PT92015A - Processo de producao e de purificacao de um factor de crescimento transformante do epitelio humano - Google Patents

Description

70 016 SKB CABE 14395

MEMÓRIA DESCRITIVA

Antecedentes do Invento 0 presente invento refere-se ao processo de produção e de purificação de um factor de crescimento trans f©rmante das células eciteliais humanas (a seguir referido como "h-TGFe"), de uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade efectiva de h-TGFe e urn veiculo ou diluente farmac euticamente aceitável e também ac processo de estimulação do crescimento das células epiteliais num humano em sua necessidade por administração de uma quantidade efectiva de h-TGFe a esse humano.

Tem sido identificado um número de polipéptidos biologicamente setivos designados "factores de crescimento transformantes (TGF) e isolados pela sua capacidade para promover o crescimento independente da fixação de uma célula indicadora apropriada. Os exemplos incluem o TGF- o< [Marquardt et al, Science, 223, 1079-1033 (1976)], uma molécula íntimamente relacionada com o factor ds crescimento epidérmico, e o TGF-β [Froliek et ad, Proc. Hat!. Acad. Sei.. U.3.A., 80, 3676-3680 (1983)], uma substância diferente do TGF-<x e de outros factores de crescimento conhecidos As células indicadoras utilizadas para medir a actívidade destes TGF são originárias do fibroblasto (fibroblastos do rim de ratazanas NRK-49F para o TGF- 0< e Í3, s f ibroblastos dos embriões de ratinhos AKR-2B só para o TGF-U). A utilisaçAo de células do fibroblasto em bioensaios para detectar a actívidade do TGF tende a resultar na descoberta de moléculas que são principalmente activas nas células mesênquimais, embora o TGF-PS tenha sido mostrado estimular o crescimento das células epiteiíais mamárias [Perroteau st al, Anticâncer Research, 6, 339 (1936)] e o TGF-S inibir a proliferação de um número de linhas de células epiteliais [Roberts et al., Proc . Nat 1. Acad, Sci . , U. 3 . A. , 82, 119-123 (1985)].

Ha 1 per et aJL, Câncer Research, 43, 1972-1979 (1983), relataram que as células 3W13, que eram derivadas de um adenocarcinoma humano do córtex ad-renal, só formavam umas poucas colónias pequenas quando suspendidas em agar mole a baixas densidades de células, mas que o número e tamanho das colónias aumentou dramaticamente a seguir á estimulação com meio livre ds soro condicio- -3- 70 016 SKB CASE 14395 nado pelas células SW13, e Ha 1 per et al_ postularam que um tal aumento indica a possibilidade de auto-estimulação nestas células malignas. Ha 1 per et ad também relataram que cs extractos de etanol ácido e os meios condicionados das três linhas de células do carcinoma humano (M31, D562 e A549) estimularam as células 3W13 para formarem colónias crescendo progressiva&ente em ágar mole. Ά caracterização preliminar do componente activo dos extractos de etanol ácido de carcinomas humanos indicou que c componente activo era estável ao ácido e calor, sensível à tripsina ou ao ditiotreitol. tinha uma massa molecular aparente de 20-22 quilodaltons e podia ser separado das activiáades semelhantes ao TGF- & e íí por crcmatografia líquida de alta pressão (HPLC). Detectou-ss actividade mimetisando cs efeitos da substância derivada dos extractos de etanol ácido, em extractos de etanol ácido em 26 dos 32 (80¾) carcinomas humanos recentemente excisados mas sõ o foi em um de 9 neoplasmas não-carcincmato-sos. Micionalmente, a actividade mimetisando os efeitos da substância derivada dos extractos de etanol ácido foi detectada em extractos de rim de bovinos e humanos não-neop1ésicos, e numa extensão menor, no pulmão humano e em embriões de ratinhos Ha1per et ai, postularam que a substância derivada dos extractos de etanol acido é de origem epitslial.

Ha 1 per et al. Câncer Research, 47,. 4552-4559 (1987). revelam a purificação e a caracterização de um factor de crescimento tranformante isolado a partir dos extractos de etanol acido do rim de bovinos s referiram que um tal material derivado de bovinos (a) estimulou o crescimento em ágar mole de certas linhas de células epiteliais tais como células 3W13; duas linhas de células do carcinoma de células escamosas humanas. M31 e D562, células AER-2B de embriões de ratinhos; (b) tinha um peso iiiulecular de 23 000 a 25 000 como determinado por electroforese em gel de dodecilsul fato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE); (c) não se ligou ao receptor FGF como determinado no ensaio de ligação rádio-receptor FGF utilizando células BHK-21; (d) era estável ao calor; (e) era lábil à tripsina; (f) era provavelmente um polípáptido de cadeia única; (g) sõ era parcialmente sensível aos agentes redutores; e (h) não se ligou significativamente quer -4- 70 016 SKB CASE 14395 aos rececptores TGFP, quer EGF.

Sumário do Invento

Este invento refere-se ao processo de produção de um factor de crescimento transformante das células epiteliais humanas (h-TGFe) que tem as característícas seguintes: a) estimula o crescimento independente da fixação das células SW13 em ágar mole duma forma auto crina ; b) é estável a cada um de pH 2-4, ureia a 8M e Tween 80 a 0,01%, mas lábil a cada um de 50^0g /ml de tripsina, ditiotreitol a 0,065M, 0,lg/100ml de fosfato de tetrabutilamónio e dodecilsul-fato de sódio a 2%; c) não se liga ao conjugado heparina-sepharose mas liga-se á sepharose vermelha; d) não consegue estimular o crescimento das células endoteli-ais do coração de bovinos fetais em cultura de monocamada; e) tem uma massa molecular de aproximadamente 59 quílodal -tons (KD) como medida por cromatografia de penetração em gel de exclusão de tamanhos na presença de ureia a 8M; f) tem um ponto isoeléctrico de aproximadamente 8,5-10 como medido por cromatografia de permuta cationíca na presença de ureia a 8M; g) elui com acetonitrilo a 20-30% de uma coluna de fase inversa C18; e h) é produzido pelas linhas de células SW13, SW403, LOVO, NRK-52E, WIDR, HCT-15, SKC01 e SW48 e é detectável no leite-humano .

Pelo termo "crescimento independente da fixação das células SW13 em agar mole duma forma autocrina quer-se dizer que o / crescimento independente da fixação das células SW13 em agar mole é estimulado por um factor de crescimento produzido pelas células SW13. Esse "crescimento independente da fixação das células SW13 em ágar mole" é medido pelo processo descrito por Halper et al, Câncer Research, 43, 1972-1979 (1983). De preferência, esse processo é modificado de maneira a que a base e as camadas superi^ ores contenham agarose a 0,5% e 0,3%, respectivarnente em DMEM, -5- 70 016 SKB CASE 14395 soro bovino fetal a 10%, e são implantadas 5000 células por disco de 3 cm.

Pelo termo "sepharose vermelha" quer-se dizer corante vermelho (Procion red HE-3B) ligado as pérolas de agarose para suporte. A sepharose vermelha está comercialmente disponível na Pharmacia, Piscataway, New Jersey. Sepharose-"7 é o nome comercial para a qualidade de pérolas de agarose vendidas pela Pharmacia.

Pelo termo "crescimento das células endoteliais do coração de bovinos fetais em cultura monocamada" quer-se dizer o crescimento dessas células como medido pelo processo de Gospoda-rowicz et a_l, J. Biol. Chem. , 250, 2515 (1975) .

Este invento refere-se também ao processo de produção de uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade efectiva de h-TGFe e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

Este invento refere-se também a um processo de estimulação do crescimento das células epiteliais num humano em sua necessidade, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade estimulante das células epiteliais de h-TGFe a esse humano.

Este invento refere-se também a um processo de produção de h-TGFe, caracterizado por compreender: a) a cultura, na ausência de soro, de células ou de uma linha de células que são capazes de produzir h-TGFe em meio condicionado na ausência de soro; e b) o isolamento do h-TGFe produzido a partir dessa cultura.

Be preferência, o processo de produção de h-TGFe inclui os passes seguintes: a) a cultura, na ausência de soro, de células ou de uma linha de células que são capazes de produzir h-TGFe em meio condicionado na ausência de soro; b) a recolha do meio condicionado produzido no passo a, após as células terem crescido até h confluência; c) a sujeição, sequencialmente, do meio condicionado a cromatografia de fase inversa, cromatografia de exclusão de tamanhos e cromatografia liquida de alta pessão de permuta cati-ónica; e d) a recolha das fraeçães contendo h-TGFe. —6— 70 016 3KB CASE 14395

Além disso, este invento refere-se ao h-TGFe purificado de acordo com o processo deste invento.

Este invento refere-se também a um processo do purificação do h-TGFe, caractsrizado por compreender: a) a recolha do meio condicionado de células capazes de produzir h-TGFe, após as células terem crescido até a confluência; h) a sujeição, sequencialmente, do meio condicionado a cromaiografia de fase inversa, cromategrafia de exclusão ds tamanhos e cromat ogra fia líquida de alta pressão de permuta Cctióniccí: e c) a recolha das fracções contendo h-TGFe.

Além disso, este invento refere-se ao h-TGFe purificado de acordo com o processo deste invento.

Este invento refere-se também ao processo de produção de uma molécula de ADN recombinante, tal como ADNc, contendo a sequência de codificação do h-TGFe. 0 termo "sequência de codificação do h-TGFe" envolve a sequência de codificação do h-TGFe de tipo selvagem assim como todos os mutantes e derivados funcionais da sequência de codificação do h-TGFe nativa. Pelo termo "mutantes e derivados funcionais da sequência de codificação do h-TGFe nativa" quer-se dizer qualquer sequência de codificação que codifica uma proteína que tem substancialmente a mesma actividade biológica que o h-TGFe nativo, i. e., uma proteína que tem a capacidade de induzir o crescimento das células epiteliais como acima descrito. Esses mutantes e derivados funcionais da sequência de codificação do h-TGFe nativa incluem as suas formas quimicamente modificadas, p. e., formas glicosiladas ou alquiladas que têm substancialmente a mesma actividade biológica que o h-TGFe nativo. Eles também incluem os mutantes e derivados nos quais tenham sido rearranjades, adicionados, deleccionados ou substituídos um ou mais aminoácidos com os quais tenha sido fundido ou conjugado um polipéptido heterólogo.

Este invento rsfere-se também ao processo de produção de uma molécula de ADN sintética contendo a sequência de codificação do h-TGFe. Como referido acima, o termo "sequência de codificação do h-TGFe" envolve a sequência de codificação do h-TGFe de tipo 70 016 8KB CASE 14395 selvagem assim como todos os mutantes e derivados funcionais da sequência de codificação do h-TGFe nativo. Pelo termo "mutantes e derivados funcionais da sequência de codificação do h-TGFe nativa" quer-se dizer qualquer sequência de codificação que codifica uma proteína que tem substancialmente a mesma actividade biológica que o h-TGFe nativo, 1. e., uma proteína que tem a capacidade de induzir o crescimento das células epiteliais. Tais mutantes e derivados funcionais da sequência de codificação do h-TGFe incluem as suas formas quimicamente modificadas, p. e., formas glico-siladas e alquiladas que têm substancialmente a mesma actividade biológica que o h-TGFe nativo.

Este invento refere-se também ao processo de produção de um vector de ADN recombinante contendo a sequência de codificação do h-TGFe operativamente associada com uma sequência de controlo da expressão.

Este invento refere-se também a uma célula hospedeira transformada com o vector deste invento, e a um processo de produção de um tal hospedeiro transformado caracterizado por compreender a transformação de uma célula hospedeira desejada com o vector produzido de acordo com o invento.

Este invento refere-se também ainda a um outro processo de produção de h-TGFe caracterizado por compreender a cultura do hospedeiro transformado, produzido de acordo com o invento, num meio de cultura apropriado. Este invento refere-se também ao h-TGFe produzido de acordo com esse processo. 0 presente invento refere-se também a um processo de produção da proteína codificada pela sequência de codificação deste invento, caracterizado por compreender a introdução da sequência de codificação deste invento em embriões de mamíferos, de preferencia em associação com as sequências de sinal que dirigem a secreção de h-TGFe no leite, o crescimento dos embriões até à maturidade e a sua indução para produzirem leite, e o isolamento da proteína assim produzida.

Este invento refere-se também ao processo de produção de um anticorpo policlonal ou monoclonal que é reactivo contra o h-TGFe.

Este invento refere-se também ao processo de produção de um -8- 70 016 3KB CASE 14395 anticorpo policlonal ou monoclonal que é reactivo contra um anticorpo h-TGFe. Um tal anticorpo policlonal ou monoclonal é geralmente referido como um anticorpo anti-idiotipo.

Descrição Detalhada do Invento

Este invento refere-se ao processo de produção de um factor de crescimento transformante do epitélio humano ("h-TGFe") que e diferente dos outros factores de crescimento conhecidos. Tem-se verificado que o h-TGFe estimula o crescimento das células SW13 em ágar mole duma forma "autocrina". A linha de células BW13 está puhiicamsnte disponível a partir de várias fontes, p.e., a partir da "American Type Culture Collection", Rockville, Maryland, U.3.A., sob o número de matrícula CCL105. A actividade do h-TGFe é também verificada em extractos de carcinomas do colon humano e é também detectávsl em extractos acidificados de leite humano e em meios condicionados isentos de soro pelas linhas de células seguintes, a maioria das quais foram derivadas de carcinomas do cólon, i.e., SW4G3, LQVO, ΝΕΚ-52Ξ, WIDP., HCT-15, SKC01 e SW48. Todas as linhas de células acima estio publicamsnte disponíveis, p.e., todas essas linhas de células estão disponíveis da "American Type Collection", Rockville, Maryland, U.S.A.. Estas constatações sugerem uma associação da actividade do h-TGFe com as células e tecidos epiteliais. Ά resposta de estimulação do crescimento das células 37713 ao h-TGFe não é mimetizada por quaisquer dos factores de crescimento conhecidos ccm a ercepçao do factor de crescimento do fihrofalasto (FGF). Foi utilizada uma preparação comercialmente disponível de FGF para avaliar as diferenças sntrs o FGF e o h-TGFe. Uma vez oue a preparação comercial de FGF utilizada para testar até agora a resposta das células SW13, estava impura, o material FGF foi fraccionado por HPLC de fase inversa e foi observada a co-purifi-cação das SW13 e a actividade estimulatória das células endoteliais do coração de bovinos fetais (FBHE), sugerindo que as células SW13 estavam de facto respondendo ao FGF s não a uma impureza da amostra. 0 crescimento das células FBHE em cultura de monocamada —9— 70 016 3KB CASE 14395 foi realizado de acordo com o processo de Gospodarowics et ai» J.Bicl, Chem., 250. 2515(1975). Contudo, o factor produzido pelas células 3W13 (h-TGFe) não é idêntico ao FGF uma vez que ele não se liga à heparina como faz o FGF, é estável em ácido enquanto que o FGF não é, e não estimula a proliferação das células FBHE ou 3T3, ambas as quais respondem ao FGF. A caracterização bioquímica do h-TGFe indica que sis é estável a cada uma das condições seguintes: pH 2-4. ureia a 3M e Toreen 80 a 0,01%, mas que o h-TGFe é lábil em cada uma das condições seguintes: dodeci1su1fato de sódio a 2%, SOjUg/ml de tripsina, 0,lg/100 ml de fosfato de tetrabuti1 amónio s ditiotreitol a 0,065 Μ. A massa molecular estimada por croraat ografia de penetração em gel de exclusão de tamanhos na presença de ureia a 8 M é de aproximadamente 59 quilodaltons (KD). A instalabi1 idade do h-TGFe ao dodeciIsulfato de sódio exclui qualquer tentativa para eluír a actividade dos geles de poliacrilamída como tem sido realizado para o possível correspondente de bovino do h-TGFe. Ver, Ha. 1 per e Moses, Câncer Research. 47, 4552-4559(1987). Contudo, a instalabi1 idade do h-TGFe ao dodeciIsulfato de sódio sugere que existem diferenças estruturais entre h-TGFe e a molécula de bovino descrita por Ha1per e Moses (1987), supra. A purificação preliminar do h-TGFe a partir de 25 litros de meio condicionado de SW13 foi realizada utilizando HPLC de fase inversa (C13) e de permuta catiónica (carboximetilo). Embora se tenham recuperado dois picos de actividade a partir da coluna C18 de grande escala é provável que o segundo pico (mais hidrofóhico) seja um artefacto do processo de HPLC, uma vez que após tratamento com ureia a 8 M e fraccionamento numa coluna BioGel P60, o segundo pico é co-eluído com a actividade do Pico I. Este resultado sugere que o material de Pico II é um agregado de h-TGFe com proteínas não-identifiçadas. 0 comportamento do h-TGFe numa coluna de permuta catiónica de carboximetilo indica um pi aparente próximo do do tripsinógenio (aproximadamente 9,3). Espe-cifieamente, o pi do h-TGFe como medido por cromatografia de permuta catiónica na presença de ureia a 8 M foi de aproximadamente 8,5-10. Estes resultados mostram que os processos de permuta -10- 70 016 SKB CASE 14395 catiónica e de fase inversa são uteis na purificação do h-TGFe.

Este invento refere-se também a um processo de produção do h-TGFe, caracterizado por compreender: a) a cultura, na ausência de soro, de células ou de uma linha de células que são capazes de produzir h-TGFe em meio condicionado na ausência de soro; e b) o isolamento do h-TGFe produzido a partir dessa cultura.

De preferência, o processo de produção do h-TGFe inclui os passos seguintes: a) a cultura, na ausência de soro, de células ou de uma linha de células que são capazes de produzir h-TGFe na ausência de soro; b) a recolha do meio, de preferência após as células terem crescido até à confluência;. c) a sujeição, sequencialmente, do meio a cromatografia de fase inversa, cromatografia de exclusão de tamanhos e cromatogra fia liquida de alta pressão de permuta catióníca; e d) a recolha das fracções contendo h-TGFe.

Este invento refere-se também ao h-TGFe produzido de acordo com o processo deste invento.

Como acima esboçado, o processo de purificação deste invento compreende três passos que podem ser utilizados para o isolamento e purificação do h-TGFe a partir de uma solução impura. Estes pas sos compreendem: a) a recolha do meio condicionado de células capazes de produzir h-TGFe, de preferência após as células terem crescido até à confluência; b) a sujeição, sequencialmente, do meio condicionado a cromatografia de fase inversa, cromatografia de exclusão de tamanhos e cromatografia liquida de alta pressão de permuta cati ónica; e c) a recolha das fracçSes contendo h-TGFe.

Este invento refere-se também ao h-TGFe purificado de acordo com o processo deste invento.

Cada um dos passos do processo de produção ou purificação do invento pode ser combinado com outros passos do processo para se -11- 70 016 SKB CISE 14395 ehegar a um processo completo para o Isolamento e purificação do h-TGFe a partir da produção duma cultura de células., procarióti-css ou eucariótícas, nativas ou recombinantes. 0 meio condicionado é recolhido (colhido) por decantação a partir de um sistema de cultura descontínua ou por recolha do meio a partir de um sistema de fluxo contínuo. 0 meio é opcionalmente clarificado tal como por filtração e/ou centrifugação, e o h-TGFe é inicialmente isolado pelas técnicas convenci-nais, p.e., precipitação selectiva, ou, de preferência, cromato-grafia de adsorção. Este passo resulta no isolamento da maioria do h-TGFe durante a redução substancial do volume de meio para posterior -processamento. Ã cromatografia de adsorção emprega um suporte sólido capaz de tratar um largo volume de meio a uma velocidade de fluxo elevada e com elevada eficiência. Um exemplo dessa cromatografia de adsorção é a cromatografia que utiliza um ligando de afinidade tal como anticorpos policlonais ou moncclona is, permutadores catiónicos tal como a S-sepharcse, um agente que1ante de metais, aglutinina de gérmen de trigo, e corantes variados. 0 passo de recolha preferido é a cromatografia de permuta iónica. 0 suporte pode ser, p.e., um gel mole tal como um gel de dextrana, aqarose ou poliacrilamida, um gsl rígido tal como um gel de polímero de vínilo Fractogsl , com um tamanho de 32-63 p m (Pierce Chemical Co, Rcckford. Illinois) ou qualquer outro suporte capas de adsorver h-TGFe que é estável abaixo de pH 5.

Na realização do passo de recolha, a lavagem é realizada de preferência a pH 2-5, de preferência a pH 4,0. 0 agente tamponants pode ser qualquer ácido/sal solúvel em água, por exemplo, ácido acético, ácido adipico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido tartárico, acido aspártico e ácido glutâmico, s os seus sais. 0 tampão preferido é o acetato de amónio. ?ara eluir o h-TGFe, é utilizada uma soluçãc de um sal inorgânico de um metal alcalino ou alcalino-terroso ou de uai caocropo a pH<5, p.e., pH 4,0. Ά soluçãc de eluícão preferida é o cloreto de sódio a 0,5 a 2,5M, de preferência a 2,0M em acetato de amónio a 0,05M (pH 4,0). Ά solução impura obtida do passo de recolha é ainda de preíe- -12- 70 016 5KB CISE 14395 rência, parcialmente purificada antes da cromatografia de fase inversa. A purificação parcial pode ser realizada por qualquer seio incluindo, por exemplo, por precipitação selectiva, cromatografia de afinidade, ultrafi1tração, cromatografia de fase normal e exclusão de tamanhos, ou qualquer combinação destes ou doutros passos. De preferência, a solução impura tem sido parcialmente purificada de forma que a actividade específica cio h-TGFe seja de pelo menos cerca de 5 vezes e de preferência cerca de 10 a 20 vezes superior ao material de partida, baseada no teor de proteína total e actividade biológica no ensaio de ágar mole das SW13 anterior ao procedimento de fase inversa.

Passos ilustrativos do processo para o alcance de um grau desejado de pureza antes do procedimento da fase inversa são a ultrafiItração utilizando, p.e., membranas ΎΜ5 (Amicon, Banvers, Massachusetts, U.S.A.) seguida por cromatografia de exclusão de tamanhos sobre, p.e., BioGel P60 (Bio Rad, Rockville Center, New York, U.S.A.). Essa cromatografia é realizada a um pH inferior a 4 e emprega de preferência ácido acético (1M) e é realizada na presença de um agente caotrópico tal como ureia a SM. A eluiçao é realizada sob as mesmas condições.

No processo preferido do invento, a solução parcialmente purificada do passo de recolha que foi tratada por ultrafiltração e por um passo de cromatografia de exclusão de tamanhos e depois tratada por cromatografia de fase inversa. A cromatografia de fase inversa utiliza um suporte hidrofóbi-co para adsorver uma proteína de um solvente aquoso, seguida por eluiçãc selectiva com um solvente orgânico polar, tipicamente uma mistura de álcool-água. 0 solvente orgânico polar causa a eluiçao por deslocamento dos domínios hidrofóbicos no polipéptido. Muitas proteínas não podem ser purificadas desta forma devido à utilização de condições bruscas que podem causar numa proteína, especialmente numa proteína para a qual a actividade á dependente da conformação, a perda de actividade. Ά cromatografia de fase inversa é tipicamente realizada, utilizando um suporte de alquilsílica, embora possa ser empregue qualquer suporte hidrofóbico, p.e., carbohidrato substituído por alquilo ou geles de alumina. 0 suporte preferido é uma sílica -13- 70 016 3KB CASE 14395 ligads a C_> até C18' de preferência . Outros si 1anos incluem os octildimet.il, octadecildimeti 1, fenildimeti 1, actil, octadecil s fenil si 1anos. 0 tamanho da partícula pode ser de 5-100β m, de preferência cerca de 15-20 Jf m. 0 tamanho de poro típico é de 200 O tí a 500 A, de preferência 300 A. Ά solução impura antes do passo de cromatografia de fase inversa é de preferência ajustada a um pH muito baixo, p.e., de 1,5 a 3,5, com, p.e., ácido hsptafluorobutírico, ácido acético, ácido fosfórico ou ácido trifluoroacético. A inclusão de um caotropo ou de um solvente orgânico na solução impura, p.e.. ureia a 8M, melhora a separação, aparentemente per dissociação dos agregados de h-TGFe. A eluição é tipicamente realizada, adicionando quantidades crescentes de um solvente orgânico para diminuir as interaeções hídrofóbicas, p.e., aeetonitrilo, dioxano tetra-liidrofurano ou um álcool míscivel em água, p.e., etanol, metanol, n-propanol ou isopropanol. 0 gradiente de eluíçac preferido é o aeetonitrilo, de 0-50%, em ácido trifluoroacético a 0,05%. A seguir à cromatografia de fase inversa, são desejáveis três passos mais para produzirem um h-TGFe mais puro. Estes passos são a cromatografia de permuta iónica, de preferência na presença de um caotropo, a cromatografia líquida de alta pressão de fase inversa (HPLC) e a cromatografia de afinidade, de preferência em sepharose vermelha. 0 passo de permuta iónica serve para concentrar e h-TGFe e para remover o solvente orgânico. De preferência este procedimento é realizado utilizando um suporte de permuta catiónica tal como um suporte de earboximetilo ou sulfopropilo equilibrado com uma solução tamponants tal como sulfato de amónio a 0,05M (pH4) e um caotropo tal como ureia a SM. 0 material é sluído a partir do suporte por aumento da concentração de sal, p.e., de 0,05M para 1M, enquanto se mantém a concentração do caotropo constante. O passo de fase inversa remove os sais s a ureia antes da cromatografia de afinidade. Pode ser realizado como descrito acima, excepto que o tamanho, de partícula preferido é de 5 y- m e a fase estacionária preferida é o fenilsilano. 0 passo de sepharose vermelha é realizado por liofi- -14- 70 016 SKB CASE 14395 lização das proteínas activas do passo de fase inversa, seguido por reconstituição num agente tamponante, p.e., fosfato de sódio a 0,Q5M (pH7), contendo uma concentração baixa .de um sal, p.e., cloreto de sódio a 0,3M. A coluna contém tipicamente Iml de sepharose vermelha (Pharmacia). Após o carregamento do h-TGFe reconstituído, a coluna é lavada com uma preparação de sal tamponada,p.e., cloreto de sódio a 1M em fosfato de sódio a Q,05M ÇpH7,0). Ela é depois lavada com uma solução ácida p.e., ácido trifluoroacético a 0,05%, antes de ser eluída com uma combinação de um sal elevado e de um solvente orgânico, p.e., acetato de amónio a 1M em n-propanol a 50%. é muitas vezes desejável purificar adicionalmente o material eluído utilizando um passo de fase inversa como descrito acima para remover o sal e qualquer corante vermelho que se possa ter destacado da coluna.

Cada passo do processo do invento, como previamente notado, pjode ser combinado com outros passos do processo que podem ou não ser passos do processo do invento.

Este invento refere-se também ao processo de produção de uma molécula de ADN recombinante, tal como um ADNc, que contém a sequência de codificação do h-TGFe. Esse ADNc pode ser preparado pelas técnicas convencionais tais como por transcrição inversa de ARNm isolado pelas técnicas convencionais de uma célula ou cultura produzindo h-TGFe, tal como pelo processo de Han et al, Biochemistrv, 26, 1617-1625(1987). Como referido acima, o termo "sequência de codificação do h-TGFe" envolve a sequência de codi ficação do h-TGFe de tipo-selvagem assim como todos os mutantes e derivados funcionais da sequência de codificação do h-TGFe nativa-Pelo termo "mutantes e derivados funcionais da sequência de codi ficaçâo do h-TGFe nativa" quer-se dizer qualquer sequência de codificação, tal como uma fusão da sequência de codificação do h-TGFe com uma outra sequência de codificação de proteína, assim como uma sequência de codificação do h-TGFe nativa contendo substituições, delecçôes ou adições de aminoácidos, que codificam uma proteína que tem substancialmente a mesma actividade biológi ca que o h-TGFe nativo, i.e-., uma proteína que tem a capacidade de induzir o crescimento das células epiteliais. Esses mutantes e derivados funcionais são convencionalmente preparados por um -15- 70 016 SKE CASE 14395 perito na arte empregando, p.e., a mutagénese dirigida ao local, a mutagénese aleatória, a síntese química de sequências de núcleo tidos ou péptidos, a muti lacSo ou a delecçãc de parte de. sequência de codificação do h-TGFe nativo, a modificação química dos acima ou a concatenaçSo de mais do que um segmento da sequência de codificação do h-TGFe. Esses mutantes e derivados funcionais da sequência de codificação do h-TGFe incluem também as suas formas quimicamente modificadas, p.e., formas glicosiladas e alquiladas que têm substancialmente a mesma actividade biológica que o h-TGFe nativo.

Como uma concretização adicional do processo de produção da molécula de ADN recombinante do invento, é proporcionado um •/setor de ADN recombinante compreendendo a sequência de codificação produzida de acordo com este invento. Este vector contém de preferência a sequência de codificação acima em associação operativa com sequências de controlo da expressão adequadas. Por "sequências de controlo da expressão adequadas" entendem-se sequências que regulam a transcrição s a tradução de um gene estrutural. Essas sequências de controlo da expressão são bem conhecidas na arte.

Por outro lado um aspecto adicional deste invento é o processo de produção de uma célula hospedeira transformada com o vector produzido de acordo com este invento. Essa célula hospedeira é capaz de crescer num meio de cultura e é capaz de expressar a sequência de codificação do invento. Essa célula hospedeira é preparada pelo processo deste invento, i.e., transformando uma célula hospedeira desejada com o vector deste invento. Essa transformação é realizada por utilização das técnicas ds transformação convencionais. As células hospedeiras que podem ser adequadas incluem, mas não estão limitadas, às células de mamíferos, células de insectos, células bacteríanas, células de plantas e células fúngicas. Assim, este invento não está limitado a quaisquer células hospedeiras específicas. O presente invento refere-se também a um processo de produção da proteína codificada pela sequência de codificação produzida de acordo com este invento, caracterizado por compreender a cultura do hospedeiro transformado do invento em -16- 70 016 3KB CÃ3E 14395 meios de cultura apropriados e isolamento dessa proteína. Por "meios de cultura apropriados", entendem-se os meios que irao possibilitar ao hospedeiro transformado sobreviver e que também irao possibilitar a esse hospedeiro exprimir a sequência de codificação do invento em quantidade recuperãvei. Será apreciado por um perito na arte que os meios de cultura apropriados para utilizar dependerão da célula hospedeira empregue. 0 isolamento da proteína assim produzida é realizado a partir de um lisado de cultura do hospedeiro ou, se apropriado, directamente a partir do meio de cultura do hospedeiro, e é realizado pelas técnicas de isolamento de proteínas convencionais tais como aquelas discutidos anteriormente.

Este invento refere-se também ao processo de produção de uma molécula de ADN sintética contendo a sequência de codificação do li-TGFe. Pelo termo "sintética" entends-se uma molécula de ADN preparada por técnicas sintéticas, em vez de, por técnicas recombinantes. Essas técnicas são bem conhecidas na arte, utilizando sintetizadores de ADN comercialmente disponíveis Como referido acima, o termo " sequência de codificação do h-TGFe" envolve a sequência de codificação do h-TGFe de tipo-selvagem assim como todos os mutantes e derivados funcionais da sequência de codificação do h-TGFe nativa. Pelo termo "mutantes e derivados funcionais da sequência de codificação do h-TGFe nativa" entende--se qualquer sequência de codificação que codifica uma proteína que tem substancialmente a mesma actividade biológica que o h-TGFe nativo, i.e., uma proteína que tem a capacidade de induzir o crescimento das células epiteliais. Esses mutantes s derivados funcionais da sequência de codificação do h-TGFe incluem também as suas formas quimicamente modificadas, p.e., formas glicosila-das e alquiladas que tem substancialmente a mesma actividade biológica que o h-TGFe nativo. 0 presente invento refere-se também a um processo de produção da proteína codificada pela sequência de codificação deste invento, caracterízado por compreender a introdução da sequência de codificação deste invento em embriões de mamíferos, de preferência em associação com as sequências de sinal que dirigem -17- 70 016 3ΕΒ CJUSE 14395 a secreção de h-TGFe no leite, o crescimento dos embriões até à maturidade e sua indução para produzirem leite, e o isolamento da proteína assim produzida. O processo acima pode ser realizado por um dos peritos na arte utilizando os processos publicados tais ec mo o processo de Gordan et al. Biotechnoloqy. 5, 1183-1187(1987). A proteína produzida pode ser purificada do leite utilizando técnicas similares àquelas descritas acima. 0 presente invento refere-se também à proteína codificada pela sequência de codificação deste invento. Essa proteína pode ser preparada pelo processo deste invento. A11ernativamente, essa proteína pode ser convenientemente preparada por um perito na arte por quaisquer técnicas de preparação de proteínas convencionais tais como síntese de oligonucleótidos.

Este invento refere-se também a qualquer anticorpo policlonal ou monoclonal que é reactivo contra o h-TGFe. Esses anticorpos são preparados utilizando as técnicas convencionais, p.e., os anticorpos policlonais podem ser preparados de acordo com o processo descrito em "Methods in Immunology'', 3§ edição, ed.J.Gorrey et ai, publicado por W.A.Benjamin Ine., páginas 189-213(1987), e os anticorpos monoclonais podem ser preparados do acordo com o processo de Kohler e Milstein, Nature, 256. 495(1975).

Este invento refere-se também a qualquer anticorpo policlonal ou monoclonal que é reactivo contra qualquer anticorpo policlonal ou monoclonal do h-TGFe, i.e., qualquer anticorpo anti-idiotipico. Os anticorpos anti-idiotipo sao convencionalmente preparados por um perito na arte, p.e., pelo processo de Kunkel et al., Science. 140, 1218-1219(1983) ou Sege e Peierson, Proc.Hat 1.Rcad.Sei.. U.S.A., 75» 2443-2447(1978).

Este invento refere-se também a um processo de estimulação do crescimento das células epiteliais num humano que o necessite, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade estimulante das células epiteliais de h-TGFe a esse humano. 0 h-TGFs é uma substância capaz de induzir o crescimento de células epiteliais humanas. Por consequência, ele é especialmente útil nas situações clínicas onde é requerida, a proliferação das células epiteliais, p.e., cicatrização de feridas, tratamento -18- 70 016 8KB CASE 14395 de úlceras ou queimaduras, e re-epitelialização de tecidos a seguir à radioterapia. Uma vez que o h-TGFe não estimula o cresci mento das células fibroblásticas humanas, p.e., células 3T3, a administração de h-TGFe de acordo com o'processo deste invento não é esperada produzir uma resposta fibrótica indesejável. Vários outros factores de crescimento que podem também induzir o crescimento das células epiteliais humanas, p.e., EGF, FGF e fac tor de crescimento derivado das Plaquetas (PDGF), estimulam as células fibroblásticas, e assim, a sua administração pode produ zir uma resposta fibrótica indesejável. Além disso, o h-TGFe é de origem humana e, por consequência, é improvável produzir uma resposta imune indesejável após administração de acordo com o pro cesso deste invento. Os modos de administração do h-TGFe incluem -a aplicação tópica; administração parentérica. p.e., aplicação via injecção intravenosa, subcutânea, ou intramuscular direetamen te no tecido lesado; e via as membranas mucosas, p.e., inalação de aerosol, nasalmente, vaginalmente, rectalmente, entéricamente

(via a membrana mucosa dos intestinos), ou bucalmente. Para apH cação tópica, é apropriada uma gama de dosagem de cerca de 0,01 a 2 cerca de 10 mg/M de superfície corporal, por aplicação. Um perito na arte apreciará que o número de aplicações tópicas por dia ou por curso de tratamento dependerá do número de factores, tais como, mas não limitados, a gravidade da condição a ser tratada, a érea superficial da condição a ser tratada e à idade do indivíduo a ser tratado. Para administração parentérica, é o apropriada uma gama de dosagem de cerca de 1 a cerca de 100 mg/M“ de superfície corporal/dia. Um dos peritos na arte apreciará que o número de aplicações parentéricas por dia ou por curso de tratei mento dependerá do número de factores, tais como, mas não limita dos, à gravidade da condição a ser tratada e à idade e ao peso do indivíduo a ser tratado. Para administração via as membranas mucosas, é apropriada uma gama de dosagem de cerca de 0,01 a cerca de 10 mg por aplicação. Um dos peritos na arte apreciará que o número de aplicações administradas via as membranas mucosas por dia ou por curso de tratamento dependerá de,/nfemero de facto res, tais como, mas não limitados, à gravidade da condição a ser -19- 70 015 8KB CASE 14395 tratada e à idade s ao peso do indivíduo a ser tratado.

Este invento refere-se também ao processo de produção de uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de factor de crescimento trans formara: e das células epitsliaís humanas (h-TGFe) e um veículo ou diluente farmaceuticarne nte aceitável Essas composições podem ser preparadas para utilização em administração parentérica (subcutânea, intramuscular ou intravenosa), particularmente na forma de soluções ou suspensões liquidas; para utilização em administração vaginal ou rectai, particularmente nas formas semi-sólidas tais como cremes e supositórios; ou intranasalmente, particulamente na forma de pós ou gotas nasais.

Como um exemplo de uma composição farmacêutica produzida de acordo com o invento adequada para administração intranasal, a preparação pode ser realizada por enchimento de qualquer recipiente convencional de administração intranasal com a solução farmacêutica parentérica descrita acima. As composições podem convenientemente ser administradas na forma de unidades de dosagem e podem ser preparadas por qualquer um dos processos bem conhecidos na arte farmacêutica, por exemplo como descrito em HemingtorFs Pharmaceutical Sciences, Mack Publishíng Company, E&ston, PA, 1970. As formulações para administração parentérica podem conter como excipientes estéreis comuns água ou solução salina, pclialquilsno-glicóis tais como polietiláno-glicol, óleos de origem vegetal, naftalenos hidrogenados e semelhantes. As formulações para administração vaginal ou rectai, p.e. supositórios, podem conter como excipientes, por eraplc, polialquileno-glicóis, gelatina de petróleo, manteiga de cacau, e semelhantes. Formulações para administração na forma de gotas nasais. As formulações incluem a incorporação em cremes, loções ou suspensões de microcápsulas de libertação retardada, soluções em soluções salinas estéreis (por exemplo para instilação no olho a seguir à lesão da córnea) impregnação de almofadas e ligaduras absorventes ou ligação cruzada covalente às fibras ou almofadas de colagénio utilizadas em cirurgia. As formulações pedem incluir outros fautores de crescimento (tais como factores de crescimento epidérmico, factor de crescimento trans fumante do tipo alfa) -20- 70 016 SKB CISE 14395 faetor da necrose tumoral, factores de crescimento do fibroblasto e insulina, assim como inibidores da protease, vasoconstritorss, etc, para prolongar a duração da acção no local de lesão, Como um exemplo, uma composição farmacêutica tópica deste invento pode ser preparada por dissolução da quantidade desejada de h-TCFe em água, e adição das quantidades necessárias de metil s popilpara~ henos, TweenSO e sorbitol para formar uma solução, e essa solução é aquecida a aproximadamente 50 °C e adicionada a uma solução separada contendo a quantidade necessária de álcool eetílico, álcool estear!lico e Span 20 dissolvida em óleo mineral e aquecida também a aprox imadament e 50 °C, e as duas soluções são misturadas até ocorrer a emulsão e a preparação é agitada até que arrefeça, e depois é enchida em tubos ou vasos de unguento. Como um exemplo de uma composição farmacêutica parentérica do invento, ó dissolvida a quantidade desejada de h-TGFe em água estéril para injecção, são adicionadas as quantidades requeridas de agentes tamponantes, p. e., fosfato de sódio a 0,Q5M, a de cloreto de sódio para ajustarem o pH a 7,4 e tornarem a solução isotóniea, e a solução e assepticamente filtrada e depois enchida em ampolas adequadas para administração parentérica. Como um exemplo de uma composição farmacêutica do invento adequada para administração intr&nas&l, pode ser enchido qualquer recipiente de libertação intranasal convencional com a composição farmacêutica parentérica descrita acima.

Sem posterior elaboração, é de crer que um perito na arte pode, utilizando a descrição precedente, utilizar o presente invento até à sua extensão mais completa. Por consequência, os exemplos seguintes são para serem construídos como meramente ilus trativos s não como uma limitação do âmbito do presente invento, de qualquer forma.

Exerop1os Ά. Materiais e processos 1. Culturas de células e factores ds crescimento.

Todas as linhas de células utilizadas foram obtidas da hmeri can Type Culture Collection, Rockville, Mryland, U.3.Ά. e mostrou -se estarem isentas de contaminação de mieoplasma utilizando o -21- 70 016 3KB CASE 14395 ensaio de Gen Probe (Gen Probe, San Diego, CA 92123) e caldo de cultura (Mlcrobio1ogica1 Associates, Bethesda, Maryland). Ά análise de isoenzina demonstra que as células SW13 eram de origem humana (Corning Authentekit). O factor de crescimento epidérmico murino (EGF), o factor de crescimento derivado das plaquetas humanas (PDGF), o factor de crescimento do fibroblasto da pituitária de bovinos (FGF) e a insulina de bovino, foram fornecidos pela Collaborative Research, Lexington, Massachusetts 02173. A gastrina humana sintética e a bonibesina foram obtidas da Sigma, St. Louís, Missouri. 0 TGF-β das plaquetas humamas foi uma oferta do Dr. R. Assosian, Columbla University, New York. As actividadss biológicas do EGF e do TGF-& foram verificadas utilizando o crescimento de células NRK-49F em agar mole como descrito por Todaro et al, Proc. Matl. Acad. Sei., 77, 5258-5252 (1980). 0 PDGF foi activo no ensaio de incorporação de timidina das NIK-3T3, descrito por Bowen-Pope et al., J. Biol. Chem., 257, 5161-5171 (1982). 2. Recolha de meios condicionados.

As células foram cultivadas até à confluência em Meio de Sagles modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco, Grand Is1and, New York, 14072) suplementado com soro bovino fetal a 1C%, em tubos de ensaio. As células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS), incubadas em DMEM isento de soro durante 4-5 horas íh) e lavadas outra vez com PBS. Cada tubo de ensaio recebeu 200 ml de meio RPMI 1640 isento de vermelho de fenol e isento de soro (Gibco, Grand Is1and, New York, 14072) suplementado com sulfato ferroso recentemente preparado a 10 jug/1 (concentração final) e selenito de sódio a 5 ng/ml (concentração final) (Collaborai ive Research, Lexington, Massachusetts). As células foram incubadas com o meio isento de soro durante 2 dias e o meio foi recolhido, acidificado com ácido trifluoroacético ÇTFA) a 5 ml/li-tro e armazenado a 4 °C. 0 meio condicionado acidificado foi cen-trifugado a ISOOxg durante 15 minutos (mn), filtrado através de uma membrana de 0,45jum (Gelman, Ann Arbor, Miehígan, 48106), e foi determinada a actividade biológica após concentração por ul-trafiltração (membrana Amiecn YM5, para Mr 5000, Amicon,

Danvers, Massachusetts, 01923) e diélise contra TFA a 0,05¾ MR 70 016 SKB CASE 14395 i—1 Ú4 quer dizer a massa molecular relativa. As linhas de células se guintes foram testadas para avaliar a produção de activadade; 35713, SW43, SKC01, LOVO, CACO 2, HT-29, COLO 320DM, COLO 320K3R, 3W343, DLB-i, ΝΕΚ-52Ξ, HCT-15, WIDR, SW403 e SW742. 3. Ensaios biológicos A actividade do h-TGFe foi medida utilizando o crescimento das células SW13 em agar mole como descrito por Kalper et al, Câncer Research. 43. 1972-1979, (1983), exceptuando que a base s as camadas superiores continham agarose a 0,5¾ e 0,3¾. respectiva-nents, em DMEM, soro bovino fetal a 10¾. e foram implantadas 5000 células por placa de 3 cm.

Foi utilizado para medir a actividade do FGF, o crescimento de células endoteliais do coração de bovinos fetais (FBHE) em cultura de monocamada, pelo processo de Gospodarowi cz et. al. J.Biol. Cnem., 250, 2515 (1975). As amostras foram adicionadas às placas de 3 cm contendo 2 ml de DMEM, soro bovino fetal a 10¾. Cada pla- r. ca recebeu depois 100 / 1 de uma suspensão de 5x10" células FBHE em DMEM. soro bovino fetal a 10¾. As culturas foram incubadas durante 5 dias, fixadas com formalina tamponada a 10¾ e coradas com de violeta cristal a 0,5¾. O crescimento das células foi quantificado por medição das éreas das colónias totais para cada placa por análise ds visualização. 4. Análise da actividade do h-TGFe no leite humano s nos extiac-tes de tecido. 0 leite humano foi deslipidado por extracção com éter e acidificado com TFA (concentração final de 0,5¾). 0 material acidificado foi filtrado através de uma membrana de 0,45^ m e concentrado 5 vezes utilizando uma membrana Amicon YM5. 0 concentrado foi dialisado contra TFA a 0,05%, liofilizado, reconstituído a 10 vozes a concentração original e bioensaiado nas células SW13.

As amostras de tecido do carcinoma do cólon de pacientes juntamente com dois espécimes de cólon adjacente normal foram obtidas por cirurgia e congeladas instantaneamente em azoto liquido Um grama de tecido foi descongelado e homogeneizado em 4 ml ds etanc-l acidificado contendo pepestatina e fluoreto ds fenilmstil-sulfcnilo como descrito por Roberts et al, Proc. Hat1. Acad. Sci.t -23- 70 016 3KB CASE 14395 33, 113-123(1985). Os homogeneizados foram csntrifugados a HOOOxg durante 25 min. e os sobrenadantes foram dial isadc-s contra TFA a 0,05¾ e liof ilizados. Os extractos foram reconstituídos em 1 ml de TFA a 0,05¾ para bioensaío. 5. Processos utilizados para a caracterização do TGFe derivado das SW13. a. Sensibilidade a. tripsina A sensibilidade à tripsina do h-TGFe foi estabelecida por incubação de um concentrado, lOx. de meio condicionado por S¥13 com tripsina a 50 Jlg/ml (Sigma) durante 2 hr a 37 °C, pH3,5. Como controlos, foi adicionado inibidor da tripsina de ovino (Sigma) a 500JUg/rnl (concentração final) por ml de amostra antes do tratamento da enzima e foi tratada só com inibidor uma amostra adicional. Passadas 2 hr. a reacção foi parada por adição de inibidor da tripsina e as amostras foram bioensaiadas. b. Afinidade da heparina A afinidade do h-TGFe para a heparina foi determinada por passagem de um meio condicionado em bruto reconstituído em HaH^FCç, a 50 rnM, HaCl a 0,25M, pH7,0 através de uma coluna de 0,5x3 cm empacotada com 1 g de conjugado heparina-sepharose íPharmacia, Piscataway, New Jersey 08854). As amostras do material de partida e do efluente da coluna foram bioensaiadas nas células SW13. Como um controlo, foi passado FGF a 50 ng/ml no mesmo tampão através da mesma coluna e as amostras foram bioen-ssiadas utilizando células FBHE. 0 h-TGFe foi ele mesmo, Incensaiado contra as células FBHE e nas células ΠΪΗ-3Τ3 utilizando o ensaio de incorporação de timidina descrito por 3owen-?opé et ai, J.Biol. Chem., 257. 5161-5171(1932), com o PDGF como o controlo positivo. c. Sensibilidade ao acrsnte desnaturante Ά sensibilidade do h-TGFe aos agentes desnaturantes foi testada por incubação do concentrado de meio condicionado em bruto curn Tween 80 a 0,1¾ (Sigma), dodeci 1-sulfato de sódio a 2b, ditiotreitol a 0,0G5M ou ureia 8M durante uma n. As amostras tratadas, juntamente com uma amostra de controlo não tratada foram exaustivamente dial içadas contra TFA a 0,05¾ para remover o agente desnaturante e bioensaiadas nas células SW13. -24- 70 016 3KB CASE 14395 d. Peso molecular Ά massa molecular do h-TGFe foi estimada por cromatoçraíia de filtração em gel do concentrado de meio condicionado numa coluna BioGei P60 na presença de ureia a SM, 0 concentrado licfiliz&do foi dissolvido em 20 ml de ureia a 8M em TFA a 0,05¾ s aplicado a uma coluna de 5x86 cm (Pharmacia, Piscataway, Nem Jersey) contendo resina BioGel P60 (BioRad, Rockville Centsr, Nev York 11571) , 0 caudal foi de 36 ml/li, foram recolhidas fraccões de 20 ml e foram dialisadas aliquotas de 100Jjt 1 contra TFA a 0,05¾ para remover a ureia e foram bioensaiadas. Os padrões de massa molecular foram a ovalbumina (43K), o quimotrípsinogénio (25K), a lisosima (14,3K), a insulina (6K) e a vitamina b!2 Í1,3E).

e. Determinação do ponto isoeléctrico por cromatcjrafia de permuta catjónica na presença de ureia a _8M 0 meio condicionado da cultura de células SW13 foi concentrado por captura em sepharose-S (Pharmacia, Piscataway, Msw Jersey), eluiçao com cloreto de sódio a 2M, diãlise e liofilisação. Este material foi reconstituído em acetato de amónio a 0,05M. pH4,0, contendo ureia a 3M como um agente de dissociação e carregado numa coluna de 5x0,5 cm de Mono S (Pharmacia., Piscataway, New Jersey) equilibrada em acetato de amónio/ureia a 8M como acima. As proteínas foram aluídas a partir da coluna utilizando um gradiente linear de acetato de amónio a C,05-0,5M, pH4,0 em ureia a 8M, aumentando 0,OlõM/minuto. 0 caudal foi de 1 ml/minuto e foram recolhidas fracçoes de 1 ml. Foram ensaiadas aliquotas (5 JU1) de cada fracçao para a actividade das células SW13 no ensaio de agar mole. Ά coluna foi calibrada utilizando proteínas padrão de pi conhecido sob as mesmas condições, com detseção por absorvãncia a 280 nm. Os padrões, foram a U lactoglobulina (pI5,2), a B anidrase carbónica de bovino (5,85), a anidrase carbónica humana (6,55), a mioglobina de cavalo (6,85, 7,35), a lecitina de lentilha (8,15, 8,45, 8,65), o tripsinogénio (9,3) e o citocromo C(10,25). 5. Purificação do h-TGFe 0 h-TGFe foi purificado a partir de meio condicionado de 3T13 por HPLC de fase inversa, de exclusão de tamanhos e de perrmi- -25- 70 C16 3KB CISE 14395 t& eaiiónica sequenciais. Uma quantidade de 25 litros de meio condicionado acidificado foi carregada a 75 ml/mn numa coluna preparativa de 5x30 cm contendo um enchimento Vydac 218 TF Cl3 (HF Chemicals, St Louis, Missouri 63108), tamanho de partícula 15-20ju m, utilizando um sistema Waters Delta-Prep (Millipore, Milford, Massachusetts 01757). I coluna foi lavada com TFA a 0,05% até que a absorvância a 214 nm alcançou a linha de base e foi passado um gradiente em TFA a 0,05%, de acetonitrilo a 0-30¾ durante 50 mn, 30-50¾ durante 20 mn e 50-100¾ durante 10 mn a um caudal do 70 ml/mn. Is fraeções foram recolhidas todos os 2,5 mn o acetonitrilo foi removido por evaporação em vácuo e as aliquotss foram bioensaiadas nas células SW13.

Is fraeções activas do passo de fase inversa foram concentradas dez vezes mais utilizando membranas Amicon YM5 e os concentrados foram carregados em duas séries ligadas de colunas de exclusão de tamanhos TSK 3000 SW (cada uma de 2,5x60 cm) (Beckman, Fullerton, Califórnia). 0 material foi eluído a partir das colunas com TFA a 0,05¾ a um caudal de 2 ml/mn e foram recolhidas fraeções de 4 ml.

Foi adicionado fosfato de sódio ao material activo do passo de exclusão de tamanhos a uma concentração final de 20mM. 0 pH foi ajustado a 6,0 com hidróxido de sódio e as amostras foram centrifugadas a 90Q00xg durante 30 mn. Os sobrenadantes foram carregados numa coluna de permuta cationica CM23W (Beclcman, Fullerton, Califórnia) e lavados com tampão de fosfato a 20 mil, pH6,0. Foi passado um gradiente linear de cloreto de sódio de 0-0,SM em tampão de fosfato, pH6,0, com 0-95% durante 90 mn e foram recolhidas e bioensaiadas fraeções de 2 ml.

Uma amostra activa de h-TGFe do passo de permuta cationica foi analisada por HPLC de fase inversa. A amostra foi acidificada a pH2,5 com TFA a 1% e carregada numa coluna de 0,46x30 cm contendo um enchimento Vydac C18 218TP de 10jx m (The Hest Group, Southboro, Massachusetts 01772). Foi passado um gradiente de 0-50%, em TFA a 0,05%, de acetonitrilo com 0,25%/mn e foram recolhidas fraeções de 2 ml e bioensaiadas após remoção do acero- -26- 70 016 SK3 CASE 14395 nitri lo por evaporação em vácuo. Ά recuperação da actividade durante & purificação foi seguida por construção de curvas de dose-resposta utilizando o material purificado. Uma unidade de actividade foi definida como a requerida para/resposta de 50¾ do máximo. Ά concentração de proteína foi medida pelo processo de 3CA (Pierce, Rockford, Illinois 61105), e por integração eieetróniea dos picos de absorvância utilizando ovalbumina como um padrão.

Resultados 1. Produção de actividade do h-TGFe pelos tecidos humanos, leite humano e linhas de células.

Os extractos de dois carcinomas do colon humano examinados no ensaio de agar mole (Halper et al., Câncer, Research, 43, 1972 1979(1983)) continham actividade do h-TGFe, enquanto que c tecido do colon adjacente normal destes pacientes tinha menor actividade. A actividade foi também detectada no leite humano. Das linhas de células testadas, SW13, 3W4G3, L0V0, NRK-52E, WIDR e HCT-15 libertaram actividade do h-TGFe no meio de cultura. Quantidades menores mas detectéveis foram produzidas pelas células 3KCG1 s SW48, enquanto que DLD-1, HT-29, 3W943, C0L032C (DM ou K3R), CÃC02 e SW742 não conseguiram libertar quantidades observáveis de h-TGFe. 2. Relação entre o h-TGFe e os......outros factoree de crescimento e afinidade do_h-TGFe para_s_e_,l.l_qay è. heparina.

Quando o meio condicionado de SW13 foi concentrado 50 vozes utilizando a ultrafi1tração e dialisado contra TFA a 0,05%, o material resultante produziu um aumento relacionado com a dose na formação da colónia pelas células SW13 no ensaio de agar mole (Halper et ad, Câncer Research, 43, 1972-1979(19835 ). O ED,-«

U deste concentrado em bruto foi de aproximadamente 37 JJ1 (correspondendo a 73 p g de proteína) por placa, dando uma actividade específica de 13,7 unidades definidas como anter iormente, por mg de proteína. Esta actividade foi sensível a 50 JUg/ml ds tripsina e não foi mimetizada por EGF, PDGF, gastrina, bombesina, insulina cu TGF-ã . Contudo, o FGF produziu um aumento relacionado com a dose na formação de colónias. -27- 70 016 SK3 CASE 14395

Para examinar posteriorment e a possível relação entre o h-TGFe e o FGF, foi passada através de uma coluna de lisparina-sepharose uma amostra de concentrado de meio condicionado. A maioria do h-TGFe foi recuperado na fracçac atravessante da coluna, indicando que ele tinha pouca ou nenhuma, afinidade pela heparina. Em contraste, o FGF aplicado à mesma coluna foi completamente retido, como esperado da afinidade conhecida dos factores de crescimento semelhantes ao FGF para a heparina, como referido por Lobb et a_l_, J.Biol .Chem. . 261, 1924-1923(1986). A actividade biológica do h-TGFe podia também ser separada da do FGF. Quando foi ensaiada uma aliquota de h-TGFe do passo de purificação de fase inversa (ver abaixo) nas células FBHE, não foi observada estimulação da proliferação, em contraste a um aumento 8 a 9 vezes maior no crescimento de células produzido pelo FGF. Quando o FGF foi ensaiado nas células FEHE na presença de h-TGFe esta resposta proliferativa não foi diminuída, indicando que a ausência de efeito do h-TGFe sozinho não foi devida à contaminação das amostras com inibidores ou toxinas. Além disso, o h-TGFe parcialmente purificado não estimulou a incorporação de timidina em células 3T3 qui esc entesem contraste às PDGF. 3. Efeitos dos agentes dessnaturantes na actividade do h-TGFe. 0 concentrado de meio condicionado em bruto de células 5Ti3 foi incubado com ureia a 8M, ditiotreitol a 0,005M, dodeci1sul fato de sódio a 2% ou Tween 80 a 0,01¾ à temperatura ambiente durante 1 h. Após remoção do agente desnaturante por diálise, o hioensaio no ensaio de agar mole (Ha1per et al, Câncer Research. 43, 1972-1979 (1983)) indicou que o h-TGFe s estável em ureia a 3M ou Tween 80 mas lábil em ditiotreitol a 0,065M ou dodeciIsulfato de sódio. Micionalmente, verificou-se que o h-TGFe era lábil em fosfato de tetrabuti1amónio a 0,1 g/100 ml após bioensaio no ensaio de ágar mole (Ha1per et al, Câncer Research. 43, 1972-1979(1983)). 4. Efeito da tripsina no h-TGFe A sensibilidade do h-TGFe h tripsina foi estabelecida pelo processo supra indicado, e os resultados indicaram que a actividade do h-TGFe é inactivacla por 50 jug/ml de tripsina. 70 016 8KB CASE 14395 5. Purificação do h-TGFe.

Foi aplicada uma quantidade de 25 litros de meio condicionado de SW13 a uma coluna preparativa contendo um enchimento Vydac 218TP (HP Chemicals, St.Louis, Missouri 63103), tamanho de partícula 15-20 ju rn, e eluida com um gradiente de acetonitrilo, Foram observados dois picos de actividade nas fracçSes resultantes após bioensaio no ensaio de agar mole (Ha1per et ai. Câncer Research, 43, 1972-1979(1983)):Pico I eluído com acetonitrilo a 20-30¾ e Pico II a 35-40¾. As fracções 17-20(Pico I) e 23-26(Pico II) foram, respectivaments, reunidas, concentradas e aplicadas a uma coluna de exclusão de tamanhos. Ά actividade eluiu à massa molecular aparente de 59KD(Pico I) s 35-45KD(Pico II). Quando foi pré-tratada uma amostra de meio condicionado em bruto de material do Pico II com ureia a 8M para dissociar proteínas não-cova1entemente ligadas e fraccionadas numa coluna de exclusão de tamanhos, foi observado um pico único de actividade a uma massa molecular aparente de 59KD.

Ti posterior purificação do material do Pico I foi obtida por HPLC numa coluna de permuta catiónica CM23W (Beckm&n, Fullerton, Califórnia). 0 h-TGFe eluiu com HaCl a Q,3M e foi subsequente mente passado numa coluna de fase inversa analítica. Ά eluiçao foi efectuada utilizando um gradiente linear de acetonítrilo de 2-50¾ aumentando 0,25?á/minuto. 0 h-TGFe eluiu como um pico único com sproximadamente acetonitri lo a 20¾ (caudaI-l ml/minuto) . Este pico foi bem separado da maioria da proteína contaminante corno calculado pelo perfil de absorvância no UV.

As estatísticas de purificação mostram uma recuperação excelente do h-TGFe a partir do meio condicionado de SW13 por HPLC de fase inversa preparativa. Cerca de 80¾ da actividade total foi distribuída em quantidades aproximadamente iguais entre os Picos I e II. A recuperação foi de 50¾ do total após o passo de exclusão de tamanhos mas só 11¾ da actividade original estavam presentes após a HPLC de permuta catiónica. Contudo, este passo resultou numa purificação superior a 100 vezes do material da coluna de exclusão de tamanhos.Estava presente material insuficiente apó o passo de cromatografia de fase inversa analítica para determl- 70 016 tíKB CASE 14395 -29- aar ã recuperação ou grau de purificação; contudo, uma estimativa aproximada da actividade sugere uma actividade especifica ds 30 000 U/mg. Uma "U“ é uma unidade, e uma unidade é a quantidade de h-TGFe (quer em mg/proteína quer em jul de amostra/ml de meio de cultura) requerida para uma resposta máxima de 50¾ no ensaio de agar mole de Ha 1 per et jal (1983), supra. Este número, i.e. 30 000 U/mg, corresponde a uma purificação superior a 2 000 veres, nesta etapa.

Claims (7)

1. 70 016 SKB CASE 14395 -30- REIVINDICKÕES 1. Processo de produção de h-TGFe caracterizado por compreender: a) a cultura, na ausência de soro, de células ou de uma linha de células que são capazes de produzir h-TGFe em meio condicionado na ausência de soro; e b) o isolamento do h-TGFe produzido a partir dessa cultura.
2. 2. Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por compreender: a) a cultura, na ausência de soro, de células ou de uma linha de células que são capazes de produzir h-TGFe sob condições livres de soro; b) a recollha do meio condicionado, produzido no passo a, de preferência após as células terem crescido até a confluência; c) a sujeição, sequencialmente, do meio condicionado a cromatografia de fase inversa, cromatografia de exclusão de tamanhos e cromatografia líquida de alta pressão de permuta catiónica; e d) a recolha das fracções contendo h-TGFe.
3. 3. Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por as células ou linha de células produtoras de h-TGFe serem seleccionadas de entre SW13, SW403, L0V0, NRK-52E, WIDR, HCT-15, SKC01 ou 3W48.
4. 4. Processo de purificação de h-TGFe, caracterizado por compreender: a) a recolha do meio condicionado de células capazes de produzir h-TGFe, de preferência após as células terem crescido até a confluência; h) a sujeição, sequencialmente, do meio condicionado a cromatografia de fase inversa, cromatografia de exclusão de tamanhos e cromatografia líquida de alta pressão de permuta catiónica; e c) a recolha das fracções contendo h-TGFe.
5. 5. Processo de produção de um hospedeiro transformado, caracterizado por compreender a transformação de uma célula hospedeira desejada com um vec-tor de ADN recombinante contendo a -31- 70 016 SKB CASE 14395 sequência de codificação de h-TGFe operativamente associada com uma sequência de controlo da expressão.
6. 6. Processo de produção de h-TGFe, caracterizado por compreender a cultura do hospedeiro transformado produzido de acordo com a Reivindicação 5 num meio de cultura apropriado.
7. 7. Processo de produção de uma proteína codificada pela sequência de codificação do h-TGFe, caracterizado por compreender a introdução da sequência de codificação em embriões de mamíferos, o crescimento dos embriões até à maturidade e sua indução para produzirem leite, e isolamento da proteína assim produzida. Lisboa, ]8 qmt Por SNITHKLINE BEECHAM CORPORATION - 0 AGENTE OFICIAL-

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