JP2007051150A - 結合組織増殖因子 - Google Patents

Abstract

【課題】新規なポリペプチド、結合組織増殖因子(CTGF)、5'および3'非翻訳ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドCTGF、CTGFと反応する抗体、ならびにCTGFを産生する手段を提供する。
【解決手段】CTGF遺伝子発現に関連する疾患の治療に使用する為の、治療上有効な量のサイクリックＡＭＰレベルを増加させる薬剤、例えばコレラトキシン、８Ｂｒ−ｃＡＭＰや、ＣＴＧＦのアンタゴニストであるＣＴＦＧポリペプチドと特異的の結合する抗体及びこれらを配合した組成物を提供する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、National Institute of Healthが認可した助成金No. GM 37223により政府の支援の下で行われた。

発明の背景
発明の分野
本発明は、一般的には、増殖因子の分野に関し、特に、結合組織増殖因子(CTGF)、この因子をコードするポリヌクレオチド、およびCTGFに対する使用方法に関する。

関連技術
増殖因子は、標的細胞を刺激して、発生組織における増殖、分化、および組織化を行う分泌ポリペプチドの1クラスである。増殖因子の作用は、細胞内でシグナル伝達イベントを刺激する特異的受容体へのそれらの結合に依存する。いくつかのよく研究された増殖因子としては、血小板由来増殖因子(PDGF)、インシュリン様増殖因子(IGF-1)、トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)、トランスフォーミング増殖因子α(TGF-α)、表皮細胞増殖因子(EGF)、および線維芽細胞増殖因子(FGF)が挙げられる。

PDGFは、循環血小板のアルファ顆粒中で見出された熱に安定なカチオン性のタンパク質であり、線維芽細胞や平滑筋細胞などの結合組織細胞に対する分裂促進剤および走化剤であることが知られている。この分子の活性に起因して、PDGFは、創傷の正常な治癒およびアテローム硬化症や線維性疾患などの疾患への病理的な寄与に関係する主要な因子であると考えられている。PDGFは、A鎖およびB鎖より成るダイマー分子である。これらの鎖はヘテロダイマーまたはホモダイマーを形成し、現在までに単離された組合せはすべて生物学的に活性である。

組織再生および修復における種々の増殖因子の役割に関する研究が行われた結果、PDGF様タンパク質が発見されるに至った。これらのタンパク質は、PDGFと共に免疫学的活性および生物学的活性の両方に関与し、PDGFに特異的な抗体を用いて妨害することができる。

こうした新しい増殖因子は、ヒト組織の正常な発生、成長、および修復において重要な役割を果たす可能性がある。これらの分子から誘導された治療薬は、所定の臨床学的状態（例えば、創傷治癒中の状態）の結合組織が関与する正常または欠陥のある成長過程を促進するうえで役に立つ可能性がある。これらの増殖因子が病理学的に疾患に作用する場合、こうしたタンパク質から開発された治療薬を使用して、無制御な組織成長を調節または軽減できる可能性がある。

新しい再生組織の形成には、細胞の成長および組織の器質化の過程に関与する調節分子および構造分子の両方を産生する種々の遺伝子の同調的調節が必要である。トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)は、この過程の中心的な調節成分であるように見える。TGF-βは、血小板、マクロファージ、および好中球（修復過程の初期段階に存在する）により放出される。TGF-βは、間充織細胞に対する増殖刺激因子として機能するとともに、内皮細胞および上皮細胞に対する増殖抑制因子としても機能する。TGF-βの増殖刺激作用には、PDGF BBまたはPDGF AAまたは結合組織増殖因子(CTGF)などの自己分泌増殖因子を含む間接的機構が介在するように見える。

TGF-βスーパーファミリーの数種のメンバーは、癌などの細胞増殖性疾患の治療に応用可能であることが示唆される活性を有している。特に、TGF-βは、種々の細胞タイプに対する増殖抑制剤としての可能性が示された(Massague,Cell49:437, 1987)。MISは、ヌードマウス中におけるヒト子宮体癌腫の増殖を抑制することが示された(Donahoeら、Ann. Surg. 194: 472, 1981)。また、インヒビンαは、卵巣および精巣の両方において腫瘍の発生を抑えることが示された(Matzukら、Nature, 360: 313, 1992)。

TGF-βのメンバーの多くはまた、組織修復の重要なメディエーターである。TGF-βは、コラーゲンの形成に顕著な作用を呈するとともに、新生マウスにおいて目立った血管新生応答の原因になることが示された(Robertsら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83:4167, 1986)。骨モルフォゲンタンパク質(BMP)は新しい骨の成長を誘発することができ、骨折や他の骨格欠損の治療に有効である(Glowackiら, Lancet,1:959, 1981; Fergusonら, Clin. Orthoped. Relat. Res.,227:265, 1988; Johnsonら, Clin. Orthoped. Relat. Res., 230:257, 1988)。

増殖因子およびそれらをコードする遺伝子の単離は、種々の結合組織関連疾患に対する診断法および治療法を開発するうえで重要である。本発明は、こうした発明を提供する。

発明の概要
種々のタイプの細胞が、PDGFおよびPDGF関連分子を産生および分泌する。培養された内皮細胞の増殖培地中に存在するPDGFダイマーのタイプを同定しようという試みの中で、新しい増殖因子が発見された。これまでに知られていなかったこの因子（結合組織増殖因子(CTGF)と呼ぶ）は、免疫学的および生物学的にPDGFとの関連を有するが、異なる遺伝子の産物である。

第1の態様において、本発明は、結合組織細胞に対するポリペプチド増殖因子を提供する。このポリペプチドは、細胞に対する分裂促進剤および走化剤である。

第2の態様において、本発明は、結合組織増殖因子をコードするポリヌクレオチドを提供するが、このポリヌクレオチドは、(1)分子量約36kD〜38kDのモノマーとして存在し、かつ(2)PDGF受容体に結合可能なタンパク質をコードすることを特徴とする。

更なる態様において、本発明は、CTGFを含有する有効な量の組成物を創傷に適用することによって、被験者の創傷治癒を促進する方法を提供する。

更にもう1つの態様において、本発明は、細胞増殖性疾患により特徴付けられる病状をもつ疑いのある被験者の病理学的状態を診断する方法を提供するが、この方法には、(1)被験者からCTGFを含有すると思われるサンプルを採取する工程と、(2)サンプル中のCTGFのレベルを測定する工程と、(3)サンプル中のCTGFのレベルと正常組織中のCTGFのレベルとを比較する工程と、が含まれる。

有効な量のCTGF反応性薬剤を用いて疾患部位を処理することによって、細胞増殖性疾患により特徴付けられる疾患を軽減する方法もまた、提供される。

本発明では、CTGF遺伝子の5'非翻訳ヌクレオチド中のTGF-β応答要素すなわち調節要素(約-154〜-145)を同定する。次に、この要素の同定に基づいて、本発明は、CTGF発現に影響を及ぼす組成物を同定する方法を提供するが、この方法には、TGF-β調節要素(TβRE)を調節するTGF-β因子の存在下で、該組成物およびTβREを含有する成分をインキュベートする工程と、CTGF発現に及ぼす該組成物の影響を測定する工程と、が含まれる。こうして、本発明は、線維性疾患の治療薬を見出す手段を提供する。

発明の詳細な説明
本発明は、結合組織増殖因子(CTGF)と呼ばれる新規なタンパク質増殖因子を開示する。このタンパク質は、ヒト組織の正常な発生、成長、および修復において重要な役割を果たす可能性がある。CTGFタンパク質の発見およびこの分子をコードするcＤＮＡのクローニングは、これが結合組織細胞に対して分裂促進活性および走化活性を示す、今までに知られていない増殖因子であるという点で意義がある。CTGFの生物学的活性はPDGFのものと類似しているが、CTGFはPDGFのA鎖またはB鎖遺伝子とは関連のない遺伝子の産物である。CTGFは内皮細胞および線維芽細胞（いずれも創傷部位に存在する）により産生されるので、CTGFが創傷治癒において増殖因子として機能する可能性がある。

病理学的には、CTGFは、結合組織細胞の過増殖が見られる疾患、例えば、癌、腫瘍形成および増殖、線維性疾患（例えば、肺線維症、腎線維症、緑内障）、ならびにアテローム硬化症、に関与する可能性がある。CTGFポリペプチドは、皮膚創傷の治癒に欠陥があるかまたは正常な治癒機構を促進する必要のある場合の治療薬として有用である。この他、CTGFポリペプチドまたはその断片に対する抗体は、CTGFが病理学的因子である疾患の検出を助ける診断用ツールとしての価値がある可能性もある。また、治療上は、抗体または抗体分子のフラグメントは、CTGFが組織の過増殖を誘発する疾患においてCTGFの生物学的活性を中和するために使用できる可能性もある。

CTGFポリペプチドの主要な生物学的活性は、その分裂促進性、すなわち、標的細胞を刺激して増殖させる能力である。in vivoにおいてこの分裂促進活性から得られる究極的な成果は、標的組織の成長である。CTGFはまた、特定分子との相互作用の結果として化学的に誘発される細胞の運動である走化活性を有する。好ましくは、本発明のCTGFは、結合組織細胞に対して分裂促進性および走化性を示すものがよいが、他のタイプの細胞がCTGFポリペプチドに対して応答性を示してもよい。

本発明のCTGFポリペプチドは、分子量約36kD〜38kDのモノマーとして存在することを特徴とする。CTGFは細胞によって分泌され、応答細胞上の受容体との相互作用に関して活性である。CTGFは抗原的にはPDGFとの関連を有するが、ペプチド配列の相同性は、あったとしてもごくわずかである。抗PDGF抗体は、PDGF異性体およびCTGF分子の非還元型に対して強い親和性を示し、生物学的活性を失ったこれらのペブチドの還元型との親和性はそれよりも10倍少ない。このことから、PDGF異性体とCTGF分子との間に共通の三次構造領域が存在し、共通の抗原性エピトープになることが示唆される。

「実質的に純粋」という用語は、本明細書中で使用する場合、CTGFと自然に会合を起こす他のタンパク質、脂質、炭水化物、またはこれ以外の物質が実質的に含まれないCTGFを指す。実質的に純粋なポリペプチドは非還元性ポリアクリルアミドゲル上で単一の主バンドを生成する。CTGFポリペプチドの純度はまた、アミノ末端アミノ酸配列分析によって測定することができる。CTGFポリペプチドには、CTGFの分裂促進活性および走化活性が保持されるかぎり、このポリペプチドの機能的断片が含まれる。CTGFの生物学的活性を有する、より低分子量のペプチドも本発明に含まれる。更に、例えば、CTGF cＤＮＡの部位特異的突然変異誘発を介して産生される、より有効なCTGF分子が含まれる。

本発明は、CTGFタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。「単離」という用語は、本明細書中で使用する場合、ポリヌクレオチドと自然に会合を起こす他のポリヌクレオチド、タンパク質、脂質、炭水化物、またはこれ以外の物質が実質的に含まれないポリヌクレオチドを指す。こうしたポリヌクレオチドとしては、結合組織増殖因子をコードするＤＮＡ、cＤＮＡ、およびＲＮＡの配列が挙げられる。CTGFの全部または一部分をコードするポリヌクレオチドもまた、CTGFの分裂促進活性および走化活性を有するポリペプチドをコードするかぎり、本発明に含まれるものとする。こうしたポリヌクレオチドには、対立遺伝子変異体などの天然に存在する形態のもの、および突然変異ポリヌクレオチドなどの意図的に操作された形態のもの、ならびに人工的に合成されたポリヌクレオチドが含まれる。例えば、CTGFポリヌクレオチドに部位特異的突然変異誘発を起こさせてもよい。本発明のポリヌクレオチドには、遺伝暗号の結果として縮重した配列も含まれる。天然アミノ酸は20個しかなく、そのほとんどが1つ以上のコドンで特定化される。従って、CTGFのアミノ酸配列が機能的に変化しないかぎり、縮重したヌクレオチド配列はすべて、本発明に含まれる。

「ポリヌクレオチド」という用語はまた、CTGFをコードする構造遺伝子の端部に位置する翻訳されない配列をコードするＤＮＡ、cＤＮＡ、およびＲＮＡをも意味する。例えば、本発明のポリヌクレオチドには、CTGF構造遺伝子と関連する5'調節ヌクレオチド配列および3'非翻訳配列が含まれる。5'および3'非翻訳領域が含まれる本発明のポリヌクレオチドは、図1Cに示されている。プロモーターを含めた5'調節領域は、図1Bに示されている。

CTGFのcＤＮＡ配列には、位置130を開始部位とし、位置1177をTGA終止部位とするとともに、349個のアミノ酸のペプチドをコードする1047個のヌクレオチドのオープンリーディングフレームが含まれる。CTGF cＤＮＡと、PDGFのA鎖およびB鎖の両方のcＤＮＡとの配列相同性はわずか40%である。

本発明は、CTGFプロモーターヌクレオチド-823〜+74ならびにCTGFプロモーター配列の位置-162と位置-128の間に位置するTGF-β調節要素(TβRE)を提供する。メチル化干渉アッセイおよび競合ゲルシフトアッセイにより、新規なTGF-βシス調節要素を表す位置-157と位置-145の間のユニークな13-ヌクレオチド配列がマッピングされる。

CTGFオープンリーディングフレームは、39個のシステイン残基を含有するポリペプチドをコードする。従って、複数の分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質をコードすることが示唆される。このペプチドのアミノ末端には、分泌タンパク質を示す疎水性シグナル配列が含まれ、アミノ酸配列のアスパラギン残基28および225の位置に2つのN-連結グリコシル化部位が存在する。CTGFは、Cyr61(O'Brienら, Mol. Cell. Biol., 10:3569, 1990)、およびFisp12(Ryseck,et al., Cell Growth & Differentiation, 2:225, 1991)/BigM2(Brunnerら, DNA and Cell Biol., 10:293 1991)；v-src誘導ペプチド(CEF-10)(Simmonsら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:1178, 1989)、および推定オンコタンパク質(nov)(Joliotら, Mol. Cell. Biol., 12:10, 1992)などの血清誘導極初期遺伝子産物を含むタンパク質ファミリーのメンバーである。ショウジョウバエの胚発生の背／腹パターン形成において内側中胚葉要素の誘導を調節する働きをする遺伝子であるねじれ嚢胚形成遺伝子(tsg)は、CTGFとの関連がより遠い(Masonら, Genes and Devel., 8:1489, 1994)。CTGFポリペプチドとCEF-10 mＲＮＡ転写物によりコードされるポリペプチドとの間の全配列相同性は45%である(Simmonsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1178, 1989)；推定選択的スプライシング領域を欠失させた場合、相同性は52%に達する。

本発明のＤＮＡ配列は、数種の方法で得ることができる。例えば、当該技術分野で公知のハイブリダイゼーション法を用いてＤＮＡを単離することができる。こうした方法には、1)ゲノムライブラリーまたはcＤＮＡライブラリーへのプローブのハイブリダイゼーションによる共有ヌクレオチド配列の検出、および2)発現ライブラリーの抗体スクリーニングによる構造上の共通する特徴の検出が含まれるが、これらの限定されるものではない。

核酸ハイブリダイゼーションによるスクリーニング法により、任意の生物体から任意の遺伝子配列を単離することができる（ただし、適切なプローブが入手可能な場合に限る）。例えば、問題のタンパク質をコードする配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプローブは、化学的に合成することができる。このためには、アミノ酸配列の短いオリゴペブチドストレッチが知られている必要がある。このタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、遺伝暗号から導き出すことができるが、暗号の縮重を考慮に入れなければならない。配列が縮重している場合、混合付加反応を行うことができる。これには変性二本鎖ＤＮＡのヘテロ混合物が含まれる。こうしたスクリーニングのために、一本鎖ＤＮＡまたは変性二本鎖ＤＮＡのいずれかを用いてハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。目的のポリペプチドに関連するmＲＮＡ配列の量が極端に少ない供給源から誘導されるcＤＮＡクローンの検出には、ハイブリダイゼーションが特に有用である。言い換えると、非特異的な結合を回避するようにしたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用すれば、例えば、標的ＤＮＡとその完全な相補体である混合物中の単一のプローブとのハイブリッドを形成することによって、特異的なcＤＮＡクローンをオートラジオグラフィーで可視化することが可能である(Wallaceら, Nucleic Acid Research, 9:879, 1981)。

λgt11などのcＤＮＡ発現ライブラリーは、CTGFに特異的な抗体またはCTGFと交差反応するPDGFに対する抗体を用いることによって、少なくとも1つのエピトープを有するCTGFペプチドのスクリーニングに間接的に利用できる。こうした抗体は、ポリクロナール的またはモノクロナール的のいずれで誘導されたものであってもよく、CTGF cＤＮＡの存在を示唆する発現産物の検出に利用できる。

CTGFをコードするＤＮＡ配列は、好適な宿主細胞へＤＮＡを移入することによってin vitroで発現させることができる。「宿主細胞」とは、ベクターが増殖でき、かつそのＤＮＡが発現され得る細胞を指す。この用語にはまた、対象宿主細胞の任意の子孫が含まれる。複製の際に突然変異が起こる可能性があるので、すべての子孫が親細胞と同じである必要はないと考えられる。しかしながら、「宿主細胞」という用語を使用する場合、こうした子孫が含まれる。

CTGFをコードするＤＮＡ配列は、原核生物または真核生物のいずれにおいてもin vitroで発現させることができる。原核生物において真核生物のコード配列を有するＤＮＡ配列を発現させる方法は、当該技術分野で公知である。宿主には、微生物、酵母、および哺乳動物が含まれる。

宿主中で発現および複製が可能な、生物学的に機能するウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターは、当該技術分野で公知である。こうしたベクターを使用して、本発明のＤＮＡ配列を取り入れることができる。一般的には、挿入される真核生物遺伝子配列の効率的な転写を促進するプロモーター配列を含有する発現ベクターは、宿主と共に使用される。発現ベクターは、典型的には、複製起点、プロモーター、およびターミネーター、ならびに形質転換される細胞の表現型選択を可能にする特異的遺伝子を含有する。

細菌、酵母、および哺乳類発現系などの当該技術分野で公知の発現ベクターのほかに、バキュロウイルスベクターを使用してもよい。この無脊椎動物ウイルス発現ベクター中の外来遺伝子を発現させることの一つの利点は、抗原的にも機能的にも天然のものと類似した組換えタンパク質を高レベルに発現することが可能な点である。バキュロウイルスベクターおよびこのベクターと併用される適切な昆虫宿主細胞は、当業者には分かるであろう。

「組換え発現ベクター」という用語は、CTGF遺伝子配列の挿入すなわち組込によって遺伝子工学的に操作されたプラスミド、ウイルス、または当該技術分野で公知の他の媒体を意味する。こうした発現ベクターには、宿主中での挿入遺伝子配列の効率的な転写を促進するプロモーター配列が含まれる。発現ベクターは、典型的には、複製起点、プロモーター、ならびに形質転換される細胞の表現型選択を可能にする特異的遺伝子を含有する。本発明に使用するうえで好適なベクターとしては、細菌中で発現させるためのT7を基剤とする発現ベクター(Rosenbergら, Gene, 56:125, 1987)、哺乳類細胞中で発現させるためのpMSXND発現ベクター(LeeおよびNathans, J. Biol. Chem., 263:3521, 1988)、および昆虫細胞中で発現させるためのバキュロウイルス由来ベクターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＤＮＡセグメントは、プロモーター（例えば、T7プロモーター、メタロチオネインIプロモーター、またはポリヘドリンプロモーター）などの調節要素に操作可能に連結されたベクター中に存在させることができる。

ベクターには、発現ベクターを含有する宿主細胞を同定するために表現型選択性マーカーが含まれていてもよい。原核生物発現ベクターで使用される典型的なマーカーとしては、例えば、アンピシリン（β-ラクタマーゼ）、テトラサイクリン、およびクロラムフェニコール（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）に対する抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。哺乳類発現ベクターに使用される典型的なマーカーとしては、例えば、アデノシンデアミナーゼ(ADA)、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(neo、G418)、ジヒドロホレートレダクターゼ(DHFR)、ヒグロマイシン-B-ホスホトランスフェラーゼ(HPH)、チミジンキナーゼ(TK)、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(XGPRT、gpt)の遺伝子が挙げられる。

宿主細胞で発現された本発明のポリペプチドの単離および精製のために、任意の従来法、例えば、分取クロマトグラフィー分離および免疫学的分離（モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体を使用する方法など）が利用できる。

組換えＤＮＡを用いた宿主細胞の形質転換は、当業者に公知の従来技術により行うことができる。宿主がE. coliなどの原核生物である場合、ＤＮＡ取込が可能なコンピテント細胞を、当該技術分野で公知の手順を利用したCaCl₂法を用いて指数増殖およびそれに続く処理を行った後で収穫された細胞より調製することができる。この他、MgCl₂またはRbClを使用することも可能である。

宿主が真核生物の場合、種々のＤＮＡ移入法が利用できる。こうしたDNAのトランスフェクション法としては、リン酸カルシウム‐沈殿物法、マイクロインジェクションなどの従来型の機械的方法、リポソーム中に包埋されたプラスミドを挿入する方法、またはウイルスベクターを利用する方法が挙げられる。本発明のポリペプチドをコードしたＤＮＡ配列および選択可能な表現型をコードした第２の外来ＤＮＡ分子（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子）を用いて、真核細胞を同時形質転換することもできる。別の方法は、シミアンウイルス40(SV40)やウシパピローマウイルスなどの真核ウイルスベクターを使用して、真核細胞に一時的に感染させ（すなわち、真核細胞の形質転換を行って）、タンパク質を発現させる方法である。(Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman 編, 1982)。哺乳類宿主細胞としては、例えば、COS細胞、BHK細胞、293細胞、およびCHO細胞が挙げられる。

真核宿主細胞にはまた、酵母が含まれる。例えば、適切な発現ベクターにＤＮＡを挿入し、この産物を宿主細胞に導入することによって、酵母中でＤＮＡを発現させることができる。酵母中で外来遺伝子の発現を行うための種々のシャトルベクターが報告されている。(Heinemann, J.ら,Nature, 340:250, 1989; Rose, M.ら,Gene, 60:237, 1987)。

本発明は、CTGFポリペプチドまたはその断片と特異的に反応する抗体を提供する。このポリペプチドはPDGFに対する抗体と交差反応を起こすが、CTGFに対する抗体がすべてPDGFと反応する訳ではない。本質的に、異なるエピトープ特異性を有するプールしたモノクロナール抗体から成る抗体、および種々のモノクロナール抗体製剤が提供される。モノクロナール抗体は、当該技術分野で公知の方法により、タンパク質の断片を含有する抗原から調製することができる(Kohlerら,Nature, 256:496, 1975; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelら、編、1989)。CTGFに特異的なモノクロナール抗体は、例えば、CTGFとは反応するがPDGFとは反応しないハイブリドーマ培養上清のスクリーニングを行うことによって選別することができる。

本質的に、異なるエピトープ特異性を有するプールしたモノクロナール抗体から成る抗体、および種々のモノクロナール抗体製剤が提供される。モノクロナール抗体は、当該技術分野で公知の方法により、タンパク質の断片を含有する抗原から調製することができる(Kohlerら, Nature, 256:496, 1975; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelら、編、1989)。

本発明において使用される「抗体」という用語は、完全な分子およびそのフラグメント（例えば、エピトープ決定基に結合可能なFab、F(ab')₂、およびFv）が含まれる。これらの抗体フラグメントは、その抗原または受容体と選択的に結合する能力をいくらか保持するものであり、以下のように定義される。

(1)抗体分子の一価抗原結合断片を含有するフラグメントFabは、パパイン酵素を用いて抗体全体を消化させ、完全な軽鎖および1本の重鎖の一部分を生成させることにより調製できる。

(2)抗体分子のフラグメントFab'は、抗体全体をペプシンで処理し、続いて還元して完全な軽鎖および重鎖の一部分を生成させることにより調製できる。抗体1分子あたり2個のFab'フラグメントが得られる。

(3)(Fab')₂は、抗体全体をペプシン酵素で処理し、その後の還元は行わずに得られる抗体フラグメントである。F(ab')₂は2個のジスルフィド結合により連結された2個のFab'フラグメントのダイマーである。

(4)Fvは、2本の鎖として発現される軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含有する遺伝子工学的に調製されたフラグメントとして定義される。

(5)一本鎖抗体（「SCA」）は、遺伝子的に融合された一本鎖分子として、好適なポリペプチドリンカーにより連結された軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含有する遺伝子工学的に調製された分子と定義される。

こうしたフラグメントの調製方法は、当該技術分野で公知である（例えば、Harlow および Lane,Antibodies; A Laboratoy Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)を参照されたい：引用により本明細書中に含まれるものとする）。

本発明で使用する場合、「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上の任意の抗原決定基を意味する。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸や糖側鎖などの化学的に活性な表面の分子団から成るとともに、通常、特異的な三次元構造特性ならびに特異的な電荷特性を有する。

本発明のCTGFポリペプチドに結合する抗体は、目的の小ペプチドを免疫抗原として含有する完全なポリペプチドまたは断片を用いて、調製することができる。動物を免疫するために使用されるポリペプチドまたはペプチドは、翻訳されたcＤＮＡまたは化学合成により誘導することができ、必要に応じてキャリヤータンパク質にコンジュゲートさせることもできる。このような普通に使用されるキャリヤーのうちでペプチドに化学的に結合するものとしては、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、チログロブリン、ウシ血清アルブミン(BSA)、および破傷風トキソイドが挙げられる。次に、結合したペプチドを使用して動物(例えば、マウス、ラット、またはウサギ)を免疫する。

必要に応じて、例えば、抗体の発生原因となるポリペプチドまたはペプチドが結合されているマトリックスとの結合および該マトリックスからの溶出によって、モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体を更に精製することができる。ポリクロナール抗体ならびにモノクロナール抗体の精製および濃縮のための免疫技術分野における通常の種々の技術について、当業者は分かるであろう(例えば、Coliganら, Unit 9,Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1994を参照されたい：引用により本明細書中に含まれるものとする)。

抗イディオタイプ技術を使用してエピトープを模倣したモノクロナール抗体を製造することも可能である。例えば、第一のモノクロナール抗体に対して作製された抗イディオタイプモノクロナール抗体は、第一のモノクロナール抗体が結合するエピトープの「イメージ」である超可変領域中に結合ドメインを有するであろう。

本発明は、CTGF(好ましくは精製されたもの)を含有する有効量の組成物を創傷に適用することによって、被験者（例えば、ヒト）の創傷治癒を促進する方法を提供する。PDGFおよびPDGF関連分子(CTGFなど)は、皮膚の創傷の正常な治癒に関与する。本発明のCTGFポリペプチドは、皮膚創傷の治癒に欠陥があるかまたは正常な治癒機構を促進する必要のある場合（例えば、やけどなど）の治療薬として有用である。CTGFタンパク質を使用して創傷治癒を促進することの1つの重要な利点は、この分子中に高パーセントのシステイン残基が存在することによるものである。CTGFまたはその機能的断片は、PDGFや創傷治癒に関与することが知られている他の増殖因子よりも安定でありプロテアーゼ分解の影響を受けにくい。

CTGFは内皮細胞および線維芽細胞により産生される。これらの細胞はいずれも皮膚創傷部位に存在する。従って、CTGFの産生を促進する薬剤を組成物に添加し、この組成物を使用して創傷治癒を促進することができる。好ましくは、本発明の薬剤はトランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)であるが、CTGFを誘導することによって創傷治癒を促進するうえで、TGF-βファミリーの他のメンバーもまた有用であろう。本発明の組成物は創傷の治癒に役立つが、それは、部分的には結合組織の成長を促進することによるものである。この組成物は、製薬上許容しうる担体（例えば、不活性なゲルまたは液体）へ、精製されたCTGFおよびTGF-βを混合することによって調製される。

「細胞増殖性疾患」という用語は、絶え間ない細胞増殖の結果、組織内の細胞集団が過増殖することを特徴とする病理学的状態を指す。細胞集団は、必ずしも、形質転換された細胞、腫瘍細胞、または悪性細胞である必要はなく、正常細胞も含まれる。例えば、CTGFは、動脈壁の内膜層において増殖性病変を誘発することにより病理学的な関わりを示し、アテローム硬化症の原因となる可能性がある。この疾患の危険因子を減少させようとする（例えば、血圧を低下させるかまたは被験者の高いコレステロール値を減少させる）代わりに、本発明のCTGF抑制剤またはアンタゴニストは、アテローム硬化症に関連したCTGFのin vivo活性を阻害するうえで有用であろう。CTGFアンタゴニストは、結合組織の過増殖に関連した他の疾患（例えば、強皮症、関節炎、アルコール性肝硬変、ケロイド、および過形成性瘢痕を含む種々の線維性疾患）の治療に有用である。

本発明は、高レベルのCTGFの存在を検出し、これを診断に利用して、細胞増殖性疾患を特徴とする病状の存在を調べる方法を提供する。例えば、CTGFを含有すると推測されるサンプルを被験者から採取し、CTGFのレベルを測定し、このレベルを正常組織中のCTGFのレベルと比較する。CTGFのレベルは、例えば、抗CTGF抗体を用いたイムノアッセイにより測定することができる。ラジオイムノアッセイ(RIA)、ELISAおよび免疫蛍光法などの、当該技術分野ではよく知られた種々の他のアッセイを用いて、サンプル中のCTGFのレベルを測定することもできる。この他、核酸プローブを使用してCTGF mＲＮＡを同じ目的で検出および定量することができる。

本発明はまた、有効量のCTGF反応性薬剤で疾患部位を処理することによって、細胞増殖性疾患を特徴とする病気を軽減する方法を開示する。「軽減」という用語は、治療を受ける患者の疾患誘発応答の有害作用を弱めることを意味する。疾患が細胞の過増殖に起因する場合、CTGFポリペプチドのアンタゴニストは、細胞上のCTGF特異的受容体に結合できる増殖因子の量を減少させるうえで有効である。こうしたアンタゴニストは、CTGF特異的抗体であってもよいしその機能的フラグメント（例えば、Fab、F(ab')₂）であってもよい。この他、プロモーターのTβRE領域を含有するポリヌクレオチドは、TGF-βに対する競合剤として作用することにより、CTGF反応性薬剤として使用可能である。この治療では、疾患部位をアンタゴニストに接触させる必要がある。細胞増殖性疾患が細胞の増殖量の減少に起因する場合、促進作用のあるCTGF反応性薬剤を疾患部位に接触させる。例えば、TGF-βは、こうした反応性薬剤の1つである。他の薬剤については、当業者には分かるであろう。

細胞増殖性疾患がCTGFの発現と関連する場合、CTGFメッセージのタンパク質への翻訳を直接に阻害する治療法が可能である。例えば、アンチセンス核酸またはリボザイムを使用して、CTGF mＲＮＡと結合させるかまたはそれを分解することが可能である。アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、標的化された遺伝子のＲＮＡメッセージと特異的に結合し、この遺伝子のタンパク質産物の発現を妨害する。アンチセンスはメッセンジャーＲＮＡと結合し、細胞が翻訳できない二本鎖分子を形成する。約15個〜25個のヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。なぜなら、こうしたオリゴヌクレオチドは合成が容易なうえに、アンチセンスＲＮＡ分子とよく似た抑制効果を有するからである。更に、鉄が結合したエチレンジアミン四酢酸(EDTA-Fe)などの化学的反応性基をアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させて、ハイブリッド形成部位でＲＮＡの開裂を引き起こすことができる。遺伝子のin vitro翻訳を抑制するためのアンチセンス法のこれらのおよび他の使用については、当該技術分野で公知である（Marcus-Sakura,Anal., Biochem., 172:289, 1988）。

アンチセンス核酸とは、特異的mＲＮＡ分子の少なくとも一部分と相補的であるＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す（Weintraub,Scientific American, 262:40, 1990）。細胞中において、アンチセンス核酸は、対応するmＲＮＡとハイブリッドを形成し、二本鎖分子となる。細胞は二本鎖のmＲＮＡを翻訳しないので、アンチセンス核酸は、mＲＮＡの翻訳を妨害することになる。約15個のヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。なぜなら、こうしたオリゴマーは合成が容易なうえに、標的CTGF産生細胞に導入されたときに大きな分子ほど問題を生じないからである。遺伝子のin vitro翻訳を抑制するためのアンチセンス法の使用については、当該技術分野で公知である（Marcus-Sakura,Anal.Biochem., 172:289, 1988）。

オリゴヌクレオチドを使用して転写を停止することは、トリプレックス法と呼ばれている。こう呼ばれるのは、オリゴマーが二本鎖ＤＮＡのまわりに巻き付いて、三本鎖のヘリックスを形成するからである。従って、所定の遺伝子上の特異な部位を認識するように、これらのトリプレックス化合物をデザインすることができる(Maherら, Antisense Res. and Dev., 1(3):227, 1991; Helene, C., Anticancer Drug Design, 6(6):569, 1991)。例えば、CTGFプロモーターのTβRE領域を認識するようにデザインする。

リボザイムとは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと同じ様な方法で他の一本鎖ＲＮＡを特異的に開裂させる能力を有するＲＮＡ分子を指す。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に改良を加えれば、ＲＮＡ分子中の特異的ヌクレオチド配列を認識し、これを開裂させる分子を設計することが可能となる(Cech, J. Amer. Med. Assn., 260:3030, 1988)。この方法の主な利点は、配列特異性があることにより特定の配列を有するmＲＮＡだけが不活性化されることである。

リボザイムには2つの基本的なタイプ、すわなち、テトラヒメナタイプ(Hasselhoff,Nature, 334:585, 1988)および「ハンマーヘッド」タイプがある。テトラヒメナタイプのリボザイムは、4個の塩基の長さの配列を認識し、一方、「ハンマーヘッド」タイプのリボザイムは、11個〜18個の塩基の長さの塩基配列を認識する。認識配列が長くなるほど、その配列が標的mＲＮＡ種中で排他的に存在する可能性が大きくなる。従って、特異的なmＲＮＡ種を不活性化するためには、ハンマーヘッドタイプのリボザイムの方がテトラヒメナタイプのリボザイムよりも好ましく、18個の塩基の認識配列の方がそれよりも短い認識配列よりも好ましい。

CTGF遺伝子のプロモーター要素〔具体的には、TGF-β応答／調節要素(TβRE)(5'-GTGTCAAGGGGTC-3'(配列番号8)；ヌクレオチド-157〜-145)〕を同定することは、CTGFの発現に影響する化合物または組成物を同定するスクリーニング法のための情報源を提供する。従って、もう1つの実施形態において、本発明は、CTGF発現に影響する組成物を同定する方法を提供するが、この方法には、該組成物およびCTGFプロモーターのTGF-β応答要素を含む成分を、該成分が相互作用するのに十分な条件下でインキュベートする工程と、該組成物がCTGF発現に及ぼす影響を測定する工程と、が含まれる。この方法には更に、TβREと反応するTGF-βまたはTGF-βファミリーのメンバーを、反応混合物に添加する工程が含まれる。従って、この方法により、TGF-β抑制剤または抗線維性化合物の同定が可能となる。本明細書中に記載のスクリーニングアッセイに使用されるプロモーター領域はヌクレオチド-823〜+74を含むことが好ましいが、TGF-β応答要素を含むより小さい領域（例えば、-162〜-128または-154〜-145）もまた、本発明の方法に有用であろう。

CTGF発現に関して観察される作用は、抑制的であってもよいし、促進的であってもよい。例えば、CTGF活性の増大または低下は、本明細書の実施例（例えば、実施例1および2）に記載されているように、CTGF用の生物学的ア・BR>Bセイにより測定することができる。この他、CTGFの調節領域(プロモーター)および構造領域の両方をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入して、組成物がCTGFの転写に及ぼす影響を、例えば、ノーザンブロット分析により測定することができる。成分の混合物へ放射性化合物（例えば、³²P-ATP）を添加して、CTGF mＲＮＡ中に取込まれた放射性化合物を測定する。

この他の方法として、リポーター遺伝子をCTGFのプロモーターのTGF-β応答領域へ操作可能に連結させ、試験対象組成物、リポーター遺伝子構築物、およびTGF-βを含む成分をインキュベートし、更にリポーター遺伝子の発現をアッセイすることによって、CTGFの発現に影響する組成物を同定することができる。こうしたリポーター遺伝子は当業者には公知であり、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(CATアッセイ)、またはβガラクトシダーゼ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

試験される組成物を添加する前または後で、TβREのインデューサーを添加することができる。インデューサーを添加する前に組成物を添加することが好ましい。CTGFプロモーター中のこの領域のインデューサーは、好ましくはTGF-βであるが、TGF-βファミリーの他のメンバーもまた、この要素からの誘導に有用であろう。こうしたファミリーの他のメンバーまたは因子は、当業者には分かるであろう。

本発明の方法は、指示細胞中で実施することが好ましい。「指示細胞」とは、CTGFの活性化またはリポーター遺伝子を検出しうる細胞を指す。哺乳類宿主指示細胞としては、例えば、プレB細胞系、70Z/3細胞、ジャーカットT細胞、COS細胞、BHK細胞、293細胞、CHO細胞、HepG2細胞、およびHeLa細胞が挙げられる。リポーター遺伝子のレベルが検出できるかぎり、他の細胞系を指示細胞として利用することができる。TβRE結合モチーフの1つ以上のさらなるコピーをコードする発現ベクター（好ましくは、操作可能にリポーター遺伝子に連結されたもの）を含有するように細胞を組換え技術により修飾することができる。また、上述したように、CTGFを発現するように細胞を修飾することもできる。

リポーター遺伝子とは、CTGFの活性化の促進または抑制を検出するための表現型同定マーカーを指す。本発明に使用するうえで好ましいマーカーには、ルシフェラーゼアッセイにより発現が検出しうるLUC遺伝子が含まれる。原核生物発現ベクターに使用される典型的なマーカーとしては、例えば、アンピシリン（β-ラクタマーゼ）、テトラサイクリン、およびクロラムフェニコール（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）に対する抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。本発明に対する好ましいベクターである哺乳類発現ベクターに使用される典型的なマーカーとしては、例えば、アデノシンデアミナーゼ(ADA)、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(neo、G418)、ジヒドロホレートレダクターゼ(DHFR)、ヒグロマイシン-B-ホスホトランスフェラーゼ(HPH)、チミジンキナーゼ(TK)、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(XGPRT、gpt)、およびβ-ガラクトシダーゼ(β-gal)に対する遺伝子が挙げられる。

更にもう1つの実施形態において、本発明は、被験者中のCTGF遺伝子発現に関連した細胞増殖性疾患を患った被験者を治療する方法を提供するが、この方法には、この疾患を有する被験者に、CTGF遺伝子発現をモジュレートする治療上有効な量の薬剤を投与して疾患の治療を行う工程が含まれる。「モジュレート」という用語は、CTGFが過剰発現されるときはCTGF発現の阻害または抑制を意味し、CTGFが低発現されるときは発現の誘発を意味する。「治療上有効」という用語は、細胞増殖性疾患に関連したCTGFの症状を弱めるうえで有効なCTGF薬剤の量を意味する。

CTGF遺伝子発現をモジュレートする薬剤は、例えば、ポリヌクレオチドであってもよい。上述したように、このポリヌクレオチドは、アンチセンス、トリプレックス薬剤、またはリボザイムであってもよい。例えば、CTGFの構造遺伝子領域またはプロモーター領域に対してアンチセンスを適用してもよい。

薬剤としては、この他に、本発明のTβREを含有するポリヌクレオチドが挙げられる。この領域は、図1Bに示されたCTGF調節ポリペプチドのヌクレオチド-162〜-128に対応することが好ましい。TβRE領域が図1Bの約-154〜-145に対応することが特に好ましい。これらのポリヌクレオチドは、TGF-βまたはTβREと結合してCTGF転写を誘発する他の増殖因子に対する競合阻害剤または偽基質として有用である。

アンチセンス、トリプレックス薬剤、リボザイム、競合阻害剤などの送達は、キメラウイルスなどの組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を用いて行うことができる。本明細書中で教示されているような遺伝子療法に利用できる種々のウイルスベクターとしては、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、または好ましくはレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスが挙げられる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスレトロウイルスまたはトリレトロウイルスの誘導体である。単一外来遺伝子を挿入できるレトロウイルスとしては、例えば、Moloneyマウス白血病ウイルス(MoMuLV)、Harveyマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳腺癌ウイルス(MuMTV)、およびラウス肉腫ウイルス(RSV)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。多数の他のレトロウイルスベクターを複数の遺伝子に取入れることができる。これらのベクターはすべて、選択マーカー用遺伝子の移入または取込を行うことができる。その結果、形質導入された細胞の同定および生成が可能となる。目的のポリヌクレオチド配列を、例えば、特定の標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードする別の遺伝子と共に、ウイルスベクター中に挿入することによって、ベクターは標的特異性をもつようになる。例えば、糖、糖脂質、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって、レトロウイルスベクターに標的特異性をもたせることができる。好ましい標的化は、抗体を使用してレトロウイルスベクターを標的化することにより行われる。レトロウイルスゲノムに挿入して、アンチセンスポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベクターの標的特異的送達を可能にする特異的ポリヌクレオチド配列について、当業者は分かるかまたは過度な実験をせずに容易に確認することができるであろう。

組換えレトロウイルスには欠陥があるので、感染性ベクター粒子を産生するための補助が必要である。例えば、LTR内の調節配列の制御下でレトロウイルスの構造遺伝子をすべてコードするプラスミドを含有するヘルパー細胞系を使用することによって、こうした補助が得られる。これらのプラスミドには、パッケージング機構を働かせて、キャプシドに包むためのＲＮＡ転写物の認識を可能にするヌクレオチド配列が含まれていない。パッケージングシグナルが欠落したヘルパー細胞系としては、例えば、Ψ2、PA317、およびPA12が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの細胞系では、ゲノムがパッケージされないので、エンプティビリオンが産生される。パッケージングシグナルが完全であるとともに目的の他の遺伝子により構造遺伝子が置き換えられている細胞へ、レトロウイルスベクターを導入する場合は、ベクターをパッケージしてベクタービリオンを産生することができる。

この他、レトロウイルス構造遺伝子gag、pol、およびenvをコードするプラスミドを、従来のリン酸カルシウムトランスフェクションを用いてNIH3T3細胞または他の組織培養細胞へ直接にトランスフェクトすることができる。この後で、目的の遺伝子を含有するベクタープラスミドをこれらの細胞へトランスフェクトする。こうした得られた細胞は、レトロウイルスベクターを培地へ放出する。

アンチセンスポリヌクレオチドに対する別の標的化送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および脂質を基剤とする系（例えば、水中エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソーム）が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系はリポソームである。リポソームは、in vitroおよびin vivoにおける送達媒体として有用な人工膜小胞である。サイズが0.2μm〜4.0μmの範囲にある大きな単ラメラ小胞(LUV)は、大型巨大分子を含有する水性緩衝剤を実質的なパーセントでカプセル化できることが分かっている。ＲＮＡ、ＤＮＡ、および完全なビリオンを水性の内部にカプセル化して、生物学的に活性な形態で細胞へ送達することができる(Fraleyら, Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981)。哺乳類細胞のほかに、植物細胞、酵母細胞、および細菌細胞において、ポリヌクレオチドの送達のためにリポソームが使用されてきた。リポソームが有効な遺伝子移入媒体であるためには、以下の特性が存在する必要がある：(1)生物学的活性を犠牲にせずに目的の遺伝子が効率よくカプセル化されること、(2)非標的細胞と比べて標的細胞への結合が優先的かつ実質的に行われること、(3)小胞の水性内容物が高い効率で標的細胞の細胞質へ送達されること、(4)遺伝情報が正確かつ効果的に発現されること(Manninoら, Biotechniques, 6:682, 1988)。

リポソームの組成物は、通常はリン脂質（特に、高相転移温度のリン脂質）の組合せであり、また通常はステロイド（特に、コレステロール）と併用される。他のリン脂質または他の脂質もまた使用可能である。リポソームの物理的特性は、pH、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。

リポソーム生成に有用な脂質としては、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシドなどのホスファチジル化合物が挙げられる。特に有用な脂質はジアシルホスファチジルグリセロールであり、この場合には、脂質部分は14個〜18個の炭素原子、好ましくは、16個〜18個の炭素原子を有し、かつ飽和されている。代表的なリン脂質としては、卵のホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。

リポソームの標的化は、解剖学的因子および機構的因子に基づいて分類されてきた。解剖学的分類は、選択性のレベル（例えば、器官特異性、細胞特異性、およびオルガネラ特異性）に基づくものである。機構的標的化は、受動的かまたは能動的かに基づいて識別できる。受動的標的化では、洞様毛細血管を含有する器官中の細網内皮系の細胞へのリポソームの自然な分配傾向を利用する。一方、能動的標的化では、モノクロナール抗体、糖、糖脂質、もしくはタンパク質などの所定のリガンドへリポソームを結合させることによるか、またはリポソームの組成またはサイズを変化させて天然の局在化部位以外のタイプの器官および細胞への標的化を行うことによるリボソームの改変が伴う。

標的化送達系の表面は、種々の方法で改質することができる。リポソーム標的化送達系の場合、リポソームの脂質二重層中へ脂質基を取込んで、リポソーム二重層と共に標的リガンドを安定に保持することができる。種々の連結基を使用して、脂質鎖を標的リガンドに結合させることができる。一般的には、標的化送達系の表面に結合される化合物は、標的化送達系が所望の細胞を見出してその細胞に滞留できるようにするリガンドおよび受容体であろう。リガンドは、受容体などの他の化合物と結合する任意の対象化合物であってよい。

本発明の方法においてCTGF遺伝子発現をモジュレートする薬剤としては、細胞中で環状ヌクレオチドの増加を引き起こす薬剤が挙げられる。例えば、コレラトキシンまたは8Br-cAMPなどの薬剤は、CTGF遺伝子発現に関連した細胞増殖性疾患を有する被験者へ投与することが好ましい。好ましくは、本発明の方法による治療の後で増加する環状ヌクレオチドはcAMPまたはcAMP類似体（機能もしくは構造のいずれか一方またはこれら両方の類似体）である。細胞中でcAMPまたは類似の同族体を誘導し、かつ本発明の方法に有用な他の薬剤について、当業者には分かるであろう。

本発明の方法に有用な治療薬は、非経口的な注入によるか、または時間をかけて徐々に灌流することにより投与することができる。投与は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、洞内、または経皮を介して行ってもよい。

非経口投与用製剤としては、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、およびエマルションのものが含まれる。非水性溶剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルがある。水性担体としては、水、アルコール性／水性溶液、エマルション、または懸濁液が挙げられる（生理食塩水や緩衝媒体が含まれる）。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、液体および栄養素補液を含有する乳酸加リンゲル静脈用媒体、電解質補液(例えば、リンゲルデキストロースを基剤とするもの)などが挙げられる。例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤、不活性ガスなどの、保存料や他の添加剤もまた存在していてもよい。

本発明にはまた、製薬上許容しうる担体中に治療上有効な量のCTGFを含んでなる医薬組成物が含まれる。こうした担体としては、非経口投与に関連して先に列挙したものが挙げられる。

本発明の実施例（実施例10を参照されたい）は、CTGFのTGF-β誘導が細胞タイプ特異性（例えば、線維芽細胞など）をもつことを示している。従って、TβREを含むCTGFプロモーター領域は、特に、結合組織細胞中の構造遺伝子の発現に有用である。目的とする任意の遺伝子産物は、TGF-βの存在下で、TβREへ操作可能に連結されれば、結合組織細胞中で特異的に産生させることができると考えられる。例えば、PDGFまたは他の増殖因子をTβREを含有するポリヌクレオチドへ操作可能に連結して、結合組織細胞中でPDGFまたは他の因子を特異的に産生させることが好ましい。この他、産生されるCTGFまたは他の因子のレベルが増加する場合は、例えば、TβREの制御下でCTGFのアンチセンスを導入して細胞中でのCTGFの産生を減少させることが好ましい。

以下の実施例は本発明を説明するためのものであって制限するものではない。これらの実施例は、使用可能な典型的な例であるが、当業者に公知の他の手順を代わりに使用することもできる。

実施例１
PDGF免疫関連HUVE細胞からのマイトジェンの同定および部分精製
細胞
ヒト臍静脈内皮(HUVE)細胞をコラゲナーゼ潅流(Jaffeら, Human Pathol., 18:234, 1987)により新鮮なヒト臍帯から単離し、20％FCS 、0.68mM L- グルタミン、20μg/ml Gentamicin 、90μg/mlブタヘパリン(Sigma, St.Louis, MO) 、および50μg/ml Endothelial Cell Growth Supplement (Sigma) を含む培地199 中で管理した。培地回収に使用した細胞は第三継代細胞であった。細胞をそれらの非重なり丸石(cobblestone) 形態およびVIII因子関連抗原に関する陽性染色により内皮細胞と同定した。NRK 細胞をAmerican Type Culture から入手し、NIH/3T3 細胞はS.Aaronson (NCl, Bethesda, MD)からの贈答品であり、両方の細胞系をDMEM、10％FCS 、20μg/ml Gentamicin 中で管理した。ウシ胎児大動脈平滑筋細胞を既に記載されたようにして(Grotendorstら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 78: 3669, 1981) 組織外植体から得、DMEM、10％FCS 、20μg/ml Gentamicin 中で管理し、第二または第三継代でアッセイに使用した。

増殖因子および抗体
ヒトPDGFを既に記載されたようにして(Grotendorst, Cell, 36:279, 1984) 血小板から均一になるまで精製した。組換えAA、BB、およびAB鎖二量体PDGF分子をCreative Biomolecules (Hopkinton, MA) から入手した。FGF をSigma から入手した。成熟PDGF AおよびB 鎖分子のアミノ配列およびカルボキシル配列を含む精製PDGFまたは合成ペプチドを使用してヤギ中に抗体を産生させた。ヤギを多重皮内注射により完全フロイントアジュバント中の精製PDGF 20 μg または合成ペプチド50μg で免疫した。免疫血清を４回目の再抗原投与（不完全フロイントアジュバント中）およびその後の再抗原投与の７日後に回収した。抗PDGF抗体はイムノブロット分析でTGF-β、EGF 、またはFGF に対する交差反応性を示さなかった。抗ペプチド抗体は配列特異性であり、その他の合成ペプチド配列または組換えPDGFペプチド（これは特定の抗原性配列を含まない）と交差反応しなかった。これをWestern ブロットおよびドットブロット分析により測定した。

抗体アフィニティーカラム
ヤギ抗ヒトPDGF IgG(150mg) を製造業者の指示に従って6 mg IgG/ml ゲルの最終濃度でAffi-Gel 10 担体(BioRad)25mlに共有結合させた。そのカラムを48時間にわたってコンディショニングされたHUVE細胞培地１リットルとともに４℃で18時間にわたって攪拌しながらインキュベートした。次にゲルをカラム(5X1.5cm) に注入し、酢酸アンモニウムでpH7.5 にした４倍の容積の0.1N酢酸で洗浄し、抗体結合PDGF免疫反応性タンパク質を1N酢酸で溶離した。ピークフラクションを生物学的アッセイおよびイムノブロッティングにより測定し、フラクションをプールした。

HUVE細胞により分泌されたPDGF関連増殖因子の初期研究を、血清を含む成長培地を細胞の集密培養物から除去し、それを無血清培地と交換することにより行った。この培地のアリコートを周期的に除去し、ヒト血小板PDGFに特異性の抗体を使用してタンパク質をイムノブロットした。この抗体はその他の既知の増殖因子のいずれとも交差反応せず、しかもイムノブロットで二量体PDFG500 ピコグラム未満または還元された単量体ＡまたはＢ鎖ペプチド10ナノグラムを検出することができる。HUVE細胞を６ウェルプレート中で集密になるまで増殖させた。成長培地を除去し、細胞をPBS で洗浄し、無血清培地１mlをそれぞれのウェルに添加した。培地を６-48 時間の期間にわたるコンディショニング後に除去し、1N酢酸に対し透析し、凍結乾燥した。次にサンプルを12％PAGE上で泳動し、ニトロセルロースに対し電気ブロッティングし、抗ヒトPDGF抗体で視覚化した。精製血小板PDGF５ナノグラムを基準として泳動した。

結果は、血小板PDGFに免疫学的に似ているが、血小板PDGFの予想30-32kD 分子量またはＡ鎖ホモダイマーもしくはＢ鎖ホモダイマーよりも高い相対分子量(36-39kD) である数種の分子の構成的分泌を示した。この無血清ならし培地で行われた走化性アッセイおよびマイトジェンアッセイは、存在する全生物活性が48時間のコンディショニング期間後に血小板PDGFの15ng/ml に等しいことを示した。抗ヒトPDGF IgG 30 μg/mlと一緒の培地のインキュベーションはマイトジェン活性の約20-30 ％および走化活性の同様の量を中和した。

PDGF免疫反応性分子の数種のHUVE培地中の存在は予期されず、特にＡ鎖及びＢ鎖二量体分子の分子量より高い分子量の分子は内皮細胞により産生され、分泌されると予想された(Collinsら, Nature, 328:621-624, 1987; Sitarasら, J.Cell. Physiol., 132:376-380, 1987)。更なる分析のために多量のPDGF様タンパク質を得るために、HUVE細胞は20％ウシ胎児血清を含む培地中で維持される必要があった。何となれば、細胞は無血清培地または低血清培地中で24時間後に死滅し始めるからである。PDGF免疫反応性タンパク質を抗ヒトPDGF IgG及びAffi-Gel 10 担体(BIORad)でつくられた抗体アフィニティーカラムの使用により血清を含む培地から部分精製した。NRK 細胞を標的細胞として使用して、マイトジェンアッセイを行った(PDGF BB=5ng/ml 、PDGF AA=10ng/ml)。HUVE培地は250 μl のHUVE細胞無血清ならし培地(48 時間) であり、これを1N酢酸に対し透析し、凍結乾燥し、試験ウェルへの添加前にDMEM中で再懸濁させた。アフィニティー精製フラクションはAffi-Gel 10 アフィニティーカラムからの合わされた濃縮された主要プール５μg/mlであった。抗PDGF IgGまたは非免疫IgG(30μg/ml) をサンプルに添加し、マイトジェンアッセイで試験する前に４℃で18時間インキュベートした。３回反復試験サンプルの平均を測定し、標準偏差は５％未満であった。実験を少なくとも３回繰り返し、同様の結果を得た。

部分精製タンパク質のアリコートを走化活性およびマイトジェン活性について分析した時、全ての生物活性を抗ヒトPDGF抗体と一緒のタンパク質の前インキュベーションにより中和することができた。これは、部分精製培地タンパク質中に存在する生物活性分子のみがPDGF免疫関連分子であることを示した。

同抗PDGF抗体を使用して、部分精製タンパク質のアリコートをイムノブロットし、データは無血清ならし培地中で観察された高分子量分子の存在を示した。分泌された主要な種は36kDでポリアクリルアミドゲルで移動し、ならし培地から精製された全免疫反応性タンパク質の少なくとも50％を含む。37kDおよび39kDで移動する免疫反応性種は残りの免疫反応性タンパク質の殆どを構成する。同様のパターンが、³⁵S システインで標識され、抗PDGF IgGイムノアフィニティーカラムでアフィニティー精製されたタンパク質で見られた。アフィニティー精製された全タンパク質の15％未満が精製血小板PDGFまたは組換えPDGFイソ型と同時移動した。精製PDGF(300ng PDGF/2 μg IgG)と一緒の抗体の前インキュベーションは分子の全てへの抗体結合をブロックし、二量体血小板PDGFと共有された抗原決定基を示した。重要なことに、抗体を組換えAA、BB、またはAB二量体でブロックした時、HUVE分泌タンパク質への抗体結合が全ての３種の二量体形態により同等に抑制され、これは抗体が全ての３種のPDGF二量体およびHUVE分泌分子に存在する共通のエピトープを認識することを示唆した。ウェスタンブロットで検出された抗体結合分子のいずれもが培地中のウシ胎児血清またはその他の添加剤に由来しなかったことを保証するために、新しい未使用の抗体アフィニティーカラムをつくり、そして細胞によりコンディショニングされなかった培地をならし培地と同様に正確に処理した。PDGF免疫反応性分子はイムノブロットによりこのカラムからのフラクション中に検出されず、また生物活性が検出されなかった。血小板PDGFまたは組換え二量体を200 mMジチオスレイトール(DTT) で還元する時、単量体のＡ鎖ペプチド(17kD)およびＢ鎖ペプチド(14kD)がイムノブロットで観察される。100mM DTTサンプル緩衝液中のHUVE分子の処理はポリアクリルアミドゲルで主要免疫反応性ペプチドの遅い移動をもたらした。免疫反応性分子の殆どが38-39kD で移動し、それ程強くないバンドが25kDおよび14kDで観察された。還元された分子を検出するために、非還元タンパク質より少なくとも10倍の還元されたタンパク質を実験することが必要であった。これはPDGF A鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチドの単量体形態に関する抗体のアフィニティーと一致する。これらのデータは、HUVE細胞のならし培地からのPDGF関連アフィニティー精製タンパク質中の主要な種が未還元で36kDおよび還元された時に38kDの見掛分子量でアクリルアミドゲルで移動する単量体ペプチドであったことを示す。

実施例２
生物学的アッセイ
走化活性を記載されたようにして(Grotendorstら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:3669-3672, 1981; Grotendorst ら, Methods in Enzymol., 147:144-152, 1987)NIH 3T3またはウシ大動脈平滑筋(BASM)細胞を用いてボイデンチャンバー走化性アッセイで測定した。96ウェルプレートおよび標的細胞としての通常のラット腎臓(NRK) 繊維芽細胞またはNIH 3T3 細胞を使用して、マイトジェンアッセイを行った。細胞をDMEM、10％FCS 中に塗布した。NRK 細胞培養物を集密の10-14 日後に使用し、3T3 細胞を使用前に無血清DMEM、0.2 mg/ml BSA 中で２日間にわたってインキュベーションにより静止状態にした。サンプルタンパク質および既知標準物質の希釈液をウェルに添加し、プレートを37℃で10％CO₂ 、90％空気中で18時間にわたってインキュベートし、その後５μCi/ml の最終濃度で³Hチミジンを添加し、更に２時間にわたってインキュベートした。培地を除去し、細胞を洗浄し、ＤＮＡ合成をシンチレーションカウンティングによりトリクロロ酢酸沈殿性物質への³Hチミジンとり込みにより測定した。

ゲル電気泳動およびイムノブロッティング
特にことわらない限り、電気泳動をSDS を含む12％ポリアクリルアミドゲル(Laemmli, U.K., Nature, 227:680-685, 1970)で行った。タンパク質をニトロセルロース膜に電気ブロッティングし、膜を50mM Tris-HCl 、pH7.4 、100 mM NaCl (TBS) 中で25℃で１時間にわたって５％無脂肪ドライミルクとともにインキュベートして非特異的抗体結合をブロックすることによりイムノブロッティングを行った。ブロッキング溶液を除去し、抗体(15 μg/ml) を0.5 ％無脂肪ドライミルクおよび１μg/mlのアジ化ナトリウムを含むTBS に添加し、25℃で終夜インキュベートした。膜をTBS 、0.5 ％ミルク中でそれぞれの洗浄につき10分間で５回洗浄し、次に0.5 ％ミルクを含むTBS 中1:1000希釈で25℃で１時間にわたってアルカリ性ホスファターゼ結合アフィニティー精製ウサギ抗ヤギIgG (KPL, Gaither-sburg, MD)とともにインキュベートした。フィルターを毎回10分間でTBS で５回洗浄し、アルカリ性ホスファターゼ基質溶液(0.1M Tris-HCl、pH9 、0.25 mg/mlニトロブルーテトラゾリウム、0.5 mg/ml 5-ブロモ-4- クロロ-3- インドリルホスフェート) を使用してブロットを展開した。

主要走化活性およびマイトジェン活性は36kDペプチドにより生じ、PDGFペプチドにより生じない
部分精製培地タンパク質中で観察された走化活性およびマイトジェン活性がPDGF A鎖ペプチドおよびB 鎖ペプチドを含む分子からのものであり、またはこれらの配列を含まない分子の産物であるかどうかを測定するために、生物学的アッセイをアフィニティー精製培地タンパク質の連続希釈液並びに組換えPDGF AA ホモダイマーおよびBBホモダイマーおよびABヘテロダイマーの連続希釈液を用いて行った。充分な量のサンプルを調製して、それぞれの希釈サンプルのアリコートを用いてマイトジェンアッセイおよび走化性アッセイ並びにイムノブロットを行った。観察されたHUVEアフィニティー精製因子のマイトジェン活性は全ての３種の組換えPDGF二量体により誘発された活性に匹敵した。走化活性はABヘテロダイマーに匹敵し、BBホモダイマーよりも小さい応答およびAAホモダイマーよりも大きい応答を生じた。サンプルの生物活性を等しい量の同サンプルのイムノブロットと比較した時、Ａ鎖分子またはＢ鎖分子が試験サンプル中で検出されなかった。これらのデータは、抗PDGFアフィニティー精製フラクション中に存在する主要な生物活性がPDGF A鎖またはＢ鎖を含む分子により説明し得ないことを実証し、そしてこれらのサンプル中に存在する主要PDGF免疫反応性タンパク質種(36kD ペプチド）が生物学的に活性であり、かつPDGF A鎖またはＢ鎖ペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端に見られるアミノ酸配列を含まないことを意味する。

実施例３
受容体競合アッセイ
DMEM、10％ウシ胎児血清、10μg/ml Gentamicin 中で増殖させた24ウェルプレート(Costar)中のNIH 3T3 細胞の集密培養物を使用して、アッセイを行った。成長培地を除去し、細胞を無血清DMEM、0.2mg/ml BSAで２回洗浄し、プレートを無血清DMEM、 0.2mg/ml BSA中で30分間にわたって氷の上に置いた。試験サンプルおよび対照を5-10ng/ml のHUVEアフィニティー精製タンパク質および300ng/ml〜16ng/ml の濃度範囲の組換えPDGFイソ型の一種の連続希釈液を含む無血清DMEM、0.2mg/ml BSA中で調合した。サンプルの１mlアリコートを24ウェルプレートのウェルに入れ、プラットフォームロッカーで氷の上で２時間インキュベートした。インキュベーション期間後に、細胞を氷の上でそれぞれ10分間にわたってPBS で３回洗浄した。細胞の表面に結合されたタンパク質を1N酢酸５μl で10分間溶離した。酢酸溶離サンプルを凍結乾燥し、５mM HCl中で再度懸濁させ、12％ポリアクリルアミドゲルで泳動し、抗PDGF抗体を使用してニトロセルロースにイムノブロットした。

PDGF細胞表面受容体への内皮細胞分子の結合を立証するために、競合受容体結合アッセイを行った。アフィニティー精製HUVE細胞分泌タンパク質のイムノブロットは多種のPDGF免疫反応性分子の存在を示したので、¹²⁵I標識PDGF競合アッセイを使用することができなかった。何となれば、これはこの混合物中のどの分子が標的細胞の受容体について標識PDGFの結合に競合しているのかを示さないからである。HUVE細胞により分泌されたPDGFのイソ型および主要PDGF免疫関連タンパク質は異なる分子量のものであるので、受容体結合競合をイムノブロットで実証した。NIH 3T3 細胞への抗PDGF免疫反応性ペプチドの直接結合を、3T3 繊維芽細胞の単層を４℃で２時間にわたって抗PDGFアフィニティー精製タンパク質(10ng/ml) とともにインキュベートすることにより実証した。細胞層を1N酢酸で洗浄することにより結合ペプチドを放出し、抗PDGF IgGを使用してイムノブロット分析により定量した。このデータは、36kD免疫反応性ペプチドがNIH 3T3 細胞の細胞表面に結合することを示す。この結合は結合培地に添加される組換えPDGF BB の濃度を増大することにより競合し得る。これらのデータは、CTGFペプチドがNIH3T3 細胞の特定の細胞表面受容体に結合すること、およびPDGF BB がこの結合と競合し得ることを示唆する。

ＲＮＡ単離およびノーザンブロッティング
全ＲＮＡを単層培養細胞中の細胞から単離した。凍結乾燥したＲＮＡを50％ホルムアミドを含むゲルローディング緩衝液中で再度懸濁させ、2.2Mホルムアルデヒド、１％アガロースゲルへのローディング（レーン当たり全ＲＮＡ20μg)の前に95℃で２分間加熱し、50ボルトで泳動した。ＲＮＡの保全性を臭化エチジウム染色並びに18S および28S ｒＲＮＡバンドの視覚化により測定した。電気泳動後に、ＲＮＡを終夜にわたって10X SSC 緩衝液によるブロッティングによりニトロセルロースに移した。ニトロセルロースを空気乾燥し、真空オーブン中で80℃で２時間にわたってベーキングした。³²P 標識プローブ１ml当たり5X10⁵ CPMを添加して、ハイブリダイゼーションを46℃で終夜行った。ノーザンブロットについて通常のように、全プラスミドを標識し、プローブとして使用した。標識をBoehringer Mannheim からのランダムプライマー標識キットを用いて行った。ハイブリダイゼーション後に、膜を室温で2X SSC、0.1 ％SDS 中で２回それぞれ15分間にわたって洗浄し、室温で0.1X SSC、0.1 ％SDS 中で15分間にわたって１回洗浄し、最後に46℃で0.1X SSC、0.1 ％SDS 中で15分間洗浄した。ブロットを-70 ℃でKodak X-omatフィルムでオートラジオグラフィーにかけた。

実施例４
ライブラリースクリーニング、クローニング、および配列決定
通常の分子生物学技術を使用して種々のＤＮＡクローンをサブクローン化し、精製した(Sambrook ら, Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second edi-tion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Col. Spring Harbor, NY)。クローンDB60を融合タンパク質の誘導および抗PDGF抗体によるスクリーニングによりλgt11 HUVE 細胞ｃＤＮＡライブラリーから採取した。採取したプラークを再度スクリーニングし、陽性クローンを低力価で再度塗布し、単離した。

クローンDB60からのEcoRI インサートをM13 ファージベクターにクローン化し、一本鎖ＤＮＡを反対配向のインサートを有するクローンについて得た。次にこれらのM13 クローンをSequenase キット(U.S.Biochemical) および³⁵S-dATP(duPo-nt) を使用してジデオキシ方法により配列決定した。このクローンに関するＤＮＡの両ストランドをプライマー伸長法並びにGTP およびITP 化学の両方を使用して完全に配列決定した。配列決定反応のアリコートを６％アクリルアミドゲル(16時間）および８％アクリルアミドゲル（６時間）の両方で泳動し、真空乾燥し、少なくとも18時間にわたってオートラジオグラフィーにかけた。

クローンDB60からのｃＤＮＡ断片を³²P-CTP 標識し、HUVE細胞ｃＤＮＡλgt11ライブラリーを再度スクリーニングするのに使用した。数種のクローンを採取し、最大のクローン、DB60R32 と称する2100bpクローンをBluescriptファージミドにサブクローン化した。また、サブクローンをBluescript中でPst I 、Kpn I 、およびEcoRI/Kpn I 制限断片からつくった。これらのサブクローンを上記Sequenase を使用して二本鎖プラスミドＤＮＡ断片決定技術により配列決定した。オープンリーディングフレームを含む1458bpEcoRI/Kpn I クローンをM13mp18 およびM13mp19 にサブクローン化し、ＤＮＡの両ストランドをプライマー伸長法並びにGTP およびITP 化学の両方による一本鎖ＤＮＡ配列決定技術を使用して完全に配列決定した。

結合組織増殖因子のｃＤＮＡのクローニング発現および配列決定
これらのPDGF関連分子を更に特性決定するために、アミノ酸配列決定に充分な量のCTGFタンパク質を必要とした。しかしながら、HUVE細胞培養物のならし培地中のCTGFの低濃度およびこれらの細胞を得、培養するのに伴われるコストがかかり、時間浪費の技術が均一までのタンパク質精製およびアミノ酸配列決定を非実用的にした。それ故、抗PDGF抗体を使用して発現ベクターλgt11中でつくられたHUVE細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。500,000 を越える組換えクローンをスクリーニングした。スクリーニング方法で抗PDGF抗体と強いシグナルを生じる数種のクローンを精製し、M13 ファージベクターにサブクローン化し、部分配列データを一本鎖ＤＮＡ配列決定により得た。GenBank ＤＮＡ配列データベースの検索は、採取されたクローンの２種がPDGF B鎖ｃＤＮＡオープンリーディングフレーム配列の断片を含むことを示した。これらのクローンの１種がc-sis ｃＤＮＡプローブを使用してCollins ら(Nature, 316:748-750, 1985) により既に単離された1.8kb インサートと同様であった。500bp の第三クローンを完全に配列決定し、GenBank 中の全てのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の相同性サーチで一致が見られなかった(CEF10配列はその時点で利用できなかった）。このクローンをDB60と称した。クローンDB60により生成された融合タンパク質への抗PDGF抗体結合はアフィニティー精製タンパク質により完全にブロックされた。³²P 標識プローブをDB60からつくり、HUVE細胞から単離された全ＲＮＡ20μg のノーザンブロットで使用した。ブロットは2.4 キロベースのｍＲＮＡとのプローブハイブリダイゼーションを示し、これはアフィニティー精製タンパク質のイムノブロットで見られた38kD分子量範囲のタンパク質を生成するのに充分なサイズのメッセージである。DB60クローンを使用してHUVE細胞ｃＤＮＡλgt11ライブラリーを再度スクリーニングし、単離された最大のクローンはDB60R32 と称される2100塩基対インサートを含んでいた。また、クローンDB60R32 の2100bp EcoRIインサートでつくられたプローブはHUVE細胞からの全ＲＮＡのノーザンブロット中の単一の2.4kb メッセージとハイブリッドを形成した。

実施例５
in vitro転写および翻訳
Bluescript KS ベクター中で2100bpｃＤＮＡクローンDB60R32 を使用して、in vitro転写反応を行った。プラスミドをXho I で切断し、これはプラスミドをｃＤＮＡインサートに3'のベクターのマルチクローニング部位中で１回切断した。ｃＤＮＡインサートに5'で配置されたT7プロモーター部位を転写に使用した。in vitro転写をBluescriptベクター(Stratagene)を補給したキットを用いて行った。

ペプチドの標識のためのシステインを含まないアミノ酸混合物(Promega) 中でヌクレアーゼ処理ウサギ網状赤血球溶解産物および³⁵S-システインを使用して、in vitro翻訳反応を行った。これらの反応を³⁵S-システイン１mCi/ml (1200Ci/ミリモル、DuPont) 、および反応管当たり50〜500 ナノグラムの範囲の濃度のin vitro転写反応からのmRNAの連続希釈液を含む50μl の最終容積で行った。これらの反応液を30℃で60分間にわたってインキュベートした。反応液のアリコートを還元され、または還元されていない12％ポリアクリルアミド電気泳動ゲルで泳動し、乾燥させ、オートラジオグラフィーにかけた。

クローンDB60R32 をpET5発現ベクター(Studierら, Ed.Academic Press, N.Y. 185 巻, 60-89, 1990)のEco RI部位にセンス配向および逆配向（制限酵素消化分析により測定されるように）でサブクローン化することにより、免疫反応性CTGFペプチドのバクテリア発現を行った。E.coli HMS174 細胞の培養物をM9培地中でOD600で0.7になるまで増殖させ、培地を0.4 mM IPTG にし、インキュベーションを２時間続けた。細胞をペレットにし、溶解し、封入体を遠心分離により除去し、ペレット抽出物のアリコートを12％ポリアクリルアミドゲルで泳動し、抗PDGF抗体を使用してイムノブロットにかけた。センス配向でクローンDB60R32 により生成されたタンパク質は36-39kD 分子量範囲の抗PDGF免疫反応性ペプチドを生成し、一方、アンチセンス対照は免疫反応性ペプチドを生成しなかった。E.coli系中で生成された組換えペプチドはならし培地中に存在するCTGFペプチドとの抗PDGF反応を完全にブロックした。

アフリカツメガエル中のCTGFの発現
アフリカツメガエル卵母細胞中の発現のために、成熟雌ツメガエル(X.laevis)をNasco (Fort Atkinson, WI) から入手し、室温で管理した。カエルを低体温法により麻酔し、卵巣組織を手術により除去した。卵巣組織を細断し、カルシウムを含まないOR-2 (Wallace ら, Exp.Zool., 184:321-334, 1973) 中で0.2 ％コラゲナーゼ(Sigma型II) で2〜3時間消化した。次に直径1.3mm の無傷段階VI卵母細胞(Dumo-nt, J.Morphol., 136:153-180, 1972)を慎重に選択し、マイクロインジェクションにかけた。

段階VI卵母細胞（一度に５-10)を中空プレキシグラスプラットフォームの上に置き、過剰のOR-2溶液を排出した。Leitz システムマイクロインジェクターを使用して、ＲＮＡ10ngを含むサンプル約50nlを卵母細胞赤道の直ぐ上の動物極に注入した。注入後に、卵母細胞を0.1 ％BSA を含むOR-2緩衝液にもどし、25℃で24時間インキュベートした。次に生存卵母細胞を溜め、10ストロークのDounceホモジナイザーで100 mm NaCl 、10mm Tris pH7.5 中で均質化により抽出した(20 μl / 卵母細胞) 。次にホモジネートを等容積のフレオンと混合して色素および脂質を除去し、10,000rpm で30秒遠心分離して相を分離させた。上の水相を除去し、上記のようにしてNIH 3T3 細胞を使用して走化活性について試験した。

DB60 R32クローンのin vitro転写により誘導されたＲＮＡ製剤10ngによるアフリカツメガエル卵母細胞の注入は繊維芽細胞走化活性の発生をもたらした。対照注入細胞はこの活性を生じなかった。これらの結果は、DB60 R32クローンのオープンリーディングフレームがCTGFと同様に繊維芽細胞に対する走化活性を有するタンパク質をコードすることを示す。

実施例６
CTGFの配列分析
クローンDB60R32 の2100bpインサートを最初にBluescriptへのPst I およびKpn I 制限断片のサブクローニングおよび二本鎖ジデオキシ方法の使用により配列決定した。これは1047塩基対のオープンリーディングフレームを示し、DB60インサートを大きいｃＤＮＡに配向した。全オープンリーディングフレームを含むEcoRI/Kpn I 断片をM13 mp18およびM13 mp19に挿入し、ＤＮＡの両ストランドをGTP およびGTP 類縁体ITP の両方を使用するプライマー伸長法により一本鎖ジデオキシ方法で配列決定した。オープンリーディングフレームのｃＤＮＡヌクレオチド断片は38,000 分子量のタンパク質をコードし、無細胞翻訳結果を確認し、免疫精製ペプチドのサイズを一致させた。GenBankデータベースの新しい検索は、このｃＤＮＡがCEF-10mRNAとの50％ヌクレオチド配列相同性を有し、その即時早期遺伝子の一つがin v-src形質転換されたニワトリ胚繊維芽細胞(Simmonsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 86:1178-1182, 1989)において誘導することを明らかにした。ヒトCTGFおよびトリCEF-10に関する翻訳ｃＤＮＡは、推定選択的スプライシング領域が欠失される場合に45％全相同性および52％相同性を有する。この領域はCTGF配列中のアミノ酸171(アスパラギン酸) と199 （システイン) の間にある。

実施例７
CTGFプロモーター領域の分析
細胞培養物
ヒト皮膚繊維芽細胞を皮膚バイオプシー標本の外殖体から増殖させた。NIH/3T3 細胞およびCos7細胞をAmerican Type Culture Collection (ATCC, Rockville,MD) から得た。全ての細胞を10％CO₂ および90％空気の雰囲気中で37℃で10％ウシ胎児血清(FCS) を含むダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)中で培養した。ヒト皮膚繊維芽細胞を第六継代の前に使用した。

増殖因子
TGF-β1 はRichard Assoian (U.Of Miami)からの贈答品であった。組換えPDGFBBをChiron (Emeryville, Calif.) から得た。精製マウスEGF をSigma (St.Louis, MO)から購入した。

ＲＮＡ単離およびノーザンブロッティング
全ＲＮＡを既に報告されたようにして(Chomczynskiら, Birchem, 162:156-159,1987) 酸グアニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出により培養細胞から単離した。全ＲＮＡを1.5 ％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移した。CTGFオープンリーディングフレームに相当する1.1kb フラグメントとしてのCTGFプローブを特定のプライマーHO1 5'-CGGAATTCGCAGTGCCAACCATGACC-3'（配列番号３）およびHO2 5'-CCGAATTCTTAATGTCTCTCACTCTC-3'（配列番号４）を使用してPCR 反応により得た。ランダムプライマーＤＮＡ標識キット(Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Inc.)を使用することにより［α-³²P］dCTPで標識したこれらのプローブ1x10⁶ cpm/ml を使用してハイブリダイゼーションを行った。Ｘ線フィルムおよび増感スクリーンを使用することにより、オートラジオグラフィーを-70 ℃で６〜72時間行った。

ゲノムクローンの単離および配列分析
ゲノムＤＮＡを既に記載されたようにして(Sambrook ら, Cold Spring HarborLaboratory Press, 9:14-19, 1989)ヒト皮膚繊維芽細胞から単離した。鋳型としてゲノムＤＮＡ４μg を使用して、CTGF遺伝子の断片をプライマーHO2およびHO3 5'-CGGAATTCCTGGAAGACACGTTTGGC-3'（配列番号５）を使用するPCR により増幅した。PCR 産物をEcoRI で消化し、M13 にサブクローン化した。Seque-naseキット(U.S.Biochemical Corp., Cleveland, Ohio)を使用して、ジデオキシチェーンターミネーター法(Sanger ら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74:5463-5467, 1977) による配列分析は、中央部分に387bp イントロンを有する900bp 断片を実証した。ヒトゲノムライブラリーint heλFIX^TM IIベクター(Stratagene, La Jolla,CA) を使用して、本発明者らはプローブとしての³²P 標識900bp ゲノムＤＮＡ断片で約1x10⁶ 組換えファージをスクリーニングし、CTGF遺伝子を含む３種のファージクローンを単離した。

ルシフェラーゼリポーター遺伝子アッセイ
ヒトゲノムクローンの一種からのヌクレオチド-823〜+74 を含むCTGFプロモーターの断片を最初にpGL-2-Basic ベクター(Promega) のSac1-Xho1クローニング部位中でクローン化した。この構築物(PO)をPCR の鋳型として使用し、欠失変異体を以下のようにして特定のプライマーでつくった。P1は-638〜+74 のヌクレオチドを含み、P2は-363〜+74 を含み、P3は-276〜+74 を含み、P4は-128〜+74 を含んだ。全ての欠失断片を配列決定して、突然変異がプロモーター断片中に導入されなかったことを保証した。NIH/3T3 細胞を６時間にわたって６ウェルプレート中でLIPOFECTIN（登録商標）試薬(GIBCO BRL) でトランスフェクトした。それぞれのトランスフェクションはpSV-β- ガラクトシダーゼベクター(Promega) ２μg を含んでいた。細胞をトランスフェクション後に24時間にわたってITS^TM (Collaborative Biomedical Products) とともに無血清DMEM中でインキュベートし、続いて４時間または24時間にわたって増殖因子とともにインキュベートした。ルシフェラーゼ アッセイ システム(Promega) およびそれを単一光子モニターモードで使用するシンチレーションカウンター(Beckman LS6000SC)を使用することによりルシフェラーゼ活性を測定した。トランスフェクション効率の相違を標準化するために、Galacto-Light^TM (TROPIX, Inc.)を使用する化学発光アッセイを使用して、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。

核抽出物の調製
核抽出物をAbmayrおよびWorkman (Current Protocols in Molecular Biology,vol 2, pp12.1.1-12.1.9, Ausubel ら, Greene Publ., and Wiley Interscience, NY, NY) により記載されたようにして調製した。簡単に言えば、細胞を低張性緩衝液(10 mM HEPES pH7.9、1.5 mM MgCl₂、10mM KCl、0.2 mM PMSF 、0.5 mM DTT) で処理し、ガラスドウンスホモジナイザーの10ストロークで均質にし、核を3300xgで15分間の遠心分離により単離した。核を等容積の抽出緩衝液(20 mM HEPES pH7.9 、25％グリセロール、1.5 mM MgCl₂、0.8M KCl、0.2 mM EDTA 、0.2 mMPMSFおよび0.5 mM DTT) 中に懸濁させることにより核タンパク質を抽出した。抽出物を使用前に20mM HEPES pH7.9 、20％グリセロール、100 mM KCl、0.2 mMEDTA、0.2 mM PMSF および0.5 mM DTTに対し透析した。BCA タンパク質アッセイ試薬(Pierce)を使用してタンパク質濃度を測定した。

ゲル移動度シフトアッセイ
CTGFプロモーターの断片をPCR またはプロモーター断片の制限エンドヌクレアーゼ消化により調製した。二本鎖オリゴヌクレオチドを相補性一本鎖オリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより調製した。全てのオリゴヌクレオチドおよび断片をアガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル中で電気泳動によりチェックした。CTGFプロモーターの放射性標識断片をクレノー酵素(Boehringer Manheim)およびポリヌクレオチドキナーゼ(Boehri-nger Manheim) による末端標識により調製した。標識断片をゲル移動度シフトアッセイ中の使用の前に２％アガロースゲルまたは20％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動により精製した。結合反応混合物は20μl の10mM HEPES pH7.9 、５mM Tris 、50mM KCl、0.1 mM EDTA 、１μg のポリ(dl-dC)ポリ(dl-dC)(Pharmacia) 、10％グリセロール、300 μg/ml BSA、および10,000 cpmの³²P 標識ＤＮＡプローブ中に核抽出タンパク質１μg を含んでいた。未標識競合ＤＮＡを添加し、標識プローブを添加する前に４℃で２時間インキュベートした。標識プローブを４℃で１時間にわたって反応混合物中でインキュベートした。５％ポリアクリルアミドゲルを使用し、50mM Tris 、0.38M グリシンおよび２mM EDTAを用いて電気泳動を行った。

メチル化干渉アッセイ
二本鎖オリゴヌクレオチドの末端標識断片をゲル移動度シフトアッセイについて記載されたようにして調製した。オリゴヌクレオチドを５分間にわたって室温でジメチル硫酸(Fisher Scientific) によりメチル化した。ＤＮＡ−タンパク質結合およびゲル移動度シフトアッセイを上記のようにして多量の標識プローブ(100K cpm)および核タンパク質(20 μg)を使用して行った。シフトしたバンドおよびシフトしなかったバンドからのＤＮＡを精製し、ピペリジン(Fisher Scientific) で開裂し、サンプルをポリアクリルアミドＤＮＡ断片決定ゲルで電気泳動にかけた。シフトした断片およびシフトしなかった断片の配列を、同方法を使用して配列決定された無傷プローブと比較した。

実施例８
短期TGF-β暴露によるCTGFｍＲＮＡの延長された誘導
増殖因子により誘導される殆どの極初期遺伝子、例えば、c-fos およびc-myc は、たとえ増殖因子が培地中に存在して残るとしても発現の短いバーストを示す。対照的に、CTFG転写産物はTGF-β(Igarashi ら, Mol.Biol.Cell., 4:637-645,1993) による細胞の活性化後の24時間以上にわたって高レベルで残る。この実施例はCTGF転写産物の長期上昇がTGF-βの連続の存在に依存したか否かを調べる。

集密ヒト皮膚繊維芽細胞をTGF-βの添加の前に24時間にわたってインスリン、トランスフェリン、およびセレンを補給した無血清DMEM(DMEM-ITS)中で培養した。TGF-βへの１時間の暴露後に、細胞をPBS 中で洗浄し、DMEM-ITSと交換し、続いて異なる期間にわたってインキュベートした。詳しくは、ヒト皮膚繊維芽細胞の集密培養物をTGF-βの添加の前に24時間にわたって５μg/mlのインスリン、５μg/mlのトランスフェリンおよび5 ng/ml のセレンを含むDMEM-ITSとともにインキュベートした。１時間の10ng/ml のTGF-βによる処理後に、細胞をPBS で洗浄し、指示された期間にわたってDMEM-ITSとともにインキュベートした。ノーザンブロット分析は、CTGFｍＲＮＡがTGF-β除去後４時間から30時間までに強く誘導されることを明らかにした（図2A）。

数種のタンパク質合成インヒビターの存在下でCTGF転写産物を誘導するTGF-βの能力を調べた。図2BはCTGFｍＲＮＡの誘導に関するシクロヘキシミドの効果を示す。レーンＡおよびＨはそれぞれ４時間および24時間の未処理対照細胞である。レーンＢ、４時間、シクロヘキシミド(CHX)(10μg/ml);レーンＣ、４時間、シクロヘキシミド暴露の１時間または２時間中の１時間にわたって存在するTGF-β；レーンＥ、シクロヘキシミドの添加後24時間で調製されたＲＮＡを用いてＢと同じ；レーンｆ、24時間、TGF-β(10 μg/ml);レーンＧ、シクロヘキシミドの添加後24時間そしてTGF-βの除去後22時間で調製されたＲＮＡを用いてＤと同じ。

図2Bに示されるように、シクロヘキシミドの存在下のTGF-βによる１時間の刺激は24時間後と同様に４時間後にCTGFｍＲＮＡを誘導するのに充分であった。シクロヘキシミド単独は４時間後にCTGFｍＲＮＡを誘導することができ、その他の転写産物（例えば、c-fos、c-myc）のシクロヘキシミド誘導について報告されたようなｍＲＮＡ安定化の可能性を示唆した(Greenbergら, Nature (London), 311:433-438, 1984; Kruijerら, Nature, 312:711-716, 1984)。しかしながら、Edwards およびMahadevan による論文(Edwards, D.R.およびL.C.Mahadevan, EMBO J., 11:2415-2424, 1992)は、ピューロマイシンではなく、タンパク質合成インヒビターのシクロヘキシミドおよびアニソマイシンがc-fos 遺伝子およびc-jun 遺伝子の転写を刺激するように作用することができ、それ故、メッセージ安定化がこれらの化合物の作用の唯一の可能なメカニズムではないことを示した。

CTGF転写産物のTGF-β誘導を抑制するアニソマイシンおよびピューロマイシンの能力をCTGF転写産物を上昇する能力についてシクロヘキシミドの能力と比較した。図2CはCTGFｍＲＮＡの誘導に関するタンパク質合成インヒビターの効果を示す。細胞を４時間にわたってピューロマイシンまたはアニソマイシンで処理した。TGF-βをタンパク質合成インヒビターの添加の１時間後に添加し、細胞を全ＲＮＡの単離の前に３時間にわたってインキュベートした。CTGF転写産物をノーザンブロットにより分析した。

ピューロマイシンは100 μg/ml（これはこれらの細胞中でタンパク質合成を完全にブロックするのに必要とされる濃度よりも10倍高い）までの試験した濃度のいずれでもCTGFｍＲＮＡを誘導しなかった。この高い濃度でさえも、それはCTGFｍＲＮＡを誘導するTGF-βの能力に影響しなかった。対照的に、アニソマイシンはシクロヘキシミドで見られたようにCTGF転写産物を上昇させたが（図2C) 、TGF-β処理はアニソマイシンの存在下で依然としてCTGFｍＲＮＡのレベルを上昇させた。

これらの知見はEdwards およびMahadevan (Edwards, D.R.およびL.C.Mahadev-an, EMBO J., 11:2415-2424, 1992)により報告された知見と同様であり、この場合、c-fos およびc-jun の両方がアニソマイシンまたはシクロヘキシミド単独により誘導されたが、ピューロマイシン単独により誘導されなかった。これらのデータは、TGF-βがタンパク質合成とは独立であり、転写のレベルで主として作用しているかもしれないメカニズムによりCTGF遺伝子発現を直接調節することを強く示唆する。

実施例９
ヒトCTGF遺伝子の単離
CTGF遺伝子の構造を解明するために、PCR を使用して、CTGF遺伝子の断片を最初に得た。ヒト皮膚繊維芽細胞から調製されたゲノムＤＮＡ４μg を鋳型として使用し、オリゴヌクレオチド、HO2 およびHO3 をプライマーとして使用した。反応の30サイクル後に、900bp 断片を回収し、これはｃＤＮＡ断片から予想されたものより390bp 長かった。この断片(HO900) のヌクレオチド配列分析は断片の中央部分中の387bp イントロンの存在を明らかにした。HO900 をプローブとして使用して、３ファージクローンはヒトゲノムライブラリー（これはCTGF遺伝子の全コード配列に相当する4.3kb Xba1断片および推定プロモーター領域の大部分を含んでいた）からのものであった。図1Aに示されるように、CTGF遺伝子は５エクソンおよび４イントロンを有する。

TATA配列は、オリゴヌクレオチドプライマー伸長法により測定して、ｍＲＮＡキャップ部位の24ヌクレオチド上流に存在する。CArGボックス（これはCC(A/T)₆GGにより特徴づけられる血清応答要素(SRE) の内部コアである）のコンセンサス配列はヌクレオチド位置-380〜-390の間に存在する。また、CAT ボックス、二つのSp1 部位および二つのAP-1部位を含む、その他の潜在的調節要素が存在する。更に、CTGFプロモーターは位置-194と-184の間のNF-1のような部位、(TGGN6GCCAA)（配列番号６）、および位置-119と-128の間のTGF-β抑制要素のような配列(GNNTTGGTGA)（配列番号７）を有する。これらの要素の両方は報告されたコンセンサス配列(Edwards, D.R.およびJ.K.Heath, The hormonal control regulation of genetranscription, 16:pp 333-347) とは単一塩基の相違を有する。ＤＮＡ配列比較は、ヒトCTGFプロモーターが転写開始部位の5'の領域300 ヌクレオチド中でマウスfisp-12 プロモーターに対し80％の配列同一性を有することを示した（図1B）。更に上流の領域はＤＮＡ配列中で極めて小さい類似性を示す。

実施例10
CTGFプロモーターに関する研究
CTGF遺伝子の5'未翻訳領域がTGF-β誘導プロモーターとして機能するか否かを試験するために、CTGFプロモーター（ヌクレオチド-823〜+74)およびベクターpGL2-basic中のホタルルシフェラーゼ遺伝子のコード領域を含む融合遺伝子を構築した。NIH/3T3 細胞を使用して、ルシフェラーゼ活性を一過性トランスフェクションアッセイで試験した。この構築物は、対照培養物と比較して、TGF-βによる24時間の刺激後にルシフェラーゼ活性の15-30 倍の誘導を与えた。CTGFｍＲＮＡのレベルで見られるように、その他の増殖因子、例えば、PDGF、EGF およびFGF は同一条件下でルシフェラーゼ活性のわずかに２−３倍の誘導を刺激した（表１）。

ND測定せず
HSF-ヒト包皮繊維芽細胞（原発性）
VSMC- ウシ胎児大動脈平滑筋細胞（原発性）
HBL100ヒト胸部上皮細胞系（非催腫瘍性）
HEP G2ヒト肝上皮細胞系（非催腫瘍性）
（ヌクレオチド位置-823から+74 まで延びるCTGF遺伝子断片をpGL2-ba-sic ベクターに挿入した。プラスミドを６時間にわたってリポフェクチンでトランスフェクトし、細胞を増殖因子の添加の前に16時間にわたってDMEM-ITS中でインキュベートした。24時間のインキュベーション後に、細胞抽出物を調製し、ルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性を共トランスフェクトされたlacZ発現ベクター、pSV-β- ガラクトシダーゼベクターから発現されたβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することにより標準化し、増殖因子処理細胞と未処理細胞の間で比較した。これらの実験を４回繰り返し、同様の観察をした。代表的な実験が示される。）
このプロモーター断片を逆配向(+74から-823へ) でクローン化した場合、ルシフェラーゼ活性の基礎レベルのみが検出され、このレベルは細胞のTGF-βまたはその他の増殖因子処理により影響されなかった。ヒト皮膚繊維芽細胞をNIH/3T3 細胞に代えて使用した場合、増殖因子誘導の同じパターンを観察した（表１）。TGF-βは数種の上皮細胞系中でルシフェラーゼ活性を誘導せず（表１）、CTGF遺伝子のTGF-β調節が細胞型特異性であることを実証した。上皮細胞による応答の欠如は、これらの細胞の増殖がTGF-β(10ng/ml) により抑制されるのでTGF-β応答の欠如のためではない。CTGFプロモーターのみの制御下のルシフェラーゼ活性の誘導はTGF-βへの細胞の短い暴露を必要とした。何となれば、TGF-βによる細胞の１時間の処理はTGF-βに連続暴露された細胞とほぼ同じ倍率の誘導を４時間および24時間で生じるからである（表2）。これらの結果は前記のノーザンブロットからのデータを確認し、転写調節がTGF-βによるCTGF遺伝子発現の制御に主要な役割を果たすことを実証する。

¹ 表１脚注および実施例７に記載されたようにして測定されたルシフェラーゼ活性の誘導倍率。NIH/3T3 細胞をこれらの実験に使用した。

実施例11
TGF-β誘導に必要とされたプロモーター要素の同定
プロモーター配列のどの領域がTGF-βによる誘導の原因であるのかを測定するために、既知転写因子コンセンサス要素を欠失するように設計されたPCR プライマーを使用して、CTGFプロモーターの欠失変異体を構築した。殆どの5'領域で開始し、転写開始部位に向かって移動するプロモーターの領域を系統的に欠失した（図3A) 。AP1 部位およびCArGボックスを含む塩基-363まで下がるプロモーターの領域の除去はルシフェラーゼ活性のTGF-β誘導に有意な効果を有しなかった。第二AP-1が欠失された場合(-363 〜-276) 、約30％の減少が見られたが、TGF-βによる誘導倍率は依然として高かった（20倍）。P4構築物中のNF-1のような部位(-276 〜-128) の除去はプロモーターのTGF-β誘導を排除し、この領域がTGF-B応答要素を含むことを示唆した。二つのBsm1部位を利用して、本発明者らは-162から-110までのヌクレオチドを欠失して、プロモーターの残部を無傷で残した。この構築物はTGF-β誘導の完全な損失を示し、位置-162と-128の間の配列がルシフェラーゼ活性のTGF-β誘導に必須であることを実証した。この領域はTGF-β抑制要素(TIC)様の部位を含み、他者がα2(I)コラーゲン遺伝子発現(Oikari-nen, J., A.Hatamochi, およびB.De Crombrugghe, J.Biol.Chem., 262:11064-11070, 1987)および１型プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター(PAI-1)遺伝子発現(Riccio ら, Mol.Cell Biol., 12:1846-1855, 1992) のTGF-β調節に役割を果たすと報告したNF-1のような部位により境界が形成される。

ルシフェラーゼ遺伝子を制御するSV40エンハンサー無プロモーターから上流にCTGFプロモーターの位置-275から-106までのヌクレオチドを配置する融合遺伝子を構築して、そのプロモーターのこの領域がTGF-β誘導を与えるのに充分であるか否かを測定した（図3B）。SV40エンハンサー無プロモーターはTGF-βにより調節されなかった。しかしながら、CTGF配列-275〜-106を含むプロモーターはTGF-β処理後にほぼ９倍の誘導を与えた。断片の反転はTGF-β処理後にルシフェラーゼ活性のわずかな刺激をもたらした。これらのデータは、ヌクレオチド-275と-106の間のCTGFプロモーター中の部位がTGF-β調節要素として作用することができることを確認する。

一連の競合ゲルシフトアッセイおよびメチル化干渉アッセイを行って、核タンパク質に結合しているCTGFプロモーターのこの部分の領域を概説した。初期競合ゲルシフトを使用して、位置-205と-109の間の配列のどの領域がタンパク質結合の標的であるかを概説した。プローブおよび種々の競合断片の線図を図４に示す。これらの研究の結果は、NH3 領域(-169 〜-149) を含む任意の断片が塩基-204〜-109を含む標識プロモーター断片に特異性の競合物質として作用したことを実証する（図４）。この領域はNF-1様部位とTIE 様部位の間に配置される。NH3 領域を含まないでTIE 様領域またはNF-1様領域のみを含むオリゴヌクレオチド断片はゲルシフトアッセイで競合しなかった。

調節要素を更に概説するために、メチル化干渉アッセイを行った。位置-275から-106までのプロモーターの断片を最初に使用した。これらの研究の結果は、TIE 要素のNF-1様部位が対照細胞またはTGF-β処理細胞中に存在する核タンパク質と相互作用しないことが明らかであることを示し、ゲルシフト競合アッセイを確認する。しかしながら、位置-157から-145までのこれらの部位の間の領域はシフトされたバンド中にメチル化されない幾つかのＧ残基を含み、この領域が核タンパク質結合部位であることを示唆した（図5A）。次にその領域の小さい断片（ヌクレオチド-169〜-139) を分析して重要なＧ残基の良好な解明を得た（図5B) 。この分析からのデータは大きい断片のデータを確認し、競合ゲルシフトにより決定された配列内にあるＧ残基をマッピングする。

実際のTGF-β反応性部位を良く特性決定するために、タンパク質結合について競合する無傷配列および幾つかの欠失の能力をゲルシフトアッセイで比較した（図６）。これらのデータはメチル化干渉アッセイの結果を確認し、位置-159から-143までのプロモーターの領域がCTGF遺伝子発現のTGF-β調節に関係したシス調節要素の少なくとも一部を含むことを示唆する。

点突然変異をTGF-β誘導に関係すると考えられる配列の領域中で行って、これらのプロモーターを本発明者らのルシフェラーゼリポーター構築物中で試験した（図７）。二つの点突然変異を試験し、両方がTGF-βによる遺伝子の誘導を減少した。一つの突然変異はその誘導を対照から25％減少し、他の突然変異は80％減少した。いずれもが対照天然配列と較べて発現の基礎レベルに効果を有していなかった。

点突然変異を所望の塩基変化を含むオリゴヌクレオチドの合成およびCTGFプロモーター中の二つのBsmI部位の利用により構築した。全ての構築物をヌクレオチド配列分析により確認し、所望の塩基変化が起こったことおよびその他のヌクレオチド配列の全てがその通常のプロモーターと同一であることを実証した。NIH3/ 3T3 細胞を標的として使用して、アッセイをその他のCTGFプロモーター−ルシフェラーゼ構築物について上記されたようにして行った。図７中の表に示されたデータはそれぞれの実験条件について二重反復アッセイによる単一実験からのものである。実験を数回行って結果を確認した。これらのデータは、プロモーターのこの領域中の単一突然変異がTGF-β誘導を85％（通常の遺伝子の15％未満まで）減少することができることを実証する。これらのデータは、同定された配列がCTGF遺伝子のTGF-β誘導に必須であることを実証する。

実施例12
TGF-βがCTGF依存性経路により足場非依存性増殖を刺激する
a.cAMPレベルの上昇によるTGF-β誘導CTGF遺伝子発現の抑制
ハービマイシンおよびホルボールエステルの両方を利用して、チロシンキナーゼまたはタンパク質キナーゼＣのいずれがTGF-βにより誘導されるCTGF遺伝子発現の調節に役割を有するのかを測定した。NIH/3T3 細胞にトランスフェクトされたCTGFプロモーター(-823 〜+74)ルシフェラーゼリポーター構築物を使用してこれらの研究を行った。

NIH/3T3 細胞をDMEM/10 ％FCS 中で50％集密まで増殖させた。実施例７に上記されたようにリポフェクチン（登録商標）を使用して、それらを全てPO CTGF プロモーター（ヌクレオチド位置-823〜+74)でトランスフェクトして、pGL2 basicベクターホタルルシフェラーゼの発現を誘導した。DMEM/ITS培地中で24時間後に、インヒビターを添加した。薬剤の全てを10ng/ml TGF-βの添加の２時間前に培養物に添加した。細胞を24時間インキュベートし、Tropixルシフェラーゼアッセイキットおよび単一光子モニターを備えたBeckman シンチレーションカウンターを使用してルシフェラーゼ活性を測定した。関連実験では、PMA をTGF-βの前に24時間にわたって細胞に添加して、タンパク質キナーゼＣを枯渇した。これはまたCTGFプロモーターの調節下でルシフェラーゼ活性を誘導するTGF-βの能力については効果がなかった。また、ハービマイシン研究に関する対照実験として、PDGF誘導細胞分裂を抑制するこの薬剤の活性を調べた。集密密度のNIH/3T3 細胞の分裂停止単層を組換えPDGF BB の添加の前に２時間にわたって指示された濃度のハービマイシンで処理した。細胞の数をPDGFの添加の24時間後にトリプシン処理およびカウンティングにより測定した。分裂指数は分裂を受けた細胞の％を表す。

これらの化合物のいずれもがCTGF遺伝子発現を誘導するTGF-βの能力について効果を有しておらず、またそれらは標的細胞中のCTGF遺伝子発現の基礎レベルをモジュレートしなかった。しかしながら、コレラトキシンまたは8Br-cAMPの両方がCTGF遺伝子のTGF-β誘導の強力なインヒビターであった（図8A) 。

これらのデータは、チロシンキナーゼまたはタンパク質キナーゼＣのいずれもがTGF-βにより制御されたCTGF遺伝子誘導をもたらすシグナル伝達経路の一部ではないことを示す。また、環状ヌクレオチド調節タンパク質はCTGF遺伝子発現の調節のためのTGF-β経路の一部ではないことが明らかである。しかしながら、細胞中のcAMPレベルの上昇はCTGF遺伝子発現のTGF-β誘導を無効にする。関連実験では、本発明者らは、cAMPまたはコレラトキシンがTGF-βの添加後８時間まで添加でき、それがCTGF遺伝子の発現をブロックするのに依然として有効であることを見出す。これは、cAMPの作用が受容体から遠位であり、CTGFプロモーターへの転写因子結合を行っているかもしれないことを示唆する。

b.cAMPは繊維芽細胞に対するTGF-βの作用の全てをブロックしない
図8Bに示された四つのパネルは上記実験に使用したNIH/3T3 細胞の顕微鏡写真であり、これらはルシフェラーゼ活性の測定の前の対照）無添加；TGF-β）TGF-β(10ng/ml); cAMP) 8BrcAMP(1000 μM ); cAMP+TGF-β）8BrcAMP(1000μM)およびTGF-β(10ng/ml) であった。これらのデータは、cAMPがNIH/3T3 細胞の形態外観の著しい変化を生じるが、これらの細胞へのTGF-β添加がTGF-βで処理された対照細胞と同一ではないとしても同様であった形態外観をこれらの細胞中に誘導することを示す。こうして、cAMPはCTGF遺伝子発現のTGF-β誘導をブロックすることができるが、それはこれらの単層培養物に見られる形態の観察された変化を調節する生化学的イベントに効果を有しない。これらの結果は、cAMPにより示差的にブロックし得る繊維芽細胞に対するTGF-βの作用に多種の成分があることを実証する。有意な相違が全細胞タンパク質含量またはSV40/ β−ガラクトシダーゼ調節リポーター遺伝子の発現に関して培養物中で検出されず、変化がcAMPの毒性効果のためではないことを示した。コレラトキシン処理はTGF-βの添加により反転される8BrcAMP 処理細胞中で見られた形態と同様の形態を誘導した。

c.cAMPによるTGF-β誘導足場非依存性増殖の抑制およびrCTGF によるその反転
先の研究の結果のために、実験を行って、cAMPがTGF-β誘導足場非依存性増殖をブロックするか否かを測定した。最初にNRK 細胞の足場非依存性増殖を誘導するTGF-βの能力に関する8BrcAMP 、8BrcGMP およびコレラトキシンの効果を測定した。足場非依存性増殖アッセイをGuadagnaおよびAssoian (J Cell Biol, 115: 1419-1425, 1991) により実質的に記載されたようにして行った。簡単に言えば、単層培養物として通常に管理されたNRK 細胞を5ng/ml EGFを含むDMEM/10 ％FCS 中のアガロース層に塗布した。TGF-βまたはCTGFを添加し、細胞を72時間インキュベートした。次に回収され、TCA 沈殿等により処理された細胞を³H- チミジン(2μCi/ml)で24時間標識することによりＤＮＡ合成を測定した。インヒビターを増殖因子と同時に添加し、実験の期間にわたって存在して残した（図8C)(略号: コレラトキシン(CTX))。

図8Cに見られるように、8BrcAMP およびコレラトキシンの両方はこのアッセイで増殖の有効なインヒビターであり、一方、8BrcGMP は10mMまでの濃度で効果を有していなかった。CTGF遺伝子の発現が細胞中のcAMPレベルの上昇によりブロックされたので、実験を行って、rCTGF が抑制を解消できるか否かを測定した。図8B中の左のパネルに見られるように、NRK 細胞へのrCTGF の添加は足場非依存性増殖を刺激せず、それ故、TGF-βを置換しない。しかしながら、TGF-βで処理され、8BrcAMP またはコレラトキシンで抑制された細胞への同量のrCTGF の添加は抑制を解消し、細胞がcAMPまたはコレラトキシンの不在下でTGF-βで処理された細胞に匹敵する速度で増殖することを可能にする（かなり右のパネル）。これらの研究はCTGFの生成と懸濁液中で増殖するNRK 細胞の能力の間の直接の関連を示唆する。それらはまた、TGF-βがcAMPの上昇したレベルの存在下で繊維芽細胞中で或る効果を誘導することができるが、それらが足場非依存性増殖を可能にするのに充分ではないことを実証する。また、CTGF単独はこの生物学的応答を刺激するのに充分ではないので、それは繊維芽細胞に対するTGF-βの作用の全ての代替ではない。これらの結果は、相乗作用して特異性細胞応答（足場非依存性増殖）を可能にする標的細胞(NRK) 中でTGF-βにより誘導されるCTGF依存性効果およびCTGF非依存性効果の両方があることを実証する。

実施例13
cAMPレベルを上昇する薬剤によるTGF-β誘導肉芽組織形成の抑制
TGF-βは数種の動物モデル研究で線維症を誘導することが示されていた。例えば、一つのグループはTGF-β 400〜800ng を新生児マウスの背中中の皮下空隙に注射した。それが３日続けて１日１回注射される場合、線維症組織の大きな領域が形成する(Robertsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 83:4167, 1986)。本実施例はTGF-βおよびCTGFとの比較研究を示し、これらの結果はCTGFがTGF-βに応答して形成した結合組織と同一ではないとしても非常に似ている結合組織の形成を誘導することを示した。その他の増殖因子、例えば、PDGFまたはEGF はTGF-βと同様の組織を誘導せず、CTGFがTGF-β注射により誘導された組織の形成の原因であり得ることを示す。

実施例12中の結果は、cAMPレベルが培養細胞中のCTGFの誘導をブロックすることができることを示したので、動物中の細胞中のcAMPレベルの上昇がinvivoにおいてTGF-βの作用をブロックすることができるか否かを測定することが重要であった。上記およびRoberts らに記載された注射モデルを使用して、以下の実験を行った。新生児マウスにTGF-β(400ng) 、コレラトキシン(100ng) 、TGF-β(400ng) およびコレラトキシン(100ng) 、または食塩水のいずれかで３日続けて１日１回注射した。３匹のマウスをそれぞれのグループで使用した。注射後に、通常の組織学的方法を使用して組織を調製し、注射の領域をヘマトキシリンおよびエオシンによる染色後に光学顕微鏡により調べた。

予想されたように、食塩水注射はマウス皮膚中に存在する組織の型に対し効果を有せず、TGF-β注射は肉芽組織に近似する多量の新しい結合組織を誘導した。この組織は増加した数の繊維芽細胞および増加した数のコラーゲン並びにその他の基質成分を含んでいた。コレラトキシン単独の注射は肉芽組織形成の刺激を生じなかった。また、TGF-βとコレラトキシンの同時注射は肉芽組織の形成を示さず、コレラトキシンが肉芽組織のTGF-β誘導形成をブロックすることを実証した。これらの結果は抗線維症薬剤としての使用についてCTGFの生成または作用をブロックする薬剤の治療上の実用性を示す。

本発明が現在好ましい実施態様に関して記載されたが、種々の改良が本発明の精神から逸脱しないでなし得ることが理解されるべきである。それ故、本発明は以下の請求の範囲のみにより限定される。

図1パネルAは、CTGF遺伝子の構造の構成を示している。エキソンは矩形領域で表されており、遺伝子中の塗りつぶし部分はオープンリーディングフレームに対応する。 図1パネルBは、CTGFプロモーターとfisp-12プロモーターのヌクレオチド配列の比較を示している。同じヌクレオチドには星印が付けられている。TATAボックスおよび他の共通配列は陰影で示されている。転写開始部位は位置番号+1で示されている。 図1C.1〜1C.3は、CTGF構造遺伝子に対する完全ヌクレオチド配列および得られるアミノ酸配列ならびに5'および3'非翻訳配列を示している。 図1C.1〜1C.3は、CTGF構造遺伝子に対する完全ヌクレオチド配列および得られるアミノ酸配列ならびに5'および3'非翻訳配列を示している。 図1C.1〜1C.3は、CTGF構造遺伝子に対する完全ヌクレオチド配列および得られるアミノ酸配列ならびに5'および3'非翻訳配列を示している。 図2は、ノーザンブロット分析を示している。パネル(A)は、短時間TGF-βによりCTGF mＲＮＡ誘導がながびくことを示している。ヒト皮膚線維芽細胞の集密的培養細胞を、5μg/mlのインスリン、5μg/mlのトランスフェリン、および5ng/mlのセレンを含有するDMEM-ITSを用いてインキュベートし、その後でTGF-βを添加した。10ng/mlのTGF-βで1時間処理した後、PBSで細胞を洗浄し、DMEM-ITSを用いて指定の時間インキュベートした。パネル(B)は、シクロヘキシミド(CHX)がCTGF mＲＮＡの誘・BR>アに及ぼす影響を示している。レーンAおよびHは、それぞれインキュベート4時間および24時間における未処理の対照細胞に対するものである。レーンBは、インキュベート4時間で、シクロヘキシミド(10μG/ML)を使用した場合であり；レーンCは、インキュベート4時間で、シクロヘキシミドの2回の暴露のうちの時間1の間でTGF-βを1時間存在させた場合であり；レーンEは、Bと同じだが、シクロヘキシミドの添加後24時間にわたりＲＮＡの誘導を行った場合であり；レーンFは、インキュベート24時間で、TGF-β(10μG/ML)を使用した場合であり；レーンGは、Dと同じだが、シクロヘキシミドの添加後24時間にわたり、またTGF-βの除去後22時間にわたりＲＮＡの誘導を行った場合である。パネル(C)は、タンパク質合成抑制剤がCTGF MＲＮＡの誘導に及ぼす影響を示している。ピューロマイシンまたはアニソマイシンを用いて細胞を4時間処理した。タンパク質合成抑制剤を添加してから1時間後にTGF-βを添加し、更に細胞を3時間インキュベートした後で全ＲＮＡを単離した。実施例に記載したようにノーザンブロット法によりCTGF転写物を分析した。 図3パネルAは、CTGFプロモーター‐ルシフェラーゼ構築物の欠失分析を示している。既知の共通配列が記されている。この構築物をNIH/3T3線維芽細胞へトランスフェクトし、細胞を活性化させるために10ng/mlのTGF-βを添加し、24時間後に細胞抽出物を調製した。相対誘導量を、非誘導対照細胞より何倍増加したかで表し、CTGF構築物で共トランスフェクションされた対照プラスミドから得られたβガラクトシダーゼ活性を用いて規格化した。これらの実験を6回繰り返したが、似たような結果が得られた。データは、記載の構築物を用いて行われた1組の実験における複数回のトランスフェクションの平均を表している。 図3パネルBは、CTGFプロモーターのTGF-β領域を含有するSV40エンハンサー非含有プロモーター要素‐ルシフェラーゼリポーター構築物のTGF-β応答を示している。CTGFプロモーターの記載領域を、SV40エンハンサー非含有プロモーターの上流で両方向にクローン化した。10ng/mlのTGF-βを用いて細胞を24時間処理した後、ルシラーゼ活性を調べた。これらの実験を4回繰り返したが、似たような結果が得られた。データは、1組の実験から得られたもので、記載の構築物を複数回トランスフェクトしたときの平均を表している。 図4は、CTGFプロモーターの領域-205〜-109中のTGF-β応答要素を詳細に調べるための競合ゲルシフトアッセイを示している。CTGFプロモーターの領域-205〜-109から成るヌクレオチド断片を³²Pで末端標識化し、記載のオリゴヌクレオチドを用いた競合ゲルシフトに使用した。特異的なゲルシフトバンドが矢印で示されている。使用した配列のダイヤグラムには、NF-1様要素およびTIE様要素に対応する配列の位置が記されている。ダイヤグラム中の番号付けされた断片は、競合ゲルシフトアッセイにおけるレーン番号に対応し、特異的なヌクレオチド配列がレーン(すなわち、番号3、-205/-150)の上に記されている。非標識競合剤を、標識化断片の250倍過剰のモル濃度で用いた。領域-169〜-150を含有するオリゴヌクレオチドだけが、特異的競合剤として働いた。NF-1もしくはTIE様領域は、どちらもこのアッセイにおいて競合しなかった。 図5は、CTGFプロモーターの-205〜-109領域のメチル化干渉アッセイを示している。図5パネルAは、領域-205〜-109の配列分析を示している。配列-200〜-113が示されている。レーンGは完全な標識化プローブのG配列であり、レーンSはシフトバンドの配列であり、レーンFは同じサンプルから得られた非シフト遊離プローブの配列である。欠落G残基を含有する唯一の領域は、位置-157〜-145である。 図5パネルBは、プロモーターのより小さい断片(-169〜193)を用いた領域-159〜-142の配列分析を示している。レーンはAのときと同じである。この配列中の競合G残基が矢印で示されている。黒丸は相補鎖の分析で検出されたG残基を表す(データは示されていない)。記号*および#は、A中の配列に関する方向を表すためのものである。 図6は、TβRE中のオリゴヌクレオチドの競合ゲルシフトアッセイを示している。CTGFプロモーターの領域-159〜-143の部分を含有するオーバーラップおよび非オーバーラップオリゴヌクレオチドを、³²P末端標識化ヒトCTGFプロモーター断片(-205〜-109)を用いた競合ゲルシフトアッセイで試験した。完全な断片(-159〜-143)が最大の親和性を呈し、10ngにおいて完全な競合を示した。この配列の一部分だけを含有する他のすべての断片は、それほど有効ではなく、領域-150〜-134は最も有効性が低かった。レーン14および15は、それぞれNF-1様要素およびTIE様要素であり、標識化プローブの5000倍モル過剰においても競合を示さない。 図7は、TβRE中で点変異が起こるとTGF-βによるCTGFプロモーターの誘導が減少することを示している。 図8パネルAは、ハービマイシン(herbimycin)、ホルボールエステル、cAMP、およびコレラトキシンが、ルシフェラーゼアッセイにより測定した場合のTGF-β誘導CTGF発現に及ぼす影響を示している。 図8パネルBは、未処理であるか、またはTGF-β、cAMP(8Br cAMP)もしくはcAMPおよびTGF-βを用いて処理されたNIH/3T3細胞のそれぞれの顕微鏡写真を示している。 図8パネルCは、8Br cAMPおよびコレラトキシンによる足場非依存性増殖の抑制、ならびにCTGFによるTGF-β誘導足場非依存性増殖のcAMPまたはコレラトキシ抑制の逆反応の結果を示している。

Claims (7)

1. 被験者におけるCTGF遺伝子発現に関連する疾患の治療において使用するための、治療上有効な量のサイクリックAMPレベルを増加させる薬剤及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
2. 前記薬剤が、コレラトキシン及び8Br-cAMPから成る群より選ばれる、請求項1記載の組成物。
3. 治療上有効な量のCTGF反応性薬剤を含む、肺線維症、腎線維症、腫瘍形成および増殖、から成る群より選ばれる細胞増殖性疾患を軽減するための医薬組成物。
4. 前記細胞増殖性疾患が細胞の過増殖に起因する、請求項3記載の組成物。
5. 前記細胞増殖性疾患が結合組織細胞の過増殖に起因する、請求項3記載の組成物。
6. 前記CTGF反応性薬剤がCTGFのアンタゴニストである、請求項3記載の組成物。
7. 前記アンタゴニストがCTGFポリペプチドと特異的に結合する抗体である、請求項6記載の組成物。