一条件下
で公知ｐ■の標準蛋白を流し、２８０ｎｍにおける吸光
度を検出することによってカラムについて検量線を作成
した。標準物はβラクトグロブリン（ｐｉ５．２）、ウ
シ炭酸脱水酵素Ｂ　（５，８５）、ヒト炭酸脱水酵素（
６，５５）、ウマ・ミオグロビン（６，８５，７，３５
）　、レンチル・レクチン（８゜１５．８．４５．８．
６５）、トリプシノーゲン（９゜３）およびチトクロー
ムＣ（１０，２５）でありＩこ。

ａ、ｈ−ＴＧＦｅの精製 連続的逆相、サイズ排除および陽イオン交換ＨＰ　Ｌ　
ＣによってＳＷ１３馴化培地からｈ　−ＴＧＦｅを精製
した。ウェーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）、デルタプレプ（
Ｄｅ　ｌ　ｔａ−Ｐｒｅｐ）システム（ミリボア（Ｍｉ
　ｌ　ｌ　１ｐｏｒｅ）、ミル７オード（Ｍｉ　１ｆｏ
ｒｄ）、マサチュセッツ州０１７５７）を用い、Ｖｙｄ
ａｃ　　２１８ＴＰＣ１８バツキング（エイチ・ビイ・
ケケミカルズ（ＨＰ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｓ）、セント
ルイス、ミズリ州６３１０８）を含有する５ｘ３０ｃｍ
調製カラムに酸性化馴化培地の２５リツトルバツチを７
５ｍｌ１分で負荷した。２１４ｎｍにおける吸光度がベ
ースラインに到達するまで該カラムを０．０５％ＴＦＡ
で洗浄し、アセトニトリル中の０．０５％ＴＦＡのグラ
ジェントを０〜３０％にて５０分間にわたり、３０〜５
０％にて２０分間にわたり、および５０〜１００％にて
１０分間にわたり、液速７０ｍ（１／分にて行った。２
，５分毎に画分を収集し、真空蒸発によってアセトニト
リルを除去し、部をＳＷ１３細胞上のバイオアッセイに
付した。

料を逆相ＨＰＬＣによって分析した。１％ＴＦＡで試料
をｐＨ２，５に酸性化し、ＶｙｄａｃＣ１８２１８Ｐ　
　１０μｍバッキング（ザ・ネスト・グループ（Ｔｈｅ
　Ｎｅ５ｔ　Ｇｒｏｕｐ）、サラスポロ（Ｓｏｕｔｈｂ
ｏｒｏ）、マサチューセッツ州０１７７２）を含有する
０、４６ｘ３０ｃｍカラムに付した。アセトニトリル中
の０〜５０％　０．０５％ＴＦＡのグラジェントを０，
２５％／分で行い、２ｍｒｌずつの画分を収集し、真空
蒸発によるアセトニトリルの除去の後、バイオアッセイ
に付した。精製間の活性物の回収を、精製物質を用いる
用量一応答曲線を作成することによってモニターした。

活性の１単位を５０％最大応答に要するものと定義した
。標準物としてオバルミンを用い、ＢＣＡ法（ピエス（
Ｐｉｅｒｃｅ）、ロック７オード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）
、イリノイ州６１１０５）、および吸収ピークの電子的
積分によって蛋白濃度を測定した。

椎邑 逆相工程からの活性画分をアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）Ｙ
Ｍ５膜を用いて１０倍に濃縮し、濃縮物を直列２個のＴ
ＳＫ３０００ＳＷサイズ排除カラム（各２゜５ｘ６０ｃ
ｍ）（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）、フレルトン（Ｆ
ｕｌｌｅｒｔｏｎ）、カリフォルニア州）に負荷した。

液速２　ｍ０１分にて、０．０５％ＴＦＡを用いて物質
を該カラムから溶出させ、４ｍｌずつの画分を収集した
。

リン酸ナトリウムを立体排除工程からの活性物質に添加
して最終濃度２０ｍＭとした。水酸化ナトリウムでｐＨ
を６．０に調整し、試料を９００００ｘｇで３０分間遠
心した。上澄みをＣＭ２ＳＷ陽イオン交換カラム（ベッ
クマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）、フレルトン（Ｆｕｌ　Ｉｅ
ｒｔｏｎ）、カリフォルニア州）に負荷し、２０ｍＭ’
Ｊン酸緩衝液ｐＨ６，０で洗浄した。リン酸緩衝液ｐＨ
６，０中の塩化ナトリウムθ〜０．６Ｍの直線状グラジ
ェントを９０分間にわたり０〜９５％で行い、Ｑｍｌず
つの画分を収集し、バイオアッセイに付した。

陽イオン交換工程からのｈ−ＴＧＦｅの活性試軟寒天ア
ッセイ（ハルパーら（Ｈａｌｐｅｒ　ｅｔ、　ａｌ、）
、キャンサ一番リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ）、４３゜１９７２−１９７９　（１９８３））で
調査した２種のヒト結腸癌の抽出物はｈ−ＴＧＦｅ活性
物を含有していたが、これらの患者からの正常隣接結腸
組織は活性物がより少なかった。また、人乳でも活性が
検出された。試験した細胞系のうち、ＳＷ１３．ＳＷ４
０３、ＬＯＶＯｌＮＲＫ−５２Ｅ。

ＷＩＤＲおよびＨＣＴ−１５がｈ−ＴＧＦｅ活性物を培
養培地中に放出した。より少量ではあるが検出可能な量
が５ＫＣＯＩおよびＳＷ４８細胞で産生されたが、ＤＬ
Ｄｉ、ＨＴ−２９，ＳＷ９４８、Ｃ０ＬＯ３２０（ＤＭ
またはＨ３Ｒ）、ＣＡＣＯ２およびＳＷ７４２は観察可
能な量のｈ−ＴＧＦｅを放出しなかった。

限外濾過を用いてＳＷ１３馴化培地を５０倍に濃縮し、
０．０５％ＴＦＡに対して透析した場合、得られた物質
は、軟寒天アッセイ（ハルバーら（Ｈａｐｅｒ　ｅｔ、
　ａｌ、）、キャンサー自リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅ
ｓｅａｒｃｈ）、±３，１９７Ｌ−１９７９　（１９８
３））におけるＳＷ１３細胞によるコロニー形成におい
て用量−関連増加を生じた。この粗製濃縮物のＥＤ５０
は型光たり約３７μＱ　（蛋白の７３μｇに対応）であ
り、蛋白１ｍｇ当たり１３，７半最大（１１ａｌ　（−
ｍａｘｉｍａｌ）単位の特異的活性を与える。

この活性は５０μｇ／ｍｌトリプシンに対して感受性で
あり、ＥＧＦＳＰＤＧＦ、ガストリン、ボンベシン、イ
ンシュリンまたはＴＧＦ−βによって模擬されなかった
。しかしながら、ＦＧＦはコロニ形成において用量−関
連増加を生じた。

ｈ−ＴＧＦｅおよびＦＧＦ間の可能な関係をさらに調べ
るために、馴化培地濃縮物の試料をヘパリン−セファロ
ースカラムに通した。ｈ−ＴＧＦｅのほとんどはカラム
の破過画分中に回収され、これは、もし存在してもヘパ
リンに対してほとんど親和性がないことを示した。ロブ
ら（Ｌｏｂｂ　ｅｔ。

ａｌ、）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、２６Ｌ　　
１９２４ル、２％ドデシル硫酸ナトリウムまたはｏ、ｏ
　ｉ％ツイーン８０と共に１時間インキュベートした。

透析によって変性剤を除去した後、軟寒天アッセイ（ハ
ルパーら（Ｈａｌｐｅｒ　ｅｔ、　ａｌ、）、キャンサ
リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｂ）、４３．
１９７２１９７９　（１９８３））におけるバイオアッ
セイにより、ｈ−ＴＧＦｅは８Ｍ尿素またはツイーン８
０に対して安定であるが、０．０６５Ｍジチオスレイト
ールまたはドデシル硫酸ナトリウムに対しては不安定で
あることが示された。加えて、軟寒天アッセイ（ハルパ
ーら（Ｈａｌｐｅｒ　ｅＬ、　ａｌ、）、キャンサー・
リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、４３．
１９７２〜１９７９　（１９８３））の後、ｈ−ＴＧＦ
ｅは０．１ｇ／１００ｍｌリン酸テトラブチルアンモニ
ウムに対して不安定であることが判明した。

４、トリプシンのｈ−ＴＧＦｅに対する影響前記方法に
よってトリプシンに対するｈ−ＴＧＦｅの感受性を評価
し、結果はｈ−ＴＧＦｅ活性が５０μｇ／ｍｌのトリプ
シンによって不活性化されることを示した。

１９２８　（１９８６）によって報告されているごトく
、ヘパリンについてのＦＧＦ−様成長因子の公知親和性
から予測されるように、対照的に、同一カラムに適用し
たＦＧＦは完全に保持された。

ｈ−ＴＧＦｅの生物学的活性はＦＧＦのそれから分離す
ることもできた。逆相精製工程（後記参照）からのｈ−
ＴＧＦｅの一部をＦＢＨＥ細胞上でアッセイに付した場
合、増殖の刺激は観察されなかったが、対照的にＦＧＦ
によって生じた細胞成長では８ないし９倍増加した。Ｆ
ＧＦをｈ−ＴＧＦｅの存在下でＦＢＨＥ細胞上でのアッ
セイに付した場合、この増殖応答は減少し、これはｈ−
ＴＧＦｅの効果の不存在は単独では試料の抑制剤または
トキシン類での汚染によるものではなかったことを示し
た。さらに、部分的に精製したｈ　−ＴＧＦｅはＰＤＧ
Ｆとは対照的に静止性３Ｔ３細胞におけるチミジン摂取
を刺激しなかった。

３、変性剤のｈ−ＴＧＦｅ活性に対する影響室温にて、
ＳＷ］３細胞からの粗製馴化培地濃縮物を８Ｍ尿素、０
．００５Ｍジチオスレイト−５、ｈ−ＴＧＦｅの精製 ＳＷ１３馴化培地の２５リツトルバツチを、Ｖｙｄａｃ
　　２１８ＴＰバツキング（エイチ・ビイ・ケミカルズ
（ＨＰ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、セントルイス、ミズリ
ー州）を含有する調製カラム、粒子サイズ１５〜２０μ
ｍ１に付し、アセトニトリルのグラジェントで溶出した
。軟寒天アッセイ（ハルパーら（Ｈａｌｐｅｒ　ｅｔ、
　ａｌ、）、キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅ
ｓｅａｒｃｈ）、４３．　　ｌ　９７２−−１９７９　
（１９８３））の後（ピーク■は２０〜３０％アセトニ
トリルで溶出、ピーク■は３５〜４０％で溶出）、活性
の２のピークが得られた画分中で観察された。

画分１７〜２０（ピークＩ）および２３〜２６（ピーク
■）を各々プールし、濃縮し、サイズ排除カラムに適用
した。活性物は５９ｋＤの見掛は分子質量（ピークＩ）
で、および３５〜４５ｋＤ（ピク■）で溶出した。ピー
ク■物質の粗製馴化培地の試料を８Ｍ尿素であらかじめ
処理して非共有結合蛋白を解離させ、立体排除カラム上
で分画し、５９ｋＤの見掛は分子質量で活性の単一ピー
クが観察された。

ピークＩ物質のさらなる精製はＣＭ２ＳＷ陽イオン交換
カラム（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）、フレルトン（
Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）、カリフォルニア州）上のＨＰＬ
Ｃで行った。ｈ−ＴＧＦｅは０．３ＭＮａＣ４で溶出し
、続いて分析逆相カラムに付した。０゜２５％／分で増
加させる０〜５０％アセトニトリルの直線状グラジェン
トで溶出を行った。ｈ−ＴＧＦｅはほぼ２０％アセトニ
トリル（液速−１ｍ（１／分）で単一ピークとして溶出
した。ＵＶ吸収のプロフィールから判断して、このピー
クは大部分の汚染蛋白から十分に分離されていた。

精製の統計処理により、調製逆相ＨＰＬＣによるＳＷ１
３馴化培地からのｈ−ＴＧＦｅの優れた回収が示される
。８０％を越える合計活性がピークＩおよび■間におお
まかに等量分配されていた。

サイズ排除工程の後、回収は合計の５０％であったが、
元の活性のｌ）％のみが陽イオン交換ＨＰＬＣの後に存
在していた。それにもかかわらず、この工程の結果、サ
イズ排除カラムからの物質は１００倍以上の精製となっ
た。回収または精製度を測定する分析逆相工程の後、不
十分な物質が存在していた。しかしながら、活性のおお
まかな見積りによると３００００Ｕ／ｍｇの特異的活性
が示唆された。ＩＵは単位であり、１単位はハルパーら
（１９８３Ｌ前掲、の軟寒天アッセイにおける最大応答
の５０％を与えるのに要するｈ−ＴＧＦｅの量（ｍ　ｇ
／蛋白またはμａ試料／培地ｍαのいずれか）である。

この数値、すなわち３００００Ｕ／ｍｇはこの段階にお
いて２０００倍以上の精製に対応する。

特許出願人　スミスクライン・ビーチャム・コーポレイ
ション

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. （１）以下の特性： ａ）オートクライン（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）様式で軟寒
   天中のＳＷ１３細胞の器壁非依存性増殖を刺激し；ｂ）
   ｐＨ２〜４、８Ｍ尿素および０．０１％ツイーン（Ｔｗ
   ｅｅｎ）８０に対して安定であるが、５０μｇ／ｍｌト
   リプシン、０．０６５Ｍジチオスレイトール、０．１ｇ
   ／１００ｍｌリン酸テトラブチルアンモニウムおよび２
   ％ドデシル硫酸ナトリウムに対して不安定であり； ｃ）ヘパリン−セファロース複合体に結合しないが、レ
   ッド・セファロースには結合し； ｄ）単層培養において胎児ウシ内皮細胞の増殖を刺激せ
   ず； ｅ）８Ｍ尿素の存在下でサイズ排除ゲル浸透クロマトグ
   ラフィーにより測定して約５９キロダルトンの分子質量
   を有し； ｆ）８Ｍ尿素の存在下で陽イオン交換クロマトグラフィ
   ーで測定して約８．５〜１０の等電点を有し、 ｇ）Ｃ１８逆相カラムから２０〜３０％アセトニトリル
   で溶出し； ｈ）ＳＷ１３、ＳＷ４０３、ＬＯＶＯ、ＮＲＫ−５２Ｅ
   、ＷＩＤＲ、ＨＣＴ−１５、ＳＫＣ０１およびＳＷ４８
   細胞系によって産生され、人乳中で検出可能である； を有することを特徴とするヒト上皮細胞形質転換成長因
   子（ｈ−ＴＧＦｅ）。
2. （２）有効量のヒト上皮細胞形質転換成長因子（ｈ−Ｔ
   ＧＦｅ）および医薬上許容される担体または賦形剤より
   なり、該ｈ−ＴＧＦｅが以下の特性： ａ）オートクライン（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）様式で軟寒
   天中のＳＷ１３細胞の器壁非依存性増殖を刺激し；ｂ）
   ｐＨ２〜４、８Ｍ尿素および０．０１％ツイーン（Ｔｗ
   ｅｅｎ）８０に対して安定であるが、５０μｇ／ｍｌト
   リプシン、０．０６５Ｍジチオスレイトール、０．１ｇ
   ／１００ｍｌリン酸テトラブチルアンモニウムおよび２
   ％ドデシル硫酸ナトリウムに対して不安定であり； ｃ）ヘパリン−セファロース複合体に結合しないが、レ
   ッド・セファロースには結合し； ｄ）単層培養において胎児ウシ内皮細胞の増殖を刺激せ
   ず； ｅ）８Ｍ尿素の存在下でサイズ排除ゲル浸透クロマトグ
   ラフィーにより測定して約５９キロダルトンの分子質量
   を有し； ｆ）８Ｍ尿素の存在下で陽イオン交換クロマトグラフィ
   ーで測定して約８．５〜１０の等電点を有し、 ｇ）Ｃ１８逆相カラムから２０〜３０％アセトニトリル
   で溶出し； ｈ）ＳＷ１３、ＳＷ４０３、ＬＯＶＯ、ＮＲＫ−５２Ｅ
   、ＷＩＤＲ、ＨＣＴ−１５、ＳＫＣ０１およびＳＷ４８
   細胞系によって産生され、人乳中で検出可能である； を有することを特徴とする医薬組成物。
3. （３）粘膜を介する投与に適当な剤型である請求項第（
   ２）記載の医薬組成物。
4. （４）非経口投与に適した剤型である請求項第（２）記
   載の医薬組成物。
5. （５）局所投与に適した剤型である請求項第（２）記載
   の医薬組成物。
6. （６）ａ）血清不存在下の馴化培地中で ｈ−ＴＧＦｅを産生できる細胞または細胞系を血清不存
   在下で培養し、 ｂ）該培養から産生されたｈ−ＴＧＦｅを単離すること
   を特徴とするｈ−ＴＧＦｅの製法。
7. （７）ａ）血清無しの条件下でｈ−ＴＧＦｅを産生でき
   る細胞または細胞系を血清不存在下で培養し； ｂ）好ましくは細胞が集密化するまで増殖した後、工程
   ａで産生された馴化培地を収集し；ｃ）続いて、該馴化
   培地を逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグ
   ラフィーおよび陽イオン交換高速液体クロマトグラフィ
   ーに付し；次いで、ｄ）ｈ−ＴＧＦｅを含有する画分を
   収集する請求項第（６）記載の方法。
8. （８）請求項第（７）記載の製法によって産生されたｈ
   −ＴＧＦｅ。
9. （９）ａ）好ましくは集密化するまで細胞を増殖させた
   後、ｈ−ＴＧＦｅを産生できる細胞の馴化培地を収集し
   ； ｂ）続いて、該馴化培地を逆相クロマトグラフィー、サ
   イズ排除クロマトグラフィー、次いで陽イオン交換高速
   液体クロマトグラフィーに付し；次いで、 ｃ）ｈ−ＴＧＦｅを含有する画分を収集することを特徴
   とするｈ−ＴＧＦｅの精製法。
10. （１０）請求項第（９）記載の方法によって精製したｈ
    −ＴＧＦｅ。
11. （１１）ｈ−ＴＧＦｅコーディング配列よりなることを
    特徴とする組換体ＤＮＡ配列。
12. （１２）ｈ−ＴＧＦｅコーディング配列を含有するｃＤ
    ＮＡである請求項第（１１）記載の組換体ＤＮＡ配列。
13. （１３）発現制御配列に作動可能に連結したｈ−ＴＧＦ
    ｅを含有することを特徴とする組換体ＤＮＡベクター。
14. （１４）請求項第（１３）記載のベクターで形質転換し
    た宿主細胞。
15. （１５）所望の宿主細胞を請求項第（１３）記載のベク
    ターで形質転換することを特徴とする形質転換宿主の製
    法。
16. （１６）請求項第（１４）記載の形質転換宿主を適当な
    培地中で培養することを特徴とするｈ−ＴＧＦｅの産生
    法。
17. （１７）請求項第（１６）記載の製法によって産生され
    たｈ−ＴＧＦｅ。
18. （１８）ｈ−ＴＧＦｅに対して反応性である多クローン
    または単クローン抗体。
19. （１９）請求項第（１８）記載のｈ−ＴＧＦｅ抗体に対
    して反応性である多クローンまたは単クローン抗体。
20. （２０）請求項第（１８）記載のコーディング配列を哺
    乳動物胚に導入し、該胚を成体まで成長させ、乳を生産
    するようにそれを誘導し、次いでかく産生された蛋白を
    単離することを特徴とする該コーディング配列によって
    コード付けされる蛋白の製法。
21. （２１）ｈ−ＴＧＦｅコーディング配列を含有すること
    を特徴とする合成ＤＮＡ分子。