PT93560B - Processo para a preparacao de factor de crescimento de celulas endoteliais e de composicoes farmaceuticas que o contem - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.°

560

REQUERENTE:

EPÍGRAFE:

THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFÓRNIA, norte-americana, estabelecida em 300 Lakesi. de Drive, 22nd Floor, Oakland,Califórnia , Estados Unidos da América.

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE FACTOR DE CRESCIMENTO DE CÉLULAS ENDOTELIAIS E DE COMPOSIÇQES FARMACÊUTICAS QUE 0 CONTEM

INVENTORES: Napeleone Ferrara, Denis Gospodarowicz

Jean Plourt.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América,dm 24 de Março de 1989, 02 de Maio de 1989 e em 01 de Junho,sob os n^s. 328,181, 346,165 e 360,235, respectivamente.

iNPI mod 113 RF 10732 ^ι’·ΓΓ .'.Tr

Descrição da patente de invenção de THE REGENTS OE THE U1TIVERSITY OE CALIFÓRNIA, norte -americana, instituição de ensino superior e de investigação científica, estabelecida em 300 Lakeside Lrive, 22nd Eloor, Oakland, Califórnia, Estados Unidos da América, (inventores; Napoleone Ferrara, Denis Gospodarowicz e Jean Plourt, residentes nos E.U.A.) para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE FACTOR DE CRESCIMENTO DE CÉDULAS ENDOTELIAIS E DE

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

QUE 0 CONTEM

Descrição presente pedido e continuação em parte do Pedido de Patente dos E.U. pendente com ο N3. de série 346 165, depositado em 2 de Maio de 1989, que é continuação em parte do pedido de Patente dos E.U. pendente N2 328 181, registado em 24 de Março de 1989, os quais estão ambos incorporados por referência na sua totalidade.

Origem da Invenção

GSP

«ja-5

A presente invenção foi feita com o apoio do Governo em parte no U.S. National Institute of Health por meio das bolsas N^s 5R0EY 02186; SROIHL 20197: e HD 08055 concedidas pelo Departamento em San Francisco, Califórnia. 0 Governo dos Estados Unidos possui determinados direitos sobre esta invenção.

Domínio da Invenção

A presente invenção refere-se a um novo factor de crescimento para células endoteliais vasculares identificado em meioaxdicionado de células foliculares de pituitária de bovino cultivadas e de células de tumor de murino. A invenção também se refere ao isolamento, a purificação e a clonagem do factor de crescimento.

Descrição do Problema e da Técnica Relacionada

As referências numéricas em parêntesis no texto referem-se a publicações listaãas seguidamente na Secção de Referências.

A angiogénese é um fenómeno que se desenrola em várias fases que envolve proliferação de células endoteliais capilares, migração e infiltração nos tecidos (1). Este fenómeno desempenha um papel central em vários processos fisiologicos e patológicos tal como o desenvolvimento embrionário, a cicatrizaçâo de feridas, a aterosclerose e o crescimento de tumores (1.2). Vários factores que induzem a angiogéneses foram recentemente isolados e caracterizados. Entre estes estão as formas ácidas e básicas do factor de crescimento de fibroblastos (FGF), ambas capazes de estimular o crescimento das células endoteliais capilares in vitro bem como apresentando quimiotaxia para este tipo de células. Para além disso tanto o FGF acidico como o básico estimulem a actividade da colagenase e a produção do activador de plasminogéno,

enquanto bloqueiam a actividade do inibidor de plasminogénio (3,4). Estas enzimas estão implicadas na interrupção da membrana de base capilar, acontecimento que é necessário para que a angiogénese tenha lugar (1). Outros factores de crescimento tal como o factor alfa de necrose de tumores (TNP λ ), o factor beta de crescimento de transformação (TGP β ), o factor alfa de crescimento de transformação (TGP a, ) e o factor de crescimento epidérmico (EGP) são também angiogénicos in vivo (5-8). Contudo, com a excepção dos factores TGP e EGP a elevados concentrações (7), estes factores de crescimento não são mitogénicos para células endoteliais capilares (5,6); a sua acçâo no processo angiogénico é por conseguinte provavelmente indirecta, resultando desta actividade a atracção de macrofagos por quimiotaxia (9,10), o que por sua vez liberta factores angiogénico(s) directo(s), um dos quais pode ser PGP básico (11).

Vários factores de crescimento, tais como PGP ácido e básico PDCF e EGP, são amplamente mitogénicos para vários tipos de células. Esta mitogenicldade ampla é desejável em muitos tipos de aplicações de cicatrização de feridas. Existem contudo tipos específicos de aplicação de citatrização de feridas nas quais seria mais desejável empregar factores de crescimento que tem uma actividade mitogénica mais específicas em relação a deterrftiinadas células. Por exemplo, a seguir à circurgia de enxerto vascular ou da angioplastia de balão, seria altameate desejável empregar um agente de cicatrização de feridas que incorporasse um factor mitogénico que tivesse uma actividade mitogénica que fosse altamente específica para células endoteliais vasculares.

Actualmente, não existe qualquer factor mitogénico adequado para este tipo de aplicação.

No decurso dos nossos estudos sobre a localização de PGP básico em vários tecidos, observou-se

que na glândula pituitária as células do folliculo stellate são as principais produtoras de bFGF (18). Se bem que se tenha verificado que o meio condicionado por aquelas células e fortemente mitogénico para células endoteliais capilares, apenas esta presente uma pequena quantidade de bFGF neste meio ou mesmo nenhum, sugerindo deste modo, que para além de sintetizar bFGF. estas células são também capazes de produzir outro mitigene de células endoteliais. Até agora, contudo, esta actividade mitogénica não foi purificada ou caracterizada.

Técnica anterior de interesse

As publicações seguintes são de interesse oomo antecedentes na especialidade.

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Todas as referências e/ou patentes refe ridas na presente memória descritiva são incorporadas aqui por referência.

Estas referências aparecem no texto entre parêntesis (1).

Investigações publicadas anteriormente descrevem a cultura de populações homogéneas de células foliculares de pituitária de bovino ou de células de folliculo stellate (CPS) (20) e subsequentemente caracterizadas como elementos de transporte de iões, possivelmente implicado na regulação da composição em iões e na osmolaridade do fluído intersticial nos cordões de células adeno-hipofisárias (41, 42). Está também descrito que as CPS produzem o factor de crescimento de fibroblasto mitogénico angiogénico (bPGP) )15).

gene para bPGP (43), de modo semelhante ao gene para o factor de crescimento de fibroblasto ácido (aPGP) (13), não codifica para um peptídeo de sinal convencional, necessário para 0 transporte extracelular de

proteínas de acordo com os perfis clássicos de secreção (44). Deste modo, o factor de crescimento não é segregado de modo apreciável para o meio (15,45) e os tipos de células sensíveis estão dependentes do bPGP oxôgénio para a proliferação óptima na cultura, mesmo quando podem conter concentrações intracelulares significativas de mitogene (46, 47, 48).

Obbervou-ae inicialpente, contudo, que o meio condicionado por CPS de pituitária de bovino é mitogénico para células endoteliais capilares derivadas do cotex adrenal. 2 interessante notar que estas células são sensíveis tanto a bPGP como a aPGP mas não são estimula das para proliferar por EGP, TGP alfa, TGP beta, PDGP, insulina ou TNP (2). Estas observações conduzem-nos a considerar a possibilidade que pode ser segregado pelas CPS em cultura um factor de crescimento das células endoteliais distinto do PGP e possivelmente de qualquer outro factor de crescimento conhecido.

A presente invenção descreve a purificação e as características biológicas deste nogo factor de crescimento. A sua sequênciaespecifica de ácidos aminados terminal, bem como a sua especificidade para células endoteliais vasculares, distingue-o de qualquer outro factor de crescimento descrito anteriormente.

RESUMO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, é proporcionado um novo factor de crescimento sob uma forma isolada, isto é, isento de impurezas que acompanham normalmente a molécula nativa quando é produzido in vivo. 0 factor de crescimento da presente invenção será referido aqui como factor de crescimento de células endoteliais derivadas de folliculo stellate (folliculo stellate derived endothelial cel) growth factor” = PSdGP), uma vez que este factc

foi originalmente isolado a partir de células de folliculo stellate de bovino, ou como factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). Subentende-se, contudo, que estas denominações tem a intenção de abranger a proteína, sem olhar à sua origem ou modo de produção. Por exemplo, a referência na presente memória descritiva a FSdGF na forma isolada proporciona um meio para isolar as seguências de ADN clonado que codificam para a proteína, de tal modo que possa ser produzida em quantidades comerciais usando as técn cas conhecidas de teconologia de ADN recombinante. Para além disso, a referência na presente memória descritiva a PSdGF deve ser entendida como abrangendo as proteínas correspondentes por outras espécies para além da espécies bovina, por exemplo, proteína humana, mesmo apesar de se saber que podem ocorrer variações mínimas na sequência de ácidos aminados de espécies para espécies que não afectam significativamente as actividades úteis duma proteína. Utilizando os materiais e processos aqui descritos os tecidos da especialidade podem obter, por exemplo, a correspondente proteína humana por isolamento e expressão das sequências de ADN clonado que codificam para a proteína. Também se consideram incluidos no âmbito do termo FSdGF os seus fragmentos biologicamente activos, bem como as suas versões prolongadas na extremidade N-terminal e/ou C-terminal que retem qualitativamente as actividades biológicas de FSdGF aqui descritas. Se bem que a forma de FSdGF que foi isolada usando os procedimentos descritos na presente memória descritiva esteja aparentemente glicosilada, é conhecida que a produção de proteínas por técnicas recombinantes em alguns hospedeiros procarióticos como E. coli geralmente não tem como resultado formas glicosiladas da proteína, mas que as formas não glicosiladas resultantes são frequentemente de grande utilidade. De acordo com isto, o termo FSdGF abrange as formas glicosiladas e não glicosiladas da molécula, conquanto que estas formas conservam as actividades biológicas aqui descritas.

PSdGP é uma proteína dimérica de apro ximadamente 4-3 a 4-5 kD, de acordo com uma determinação por electroforese em gel de poliacrilamida SDS sob condições não redutoras. Esta proteína parece apresentar uma actividade mitogénica específica em relação às células endoteliais vasculares. Consequentemente o PSdGP terá utilidade como um factor de crescimento em várias aplicações de cicatrização de feridas nas quais seja desejado promover uma re-endotelização no sistema vascular. 0 PSdGP será particularmente útil como agente cicatrizante na cirurgia de enxertos vasculares e na angioplastia de balão. 0 PSdGP pode também ser utilizado como agente mitogénico para células PSdGP e a promoção de cicatrização de feridas vasculares que se segue a um infarte de miocárdio.

De acordo com a presente invenção, o PSdGP pode ser obtido sob forma isolada a partir de meio de cultura de células condicionado que contenha o PSdGP por um processo que inclui as fases da precipitação por sulfato de amónio: cromatografia de afinidades em Sepharose de heparina; cromatografia de gel de exclusão; cromatografia de permuta catiónica e opcionalmente cromatografia líquida de alta pressão de fase inversa.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Pigura IA mostra uma cromatografia de afinidade de sepharose de heparina (HSAC) do meio condicionado de células de PS de bovino.

A Pigura 1B mostra uma cromatografia de exclusão de gel das fracções de HSAC purificadas parcialmente em Bio-Gel P-60.

A Pigura 10 mostra os resultados cromatográfioos em Mono S da fracção P-60 de BioGel bioactiva.

A Figura 2A mostra uma HPLC de fase inversa das fracçães de Mono S purificadas e bioactivas e uma comparação da capacidade do meio condicionado de células de FS em varias fases de purificação para estimular a proliferação de culturas de células AGE de baixa densidade.

A Figura 2B é uma comparação da capacidade do meio condicionado de células de FS em várias fases de purificação para estimular a proliferação de culturas de células ACE de baixa densidade.

A Figura 3 é o HaDodSO^/PAGE da fracçâo bioactiva purificada por RP C^ HPLC.

As Figuras 4A, 4B e 4C são uma comparação entre a capacidade de bFGF derivado de pituitária de bovino e o FSdGF para estimular o crescimento de células HUE (A), células ACE (B) e células BHK-21 (C).

A Figura 5 é uma comparação de capacidade de bFGF e de FSdGF para estimular a proliferação de células BCE, células granulosas, células do córtex adrenal e células BALB/MK.

A Figura 6 é um espectro de FECF reduzid /alquilado bloqueado por lisina.

A Figura 7 é um traço da digestão de tripsina do novo factor de crescimento.

A Figura 8 é um gráfico de cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa da actividade mitogénica de células foliculares de bovino.

As Figuras 9A e 9B são uma análise HadoSO^/PAGE (12,5 de acrilamida) da fracção mais activa do perfil de HPLC mostrado anteriormente.

A Figura 10 mostra um gráfico de proliferação de células endoteliais derivadas do córtex adrenal de baixa densidade em função do tempo.

A Figura 11 é uma curva de crescimento em função da dose de células endoteliais capilares derivadas do córtex na presença de VEGF purificado.

A Figura 12 é um gráfico dos efeitos de VEGF nos diferentes tipos de células.

A Figura 13A mostra a cromatografia de afinidade em Sepharose de heparina (HSAC) do meio condiciona do por células de FS.

A Figura 13B a cromatografia de exclusão de gel de fracções de HSAC purificadas parcialmente em Sepharose G/100.

A Figura 13C mostra os resultados cromatográficos de Mono S da fracçâo bioactiva P-60 de BioGel.

A Figura 13B mostra a HPLC de fase inversa das fracções purificadas ebioactivas de Mono S e uma comparação de capacidade do meio condicionado de células de FS em vários estados de purificação para estimular a proliferação de culturas de células ACE de baixa densidade .

A Figura 14- é a NaDoDSO^/PAGE da fracção bioactiva purificada por RP C^ HPLC.

As Figuras 15A, 15B e 15C são uma comparação entre a capacidade de bFGF derivado de murino e o FSdGF para estimular o crescimento das células HUE (A), células ACE (B) e células BHK-21 (C).

A Figura 16 é uma comparação da capaci· dade de bFGF e do factor de crescimento de murino para estimular a proliferação de células BGE, células granulosas, células de córtex adrenal e células BALB/MK.

As Figuras 13 a 16 referem-se a origem de murino (AtT2O) para o factor de crescimento.

Descrição Pormenorizada da Invenção

Definiçães

te memória	As descritiva	abr OS 1
aFGF	factor	de
bFGF	factor	de i
PDGF	factor	de
TGF	factor	de
TGF P,	factor	de i
EGF	factor	de
PDECGF	faotor de endoteliai
FS	células do
FSdGF	factor	de

STV

CS

FCS

PBS

HSAC

RP-HPLG

FPLC stellate fosfato de sódio 0,01 M (pH 7,4), 0,9 % de NaCl, 0,05 % de tripsina, 0,02 % de EDTA soro de vitela soro de vitela fetal salina tamponizada com fosfato cromatografia de afinidade em Sepharose de heparina cromatografia líquida de alta pressão de fase inversa cromatografia líquida de alta pressão rápida

células ACE células HUE células BCE

RIA

BSA

BHK21

Ra Dod S0₄

PAGE

PM kDa

DMEM células endoteliais capilares derivadas do córtex adrenal células endoteliais umbilicais humanas células endoteliais corneais de bovino análise radioimunológica albumina de soro de bovino clone 21 de fibroblasto derivado de rim de hamster bebé dodecilsulfato de sódio electroforese em gel de poliacrilamida peso molecular quilodalton meio de Eagle modificado de Bublbecco.

Materiais Os materiais Bio Gel P-60, conjunto de análise de proteínas Bio Rad, conjunto de coloração de nitrato de prata e padrões de peso molecular baixo para

Ra Dod SO^/Page da Bio Rad (Richmond, CA). Os produtos heparina, Sepharose, concanavalina A Sepharose e a coluna

Mono S HRS/5 foram obtidos de Pharmacia (Piscataway, RJ).

A coluna de fase inversa Vydac C^ foi obtida do Separation

Group (Hesperia, CA). 0 meio de Dulbecco Modified Eagle (DMEM) foi obtido de Grand Island Biological Co. (Grand

Island, RY). A solução SIV (salina contendo 0,05% de tripsina, fosfato de sódio 0,01 M de pH 7,3 e 0,02 $ de EDTA) foi obtida de Difco Lab (Detroit, MI). 0 soro de vitela (CS) e soro fetal de vitela (PCS) foram obtidos de

HyClone Sterile Systems, Inc. (Logan, UT). As placas para cultura de tecidos foram obtidas de Palcon PÍastics (Oxnard,

CA), excepto para placas de cultura de grande dimensão (600 2 cm ) que foram de Applied Scientific (San Francisco, CA).

A gentamicina foi obtida da Schering Co. (Kenilworth, RJ), e a fàngizona foi obtida de E. R. Squibb and Sons (Princepton, RJ). A leupeptina, a gelatina de transferência e a insulina eram da Sigma (St. Louis, MO). 0 PGF básico derivado de pituitária e os anticorpos policlonais de coelho neutralizantes dirigidos contra PGF básico foram preparados como

descrito previamente (18,19)

Cultura de células

Preparam-se culturas de células de folliculo stellate (PS) derivado de pituitária e caracterizaram-se como previamente descrito (17,20). Culturas confluentes, que consistiam em mono-camadas de células em forma de cúpula homogéneas, foram dissociadas por emposição a SIV suplementando com NagEDTA até uma concentração final de 0,3 % (4 a 5 min, 24°C). As células foram em seguida inoculadas numa proporção de divisão de 1:10 em placas de cultura de grande dimensão e foram cultivadas na presença de DMEM suplementado com 5% de CS, 5 % de PSC, 50 ^ug/ml de gentamicina e 2,5_zug/ml de fungizona (18). Ao atingir a confluência, as culturas foram para além disso passadas ou expostas a um meio isento de soro (ver abaixo). As culturas de células endoteliais umbilicais humanas (21), as células de cérebro de bovino e endoteliais capilares derivadas de córtex adrenal (22), as células granulosas de bovino (23), as células de córtex adrenal (24), as células endoteliais corneais (25), o clone 21 de células de rim de hamster bébé (BHK-21) e queratinocitos epidérmicos de rato BALB/MK (27) (uma oferta da NIH NCI, Bethesda, MD) foram mantidas como anteriormente descrito (21-27).

Preparação do melo condicionado

Células PS de Passagem recente foram 2 depositadas em placas Nunc de 600 cm e cultivadas até a confluência durante 4 e 5 dias em DMEM suplementado com 5?o de CS, 5 $ de PCS e anticorpos como descrito acima. Uma vez observada a formação de cúpula, as monocamadas foram lavadas duas vezes com 25 ml de salina tamponizada com fosfato antes da adição de 150 ml de por placa de DMEM suplementado com 50 xUg/ml de gentamicina, 25 _xug/ml de

fungizona, 10 _zug/ml de leupeptina, 5 _zug/ml de insulina e 10 p.g/ml de transferrina. Depois de 48 ou 72 horas, os líquidos de cultura foram separados e suhstituidos pela mesma quantidade de meio fresco isento de soro. Puderam ser feitas recolhas durante 1 mês ou mais sem deterioração visível da monocamada.

Processo de isolamento meio condicionado recolhido a partir das camadas confluentes foi centrifugada (10 000 g, 15 min.) no intuito de remover as células flutuantes e resíduos de células. 0 pH do sobrenadante foi então ajustado a 5,6 com HC1 6 H. Adicionou-se sulfato de amónio (NH^)₂SO^ (520 g/l), e a suspensão foi deixada durante 6 horas a 4°C, separou-se então o precipitado por centrifugação (10 000 g, 30 min), redissolveu-se em PBS e armazenou-se a -70°0.

Para o isolamento final, os precipitados de 3 recolhas (21 litros no total de meio condicionado, produto inicial) foram descongelados, reunidos e em seguida dialisados durante a noite a 4°C contra Tris-HCl 10 mM a pH 7,3 e NaCl 50 mM. A seguir à diálise o produto insolúvel foi removido por centrifugação (10 000 g, 30 min) e o sobrenadante foi deitado sobre resina de Speharose de heparina (20 ml) que tinha sido equilibrado em Tris-HCl 10 mM a pH 7,3 e NaCl 50 mM. Lavou-se a resina a fundo com o tampão de equilíbrio até que a absorvânoia voltasse a linha de base, e em seguida eluiu-se por fases com concentrações. crescentes de NaCl (Na010,15 M, 0,45 Μ, 1 M e 3 M). Removeram-se alíquotas das fracções para análise da proliferação de células e reuniram-se as fracções com a maior bioactividade que foram concentradas até 1 ml com uma célula de ultrafiltração Amicon (Modelo 12) equipada com uma membrana de ultrafiltração Liaflo YM 10.

A amostra concentrada foi carregada numa coluna Bio Gel P-60 (100-200 mesh 1 x 95 cm) equilibrada a 4°C em PBS e foi eluida com PBS. A coluna Bio Gel P-60 pode ser substituída por uma de Sephadex G-100 que parece ser mais eficiente. Foram tomadas aliquotas de cada fracção para análise de proliferação de células e as fracções bioacti vas foram reunidas e diluídas duas vezes com Hepes 20 mM a pH 8,3. A amostra foi então aplicada com um Super loop numa coluna Mono S ligada a um sistema FPLC (Fharmacia, Piscataway, NJ). Realizou-sa a eluição com um gradiente multilinear de acetonitrilo aquoso de 20 a 45%. T_omaram-se então aliquotas para a análise biológica e as fracções de coluna foram armazenadas congeladas a -70°C.

Análise de proliferação de células

A actividade mitogénica das fracções de coluna e das amostras purificadas foi determinada usando como células alvo células endoteliais capilares derivadas de córtex adrenal (células ACE) (22). As culturas armazenadas, mantidas na presença de DMEM suplementado com CS a 10 % 50 um/ml de gentamicina e 0.25 ;im/ml de fungizona foram transferidos semanalmente para discos de cultura de tecido gelatinizado numa proporção de divisão de 1:10.

Para a análise mitogénica, as células foram inoculadas em placas de grupos de 12 alvéolos a uma densidade de 5 x lo³ células por alvéolo em 1 ml de DMEM suplementado com 10 % de soro de vitela e antibióticos, como descrito antériormente (19). Seis horas mais tarde, um conjunto de alvéolos em triplicado foi tratado com tripsina e as células foram contadas para determinar a eficiência de inoculação. Dez aliquotas de microlitro na diluição apropriada, de cada amostra, como indicado nas descrições pormenorizadas da legenda da figura, foram então adicionadas em triplicado aos alvéolos nas placas nos dias 0 e 2. Após 4 dias em cultura, as placas foram tratadas com tripsina e foram determina- 19 -

A actividade mitogánica do produto purificado final foi também ensaiado nas células endoteliais umbilicais humanas, células granulosas de bovino, células de córtex adrenal, células endoteliais corneais, células BHK-21 e gueratinócitos epidérmicos de rato BALB/MK. Para aaálise, as células foram inoculadas numa densidade inicial de 2 ou 4 x 10 celulas/placa de 35 mm. As analises foram conduzidas como descrito para células vasculares de bovino. !

i

Na Dod SO₄/PAGE

Fizeram-se reagir amostras com 250 uCi

125 de Na I usando o método da cloroamina T de iodinação (28). ι Depois da precipitação por TCA na presença dum veículo de | ovalbumina (100 /íg/rnl), as amostras marcadas com I (2.5 a 16 x 10 cpm em 10 ^ul) foram analisadas por Na Dod SO^/PAGE, (15 % de poliacrilamida, ref. 29) sob condições redutoras ou não redutoras. Depois de electroforese (5 h, 20 mA) os géis foram corados com azul de Coomassie a 0,1 % em ácido tricloroacético durante 15 min e descorados de um dia para o outro com ácido acético a 7%. Os géis foram em seguida secos e submetidos a autorradiografia durante 6 a 92 h.

Mlcrosseguenciação de proteínas

Para a s equenciação de proteínas, redissolveram-se aproximadarnente 5 jig (=200 pmol) de proteína das fracções activas da coluna C₄ em ácido trifluoroacético e carregaram-se num sequenciador de proteína de fase gasosa Applied Biosystems 477A. Realizaram-se 12 ciclos de degradação de E<aman utilizando software padrão e reagentes fornecidos por Applied Biosystems e fizeram-se identificações de ácidos aminados PTH com uma coluna HPLC em linha automatizada (modelo 120, Applied Biosystems, Foster City, CA).

Isolamento e Detecção do Factor de Crescimento !

Os ensaios preliminares indicaram que ο I meio condicionado por células de FS continham quantidades consideráveis de actividade mitogenica para células endoteliais capilares que não podem ser neutralizadas por anticorpos policlonais. Para além disso quando aplicado a uma coluna de afinidade HS em NaCl 0,6 M, a maior parte da actividade não era retida. Em contraste, tanto o aFGF como o bFGF são retidos sob condições semelhantes e eluídos a partir de HS a concen- j trações de NaCl de 1,1 Me 1,6 M, respectivamente (18,30,31). uma vez que se sabe que as células de pituitária em cultura produzem vários factores de crescimento (32), existia a possibilidade de que factores tais como TGFa, EGF e/ou TGFp pudessem também estar presentes no meio condicionado de cé- í lulas de FS. Usaram-se por conseguinte células ACE, que não respondem a TGFa, EGF, ou PDFG (22) e para as quais o TGFJ3 é j inibidor do crescimento (33, 34), para seguir a purificação do novo factor de crescimento.

A precipitação com (NH^jSO^ constituiu uma via conveniente de redução de volume do meio condicionado recolhida das células de FS para um nível adequado para a cromatografia subsequente. A análise por HSAC, que foi usada para a purificação de outros factores de crescimento (32, 33), proporcionou uma fase de purificação eficiente. O j produto que não ficaou retido pela colina era inactivo e j correspondia a 50 % do total da proteína carregada (Fig. IA).j É provável que os componentes de transferrina e insulina do j meio celular estivessem presentes na fracção não retida e contribuíssem para a porção maioritária das proteínas. A í eluição com NaCl 0,15 M deu origem a um pequeno pico de pro- í teina nao bioactiva, enquanto a eluição com 0,45 M deu origem i

ao maior pico de proteína com lo % de bioactividade aplicada ' à coluna. Ensaios preliminares mostraram que a maior parte da bioactividade podia ser eluída da coluna HS com NaCl 0,6 M mas que a actividade era eluída sob a forma de um pico

alargado. Por conseguinte, para concentrar o pico de proteína realizou-se a eluição com NaCl 1 M. Egta fase deu um pico de proteína relativamente estreito no qual foi recuperada 90 % da bioactividade aplicada na coluna (figura IA). Globalmente, a cromatografia por HS deu como resultado uma purificação de 30 vezes, estimada pela proteína recuperada. Uma vez que a actividade de intensidade de crescimento no produto inicial era variável, possivelmente devido à presença do inibidor. o rendimento nesta fase não poude ser determinado com rigor (ver Quadro I).

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a) A actividade de intensificação de crescimento no (nh₄)2^SO4 ^era variável, talvez devido à presença do inibidor de crescimento. A estimulação máxima na saturação foi também, muito mais baixa do que a obser-j vação para outras fracções purificadas parcialmente (ver figu. 6). Por conseguinte o rendimento foi baseado na actividade total presente na primeira fracção purificada parcialmente. (HSAC, NaCl 1 M).

b) A purificação na fase HSAC foi estimada em 30 vezes com base na quantidade de proteína recuperada.

c) A proteína foi estimada usando o reagente de Bradford de Bio Rad com BSA como um padrão

d) A proteína foi estimada por análise de AA

e) A EDgQ foi determinada como a concentração de proteína que deu uma estimulação de 50 % de proliferação de células na análise de células ACE. Corresponde a uma unidade de actividade.

A cromatografia por Sepbarose foi seguida por cromatografia de exclusão em gel usando Bio Gel P-60 (Fig. 1B). A bioactividade foi eluida como um pico maioritário com nm PM aparente de 40 a 45 kDa. Esta fase teve como resultado uma purificação adicional de de»· vezes com uma recuperação de 100 % (Quadro 1).

As fracções bioactivas da coluna Bio Gel P-60 foram reunidas e aplicadas a uma coluna mono S (Fig. 1C). 0 perfil bioactivo das fracções eluidas consistiam em dois picos minoritariamente de eluição de bioactividade respectivamente de NaCl 0,23 M e NaCl 0.28 M, com um pico de bioactividade maior que eluiu a 0.33 M NaCl. A análise de bioactividade presente nos vários picos indicou que as fracções de NaCl 0.33 M continham cinco vezes mais actividade •a*»*.

que quer o pico de NaCl 0,25 M quer o de 0,28 Μ. A fase de Mono S deu um aumento adicional de três vezes em actividade biológica específica depois da fase de Bio Gel P-60; a recuperação foi de cerca de 50 % (Quadro 1). Os dois outros picos bioactivos somavam o remanescente da bioactividade.

A purificação final da actividade mitogé nica das células endoteliais foi conseguida por BP-HPLC com uma coluna de Vydac 0^ (Pigura 2A), um processo preparativo adequado para análise de sequência de ácidos aminados. Apesar das perdas na actividade que foram encontradfes, presiumivelmente devido às condições ácidas e ao solvente usado, estas não foram suficientèmente graves para evitar a detecção das fracções bioactivas. Toda a bioactividade detectada estava presente em dois picos de proteína aguçados apostos muito juntos que, quando analisados por Na₂ Bod SO^/Page deram a mesma banda simples no gel corado por prata (Pigura 3). A fase de RP-HPLC-C^ deu como resultado pelo menos num aumento de sete vezes numa actividade biológica específica com uma recuperação de 50 % (Quadro 1). A Pigura 2B ilustra a potência relativa das várias fracções em diferentes fases de purificação.

Quando as fracções bioactivas de Mono S de NaCl 0,23 M e 0,28 M reunidas foram cromatografadas sob condições similares na coluna C^, obteve-se um perfil biológico idêntico ao observado para as fracções de Mono S de 0,33 M reunidas. A porção maioritaria (90$) da bioactividade coincidia com dois picos apostos muito próximos de proteínas que foram eluidas na mesma posição das observadas por Na₂ Dod SO^/Page estes picos deram, sob condições redutoras, uma banda comum em 23 kDa, migrando numa posição idêntica à observada na Pigura 3.

Caracterização Písica e Biológica do Pactor de Crescimento

factor purifiaado quando analisado sob condições não redutoras apresentou um peso molecular estimado de 46 kDa (Figura 3). Este valor está de acordo com a sua posição de eluição na análise de dimensão na coluna de Bio Gel P-60 em solvente que normalmente permitem manter a conformação nativa. Quando analisado sob condições redutoras a massa molecular aparenta foi de 23 kDa (Fig.

3). A partir destes dados parece que o mitogene é constituído por duas cadeias peptidicas com massa molecular de 23 kDa. Dado que se obtem uma sequência N-terminal simples a molécula dimérica é provavelmente composta por duas cadeias homólogas idênticas ou pelo menos cadeias muito homólogas.

facto de aparentemente a banda de 46 kDa não ser distinta podia ser interpretado como indicando a presença de uma glicoproteína. No sentido de explorar este ponto as fracções bioactivas de HSAC foram aplicadas numa coluna de Sepharose· de concanavalina em Tris 10 mM de pH 7.5, NaCl 0,05 M e MgCl₂ 5 mM. Toda a actividade biológica foi retida pela coluna. A eluição com concentração salina elevada (NaCl 0,5 M) não eluir qualquer quantidade de bioactividade significativa, enquanto a eluição com metilaminósido 10 mM deu como resultado uma recuperação de 25 % da actividade aplicada na coluna. A eluição com metilaanósido 0,2 M não teve como resultado uma maior recuperação de bioactividade. Estes resultados sugerem que o factor é uma glicoproteína com forte afinidade para a con cavalina A, Contudo, a fraca recuperação biológica do factor a partir deste tipo de resina de cromatografia de afini dade torna a concavalina A inadequada como fase de purificação .

As curvas de relacionamento da resposta em relação à dose para o factor de crescimento descrito nas figuras 2B e 4 ilustram que mesmo uma quantidade tão pequena como cerca de 25 pg/mi estimula a proliferação

das células ACE. A saturação foi observada a cerca de 500 pg/ml com uma Εΰ^θ de 65 pg/ml (Fig. 4-B). Esses valores podem ser comparados favoravelmente com a gama de concentrações em que o bFGF promove a proliferação de células ACE (efeito mínimo a 10 pg/ml, saturação 200 mg/ml e EDpj₀ a 50 pg/ml. ref. 22 e fig. 4B). Contudo, a d ensidade final da cultura cultivada na presença do factor de crescimento derivado de FS era metade ao das culturas expostas às concentrações de bFGF óptimas. Apesar d isso, se se considera que o PM do factor de crescimento derivado das células de FS é 2,5 vezes o do bFGF, este novo factor tem essencialmente a mesma potência que o bFGF numa base molar. Para além da sua capacidade para estimular a proliferação de células ACE o factor de crescimento derivado de FS estimulou o crescimento de células endoteliais capilares derivadas de cérebro de bovino bem como as de células de HUE (Fig. 4). Estes resultados indicam que o efeito mitogénico do factor nao é limitado pelas variações de espécie nem pela origem das células endoteliais vasculares. Contudo, e em contraste com o bFGF, o factor não é mitogénico para células BHK-21 (Fig. 4C) nem é mitogénico para célnlas do córtex adrenal, células endoteliais corneais, células granulosas ou células BA1B/MK (Fig, 5). Por conseguinte, e em contraste com o FGF, este factor parace ter uma grande especificidade para células endoteliais vasculares.

Descrição Pormenorizada das Figuras 1 a 7

Figu, 1 Purificação de FSdGF por HSAC, cromatografia de exclusão de gel e cromatografia de permuta iónica em Mono S

Fig. IA. Aproximadamente 350 ml das fracções de precipitado com (NH^)₂S0^ derivadas de 21 litros de meio condicionado por células de FS e dialisadas contra a Tris HC1 10 mM de pH 7,3 e NaCl 50 mM foram feitos passar numa coluna de Sepharose de heparina

- 27 wrssw

(1,5 cai χ 12 cm, 25 ml de volume de leito) a um caudal de 150 ml/h. A coluna foi em seguida lavada com 150 ml de tampão de equilíbrio (Tris-HCl 20 mM pH 7,3, NaCl 50 mM), e as proteínas retidas (50$ do total de proteína aplicada à coluna) foram eluidas cora uma aplicação por fases de concentrações crescentes de NaCl (NaCl 0,15 M, 0,45 Μ, 1 M e 3M).

A dimensão da fracção foi de 2 ml e 0 caudal foi de 60 ml/h. A cromatografia foi realizada a 4°C e monitorizada a absorvância a 280 nm. 0 histograma e os circulos a vazio mostram a capacidade relativa dos diferentes conjuntos de fracçSes individuais para estimular a proliferação de baixa densidade de culturas de células AGE (5 x 10^ células/placa de 35 mm). No caso das fracçSes reunidas (eluir, lavar e NaCl 0,15 M), diluiu-se as aliquotas dez vezes em gelatina a 0,2$ em PBS e submeteram-se aliquotas de 10 ,ul a bioanálise. No caso de fracçSes individuais de NaCl 0,45 M e 1 M, as aliquotas foram diluidas uma centena de vezes em gelatina a 0,2$ em PBS e submeteram-se aliquotas de 10 _zul a bioanálise. A maior parte da actividade biológica es tava presente no eluído de NaCl 1 M.

Pig. 1B Depois de concentrar as fracçSes bioactivas 126 a 133 de HSAC de NaCl 1 M até 1 ml num concentrador Amicon YM10, aplicou-se o retentado da ultrafiltração numa coluna de Bio Gel P-60 (100 a 200 malhas, x 95 cm) equilibrada e carregada a 4°C em PBS.

caudal para o desenvolvimento da coluna foi de 6 ml/h e recolheram-se fracçSes de 1,45 ml. A absorvância foi monitorizada a 280 nm. As posiçSesde eluição de marcadores de massa molecular (em kDa) encontram-se indicadas com setas. Diluiram-se 1 para 100 aliquotas de cada fracção da coluna em de gelatina a 0,2 $ em PBS e submeteram-se a bioanálise em células ACE aliquotas de 10 _zul em placas de 12

alvéolos, como descrito em Materiais e Métodos. A maior parte da bioactividade foi eluida sob a forma de um único pico com um PM de 40 a 45 kDa.

Fig. 10. As fracçSes bioactivas 26 e 29 eluídas a partir da coluna de Bio Gel P-60 foram reunidas e diluídas três vezes com HEPES 20 mM de pH 8.3. Usando um Súper loop de 50 ml, a amostra foi em seguida aplicada numa coluna Mono S HR 5/5 equilibrada em H HEPES 20 mM de pH 8,3. A coluna foi em seguida eluída com uma gradiente de NaCl (0 M até 1 M) como se segue: NaCl 0 M durante 5 min, NaCl 0 M até 0,45 M em 45 min, NaCl 0,45 até 1 M em 25 min.

NaCl 1 M durante 45 min. A absorvância foi monitorizada a 280 nm. 0 caudal foi de 1 ml por minwe recolheram-se fracçSes de 1 ml. Diluiram-se 1 para 100 aliquotas de cada fracção em gelatina a 0,2$ em PBS e submeteram-se a bioanálise em células AGE aliquotas de 10 _zu em placas de 12 alvéolos como descrito na secção de Materiais e Métodos. Os histogramas mostram a distribuição da actividade biológica com a maior parte da actividade biológica sendo eluida nas fracçSes de 37 a 40 (NaCl 0,33 M), As fracçSes indicadas por esteriscos foram reunidas e examinadas adicionalmente por RP-HPLC usando uma coluna C^.

Fig.2 HPLG de fase inversa das fracçSes purificadas e bioactivas de Mono S e comparação da capacidade do meio condicionado por células em várias fases de purificação para estimular a proliferação de culturas de células ACE de baixa densidade.

Fig.2A. As fracçSes activas de Mono S (fracção 38 até 40;

Fig. 3) foram carregadas numa coluna Vydac (25 x 0,46 cm, dimensão das partículas 5 um, dimensão dos poros 300 A) equilibrada em TFA a 0.1 $ (v/v),

- 29 acetonitrilo a 20$. As setas mostram os tempos de injecção. A proteína foi eluida com um gradiente linear de 115 min de acetonitrilo de 20 a 45$ em TFA a 0,1 $ com um caudal de 0,6 ml/min, a temperatura ambiente.

Recolheram-se fracçSes de 1,5 ml excepto na região onde se esperava eluir a bioactividade; nesta região os volumes da fracção foram limitados manual mente à dimensão das fracçSes de pico individuais. Diluiram-se 1 para 10 aliquotas de cada fracção com gelatina a 0,2 $ em PBS e snbmeteram-se a bioanálise como descrito em Materiais e Métodos.

histograma mostra a distribuição da actividade biológica. As fracçSes de pico (fracçSes 25 e 26) indicadas pelos asteriscos foram usadas individualmente para estudos estruturais e posterior análise da sua actividade biológica.

Fig.2B. Culturas de células AGE de baixa densidade (5 x 10^ células/alvéolo) foram inoculadas e a sua proliferação foi medida como descrito em Materiais e Métodos. As amostras ensaiadas eram precipitadas de (NH₄)₂ so₄ c a _7, conjunto das fracçSes de NaCl 1 M de HSAC Z~ J⁷ ; conjunto das fracçSes bioactivas de Bio Gel P-60 C 0 J\ co njunto das fracçSes bioactivas de Mono S fracção bioactiva de Ό _/. Os pontos individuais são a media de determinações em triplicado e os desvios padrão foram inferiores a 10 $ da média. As culturas de controlo expostas a DMEM suplementado com CS a 10 $ tinham uma densidade final de células de 1,5 X 10⁴ células/alvéolo.

Fig. 3 NaDodSO^/PAGE das fracçSes bioactivas purificadas por RM-HPLC C^.

As fracções em cada um dos três picos de actividade da fase de eromatografia de permuta iónica de Mono S (eluindo a NaCl 0,25 M, 0,28 M e 0,55 M, respectivamente; ver Fig. 10) foram reunidas e cada conjunto foi posteriormente purificado por RP-KPLC G^, como descrito na Fig. 2A. Em cada caso, os dois picos de actividade eluídos a partir da coluna (ver Fig. 2A) foram recolhidos e reunidos. Amostras do material recolhido de cada uma das três eluições da coluna foram seguida submetidas a electro forese num gel de poliacrilamida a 15$ sob condições redutoras (pistas 5 a 5) ou não-redutoras (pistas 6 a 8). 0 gel foi em seguida corado utilizando o conjunto de coloração de BioRad de nitrato de prata. As amostras eram: pistas 5 e 6, conjunto de 0,25 M; pistas 4 e 7, conjunto de 0,28 M; pistas 5 θ 8, conjunto de 0,55 M. Os marcadores de peso molecular depositados nas pistas 1, 2 e 9 eram: albumina de soro de bovino (PM 66 000), ovalbumina (PM 42 700), anidrase carbónica (PM 51 000) e lisozima (PM 14 500).

Fig.4 Comparação do bFGF derivado de pituitária com o

FSdGF no que se refere à capacidade para estimular o crescimento de células HUE (A), células ACE (B) e células BHK-21 (C).

Fig.4A As culturas de densidade baixa de células de HUE (5 x 10^ células por alvéolo gelatinizado de 1 cm de diâmetro) foram expostas a meio tampão 199

HEPES (25 mM) suplementado com 100 ug.ml de hepa—8 rina, selénio 10 M, FCS a 20 $ e concentrações crescentes de bFGF (O) ou de derivado de pituitária ou FSdGF (·). Adicionou-se heparina apenas uma vez na altura da inoculação enquanto se adicionaram os factores bFGF e FSdGF dia sim dia não. Depois de seis dias em cultura, trataram-se com tripsina os alvéolos em triplicado e contaram-se as células.

A densidade final das culturas expostas a FCS a 20$ isoladaraente foi 1,5 x 10⁴ células por alvéolo. 0 desvio padrão foi inferior a 10 $ da média.

Fig.4B As culturas de baixa densidade de células ACE (5 x 10 células por alvéolode 1 cm de diâmetro) foram expostas a DMEM suplementado com CS 10 $ e a concentrações crescentes quer de bFGF derivado de pituitária (0) quer de FSdGF (®) adicionado em dias alternados. Depois de 5 dias em cultura, trataram-se com tripsina os alvéolos em triplicado e contaram-se as células. A densidade final das culturas expostas a CS a 10 $ isoladamente foi 1,5 x 10⁴ células por alvéolo. 0 desvio padrão foi inferior a 10 $ da média.

Fig.4C. Expuseram-se culturas de baixa densidade de células BHK-²1 (2 x 10⁴ células por placa de cultura gelatinizadas de 35 mm) foram expostas a 2 ml de DMEM-F12 (1 para 1 v/v) suplementado com Fungizona

2,5 ug/ml, gentamicina 50 ^ug/oil, transferrina 10 ^ug/ml, insulina 5 .ug/ml e concentrações crescentes quer de bFGF derivado de pituitária (0) ou FSdGF (®). A insulina e a transferrina foram adicionadas apenas uma vez. bFGF e FSdGT foram adicionados cada um dos outros dias. Depois de 4 dias em placas de cultura triplicadas foram tratadas com tripsina e as células contadas. A densidade da cultura final exposta a transferrina e a insulina isoladamente foi

1,38 x 10⁴ células/placa. 0 desvio padrão foi inferior a 10 $ da média.

Fig.5 Comparação de bFGF com FSdGF no que se refere à capacidade para estimular a proliferação de células BCE, células granulosas, células do córtex adrenal e células BALB/MK.

-32 Inocularam-se 2 χ 10⁴ células de BCE, células granulasas ou células do córtex adrenal em placas de 35 mm nos respectivos meios (DMEM) suplementado com CS a 10% para células BCE e do córtex granulosas Inocularam-se células BALB/MK a uma densidade de 3 x 10⁴ células por placa de 35 mm em meio Eagle modificado de baixa concentração de Ca (40) suplementado com FCSa 10%, Adicionaram-se bFGF derivado de pituitária (bFGF, 2 ng/ml) ou FSdGF (5 ng/ml) em dias alternados. As células BALB/MK foram também expostas aFGF (10 ng/ml) uma vez que este mitogene é tão potente como FGF na promoção do seu crescimento.

Depois de 6 dias em culturas, as células foram tratadas com tripsina e contadas num contador Coulter. 0 desvio padrão foi inferior a 10% da média.

A Mioroseequênciagão Revela uma única Sequência N-Terminal de Ácidos Aminados

Identificou-se um ácido aminado simples em cada um dos primeiros 12 ciclos, consistente com uma proteína homogénea. 0 rendimento do resíduo amino-terminal foi de 150 picomoles. As atribuiçães não ambíguas feitas para os ciclos 1 a 12 foram como se segue; Ala-Pro-Met-Aia-Glu-Gly-Gly-Gln-Lys-Pro-His-Glu. Uma pesquisa na base de dados NBRF usando a programa FASTP de Lipman e Pearson (35) não mostrou qualquer homologia significativa entre esta sequência e qualquer proteína conhecida.

Análise de Sequência de Peptideos Tripticos

Reduziram-se 12 _zug de FSdGF em 200 _zul duma solução que continha cloridrato de guanidina 6 M, Tris base 0,5 M de pH=8, EDTA 1 mM e ditiotreitol 10 mM durante 1 hora a 37°C.

A proteína reduzida foi alquilada por adição de idodocetamida sólida para dar uma concentração final de 25 mM e a reacção foi deixada prosseguir durante 30 minutos à tempera-

tura ambiente. A seguir à reacção de alquilação as lisinas foram modificadas com anidrido succinico. Adicionaram-se quatro alíquotas de 5 μΐ cada de anidrido succinico a 100 mg/ml em acetonitrilo preparado recentemente a intervalos de 5 minutos. Depois da adição final a proteína foi desalanizada por HPLC de fase inversa usando um aparelho de HPLC Hewlett-Packard 1090L equipado com um diodo detector de ordem e uma coluna Brownlee Labs (BU 300) de 0,46 x 3 cm. O solvente A era TFA a 0,1 % em agua, o solvente B era TFA a 0,1 % em acetonitrilo. O gradiente foi de 20 a 6o % de B durante 30 minutos a um caudal de 0,5 ml/min. 0 perfil de eluiçâo foi monitorizado a 214 nm e o pico da proteína simples foi recolhido manualmente. O cromatograma é apresentado na Figura 6. Depois de secagem num Speed-Vac (Savant) a proteína foi redissolvida em 200 jjI de bicarbonato de amónio 100 mM. Adicionaram-se 0,4 mg de TPCK tratado com tripsina e a amostra foi incubada por uma 2 horas adicionais a 37°C. Adicionou-se uma quantidade adicional de 0,4 ug de tripsina depois de 2 horas e a amostra foi incubada durante mais o , horas a 37 c. Os peptxdeos foram separados por um processo de HPLC idêntico e usando os mesmos solventes conforme descrito acima. A coluna era uma Vydac C._o (218TP5215) eluída a 0,25 ml/min. 0 programa de HPLC fluiu inicialmente durante 5 minutos a B 10 % e depois eluiu-se cop um gradiente de B de 10 a 70% durante 65 minutos. A eluição de peptídeos foi monitorizada a 214 nm e os picos foram recolhidos manualmente. 0 cromatograma é apresentado na Figura 7. Para os picos da análise de sequência de ácidos aminados 7, 15, 16, 24 e 25 foram depositados e secos directamente nos discos de fibra de vidro usados como suporte no sequenciador de proteína. Não se obtiveram quaisquer sequências para os peptídeos 15 e 16. 0 peptido 7 deu uma sequência mista com a sequência maior H-Ile-X-Fro-His-Gln-Ser-Gln-His-Ile-Gly-Glu-Met-Ser-Ile-Leu-Gln-His-Asn-e a sequência menor H-X-Val—Leu—Asp/Phe—Val-Val-X-X-Pro—. O peptideo 24 deu uma sequência única H-S_er-Phe-Cys-Arg-Pro-Ile-Glu-Thr-Leu-ValAsp-Ile-Phe-Gln-Glu-Tyr-Fro-Àsp-Glu-Ile. O peptideo 15 deu

uma sequêncis única H-Ser-Phe-Cys-Arg-Pro-Ile-Glu-Thr-Leu-Val-Asp-Ile-Phe-Gln-Giu-Tyr-Pro-Asp/Ile-Glu. A Ser 1 dos peptídeos 24 e 25 corresponde a Ser 23 da sequência de amino-terminal apresentada acima de modo que estas sequências podem ser fundidas para dar a sequência dos primeiros 42 ácidos aminados da proteína.

A_s atribuições não ambíguas feitas para os ciclos 1 a 12 foram as seguintes: ^Ala-Pro-Met-Ala-Glu-Gly-Gln-Lys-Pro-His-Glu. Uma pesquisa na base de dados NBRF usando o programa FASTP de Lipman e Pearson (35) não encontro qualquer homologia significativa entre esta sequência e qualquer proteína conhecida.

Composições e Utilizações

O FSdGF proporcionado pela presente invenção e util como agente de cicatrização de feridas, particular mente em aplicações em que é desejável reendotelizar tecidos vasculares, ou em que o crescimento de um novo leito capilar (angiogénese) e importante.

FSdGF pode, para alem disso, ser utiliza do no tratamento de feridas pouco profundas tal como feridas dérmicas, incluindo as categorias de chagas de pressão, úlceras de estase venosa e úlceras diabéticas. Para além disso, o FSdGF pode ser usado no tratamento de queimaduras pouco profundos e de feridas no local para o enxerto de pele. Neste caso, o FSdGF é aplicado quer directamente no local ou é usaêo para embeber a pele que vai ser transplantada antes do enxerto. Dum modo semelhante, o FSdGF pode ser usado na circurgia plástica quando é necessária a reconstrução que se segue a uma queimadura ou para efeitos estéticos.

A angiogénese á também importante na manutenção de feridas limpas e desenfectaâàs. 0 FSdGF pode, por conseguinte, ser usado na cirurgia geral e no seguimento do

.. 'a·-*·* .w tratamento de cortes e de lacerações, é particularmente útil no tratamento de feridas abdominais em que a passagem de material fecal aumenta o risco de infecção. A neovascularização é também a chave para a reparação de facturas uma vez gue os vasos sanguíneos se desenvolvem no local da danificação do osso. A administração do FSdGF no local da fractura é por conseguinte uma outra possibilidade de utilização.

Nos casos em gue o FSdGF e usado para cicratização de feridas como tópico, como descrito acima, pode ser administrado por qualquer das vias descritas abaixo para a reendotelização do tecido vascular ou preferivelmente por meios tópicos. Nestes casos, será administrado sob a forma de solução gel, cremes, unguento ou sob a forma de um pó seco directamente no local da ferida. P_odem também ser usados dispositivos de libertação lenta que dirigem o FSdGF para o local da ferida. Nas aplicações tópicas, o FSdGF deve ser aplicado em concentrações na gama de 5o a 1 000 jig/ml, quer numa única aplicação ou em regime de doses que são diariamente ou de tantos em tantos dias por um período de uma até várias semanas.

FSdGF pode ser usado como agente de cica trização de feridas pós-operatório em angioplastia de balão, um processo no qual as células endoteliais vasculares são removidas junto com as placas ateroscleróticas. o FSdGf pode ser aplicado a superfícies endoteliais vasculares por aplicação intravenosa sistémica ou local quer sob a forma de uma injecção intravenosa ou sob a forma de perfusões. Se desejado, o FSdGF pode ser administrado durante períodos longos usando uma bomba micrométrica. As composições adequadas para administração intravenosa contém o FSdGF numa quantdade eficaz para promover o crescimento das células endoteliais e uma substância veicular parenteral. 0 FSdGF pode estar presente na composição numa larga gama de concentrações, por exemplo, de cerca de 50 /ig/ml até cerca de 1 000 /íg/ml utilizando injecções de 3 a 10 ml por paciente. Qualquer dos

veículos parenterais conhecidos pode ser usado, tal como salina normal ou dextrose de 5 a 10 %.

FSdGF pode também ser usado para promover a endoteliazàção em cirurgia de enxerto vascular. No caso de enxertos vasculares usando vasos transplantados de matéria; sintético, por exemplo, o FSdGF pode ser aplicado a superfícies de enxerto e/ou nas junções do enxèrto e a vasculatura que existe no sentido de promover o crescimento de células endoteliais vasculares. Para estas aplicações, o FSdGF pode ser aplicado por via intravenosa como descrito acima para a angio· plastia de balão ou pode ser aplicado directamente às superfícies de enxerto e/ou à vasculatura existente quer antes quer durante a cirurgia. Em tais casos, pode prtender-se apli car o FSdGF numa substância veicular viscosa de modo que se obtenha uma adesão à superfície afectada. Substâncias adequadas incluem, por exemplo, carbopol de 1 a 5%. O FSdGF pode estar presente no veículo numa larga gama de concentrações, por exemplo, de cerca de 50 pg/mg até cerca de 1 000 ^pg/mg.

FSdGF pode também ser empregue para ^reparar danificações a segnir a enfarte de miocárdio. O FSdGF é administrado por via intravenosa para este efeito, quer em injecções individuais quer por bombas micrométricas durante um período de tempo como descrito acima.

FSdGF pode também ser utilizado como um factor de crescimento para as culturas in vitro d e células endoteliais. Para tais usos, o FSdGF pode ser adicionado ao meio da cultura das células a uma concentração desde cerca de 10 ng/ml até cerca de 10 /ig/ml.

A sequência de ácidos aminados do FSdGF pode ser usada para projectar sondas oligonncleotídieas sintéticas para a recuperação do gene do FSdGF. Estas sondas são de uma sequência mista baseada em todas as possibilidades das escolha do código genético ou de sequência simples basea37 da nas prefer_encias da escolha de codões e outros factores.

Nos primeiros exemplos, as sondas baseadas na sequência de ácidos aminados do FSdGF de bovino serão usadas para efectuar buscas em bancos de ADNc de bovino feitas a partir de células de folliculo stell.ate ou em bancos genómicos de bovino. Os clones de ADN de bovino que codificam para o FSdGF as sim isolado serão sequenciados para determinar a codificação completa e assim a sequência de ácidos aminados do FSdGF de bo vino. Os clones de FSdGF de bovino serão em seguida usados como sondas para isolar sequências de FSdGF humanas a partir de bancos de ADNc obtidos a partir de têcidos que mostram exprimir este factor, ou de bancos genómicos humanos. Deste modo, é possível estabelecer o nucleótido completo bem como a sequência de ácidos aminados de FSdGF.

Discussão

Esta é a primeira identificação, purificação e identificação biológica dum novo factor de crescimento de células endoteliais de ligação a heparina (VEGF) a partir de meio de cultura condicionado por FC de pituitária. Nos exemlos que se seguem são fornecidos pormenores adicionais

Resultados

Verificou-se que o meio condicionado por FC estimula a velocidade de proliferação das células endoteliais microvasculares de baixa densidade. O Quadro 2 resume as fases para a purificação da actividade de promoção de crescimento e o correspondente rendimento em bioactividade. A actividade mitogénica foi precipitada por sulfato de amónio a 50 % e resuspendida num volume adequado para subsequente purificação. A fase H-S dá-nos uma via eficiente de concentrar posteriormente tal actividade e também proporciona uma purificação de dez vezes, Appoximadamente 90% da actividade biológica foi eldda na presença de NaCl 0.9 M (Fig.

8). A bioactividade não foi afectada ao aquecer as fracções a 65°C durante 5 min e diminui 25 a 30% em seguida à exposição a TFA a 0,1% (pH 2) durante duas horas.

- 38 _

Sumário da purificação de VEGF a partir de 6 litros de meio condicionado

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a concentração de proteína foi determinada por comparação das intensidades relativas de bandas com padrões em SDS/PAGE corados com prata.

A fracção de HS mais bioactiva foi apli cada a uma coluna semi-preparativa de HPLG de fase inversa, método adequado para a purificação rápida de proteínas e peptídeos. A bioactividade foi eluida sob a forma de um pico simples na presença de acetonitrilo a cerca de 29 (Fig. 9A). Um gel de SDS/PAGE (56) corado de prata nas fracções mais bioactivas revelou a presença de três ou quatro bandas. Estas fracções foram ainda purificadas por uma segunda fase de HPLC de fase inversa, usando uma coluna analítica que foi eluida com um gradiente de 2-propanol, em vez de acetonitrilo. Foi obtido um pico único de bioactividade correspondendo a um pico distinto no perfil de absorção. (Pig. 9B).

As fracções de pico da segunda análise da cromatografia de fase inversa apresentavam uma banda única numa SDS/PAGE corada de p^ata, com uma M aparente de cerca de 23 kDa sob condições redutoras (Fig. 10). A intensidade de coloração estava correlacionada duma forma nitida com a actividade mitogénica ao longo do perfil de bioactividade. Uma vez que ensaios anteriores utilizando um peneiro molecular com uma coluna TSK G 3000 SW tinham sugerido uma M na gama de 40 a 45 kDa, a possibilidade de que o factor de crescimento em condições nativas seja um dímero foi considerada. Esta possibilidade foi fortemente sugerida pela constatação de que a substância purificada tem uma M_r aparente de cerca de 45 kDa numa SDS/PAGE corada por prata sob condições nSo redutoras (ver Fig. 10).

Como ilustrado na Figura 11 a curva de resposta em relação à dose para o factor de crescimento purificado revelou um efeito de metade do máximo na proliferação de células endoteliais capilares derivadas do córtex adrenal a 150-200 pg/ml e um efeito máximo a 1-1,5 ng/ml Estes valores foram derivados a partir da sequenciação da proteína e verifioou-se que estavam de acordo com os valores obtidos comparando as intensidades relativas das ban40

das com padrões em SDS/PAGE corado por prata.

Por microssequenciação de fase gasosa da substância purificada demonstrou-se sem ambigui· dades uma sequência de ácidos aminados N-terminal única.

Os cinco primeiros residuos são ^Ala-Pro-Met-Ala-Glu.

Outro modo para descrever a sequência de ácidos aminados N-terminal é Ala-Pro-Met-Ala-Glu-Gly-Gly-Gln-Lys-Pro-His-Gl·u-Val-Val·-Lys-Phe-Met-Asp-Val·-Tyr-Gl·n-(Arg)-Ser-Phe-X-Arg-Pro-Ile-Glu-Thr-Leu-(Val)-X-Ile-X-(Gln)-Glu-Tyr-(Pro)- em que os ácidos aminados em parêntesis são conhecidos com um alto grau de certera e -X- corresponde a um ácido aminado de identidade ainda desconhecida. Uma pesquisa por computador revelou que uma tal sequência não apresenta homologia significativa para qualquer proteína anteriormente conhecida.

A bioactividade do factor de crescimen to foi também ensaiada com diferentes tipos de células. Conforme se apresenta na Figura 12, apreciou-se uma actividade apreciável apenas em tipos de células de origem endoteliai vascular tal como células endoteliais da aorta de bovino adulto e fetais, células endoteliais capilares de cérebro de bovino e células endoteliais humanas da veia umbilical. Em contraste, células do córtex adrenal, células epiteliais do cristalino, células endoteliais corneais, fibroblastos BHK-21 e queratinócitos não apresentam qualquer resposta mitogénica significativa.

factor de crescimento foi purificado usando uma combinação de precipitação por sulfato de amónio, cromatografia de afinidades de H-S e uma sequência de duas cromatografias de HPLC de fase inversa. A análise do produto purificado por SUS PAGE revela uma M de cerca de 45 kDa sob condições não redutoras. Quando o produto foi analisado em presença de 2-mercaptoetanol, uma única banda com uma de 23 kDa foi visualizada, indicando que o fact

de crescimento e um dimero composto de duas sub-unidades de peso molecular aparente idêntico. A microssequênciação do produto purificado revela uma única sequência de ácidos aminados N-terminal·.

factor de crescimento era estável ao calor e perante os ácidos e o seu p.I. é cerca de 8,5, por estimativa por cromatofocagem numa coluna de Mono P.

factor de crescimento purificado é capaz de estimular a proliferação de células endoteliais vasculares a concentrações entre 25 pg e 1 a 1,5 ng/ml. Estes valores, admitindo uma M_r de 45 kDa, correspondem respectivamente a 0,55 pM e 22 a 35 pM. Estes valores são da mesma gama do que os obtidos cem o bPGP (2,56). Contudo, o novo factor de crescimento não induz qualquer efeito mitogénico apreciável nas células endoteliais corneais, células endoteliais do cristalino, fibroblastos BHK-21, células do córtex adrenal ou queratinócitos. Em contraste, tanto o bPGP como o aPGP são potentes agentes mitogénicos para todos estes tipos de células (2,56).

A capacidade do VEGF se ligar à heparina pode ter implicações no que se refere à sua função e regulação in vivo. Os sulfatos de heparina são componentes fundamentais da matriz extracelular e tem sido indicados como desempenhando um papel importante determinando o contacto entre as células alvo e os factores de crescimento de ligação a heparina (16, 57, 58, 59).

A presença de VEGF em FC de pituitária indica um papel para estas células no desenvolvimento, organização e manutenção de um estado diferenciado da microvasculatura complexa da adeno-hipófisa.

E presentemente desconhecido se o VEGF se expressa em outros órgão para além da glândula pituitária. Contudo, considerando o papel fundamental do cresci- 42 -

cimento das células endoteliais vasculares e da angiogénese numa grande variedade de proliferação normais e patológicas (60), é de esperar que a distribuição do factor de crescimento seja muito espalhado. Com este contexto, é intesse notar que se verificou mais tarde que os factores FDGF, EGF TGF alfa, TGF beta, FGF e NGF, que se acreditou inicialmente serem restritos a células ou a tecidos específicos, tinham uma distribuição mais vasta e algumas vezes ub.íqua (61).

Os genes para os factores bFGF e aFGF, os mitogenes de células endoteliais mais bem caracterizados não codificam para um .peptídeo de sinal convencional (17,43). Deste modo, estes factores de crescimento parecem estar sequestrados dentro das células de origem e aparentemente não tem acesso directo às células alvo (2, 15, 45). Foi sugerido que o bFGF pode estar incorporado na base da membrana e ser subsequentemente libertado numa forma solúvel apenas quando a matriz é degradada a seguir à acção de enzimas específicos (16). ^ste mecanismo de libertação sugere um papel para o factor de crescimento principal ou exclusivamente em acontecimentos que envolvem degradação da base da membrana ou lise da célula, tal como remodelação orgânica, cicatrização de ferida ou neoplasia (60).

Em contraste, um factor de crescimento de célula endotelial solúvel como o VEGF pode desempenhar u papel mais dinâmico na regulação fisiológica da proliferação das células endoteliais vasculares quer no crescimento cíclico dos vasos sanguíneos que tem lugar nos órgãos tal como o corpo líteo (62) quer na manutenção tónica do estádio diferenciado do endotélio na árvore vascular.

Ao contrário do bFGF ou do aFGF, que são activos num espectro de células muito largo (2, 5o), o VEGF parece ser específico para células endoteliais vasculares.

VEGF tem significado t erapeutico especial para condições

em que é adequado uma acção seletiva nas células endoteliais vasculares, na ausência de escessiva proliferação de tecido conectivo, tal como úlceras diabéticas ou lesões vasculares traumaticas.

Descrição Pormenorizada das Figuras 8 a 12

Fig, 8 — Perfil da bioactividade de Heparina-Sepharose (H-S) de meio condicionado com FO. 0 meio (6 litros) foi concentrado e aplicado a uma coluna de HS que t inha sido pré-equilibrada em Tris/Cl 10 mM de pH 7,2 contendo NaOl 50 mM. Lavou-se a coluna com o mesmo tampão e depois eluiu-se sequencialmente com Tris/Cl 10 mM de pH 7,2 contendo NaCl 0,15, 0,9 e 3 M. Diluiram-se 100 vezes aliquotas das fracçSes recolhidas ea gelatina a 0,2 $ em PBS e aplicaram-se 5 ul/ml a células endoteliais capilares para bioanálise.

Fig. 9A e 9B - Perfis de HPLC de fase inversa sequencial de actividade mitogénica de células endoteliais.

As fracçSes de H-S mais bioactivas foram aplicadas a uma coluna (10 x 250 mm) pré-equilibrada com TFA a 0,1 $/acetonitrilo a 20 $ (Fig. 9A). Depois da coluna ser lavada com 10 ml de tampão de equilíbrio, a amostra foi eluida com um gradiente linear de acetonitrilo. Diluiram-se dez vezes aliquotas de cada fracção com gelatina a 0,2 $ em PBS e aplicaram-se 5 ul/ml a células endoteliais capilares para bioanalise. As fracçSes mais bioactivas foram reunidas e aplicadas a uma coluna (4,6 x 250 mm) que tinha sido pré-equilibrada com TFA a 0,l$/2-propanol a 20$ (Fig. 9B). Depois de lavagem da coluna com 3 ml de tampão de equilíbrio, a amostra foi eluída com um gradiente linear de 2-propanol. Ensaiaram-se aliquotas de fracçSes para verificação d a bioactividade .

g. 10 — Análise de NaDodSO^/PAGE da fracção mais bioactiva do cromatograma apresentada na Fig. 9B. Secaram-se duas alíquotas desta fracção num speed vac e redissolveram-se em tampão de amostra contendo 2-mercaptoetanol a 2,5 % ( + ) ou não contendo este reagente (-). As amostras foram desnaturadas pelo calor e submetidas a electroforese numa FAGE a 12,5 que foi subsequentemente corada por prata. Os marcadores de peso molecular são: fosforilase B, 97 400; albumina de soro de bovino, 66 200; ovalbumina, 43 000; anidrase carbónica, 31 000; inibidor de tripsina de soja, 21 500; lisozima, 14 400.

g, 11 — Crescimento cdependente da dose de células endoteliais capilares derivado do córtex adrenal na presença de VEGF purificado. Inocularam-se células à densidade de 1 x 10^/alvéolo em placas de 12 alvéo los. As quantidades indicadas de VEGF foram adiciona das algumas horas depois de serem depositadas em placas de alíquotas de 5 ul/ml. Depois de 5 dias, contaram-se as células num contador Coulter. Os resultados apresentados representam valores médios de três ensaios separados conduzidos em duplicado.

Os duplicados em cada ensaio variaram menos do qie 10

g. 12 — Efeitos do VEGF no crescimento de diferentes tipos de células. CEO, células endoteliais corneais;

BAC, células de cortem adrenal de bovino; TKC, queratinocitos; Lee, células epiteliais de cristalino; BHK-31, células de rim de hamster bebé, clone 21; ACC, células endoteliais capilares de córtex adrenal; BBC, células endoteliais capilares de cérebro de bovino; KUVE, células endoteliais humanas da veia umbilical; FBAE, células endoteliais da aorta fetal do bovino, A3AE, células endotelial da aorta de bovino adulto. As células foram inocula- 45

das no seu respectivo meio de crescimento, incubadas com uma concentração máxima de VEGF e contadas depois de 4 ou 5 dias. Os resultados são expressos em percentagem do controlo adequado.

A angiogénese é um fenómeno de fases múltiplas que envolve a proliferação de células endoteliais capilares, migração e infiltração nostecidos (1). Lesem-panha um papel fundamentei em vários processos fisiológicos e patológicos tal como desenvolvimento embrionário, cicatrizaçâo de feridas, ateroesclerose e crescimento de tumores (1, 2). Vários factores que induzem a angiogénese foram recentemente isolados e caracterizados. Destes, verificou-se que apenas as formas básica e acidica do FGF controlam directamente todas as fases da angiogénese incluindo a proliferação de células andoteliais vasculares, a migração e o aumento da expressão de activador de plasminogénio e da actividade de colagenase (2).

Apesar da evidência de que o FGF é angiogénico, duas questões enigmáticas apontam para a existência de outros factores angiogénicos que poderiam complementar a acção do FGF. Em primeiro lugar, no FGF não existem as sequências de sinal hidrofóbico que governam a secreção (12, 13), ainda que para aceitação como um factor angiogénico qualquer presumível mediador devesse ser apresentado como sendo uma substância difusível que induz formação de novos capilares a partir dum leito microcirculatório. Em segundo lugar, o FGF é produzido pelas próprias células endoteliais (14, 15). Se o FGF está presente nas células endoteliais circundantes se bem que as células sejam quiescentes, outros factores devem entrar na acção para desencadear a angiogénese.

A presente invenção também se refere ao isolamento e à caracterizado de um novo agente mitogénico

das células endoteliais produzido e segregado por células AtT20. Esta linha de células de rato e' fornecida pela The America Type Culture Collection, 12301 Parkiaw Drive, Rockville, Maryland, 0 factor produzido por células AtT20 tem uma única especificação de células alvo, uma vez que estimula a proliferação apenas das células endoteliais vasculares e não afecta outros tipos de células sensíveis ao FGF.

Este factor foi descoberto durante estudos sobre a expressão de bFGF e de vias de secreção possíveis da linha de células de pituitária AtT-20 (5). As células foram transfectadas com um gene de bPGE quimérico composto pela sequência de codificação para o peptídeo de sinal d e secreção da hormona de crescimento fundida com a sequência de codificação para o gene de bPGE (6). A linha de células de murino foi seleciionada porque conserva as funçSes de secreção e pode ser usada para e studar os acontecimentos moleculares envolvidos na embalagem e na secreção da proteína (5). Esperava-se que o bFGF expresso fosse segregado por estas células quer através duma via de secreção constitutiva quer através duma via de secreção envolvendo grânulos secretórios. Quando o meio condicionado por células AtT-20 traasfectadas foi examinado para verificar da actividade anglogénica, uma quantidade considerável d actividade estava presente, a qual não pode ser imunoneutralizada por anticorpos contra bFGF e não apresentou reação cruzada numa analise de RIA específica para o bFGF.

Do mesmo modo, o meio condicionado por células progenitoras que não expressam o gene de bFGF também continha uma quantidade considerável de bioactividade, o que sugeria que um factor não relacionado com o bFGF era responsável por esta actividade.

mitogene de células endoteliais presen te no meio condicionado foi em seguida purificado por uma combinação de fases incluindo cromatografia de afinidade

- 47 de Sepharose de heparina, cromatografia de gel de exclusão em Sephadex G 100, cromatografia de permuta catiónica em resina Mono S e finalmente por PR-EPLC com coluna Vydac C^ (ver Quadro 3 ), As fracções foram analisadas para verificaçãoda bioactividade usando células endoteliais capilares derivadas do córtex adrenal. Quando o produto recolhido foi aplicado em HS sob condições descritas na Pig. 13A a actividade foi eluída num largo pico na gama de 0,5 a 0,6 M.

No sentido de o concentrar, efectuou-se a eluição com NaCl 0,8 M. Este produto quando aplicado em Sephadex G 100 deu o maior pico de bioactividade que foi elulda com um PM aparente de cerca de 45 kDa. Quando cromatografado em Mono S sob condições indicadas na Pigura 13 C, observou-se um único pico bioactivo maioritariamente que foi eluido com NaCl 0,28 Μ. A purificação final foi conseguida por RP-HPLC usando uma coluna Vydac (Pig. 13D). Toda a bioactividade detectada estava presente em dois picos de proteína aguçados muito próximos que quando analisados por NagDodSO^/PAGE sob condições não redutoras deram uma banda única com um peso molecular aparente de 45 kDa. Quando observado sob condições redutoras, a banda tinha um peso molecular aparente de 23 kDa (Pig. 13D). Numa das fracções, estava também presente uma pequena quantidade de contaminante com um PM de 27 kDa cuja migração não era afectada por redução. A quantidade desde contaminante não era superaor a 5 $ do total, Quando a actividade de pico maior foi novamente analisada sob contições idênticas numa coluna C^. obteve-se um pico único de proteína com um pequeno patamar (Pigura 13 D). Por microssequenciação deste produto foi revelado uma sequência de ácidos aminados terminal única. Sequenciaram-se aproximadamente 2 jjg (80 pmole) de proteína usando um sequenciador de proteína de fase gasosa Applied Biosystems 477A. Indentificou-se um sÓ ácido aminado em cada um dos 24 primeiros ciclos, o que está de acordo com.-uma proteína homogénea. 0 rendimento do resíduo amino-terminal foi 30 pmole. Modos de atribuição não ambigua para os ciclos de 1 a 5 são os seguintes: Ala-Pro-Met-Ala-Glu. Uma sequência de ácidos aminados mais

longa para o factor de crescimento a partir de AtT-20 foi mais tarde determinada e é descrita seguidamente.

Uma pesquisa da base de dados NBRF utilizando o programa de Lipman e Pearson (35) não encontrou qualquer homologia significativa entre a sequência dos primeiros 22 ácidos aminados e qualquer proteína conhecida.

A curva da resposta em relação à dose para o factor de crescimento apresentada na Fig. 15B ilustrs. como uma quantidade tão pequena como 50 pg/ml estimula a proliferação de ACE.

Observou-se a saturação a 1 ng/ml com nm de 150 pg/ml. Estes valores podem ser comparados favoravelmente com a gama de concentrações em que o bFGF promove a proliferação de células ACE (efeito mínimo de cerca de 10 pg/ml, saturação a cerca de 200 pg/ml e ΕΒ^θ a 50 pg/ml, (22) e Fig. 15). Contudo, a densidade final do crescimento da cultura em presença do factor de crescimento derivado de atT20 foi metade da das culturas expostas a concentração óptimas de bFGF, indicando que o tempo médio de duplicação das células ACE era mais longo quando levado a proliferar pelo factor de crescimento derivado de AtT20 do que pelo bFGF. Apesar disso, se se considera que o PM do factor de crescimento derivado das oélulas AtT-20 é 2,5 vezes o de bFGF poderia pensar-se que tem mais ou menos a mesma potência que o bFGF. Para além da sua capacidade para estimular a proliferação de células ACE o factor de crescimento derivado de atT20 estimula o crescimento das células endoteliais capilares de cérebro de bovino bem como o das células HUE (Fig. 15A).

Isto indica que o seu efeito mitogénico não está limitado por variação de espécies nem pela origem das células endoteliais vasculares. Surpreendentemente, ele não estimula a proliferação mesmo das células BHK-21,

uma linha de células conhecida por responder a uma larga variedade de mitogenes incluindo TGF EGF, PLGF, IGFβ e aFGF ou bFGF (como verificado em (26), nem foi mitogénico para células do córtex adrenal, células endoteliais corneais, células granulosas, células vasculares de músculos brandos ou células BALB/MK (Figura 15D). Por conseguinte, e em contraste com FGF, parece ter uma única especificidade para células endoteliais vasculares. Os presentes dados estabelecem que células AtT20 que conservam muitas propriedades químicas e fisiológicas importantes de corticotrofo de pituitária, em particular a capacidade para d.ntetisar e libertar como principais produtos de secreção AGTH, B-lipopropina e B-endorfina (64), produzem também um factor angiogénico.

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A H 2 PM

Sumário de purificação do factor de crescimento d erivado de AtT-20 o

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A proteína foi detèrminada utilizando Ε^θ = 140 (VKW&muMj <

As propriedades físicas do factor de crescimento (PM 45 kDa, pi básico, afinidades para HS) e as propriedades biológicas (mitogénico para células endoteliais vasculares) indicam que este factor é distinto de outros factores de crescimento conhecidos tais como EGF, TGI PLGP, TGPB ou o recentemente referido factor de crescimento de queratinócito (21). A sua falta de reconhecimento por neutralização de anticorpos policlonais dirigidos contra aPGP ou bPGP bem como a sua falta de reactividade cruzada em RIA específico para aPGP ou bPGP indica que é distinto de PGP. Pareàe também ser distinto do factor de crescimento de células endoteliais derivado de plaquetas recentemente referido (37). Apesar de terem a mesma especificidade aparen te de células alvo e uma massa molecular semelhante, eles diferem de 20 vezes em potência e pela sua estrutura secundária, sendo o PDECGF um polipeptideo de cadeia simples enquanto o faotor de crescimento AtT20 tem uma estrutura dimérica.

A especificidade distinta em relação às células alvo e à sequência N-terminal diferente leva-nos à conclusão de que o factor de crescimento derivado de AtT20 representa um faotor de crescimento anteriormente desoonhecido. Apesar do presente estudo estabelecer claramente que este novo factor de crescimento é mitogénico para células endoteliais capilares, não é ainda conhecido se este factor pode estimular outros acontecimentos ligados à angiogénese. Estes incluem a quemotaxia das células endoteliais capilares e a activação da sintese de enzimas celulares tais como a còlagenase: e o activador de plasminogénio que está envolvido na desintegração da membrana (3) base capilar Em vista desta actividade preferencial nas células endoteliais vasculares em comparação com outras células derivadas da mesoderme o nome de vasculotropina é sugerido para este novo factor de crescimento.

Dados estruturais disponíveis permitiriam estudos na clonagem, estrutura, topologia, expressão e regulação do gene do faotor de crescimento quer nas condições fisiológicas quer nas patológicas, Estes estudos podem proporcionar indicios sobre a sua distribuição em tecidos normais em comparação com tecidos malignos bem como sobre as suas funções fisiológicas incluindo angiogénese.

Descrição Pormenorizada das Figuras 15 a 16

Figura 13. Purificação do factor de crescimento AtT20 por HSAC, cromatografia de exclusão de gel, cromatografia de permuta iónica Mono S e R-HPLC em coluna

Figura 13A. Aproximadarnente 490 ml de fracções precipitadas por (NH^)₂S0^ derivadas de 30 litros (6 recolhas de 5 litros com dois dias de intervalo de meio condicionado por células AtT-20 (DMEM-H21) suplementado com 5 ^ig/ml de insulina e 10 jig/tnl de transferrina e dialisados contra Tris HCl 10 mM de pH 7,3, NaCl mM, foram carregados numa coluna de Sepharose de hiparina (1,5 cm x 12 cm, 25 ml de volume de leito) com um caudal de 150 ml/h. A coluna foi em seguida lavada com 150 ml de tampão para equilibrar (Tris-HCl 20 mM de pH 7,3, NaCl 50 mM) e as proteínas retidas (50$ do total das proteínas aplicadas na coluna) foram eluidas com uma aplicação por fases de concentrações crescentes de NaCl (NaCl 0,3 M, 0,8 M e 3 M).

A dimensão da fracção foi de 3 ml e o caudal foi de 6 ml/h.

A cromatografia foi realizada a 4°C e a absorvância foi monitorizada a 280 nm. 0 histograma e circulos a cheio mostram a capacidade relativa das diferentes fracções reunidas ou individuais para estimular a proliferação de culturas de células de ACE de baixa densidade (5 x 10^ células/ /alvéolo, 12 alvéolos por placa). As condições para ensaio da actividade biológica eram semelhantes às descritas em (37). A maior parte da actividade biológica estava presente

no eluído de NaCl 0;8‘ M.

Fig. 15B. Depois de concentrar as fracções bioactivas de HSAC NaCl 0,8 M até 1 ml num concentrador Amicon YM10 aplicou-se o retido da ultrafiltração numa coluna de Sephadex G 100 (1 x 95 cm) equilibrada e eluída a 4°θ em PBS. 0 caudal para desenvolvimento da coluna foi de 6 ml/h e recolheu-se fracções de 3 ml. A absorvância foi monitorizada a 280 nm. As posições de eluição de marcadores de massa molecular (em kDa) foi como indicado pelas se-tas. Diluiram-se 1 para 100 aliquotas de cada fracção da coluna em de gelatina e 0,2 % em PBS, e submeteram-se a bioanálise aliquotas de 10 /il.

Fig. 130. As fracções bioactivas eluidas a partir da coluna de Sephadex G 100 foram reunidas e diluidas três vezes com HEPES 20 mM de pH 8.3. Utilizando um Super loop de 50 ml, a amostra foi em seguida aplicada numa coluna de Mono S HR 5/5 equilibrada com Hepes 20 mM de 8,3 à temperatura ambiente. Eluiu-se em seguida a coluna com um gradiante multilinear de NaCl (0 M até 1 M) como se segue: NaCl 0 M durante 5 minutos, NaGl 0 M até φ,45 M em 45 minutos, NaCl 0,45 M até 1 M em 15 minutos, NaCl 1 M durante 5 minutos. A absorvância foi monit «rizada a 280 nm.

caudal foi de 1 ml por min. e foram reunidas fracções de 1 ml. Diluiram-se de 1 para 100 aliquotas de cada fracção em gelatina a 0,2 ^em PBS, submeteram-se a daioanálise aliquotas de 10 ul em células ACE em placas de 12 alvéolos como descrito atrás. 0 histograma mostra a distribuição de actividade biológica com a maior parte da actividade biológica eluindo-se nas fracções 35 a 55 (NaCl 0,28 M).

Fig. 15D. As fracções de Mono S activas (fracções 55 a 55? Fig. 150 foram carregadas numa coluna Vydac (25 x 0,46 cm, dimensão das partículas 5 um, dimensão do poro 500 A) equilibrada em TFA a 0,1 (v/v) e acetonitrilo a 20%. As setas mostras os tempos de injecção. A proteína foi eluida com um gradiente linear de 115 min de acetonitrilc

de 20 a 45% em TPA a 0,1% com um eaudal de 0,6 ml/min, à temperatura ambiente. Recolheram-se fracções de 1,5 ml. Liluiram-se de 1 para 10 aliquotas de cada fracção com gelatina a 0,2 % em PBS e submeteram-se a bioanálise como descrito acima. 0 histograma apresenta a distribuição da actividade biológica, As fracções de pico (22, 24) foram usadas individualmente para estudos estruturais e para análi· se mais aprofundada da sua actividade biológica, (a) 0 pico de actividade maior foi reeluido nas mesmas colunas como apresentado na inserção b, as fracções de pico foram tomadas para análise de sequência de amino e terminal, (b) Amostras de proteína marcadas por da fracção 22 (pistas

A.C) e 23 (pistas B,D) foram analisadas individualmente em condições não redutoras (pistas A,B) ou em condições redutoras (pistas C,L),

Pig. 14 - Realizou-se electroforese sob as condições descritas, Em condições não redutoras verificou-se a existência de um componente de cerca de 43 a 45 kDa.

Em oondições redutoras apareoeu um componente de cerca de 23 kDa. Depois da electroforese os géis foram corados com azul de Coomassie. descorados, seeos e submetidos a autoradiografia. A migração das amostras foi comparada à dos padrões de proteína não reduzidos (esquerda) ou reduzidos (direita):

97,66,43,30,21 kDa.

Pig. 15 - Compararão da capacidade do bPGP derivado de pitutária com o faotor de crescimento derivado das células AtT-20 para estimular os crescimento de células HUE (a), células ACE (B) e células BHK-21 (C).

Fig. 15A. Culturas de baixa densidade de % células HUE (21) (5 x Kr células por alvéolo gelatinizado d 1 cm de diâmetro) foram expostas a meio 199 HEPES (25 mM) tamponizado suplementado com 100 yUg/ml de hiparina. selénio 10“⁹ M, PSC a 20% (como descrito em (11) e aumento de conoentração quer do bPGP derivado de pituitária (0) quer do factor de crescimento derivado de células AtT-20 (·).

Adicionou-se heparina apenas uma vez na altura da inoculação enquanto que tanto o bPGP oomo o factor de crescimento das células AtT-20 foram adicionadas em dias alternados. Depois de 6 dias em cultura, trataram-se com tripsina alvéolos em triplicado e contaram-se as células. A densidade final das culturas expostas a PES a 20% isolado foi de 7,4 x 10⁴ células por alvéolo. 0 desvio padrão foi inferior a 10 % da média.

Pig. 15C. Expuseram-se baixas densidades de células BHK-21 (26) (2 x 10⁴ células por placas de cultura de tecido gelatinizado de 35 mm) a 2 ml de DMEM-P12 (1 para 1 v/v) suplementado com 1,5 Aig/ml de gentamicina. 10 'Ug/ml de transferrina, 5 ug/ml de insulina e concentrações crescentes quer de bPGP derivados de pituitária (0) quer de factor de crescimento derivado de células AtT-20 (0). Adicionaram-se institlina e transferrina apenas uma vez, enquanto que o bPGP e o factor de crescimento derivado de células AtT-20 foram adicionadas em dias alternados. Depois de 4 dias em cultura trataram-se com tripsina triplicados dosdisoos e contaram-se as células. A densidade final da cultura exposta e transferrina insulina i soladamente foi de 1,05 X IO⁴ células/placa. 0 desvio padrão foi inferior a 10 % da média.

Pig. 16. Inocularam-se células BALB/MK (14) a uma densidade de 3 x 10⁴ células porplaca de 35 mm em meio Eagle modificado de baixa concentração de Ca (15) suplementado com 10 % de PCS. Inocularam-se 2 x 10⁴ células BOE (16), células granulosas (17) ou células do córtex adrenl (18) por placa de 35 mm nos seus respectivos meios (DNME suplementado com 10 % de PCS, 5 % de CS e 10 % de CS para BCE e células do córtex adrenal e meio P-12 suplementado com 2,5 % de CS para células granulosas). Adicionaram-se o bPGP derivado de pituitária (bPGP, 2 ng/ml) ou o factor de crescimento derivado de células AtT-20 (1,5 ng/ml) em dias alternados. Expuseram-se também células BALB/MK a

aFGF (10 ng/ml) uma vez que este mitogene ser tão patente como o EGF na promoção do seu crescimento. Depois de 6 dias em cultura, as células foram tratadas com tripsina e contadas num contador Coulter. 0 desvio padrão foi inferior a 10 % da média.

Uma vantagem de cultivar células de bovino para recolher o factor de crescimento é que o conjunto da estrutura da célula tem uma boa integridade de coesão. Isto é. a camada de células normalmente permanece intacta para recolher o meio condicionado por muitos dias e mesmo durante um mês ou mais da recolha sucessiva de amostras de meio. Quando está presente a estrutura em cápsula, á possive recolher amostras por cima da cúpula e também do interior ou por debaixo da cúpula. A desvantagem observada durante a cultura das células de bovino reside em que estas células produzem uma grande quantidade de proteínas diferentes que são segregadas pelas células. Leste modo, as fasee de purificação precisam de ser capazes de remover maiores quantidades da proteína não desejada.

Uma vantagem da linha de células AtT-20 é que está comercialmente disponível.

Uma vantagem da cultura de células de murino, AtT-20, é que estas células produzem o novo factor de crescimento sem produzir uma grande quantidade de outras proteínas que podiam interferir com as fases de isolamento subsequentes.

A desvantagem d e cultivar células de murino AtT-20 é que a integridade estrutural da cultura de células não é elevada. Deste modo, durante a cultura e a recolha, pequenas porções da camada de células podem partir -se, flutuar no meio condicionado e depois morrerem. Muitas vezes a cultura das células de murino apenas é possível até c erca de 7 dias ou por períodos ligeiramente mais longos.

novo factor de crescimento com origem em bovino é muitas vezes de pureza suficiente depois da fase de mono S e uma fase de Sephadex G-100 de modo que não é necessária a purificação por RP HPLC-C^. A análise por RP HPLC pode ser adequada para determinar a pureza de FsdGF.

SEQUENCIA DE ÁCIDOS AMINADOS DO FACTOR DE CRESCIMENTO DE

MURINO

A sequência N-terminal foi determinada para a proteína do factor de crescimento derivado das células de rato AtT20. Duas análises de sequênciaçâo N-termi nal foram realizados num sequenciador de proteínas de fase gasosa Applied Biosystems. Na segunda análise, o sequenciador foi carregado com aproximadamente 2,5 vezes a quantidade de proteína da primeira análise.

Como resultado de comparação dos dados das duas análises de sequenciação, a seguinte sequência N-terminal foi determinada:

X’-Pro-Thr-Thr-Glu-Gly-Glu-Gln-Lya-Ala His-Glu-Val-Val-Lys-Phe-Met-Asp-Val-Tyr-Gln-Arg-Ser-...

Na posição do ácido aminado um-(X') detectaram-se três ácidos aminados diferentes (Ala, Gly, e S sendo Ala o mais frequente. Uma vez que este resíduo de ácido aminado é ambíguo, o resíduo é representado por X’¹’.

A compapaçâo da s equência obtida a partir das células AtT20 de rato com os 23 ácidos aminados N-terminais determinados para a proteína de FSdGF de bovino demonstrou que estas duas proteínas são substancialmente homólogas j rato

AtT20 prot.; X'-Pro-Thr-Thr-Glu-Gly-Glu-Gln-Lys-Ala-His-Glu-Val-Val-Lys-Phe-Met-Asp-Val-Tyr-Gln-Arg-Ser-...

bovino

FSdGF í Ala-Pro-Met-Ala-Glu-Gly-Gly-Gln-Lys-Pro-His-Glu-Val-Val-Lys-Phe-Met-Asp-Val-Tyr-Gln-Arg-Ser-...

Os Exemplos seguintes tem como finalidade ilustrar a presente invenção apenas a titulo de exemplo, não devendo ser considerados de qualquer modo como restringindo o seu âmbito.

Reagentes — Os meios de cultura de tecido e os reagentes foram obtidos da Gibco (Grand Island. N.Y.). 0 acetonitrilo e o 2-propanol foram adquiridos na Fischer Sei. (Fair Lawn, NJ). A heparina-Sepharose (H-S) foi obtida de Pharmacia (Piscataway, N.J.). As colunas de HPLC Vydac foram de Separation Group (Hesperia, CA). Os marcadores de peso molecular para PAGE e o conjunto de determinações de proteína foram da Bio Rad Labs (Richmond, CA). As placas de cultura de t ecido foram adquiridas a Coster, excepto para as placas de Nuno de grande escala (24,5 x 24,5 cm), que foram da Applied Sei. (San Francisco, CA). Todos os outros reagentes foram da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) ou da Applied Biosystems (Foster City, CA).

EXEMPLO A

A intenção deste exemplo era a determinação do peso molecular do factor de crescimento de células endoteliais segregado no meio por células foliculares.

Incubaram-se culturas confluentes de células foliculares foram incubadas durante três dias num meio isento de soro constituído por meio de Eagle modificado por Dulbecco de baixo teor em glucose suplementado com transferrina (10 _zul/ml), insulina (5 p.g/ml), glutamina 2 mM e antibióticos. 0 meio condicionado (CM) (150) ml foi então recolhido, centrifugado (1000 xg, 15 min. 4°C) no sentido de remover os resultados das células e depois apli- 59 -

cado a uma coluna de Heparina-Sepharose que tinha sido equilibrada previamente com Tris/Cl 10 mM de pH 7.0. A coluna foi então séquencialmente eluida com Tris/Cl 10 mM de pH 7.0 que continha NaCl 0,6, 1 e 3 M. 0 caudal foi de 21 ml/h. Recolheram-se fracções de 700 jul e analisaram-se aliquotas para a bioactividade em células endoteliais microvasculares derivadas do córtex adrenal. A maioria da bioactividade foi eluida na presença de NaOl 0,6 M. Este comportamento cromatográfico é diferente do dos factores aFGF ou bFGF que são conhecidos por serem eluidos, respectivamente, na presença de NaOl 0,9-1.1 M e NaCl 1,8-2.2 M.

As fracções de NaCl 0,6 mais bioactivas foram reunidas e examinadas adicionalmente para determinação do peso molecular da actividade do factor de crescimento. Preparou-se uma placa de gel SDS de poliacrilamida a 12,5$ normal. Adicionou-se glicerol a dez por cento às fracções reunidas. Cinquenta porcento da amostra foi tratada com 2-mercaptoetanol a 2,5 $. Os 50$ restantes não foram expostos a 2-mercaptoetanol ou outros agentes redutores. As amostras e os marcadores de peso molecular pré-corados foram então incubados durante 3 min a 37°C e submetidos a electroforeses durante toda a noite com uma corrente de 10 mA. Quando a electroforese fioou completa, o gel foi rapidamente lavado em PBS e a distância dos marcadores de peso molecular desde o cimo do gel foi imedia tamente medida. Foram cortadas tiras horizontais de vinte centimetros e meio com uma lamina de barbear tanto das pistas que foram eluidas sob condições redutoras como das eluidas sob condições não redutoras. As tiras foram em seguida lavadas duas vezes com 1 ml de PBS e depois agitada durante a noite a duas vezes com 1 ml de PBS e depois agita das durante a noite a 4°C em tubos individuais que continham 500 ul de gelatina a 0,2 $ em PBS para eluição da actividade biológica. As tiras do gel foram em seguida remo vidas dos tubos, que foram em seguida cen-rifugados com o

fim de remover partículas que estivessem presentes. Os sobrenadantes foram transferidos para novos tuboe. Ensaiaram-se aliquotas de 20 microlitros de cada uma das fracções paraverificação da actividade biológica nas células endoteliais.

Observou-se um único pico de bioactividade no grupo não exposto a 2-mercaptoetanoi. 0 peso molecular aparente, conforme determinado comparando a posição dos marcadores de peso molecular com a das tiras, foi de cerca de 43 000. Não se recuperou qualquer bioactividade das tiras expostas a 2-mercaptoetanol.

Estes resultados deram uma boa determinação do peso molecular do factor de crescimento, que tinha sido confirmado com a molécula purificada até homogeneidade, e também indicaram que esta actividade é destruida pelos agentes redutores.

EXEMPLO 1

CULTURA DE CÉLULAS EOLIOULARES E RECOLHA LE MEIO

Estabeleceram-se culturas primárias de pituitária de bovino PC como anteriormente descrito (20,41) Numa forma de concretização, na cultura de soro de bovino fetal a 20 $ na referência 20 foi reduzido para 10 $. As concentrações de 5 a 20$ devem ser eficazes. Também não se usou ADNase. Todas as outras componentes são idênticas. Na confluência, as células foram passadas para placas de cultura de tecido em larga escala na presença de meio de Eagle modificado por Dulbecco com baixo teor de glucose (DMEM) suplementado com 10$ de soro de bovino fetal, glutamina 2 mM e antibióticos. Imediatamente depois de atingir a confluência, as culturas foram completamente lavadas com PBS a fim de remover as componente do soro. Incubaram-se em seguida as células num meio isento de soro cons- 61 1...1..1 ^vrnnTOEF^^^¹*''¹·' g*n^SÍ?^aaas»y>aM^. ⁿ*s tituido por DMEM mais transferrina (10 ul/ml), insulina (5 ug/ml), selénio (10^-^ M), glutamina 2 mM e antibióticos. Depois de três ou quatro dias, recolheu-se o meio e substituiu-se por meio fresco isento de soro. 0 meio recolhi do foi centrifugado (1000 g, 15 min, a 4°C) e armazenado a -70°C. 0 meio condicionado (CM) foi em seguida recolhido de três em três ou de quatro em quatro dias até seis semanas.

EXEMPLO 2

CONCENTRAÇÃO DO MEIO CONDICIONADO

Lotes de quatro a seis litros de meio condicionado (CM) foram submetidos a precipitação por sulfato de amónio. Adicionou-se oom agitação constante sulfato de amónio (500 g/1). até dissolução completa do sal. Depois de 8 a 12 horas na câmara frigorífica, o produto foi centrifugado (20 000 xg, 45 min a 4°C). Separou-se o sobrenadante e o sólido foi ressuspendido com Tris/Cl 10 mM de pH

7,2 e NaCl 50 mM e dialisado a 4°C contra o mesmo tampão durante 8 a 12 h. 0 volume final foi 50 a 60 vezes menos que o original.

Em alternativa, o CM é concentrado usando uma célula de agitação Amecon (unidade de 2,5 litros) usando uma membrana que tem um limiar de separação de peso molecular de 10 000 Daltons com resultados semelhantes.

EXEMPLO 3

CROMATOGRAPIA DE AFINIDADE DE HEPARINA-SEPHAROSE

CM concentrado foi aplicado a uma coluna de H-S (14) (10 ml) pré-equilibrado com Tris/Cl 10 mM de pH 7,2 e NaCl 50 mM. A coluna foi em seguida lavada oom o mesmo tampão até a absorvância a 280 nm ser desprezável e depois eluiu-se por fases com Tris/Cl 10 mM de pH 7.2 con- 62 -

tendo NaCl 0,15, 0,9 e 3 M. 0 caudal foi de 1.5/min. Recolheram-se fracçSes de 1,5 ml e ensaiaram-se aliquotas diluídas com gelatina a 0,2 $ em PBS para verificação da actividade mitogénica em células endoteliais.

EXEMPLO 4

HPLC DE PASE INVERSA (a) As fracçSes de H-S mais bioactivas (conjunto de NaCl 0,9 M) foram diluídas quatro vezes com ácido trifluoroaoético (TPA) em água e aplicadas a uma coluna de HPLC Vydac C^ (10 x 250 mm) pré-equilibrada com TPA 0,1/acetonitrilo a 20$. A coluna foi elui da com um gradiente linear de acetonitrilo (20) a 45$ em 115 min) a um caudal de 2 ml/min. A absorvância foi monitorizada a 21 nm, As fracçSes de 2 ml foram diluidas em gelatina a 0,2 $ em PBS para análise em células endoteliais.

(b) As fracçSes mais bioactivas foram reunidas, diluidas duas vezes em TPA a 0,1 $ em água e aplicadas a uma coluna de HPLC Vydac C^ )4,6 x 250 mm) pré-equilibrada em TPA a 0,1 %-2-propanol a 20$. Eluiu-se a coluna com um gradiente linear de 2-propanol (20 a 45$ em 113 min). 0 caudal foi de 0,6 ml/ /min. Diluiram-se aliquotas das fracçSes para bioanálise. 0 restante das fracçSes foi seco num Speed-Va para SDS/PAG-E (29) e análise estrutural.

EXEMPLO 5

BIOANALISE

Células endoteliais capilares de córtex adrenal ou derivados do cérebro de bovino, células endoteliai da aorta de bovino fetal ou adulto, células endoteliais da

veia umbilical humana, células endoteliais corneais de bovino, células do córtex adrenal, células eptiteliais do cristalino, fibroblastos BHK-21 e queratinocitos humanos foram cultivados e mantidos como anteriormente descrito (17,47,48,50,51, 52,26,53). Para as bioanalises, as células foram inoculadas na presença do seu respectivo meio de crescimento a uma densidade de 2 x 10^ por placa de 35 mm ou 1 x lO^/aívéolo em 12 placas multiaiveolares. Adicionaram-se fracçSes às células em aliquotas de 5 ul/ml. Depois de 4 ou 5 dias, as células foram dissociadas por exposição a tripsina e contados num contador Counter.

EXEMPLO 6

MICROSSEQUENCIAQÃO DAS PROTEÍNAS

Aproximadamente 20 pmol de proteína das fracçSes mais bioactivas obtidas da segunda fase de foram aplicadas directamente a um sequenciador de proteínas de fase gasosa Model 470A (Applied Bisystems). Os ciclos de degradação de Edman foram realizados e a identificação dos derivados dos ácidos aminados foi feita por uma coluna de HPLC em linha (54),

EXPRESSÃO

A purificação de factores de crescimento está também descrita nas Patentes dos E.U. 4 708 948:

376 071: 4 350 687: 4 444 760; e 4 722 998.

A produção de ADN recombinante de factores de crescimento está descrita nas Patentes dos E.U.

670 394; 4 721 672: 4 738 927; 4 783 412; e 4 801 542; todas elas são aqui incorporadas por referência.

Antecipou-se que os factores de crescimento descritos aqui seriam capazes de ser clonados e produ- 64 -

zidos de acordo com os métodos descritos nas Patentes e referências mencionadas na presente memória descritiva.

Deverá entender-se que o factor de crescimento descrito na presente memória descritiva pode ser quer o dimero (43 000 sté 46 000 kBa) ou o monómero (cerca de 23 kDa).

Embora apenas algumas formas de concretização da invenção tenham sido apresentadas e descritas na presente memória descritiva, torna-se evidente para os especialistas na matéria que podem ser feitos várias modificações e mudan$as na presente invenção para o novo factor de crescimento de células endoteliais, nos seus métodos de isolamento, de produção usando métodos de ALN recombinante e nos seus usos naterapia (oicatrizaçâo de feridas) sem se desviar do espírito e do âmbito da presente invenção. Existe a intenção de que todas estas modificações e alterações abrangidas no âmbito das reivindicações em anexo possam ser realizadas de acordo com a presente invenção,

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   - ia _

   Processo para a preparação de factor de crescimento derivado de folliculo stellate (FSdGF) substancialmente puro sob forma isolada caracterizado por compreender as fases de:

   (a) proporcionar uma amostra biológica que contenha FSdGF (b) extrair a porção solubilizada da amostra;

   (c) purificar parcialmente o FSdGF a partir do extracto usando uma fase de precipitação por um sal em meio aquoso;

   - 65 (d) fraccionar o extracto purificado usando cromatografia de afinidade por meio de fracções de heparina ligadas a um suporte insolúvel como fase estacionária e empregando uma fase móvel de gradiente num sal de concentração em sal crescente;

   (e) fraccionar o extracto usando cromatografia de exclusão em gel;

   (f) fraccionar a amostra usando cromatografia líquida; e opcionalmente (g) purificar o extracto usando cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa.

   - 2β Processo de acordo com a reivindicação

   1 caracterizado por na fase (c) o sal de precipitação em meio aquoso ser sulfato de amónio.

   - 3& Processo de acordo com a reivindicação

   1 caracterizado por o produto obtido ser uma proteína dimérica com um peso molecular de aproximadamente 43 kLa por determinação por electroforese em gel de SS-poliacrilamida sob condições não redutoras e conter na sua exèremidade N-tei minai a sequência de ácidos aminados ^Ala-Pro-Met-Ala-Glu-Gly-Gly-Gln-Lys-Pro-His-Glu.

   - 4& _

   Processo de aoordo com a reivindicação 3 caracterizado por o produto obtido conter adicionalmente uma sequência interna de ácidos aminados obtenível por digestão tríptica selecionada de entre o grupo constituído por:

   Ser-Phe-Cys-Arg-Pro-Ile-Glu-Th.r-Leu-Val-SSp-Ile-Phe-Gln-Glu-Tyr-Pro-Asp-Glu-Ile; e

   Ser-Phe-Cys-Arg-Pro-Ile-Glu-Thr-Leu-Val-Ssp-Ile-Phe-Gln-Glu-Tyr-Pro-Asp/lle Glu.

   _ 5& _

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 caracterizado por o produto obtido ser uma glicoproteína constituída essencialmente por duas sub-unidades substancialmente homólogas tendõ cada uma um peso molecular de cerca de 23 000 Daltons.

   - 6ô Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o produto obtido ser efioaz na cicatrização de feridas num s er humano numa concentração entre cerca de 10 picogramas/mililitro e cerca de 500 picogramas/ /mililitro.

   Processo de acordo com a reivindicação

   1 caracterizado por na fase de purificação parcial o FSdGF ser feito contactar com uma solução aquosa de sulfaõo de amónio;

   na fase de fraccionamento (d) a heparina estar ligada a Sepharose; e na fase de purificação (g) a cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa ser conduzida usando um gradiente de acetonitrilo;

   Processo para a preparação de factor de crescimento derivado de folliculo stellate sob forma i solada caracterizado por se proporcionar um vector de expressão replicável com capacidade para expressar a Êsequência de ADN que codifica para o factor de crescimento derivado de folliculo stellate num hospedeiro adequado, transformar o referido hospedeiro de modo a obter um hospedeiro recombinante e manter o referido hospedeiro recombinante sob condições que permitam a expressão da referida sequência de ADNc que codifica para o preferido factor de crescimento derivado de folliculo stellate.

   _ ga Processo de acordo com a reivindicação 8 caracterizado por o produto obtido fcer um peso molecular de cerca de 43 000 Da.

   - 106 Processo de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por o produto obtido ser uma proteína com um peso molecular de aproximadamente 43 a 45 kDa por determinação por electroforese em gel de SS-poliacrilamida sob condições não redutoras.

   - 11 & Processo de acordo com a reivindicação 10 caracterizado por o produto obtido conter na sua extremi dade N-terminal a sequência de ácidos aminados Ala-Pro-Met-Ala-Glu-Gly-Gly-G1n-Lys-Pro-His-Glu-Va1-Vai-Lys-Phe-Me t-Asp-Val-Tyr-Gln.

   Processo de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por o produto obtido sob condições redutoras produzir um dímero substancialmente homólogo que tem um peso molecular de cerca de 23 000 Daltons.

   - 13 § Processo para a preparação de factor de crescimento derivado de folliculo stellate concentrado sob forma isolada caracterizado por compreender as fases de:

   (a) obter uma amostra de um sobrenadante líquido biológi que contém FSdGF usando o meio de condicionamento de uma cultura;

   (b) fraccionar a amostra da fase (a) usando fracções de heparina ligadas a um suporte insolúvel como fase estacionária e usando uma fase móvel de gradiente num salde concentração salina crescente; e (c) purificar a fracção bioactiva da fase (b) usando electroforese em gel.

   - 140 Processo de acordo com a reivindicação 13 caracterizado por na fase de fraecionamento o factor de crescimento ser eluído numa concentração de cloreto de sódio entre cerca de 0,6 e 1,0 Molar.

   - 15® Processo de acordo com a reivindicação 14 caracterizado por na fase de purificação o gel ser uma poliacrilamida adequada.

   - 168 Processo de acordo com a reivindicação

   13 caracterizado por 0 produto obtido ter um peso molecular de cerca de 43 000 Da.

   - 17 & Processo para a preparação de factor de crescimento derivado de folliculo stellate (FSdGF) sob forma isolada caracterizado por compreender as fases de:

   (a) proporcionar uma amostra biológica que contém FSdGF;

   (b) extrair a porção solubilizada da amostra;

   (c) purificar parcialmente o FSdGF a partir do extracto usando uma fase de precipitação por um sal em meio aquoso;

   (d) fraccionar o extraoto purificado usando cromatografia de afinidade empregando fracções de heparina ligadas a um suporte insolúvel oomo fase estacionária e empregando uma fase móvel de gradiente de sal com uma concentração salina crescente;

   (a) fraccionar o extracto usando cromatografia de exclusão de gel; e (f) purificar 0 extracto usando cromatografia líquida de alta pressão de fase invertida.

   - 188 Processo de acordo com a reivindicação 17 caracterizado por 0 produto obtido ter um peso molecular entre cerca de 43 000 e 45 000 Da.

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 17 ou 18 caracterizado por o produto obtido ser uma glicoproteína constituida essencialmente por duas sub-unidades substancialmente homólogas tendo cada uma um peso polecular de cerca de 23 000 Dantons.

   - 208 Processo de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por o produto obtido ser eficaz na cicatrização de feridas num ser humano numa concentração entre cerca de 10 picogramas/mililitro e cerca de 500 micogramas/ /mililitro.

   - 218 Processo de a cordo com a reivindicação 17 caracterizado por na fase de purificação (f) a cromatografia líquida de alta pressão de fase inversa ser conduzida usando um gradiente de acetonitrilo aquoso.

   - 228 Processo de acordo com a reivindicação

   17 caracterizado por compreender adicionalmente a fase de:

   (g) purificar o produto concentrado da fase (f) usando cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa com um gradiente de isopropanol aquoso.

   - 71 Processo de acordo cota a reivindicação 9 caracterizado por o produto obtido ter a seguinte sequência de ácidos aminados interna N-terminal: Ala-Pro-Met-Ala-Glu-Gly-Gly-Gln-Lys-Pro-His-Glu-Val-Val-Lys-Phe-Met-Asp-Val-Tyr-Gln-(Arg)-Ser-Phe-X-Arg-Pro-Ile-Glu-Thr-Leu-(Val)-X-Ile-X-(Gln)-Glu-Tyr-(Pro)- em que os ácidos aminados entre parêntesis são certos e o sinal -X- indica um ácido aminado de identidade desconhecida.

   - 2 4& Processo para a preparação de factor de crescimento de células endoteliais humanas caracterizado por se proporcionar um vector de expressão replicável com capacidade para expressar a sequência de ADN que codifica para o factor de crescimento de células endoteliais humanas num hospedeiro adequado, transformar o referido hospedeiro a fim de obter um hospedeiro recombinante e manter o referido hospedeiro recombinante sob condiçães que permitem a expressão da referida sequência de ADNc que codifica para o referido factor de crescimento de células endoteliais a fim de produzir o factor de crescimento de células endoteliais.

   - 25& Processo de acordo com a reivindicação 24 caracterizado por incluir uma fase adicional de recuperação do referido factor de crescimento de células endoteliais

   268

   Processo de acordo com a reivindicação 25 caracterizado por o referido vector de expressão ser um bacteriófago.

   - 27^â Processo de acordo com a reivindicação 25 caracterizado por 0 referido vector de expressão ser um plasmídeo.

   - 28® Processo para promover a proliferação de células endoteliais c aracàerizado por compreender a apli cação a tais células de uma quantidade mitogénica de factor de crescimento derivado de folliculo stellato obtido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 24.

   - 298 Processo de acordo com a reivindicação 28 caracterizado por as células crescerem numa cultura de células.

   - 308 _

   Processo para promover a endotelialização vascular caracterizado por compreender a aplicação a superfícies vasculares de um hospedeiro que necessita de tal tratamento de uma quantidade de factor de crescimento derivado de folliculo stellate obtido de aoordo com qualque das reivindicações 1 a 24 suficiente para promover a endotelialização.

   - 31^s Processo de acordo com a reivindicação 30 caracterizado por o factor de crescimento derivado de follicuio stellate ser aplicado no período pós-operatório a superfícies vasculares a seguir a engloplastia de balão.

   - 32a Processo de acordo com a reivindicação 30 caracterizado por o factor de crescimento derivado de follicuio stellate ser aplicado às superfícies de vasculatura e/ou a superfícies de enxertos vasculares durante ou antes da cirurgia de enxerto vascular.

   - 33& Processo de acordo com a reivindicação 30 caracterizado por o factor de crescimento derivado de follicuio stellaíje ser administrado a um hospedeiro a seguir a infarto do miocárdio.

   - 34^ã Processo para promover a cicatrizaçâo de feridas caracterizado por compreender a administração a uma ferida de uma quantidade de factor de crescimento derivado de follicuio stellate quando obtido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 24 suficiente para promover angiogénese no local da ferida.

   Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por se incorporar como ingrediente activo faotor de crescimento derivado de folliculo stellate quando obtido de aoordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 em conjunto com uma substância veicular farmaceutioamente aceitável.

   - 36s Processo para a preparação de uma composição farmaoeutioa caracterizado por se incorporar como ingrediente activo factor de crescimento derivado de folliculo stellate quando obtido de aoordo com a reivindicação

   13.

   - 37^a Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por se incorporar como ingrediente activo factor de crescimento derivado de folliculo stellate quando obtido de aoordo com a reivindicação 7 em conjunto com uma substância veicular farmaceuticamente aceitável.

   - 38& Processo de acordo com a reivindicação 37 caracterizado por a referida composição ter como substância veicular uma substância veicular parenteral.