ES2311290T3 - Factor 2 homologo al factor de crecimiento de fibroblastos y metodos de uso. - Google Patents

Abstract

SE DESCUBRE UN NUEVO FACTOR DE CRECIMIENTO, EL POLIPEPTIDO DE FACTOR OS (FHF HF IMISMO METODOS DE DIAGNOSTICO Y TERAPEUTICOS PARA UTILIZAR EL POLIPEPTIDO Y SECUENCIAS DE POLINUCLEOTIDOS DE FHF UERPOS QUE SE UNEN ESPECIFICAMENTE AL FHF

Description

Factor 2 homólogo al factor de crecimiento de fibroblastos y métodos de uso.

Antecedente de la invención 1. Campo de la invención

La invención se refiere generalmente a factores de crecimiento y específicamente a un miembro novedoso de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos, indicado como factor 2 homólogo del factor de crecimiento de fibroblastos (FHF-2) y el polinucleótido que codifica FHF-2.

2. Descripción de la técnica relacionada

La familia del factor de crecimiento de fibroblastos engloba un grupo de proteínas relacionadas estructuralmente con una amplia gama de actividades de estimulación del crecimiento, supervivencia y/o diferenciación in vivo e in vitro (revisado en Baird, A., y Gospodarowicz, D. Ann N. Y. Acad. Sci. 638: 1, 1991; Eckenstein, F.P., J. Neurobiology 25: 1467, 1994; Mason, I.J. Cell 78: 547, 1994). Desde diciembre de 1994, se habían caracterizado nueve miembros de esta familia mediante clonación molecular. Los dos primeros miembros de la familia que se caracterizaron, el factor de crecimiento de fibroblastos ácido (FGFa/FGF-1) y el factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGFb/FGF-2), se han encontrado en numerosos tejidos, incluyendo por ejemplo cerebral, ocular, renal, placentario y suprarrenal (Jaye et al., Science 233: 541, 1986; Abraham et al., Science 233: 545, 1986). Se ha demostrado que estos factores son potentes mitógenos y factores de supervivencia para una variedad de tejidos derivados del mesodermo y neurectodermo, incluyendo los fibroblastos, células endoteliales, neuronas corticales cerebrales e hipocámpicas y la astroglía (Burgess, W. H. y Maciag, T. Ann. Rev. Biochemistry 58: 575, 1989). Otros miembros de la familia de FGF incluyen: int-2/FGF-3, identificado como uno de los frecuentes sitios de integración del virus del tumor mamario de ratón, y por tanto, un presunto factor oncogénico (Smith et al., EMBO J. 7: 1013, 1988); FGF-4 (Delli-Bovi et al., Cell 50: 729, 1987) y FGF-5 (Zhan et al., Mol. Cell Biol. 8, 3487, 1988) como genes transformantes en el ensayo de transfección de NIH 3T3; FGF-6, aislado mediante clonación molecular basándose en su homología con FGF-4 (Marics et al., Oncogene 4: 335 (1989); factor de crecimiento de queratinocitos/FGF-7, identificado como mitógeno para los queratinocitos (Finch et al., Science 245: 752, 1989); FGF-8 como un mitógeno inducido por andrógenos para células de carcinoma mamario (Tanaka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8928, 1992); y FGF-9 como mitógeno para astrocitos primarios (Miyamoto et al., Mol. Cell Biol. 13: 4251, 1993). Varios de los FGF, incluyendo FGFa y FGFb, carecen de una secuencia señal clásica; no se conoce el mecanismo mediante el cual se
secretan.

Todos los miembros de la familia de FGF comparten una identidad de la secuencia de aminoácidos de aproximadamente el 25% o más, un grado de homología que indica que es probable que compartan estructuras tridimensionales casi idénticas. El respaldo para esta inferencia proviene de una comparación de las estructuras tridimensionales de FGFb y interleucina 1-beta determinadas mediante difracción de rayos X (Eriksson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 3441, 1991; Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 3446, 1991; Ago et al., J. Biochem. 110: 360, 1991). Aunque estas proteínas sólo comparten una identidad de aminoácidos del 10%, las estructuras alfa carbonadas de las dos estructuras cristalinas pueden superponerse con una desviación cuadrática media inferior a 2 ángstroms (Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 3446, 1991). Ambas proteínas consisten casi por completo en láminas beta, que forman un barril compuesto por tres copias de un motivo de meandro beta de cuatro hebras. Las regiones probables de unión a heparina y al receptor están ubicadas en regiones próximas en una cara de la proteína.

FGFa, FGFb, y FGF-7/KGF han demostrado ejercer parte o toda su actividad biológica a través de la unión de alta afinidad a receptores de tirosina cinasa celulares (por ejemplo, Lee, P. L. et al., Science 245: 57, 1989; revisado en Johnson, D.E. y Williams, L.T., Adv. Cancer Res. 60: 1, 1993). Muchos miembros de la familia de FGF también se unen fuertemente a heparina, y a un complejo ternario de heparina, FGF y receptor transmembrana puede ser la especie de señalización biológicamente relevante. Por tanto, hasta ahora se han identificado cuatro genes diferentes que codifican para receptores para miembros de la familia de FGF. El trabajo reciente ha mostrado que la diversidad de receptores aumenta mediante el corte y empalme de ARNm diferencial dentro del dominio de unión a ligandos extracelular, con el resultado de que múltiples isoformas de receptor con diferentes propiedades de unión a ligandos pueden estar codificadas por el mismo gen (Johnson, D.E. y Williams, L.T., Adv. Cancer Res. 60:1, 1993). En sistemas de cultivo tisular, la unión de FGFa o FGFb a su receptor de la superficie celular activa la fosfolipasa C-gamma (Burgess, W. H. et al., Mol. Cell Biol. 10: 4770, 1990), una ruta que se sabe que integra una variedad de señales mitogénicas. La identificación y caracterización de nuevos miembros de la familia de FGF proporcionará una idea los mecanismos mediante los cuales las células y órganos controlan su crecimiento, supervivencia, senescencia, diferenciación y recuperación de una lesión.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un factor de crecimiento, supervivencia y diferenciación celular, FHF-2, y una secuencia de polinucleótido que codifica el factor. Este factor está implicado en el crecimiento, la supervivencia y/o la diferenciación de células dentro del sistema nervioso central (SNC) y en el corazón.

La invención proporciona un método in vitro para detectar alteraciones en la expresión génica de FHF-2 que son diagnóstico de trastornos neurodegenerativos, neoplásicos o cardíacos. En otra realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un reactivo seleccionado de un anticuerpo anti-FHF-2 de la invención y una secuencia antisentido de FHF-2 de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra el nucleótido y secuencia de aminoácidos de human FHF-2 pronosticada.

La figura 2 muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos de FHF-2 humano y cada uno de los nueve miembros publicados de la familia de FGF. Están destacados los residuos conservados. Los miembros de la familia de FGF son: FGFa/FGF-1 (Jaye et al., Science 233: 541, 1986), FGFb/FGF-2 (Abraham et al., Science 233: 545, 1986), int-2/FGF-3 (Smith et al., EMBO J. 7: 1013, 1988), FGF-4 (Delli-Bovi et al., Cell 50: 729, 1987), FGF-5 (Zhan et al., Mol. Cell Biol. 8, 3487, 1988), FGF-6 (Marics et al., Oncogene 4: 335, 1989); factor de crecimiento de queratinocitos/FGF-7 (Finch et al., Science 245: 752, 1989), FGF-8 (Tanaka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8928, 1992), y FGF-9 (Miyamoto et al., Mol. Cell Biol. 13: 4251, 1993).

La figura 3 muestra un dendograma en el que la longitud de cada ruta que conecta cualquier par de miembros de la familia de FGF es proporcional al grado de divergencia de la secuencia de aminoácidos de ese par.

La figura 4 muestra la ubicación del gen que codifica FHF-2 en el cromosoma X humano. Se preparó una inmunotransferencia de tipo Southern a partir de ADN derivado de líneas celulares híbridas de ratón-ser humano o hámster-ser humano, que contiene cada una un único cromosoma humano, indicado sobre cada carril. La hibridación específica humana se encuentra en el cromosoma X.

La figura 5 muestra la producción de FHF-2 en células renales embrionarias humanas transfectadas. Se marcaron las proteínas de manera biosintética con ^{35}S-metionina y se resolvieron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Carriles 1, 3, 5 y 7: proteína celular total; carriles 2, 4, 6 y 8: proteína presente en el medio (proteína secretada). Carriles 1 y 2, células transfectadas de manera simulada; carriles 3 y 4, transfección con ADNc que codifica FHF-1, un miembro estrechamente relacionado de la familia de FGF; carriles 5 y 6, transfección con ADNc que codifica FHF-2; carriles 7 y 8, transfección con ADNc que codifica la hormona del crecimiento humana. Las flechas indican las bandas de proteína de FHF-1 y FHF-2. Los patrones de proteína se muestran a la izquierda; de arriba a bajo sus masas moleculares son 220, 97, 66, 46, 30, 21,5 y 14,3 kD.

La figura 6 muestra la especificidad de tejido de la expresión de FHF-2. Se prepararon diez microgramos de ARN total a partir de los tejidos de ratón indicados (Chomczinski & Sacchi. Anal. Biochem. 162: 156, 1987) y se usaron para la protección de ARNasa (Ausabel et al., Current Protocols in Molecular Biology; Nueva York: Wiley Interscience, 1987) con una sonda antisentido de FHF-2 de ratón que abarcaba 197 bases del exón de la región codificante más en 3' y las 335 bases adyacentes en sentido 5' de la secuencia de intrón. La protección de ARNasa en el tamaño esperado para la región de exón de 197 bases de la sonda (puntas de flecha) se observó con ARN del cerebro, ojo y corazón. Una mayor exposición revela bandas apenas visibles en todos los demás tejidos pero no en la muestra control de ARNt.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un factor de crecimiento, FHF-2, y una secuencia de polinucleótido que codifica FHF-2. FHF-2 se expresa a altos niveles en los tejidos cerebral y cardíaco. En una realización, la invención proporciona un método in vitro para la detección de un trastorno de proliferación celular o inmunológico con origen en el sistema nervioso central o tejido cardíaco que está asociado con la expresión o función de FHF-2. En otra realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un reactivo seleccionado de un anticuerpo anti-FHF-2 de la invención y una secuencia antisentido de FHF-2 de la invención.

La homología estructural entre la proteína FHF-2 de esta invención y los miembros de la familia de FGF, indica que FHF-2 es un nuevo miembro de la familia de factores de crecimiento. Basándose en las actividades conocidas de muchos de los otros miembros, puede esperarse que FHF-2 también presentará actividades biológicas que lo hará útil como reactivo de diagnóstico y terapéutico.

Muchos factores de crecimiento tienen patrones de expresión o presentan actividades que se relacionan con la función del sistema nervioso. Por ejemplo, un factor de crecimiento en la familia de TGF, concretamente GDNF, ha demostrado ser un potente factor neurotrófico que puede estimular la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas (Lin, et al., Science, 260:1130). Otro miembro de la familia, concretamente dorsalina 1, puede estimular la diferenciación de células de la cresta neural (Basler, et al., Cell, 73:687, 1993). Se ha demostrado que las inhibinas y activinas se expresan en el cerebro (Meunier, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA, 85:247, 1988; Sawchenko, et al., Nature, 334:615, 1988), y se ha demostrado que la activina puede funcionar como una molécula de supervivencia de las células nerviosas (Schubert, et al., Nature, 344:868, 1990). Otro miembro de la familia de TGF, concretamente GDF-1, es específico del sistema nervioso en su patrón de expresión (Lee, Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA, 88:4250, 1991), y también se sabe que otros miembros determinados de la familia, tales como Vgr-1 (Lyons, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci, USA, 86:4554, 1989; Jones, et al., Development, 111:581, 1991), OP-1 (Ozkaynak, et al., J. Biol. Chem., 267:25220; 1992) y BMP-4 (Jones, et al., Development, 111: 531, 1991), se expresan en el sistema nervioso.

La expresión de FHF-2 en el cerebro y los ojos sugiere que FHF-2 también puede presentar actividades que se relacionan con la función del sistema nervioso. Las actividades neurotróficas conocidas de otros miembros de esta familia y la expresión de FHF-2 en el músculo sugieren que una actividad de FHF-2 puede ser como factor trófico para neuronas motoras. Alternativamente, FHF-2 puede tener actividades neurotróficas para otras poblaciones neuronales. Así, FHF-2 puede tener aplicaciones in vitro e in vivo en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, tales como esclerosis lateral amiotrófica, o en el mantenimiento de células o tejidos en cultivo antes de su trasplante.

También se ha demostrado que los factores de crecimiento inhiben la diferenciación de mioblastos en cultivo (Massague, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83:8206, 1986). Además, dado que pueden usarse células de mioblasto como vehículo para la inserción de genes en músculo para la terapia génica, las propiedades de FHF-2, concretamente la expresión elevada en tejido cardíaco (es decir, músculo), podría aprovecharse para mantener células antes de su trasplante o para potenciar la eficacia del proceso de fusión.

En una primera realización, la invención proporciona factor 2 homólogo al factor de crecimiento de fibroblastos (FHF-2) sustancialmente puro caracterizado por tener un peso molecular de aproximadamente 30 kD tal como se determina mediante SDS-PAGE reductora y por tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2. La expresión "sustancialmente puro" tal como se usa en el presente documento se refiere a FHF-2 que está sustancialmente libre de otras proteínas, lípidos, hidratos de carbono u otros materiales con los que está asociado de manera natural. Un experto en la técnica puede purificar FHP-2 usando técnicas habituales para la purificación de proteínas. El polipéptido sustancialmente puro producirá una única banda principal en un gel de poliacrilamida no reductor. También puede determinarse la pureza del polipéptido de FHF-2 mediante el análisis de la secuencia de aminoácidos amino-terminal. El polipéptido de FHF-2 incluye fragmentos funcionales del polipéptido, siempre que permanezca la actividad de FHF-2. Péptidos más pequeños que contienen la actividad biológica de FHF-2 están incluidos en la
invención.

La invención proporciona polinucleótidos que codifican para la proteína FHF-2. Estos polinucleótidos incluyen secuencias de ADN, ADNc y ARN que codifican para FHF-2. Se entiende que todos los polinucleótidos que codifican para la totalidad o una parte de FHF-2 también están incluidos en el presente documento, siempre que codifiquen para un polipéptido con actividad de FHF-2. Tales polinucleótidos incluyen polinucleótidos que se producen de manera natural, sintéticos y manipulados intencionadamente. Por ejemplo, el polinucleótido de FHF-2 puede someterse a mutagénesis dirigida al sitio. La secuencia del polinucleótido para FHF-2 también incluye secuencias antisentido. Los polinucleótidos de la invención incluyen secuencias que son degeneradas como resultado del código genético. Existen 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales están especificados por más de un codón. Por tanto, todas las secuencias de nucleótidos degeneradas están incluidas en la invención siempre que la secuencia de aminoácidos del polipéptido de FHF-2 codificado por la secuencia de nucleótidos esté funcionalmente inalterada.

Se da a conocer específicamente en el presente documento una secuencia de ADN que codifica el gen de FHF-2 humano. La secuencia contiene un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de 245 aminoácidos de longitud. El codón de metionina iniciador de FHF-2 humano mostrado en la figura 1 en la posición 352-354 corresponde a la ubicación del codón de metionina iniciador de otro miembro de la familia de FGF, FHF-1, cuando se alinean las dos secuencias; se encuentra un buen sitio de unión al ribosoma consenso (TGGCCATGG; Kozak, Nucleic Acids Res., 15: 8125, 1987) en esta posición. El siguiente codón de metionina dentro del marco de lectura abierto se encuentra a 124 codones en 3' del supuesto codón de metionina iniciador. Tal como se observa para FGFa y FGFb, el extremo amino-terminal del producto de traducción primaria de FHF-2 no se ajusta a la secuencia consenso para un péptido señal para dirigir la inserción cotraduccional a través de la membrana del retículo endoplasmático. La secuencia de FHF-2 tiene un posible sitio asn-X-ser/thr para la glicosilación unida a asparagina a cuatro aminoácidos del extremo carboxi-terminal. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos de FHF-2 humano es SEQ ID NO:1 y la secuencia de aminoácidos deducida es probablemente SEQ ID NO:2.

El polinucleótido que codifica FHF-2 incluye SEQ ID NO:1 así como secuencias de ácido nucleico complementarias a SEQ ID NO:1. Una secuencia complementaria puede incluir un nucleótido antisentido. Cuando la secuencia es ARN, los desoxinucleótidos A, G, C y T de SEQ ID NO:1 se sustituyen por los ribonucleótidos A, G, C y U, respectivamente. También están incluidos en la invención fragmentos de las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente que son al menos de 15 bases de longitud, que es suficiente para permitir que el fragmento se hibride selectivamente en condiciones rigurosas con ADN que codifica la proteína de SEQ ID NO:2 en condiciones fisiológicas.

El miembro de la familia de FGF más homólogo es FGF-9, que comparte una identidad de aminoácidos del 28% con FHF-2, cuando se alinea con 6 huecos. Modificaciones menores de la secuencia de aminoácidos primaria de FHF-2 pueden dar como resultado proteínas, según se definen en las reivindicaciones, que tienen una actividad equivalente en comparación con el polipéptido de FHF-2 descrito en el presente documento. Tales modificaciones pueden ser deliberadas, como la mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser espontáneas. Todos los polipéptidos producidos mediante estas modificaciones están incluidos en el presente documento siempre que la actividad biológica de FHF-2 todavía exista. Además, la deleción de uno o más aminoácidos puede dar como resultado una modificación de la estructura de la molécula resultante sin alterar significativamente su actividad biológica. Esto puede conducir al desarrollo de una molécula activa más pequeña que tendría una utilidad más amplia. Por ejemplo, pueden eliminarse aminoácidos amino o carboxi-terminales que no se requieren para la actividad biológica de FHF-2.

La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de FHF-2 de la invención incluye la secuencia dada a conocer (SEQ ID NO:2), y variaciones conservativas de la misma, en las que el polipéptido que tiene variaciones conservativas tiene la actividad biológica del polipéptido de SEQ ID NO:2. La expresión "variación conservativa" tal como se usa en el presente documento indica el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar. Los ejemplos de variaciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo hidrófobo tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la sustitución de un residuo polar por otro, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por aspártico, o glutamina por asparagina, y similares. La expresión "variación conservativa" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido original no sustituido siempre que los anticuerpos producidos contra el polipéptido sustituido también inmunorreaccionen con el polipéptido no sustituido.

Las secuencias de ADN de la invención pueden obtenerse mediante varios métodos. Por ejemplo, el ADN puede aislarse usando técnicas de hibridación que se conocen bien en la técnica. Éstas incluyen, pero no se limitan a: 1) hibridación de bibliotecas de ADNc o genómico con sondas para detectar secuencias de nucleótidos homólogas, 2) reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con ADN genómico o ADNc usando cebadores que pueden hibridarse con la secuencia de ADN de interés, y 3) la selección de anticuerpos a partir de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas.

Preferiblemente, el polinucleótido de FHF-2 de la invención se deriva de un organismo mamífero, y lo más preferiblemente de ser humano. Los procedimientos de selección que se basan en la hibridación de ácidos nucleicos hacen posible aislar cualquier secuencia génica de cualquier organismo, siempre que esté disponible la sonda apropiada. Pueden sintetizarse químicamente sondas de oligonucleótido, que corresponden a una parte de la secuencia que codifica la proteína en cuestión. Esto requiere que han de conocerse tramos cortos de oligopéptido de la secuencia de aminoácidos. La secuencia de ADN que codifica la proteína puede deducirse a partir del código genético, sin embargo, debe tenerse en cuenta la degeneración del código. Es posible realizar una reacción de adición mixta cuando la secuencia es degenerada. Esto incluye una mezcla heterogénea de ADN bicatenario desnaturalizado. Para tal selección, se realiza preferiblemente la hibridación con ADN o bien monocatenario o bien bicatenario desnaturalizado. La hibridación es particularmente útil en la detección de clones de ADNc derivados de fuentes en las que está presente una cantidad extremadamente baja de secuencias de ARNm relativas al polipéptido de interés. En otras palabras, usando condiciones hibridación rigurosas dirigidas a evitar la unión no específica, es posible, por ejemplo, permitir la visualización autorradiográfica de un clon de ADNc específico mediante la hibridación del ADN diana con aquella sonda individual en la mezcla que es su complemento completo (Wallace, et al., Nucl. Acid Res., 9:879, 1981; Maniatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989).

El desarrollo de secuencias de ADN específicas que codifican para FHF-2 también puede obtenerse mediante: 1) aislamiento de secuencias de ADN bicatenarias a partir del ADN genómico; 2) fabricación química de una secuencia de ADN para proporcionar los codones necesarios para el polipéptido de interés; y 3) síntesis in vitro de una secuencia de ADN bicatenario mediante transcripción inversa de ARNm aislado de una célula donante eucariota. En este último caso, finalmente se forma un complemento de ADN bicatenario de ARNm que se denomina generalmente como ADNc.

De los tres métodos indicados anteriormente para el desarrollo de secuencias de ADN específicas para su uso en procedimientos recombinantes, el aislamiento de aislados de ADN genómico es el menos común. Esto es especialmente cierto cuando es deseable obtener la expresión microbiana de polipéptidos de mamíferos debido a la presencia de intrones.

La síntesis de secuencias de ADN es frecuentemente el método de elección cuando se conoce la secuencia de residuos de aminoácido completa del producto de polipéptido deseado. Cuando no se conoce la secuencia de residuos de aminoácido completa del producto de polipéptido deseado, la síntesis directa de secuencias de ADN no es posible y el método de elección es la síntesis de secuencias de ADNc. Entre los procedimientos habituales para aislar secuencias de ADNc de interés está la formación de bibliotecas de ADNc que portan plásmido o fago que se derivan de la transcripción inversa de ARNm que es abundante en células donantes que tienen un alto nivel de expresión genética. Cuando se usan en combinación con la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa, pueden clonarse incluso productos de expresión poco frecuentes. En aquellos casos en los que se conocen partes significativas de la secuencia de aminoácidos del polipéptido, puede emplearse la producción de secuencias de sondas de ADN o ARN mono o bicatenarios marcadas que duplican una secuencia presente supuestamente en el ADNc diana en procedimientos de hibridación de ADN/ADN que se llevan a cabo en copias clonadas del ADNc que se ha desnaturalizado en una forma monocatenaria (Jay, et al., Nucl. Acid Res., 11:2325, 1983).

Puede seleccionarse indirectamente una biblioteca de expresión de ADNc, tal como lambda gt11, para determinar péptidos de FHF-2 que tienen al menos un epítopo, usando anticuerpos específicos para FHF-2. Tales anticuerpos pueden derivarse o bien de manera policlonal o bien de manera monoclonal y usarse para detectar el producto de expresión indicativo de la presencia de ADNc de FHF-2.

Pueden expresarse secuencias de ADN que codifican para FHF-2 in vitro mediante transferencia de ADN a una célula huésped adecuada. "Células huésped" son células en las que puede propagarse un vector y expresarse su ADN. La expresión también incluye cualquier progenie de la célula huésped del sujeto. Se entiende que toda la progenie puede no ser idéntica a la célula parental puesto que pueden producirse mutaciones durante la replicación. Sin embargo, tal progenie está incluida cuando se usa la expresión "célula huésped". Se conocen en la técnica métodos de transferencia estable, lo que significa que el ADN foráneo se mantiene de manera continua en el huésped.

En la presente invención, las secuencias de polinucleótidos de FHF-2 pueden insertarse en un vector de expresión recombinante. La expresión "vector de expresión recombinante" se refiere a un plásmido, virus u otro vehículo conocido en la técnica que se ha manipulado mediante inserción o incorporación de las secuencias genéticas de FHF-2. Tales vectores de expresión contienen una secuencia promotora que facilita la transcripción eficaz de la secuencia genética insertada del huésped. El vector de expresión normalmente contiene un origen de replicación, un promotor, así como genes específicos que permiten la selección fenotípica de las células transformadas. Los vectores adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan al vector de expresión basado en T7 para la expresión en bacterias (Rosenberg, et al., Gene, 56:125. 1987), el vector de expresión pMSXND para la expresión en células de mamífero (Lee y Nathans, J. Biol. Chem., 263:3521, 1988) y vectores derivados de baculovirus para la expresión en células de insecto. El segmento de ADN puede estar presente en el vector unido operativamente a elementos reguladores, por ejemplo, un promotor (por ejemplo, promotores de T7, metalotioneína I o polihedrina).

Pueden expresarse secuencias de polinucleótido que codifican para FHF-2 o bien en procariotas o bien en eucariotas. Los huéspedes pueden incluir organismos microbianos, levaduras, insectos o mamíferos. Se conocen bien en la técnica métodos de expresión de secuencias de ADN que tienen secuencias víricas o de eucariotas en procariotas. Se conocen en la técnica vectores de ADN de plásmido y virus biológicamente funcionales que pueden dar expresión y replicación en un huésped. Tales vectores se usan para incorporar secuencias de ADN de la invención.

Puede llevarse a cabo la transformación de una célula huésped con ADN recombinante mediante técnicas convencionales que se conocen bien por los expertos en la técnica. Cuando el huésped es procariota, tal como E. coli, pueden prepararse células competentes que pueden producir captación de ADN, a partir células recogidas tras el crecimiento en fase exponencial y posteriormente tratarse mediante el método de CaCl_{2} usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Alternativamente, pueden usarse MgCl_{2} o RbCl. También puede realizarse la transformación tras formar un protoplasto de la célula huésped, si se desea.

Cuando el huésped es eucariota, pueden usarse métodos de transfección de ADN tales como coprecipitados con fosfato de calcio, procedimientos mecánicos convencionales tales como microinyección, electroporación, inserción de un plásmido encapsulado en liposomas, o vectores virales. También pueden cotransformarse células eucariotas con secuencias de ADN que codifican para el FHF-2 de la invención, y una segunda molécula de ADN foráneo que codifica un fenotipo seleccionable, tal como el gen de la timidina cinasa del herpes simple. Otro método es usar un vector viral eucariota, tal como el virus del simio 40 (SV40) o el virus del papiloma bovino, para transformar o infectar de manera transitoria células eucariotas y expresar la proteína. (véase por ejemplo, Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982).

El aislamiento y la purificación del polipéptido expresado microbiano, o fragmentos del mismo, proporcionado por la invención, pueden llevarse a cabo mediante medios convencionales que incluyen cromatografía preparativa y separaciones inmunológicas que implican anticuerpos monoclonales o policlonales.

Los polipéptidos de FHF-2 de la invención también pueden usarse para producir anticuerpos que se unen específicamente a epítopos de los polipéptidos de FHF-2. Se proporciona un anticuerpo que consiste esencialmente en anticuerpos monoclonales agrupados con diferentes especificidades epitópicas, así como distintas preparaciones de anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de fragmentos que contienen antígeno de la proteína mediante métodos bien conocidos en la técnica (Kohler, et al., Nature, 256:495, 1.975; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., ed., 1989).

El término "anticuerpo" tal como se usa en esta invención incluye moléculas intactas así como fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab')_{2} y Fv que pueden unirse al determinante epitópico. Estos fragmentos de anticuerpo retienen cierta capacidad para unirse selectivamente con su antígeno o receptor y se definen tal como sigue:

(1) Fab, el fragmento que contiene un fragmento de unión a antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo puede producirse mediante digestión del anticuerpo completo con la enzima papaína para producir una cadena ligera intacta y una parte de una cadena pesada;

(2) Fab', el fragmento de una molécula de anticuerpo puede obtenerse tratando el anticuerpo completo con pepsina, seguido por reducción, para producir una cadena ligera intacta y una parte de la cadena pesada; se obtienen dos fragmentos Fab' por molécula de anticuerpo;

(3) (Fab')_{2}, el fragmento del anticuerpo que puede obtenerse tratando el anticuerpo completo con la enzima pepsina sin posterior reducción; F(ab')_{2} es un dímero de dos fragmentos Fab' mantenidos juntos mediante dos enlaces disulfuro;

(4) Fv, definido como fragmento modificado mediante ingeniería genética que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada expresada como dos cadenas; y

(5) Anticuerpo de cadena sencilla ("SCA"), definido como una molécula modificada mediante ingeniería genética que contiene la región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena pesada, unidas mediante un ligador de polipéptido adecuado como una molécula de cadena sencilla fusionada genéticamente.

Se conocen en la técnica métodos de preparación de estos fragmentos. (véase por ejemplo, Harlow y Carril, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1988), incorporado en el presente documento como referencia).

Tal como se usa en esta invención, el término "epítopo" significa cualquier determinante antigénico en un antígeno al que se une el paratopo de un anticuerpo. Los determinantes antigénicos normalmente consisten en agrupaciones de moléculas químicamente tensioactivas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.

Pueden prepararse anticuerpos que se unen al polipéptido de FHF-2 de la invención usando un polipéptido intacto o fragmentos que contienen pequeños péptidos de interés como el antígeno de inmunización. El polipéptido o un péptido usado para inmunizar un animal puede derivarse de ADNc traducido (véase por ejemplo, el ejemplo 4) o síntesis química que puede conjugarse con una proteína de soporte, si se desea. Tales soportes usados comúnmente que se acoplan químicamente con el péptido incluyen hemocianina de lapa californiana (KLH), tiroglobulina, albúmina sérica bovina (BSA), y toxoide tetánico. El péptido acoplado se usa entonces para inmunizar el animal (por ejemplo, un ratón, una rata o un conejo).

Si se desea, pueden purificarse adicionalmente los anticuerpos policlonales o monoclonales, por ejemplo, mediante unión a y elución de una matriz a la que se une el polipéptido o un péptido contra el que se producen los anticuerpos. Los expertos en la técnica conocerán diversas técnicas comunes en las técnicas inmunológicas para la purificación y/o concentración de anticuerpos policlonales, así como anticuerpos monoclonales (véase por ejemplo, Coligan, et al., Unidad 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1994, incorporado como referencia).

También es posible usa la tecnología de anti-idiotipos para producir anticuerpos monoclonales que imitan un epítopo. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-idiotípico producido con un primer anticuerpo monoclonal tendrá un dominio de unión en la región hipervariable que es la "imagen" del epítopo unido por el primer anticuerpo monoclonal.

La expresión "trastorno de proliferación celular" indica poblaciones de células malignas así como no malignas que a menudo parecen diferir del tejido circundante tanto morfológica como genotípicamente. Las células malignas (es decir, cáncer) se desarrollan como resultado de un proceso de múltiples etapas. El polinucleótido de FHF-2 que es una molécula antisentido es útil en el tratamiento de tumores malignos de los diversos sistemas de órganos, particularmente, por ejemplo, células en el sistema nervioso central, que incluyen tejido neural, corazón y células de los ojos. Esencialmente, cualquier trastorno que está relacionado etiológicamente con la expresión alterada de FHF-2 podría considerarse susceptible de tratamiento con un reactivo supresor de FHF-2. Un trastorno de este tipo es un trastorno de proliferación de células malignas, por ejemplo.

Para los fines de la invención, puede usarse un anticuerpo o sonda de ácido nucleico específica para FHF-2 para detectar el polipéptido de FHF-2 (usando el anticuerpo) o el polinucleótido (usando la sonda de ácido nucleico) en tejidos o fluidos biológicos. La invención proporciona un método in vitro para detectar un trastorno de proliferación celular de tejido cardíaco o tejido neural, por ejemplo, que comprende poner en contacto un anticuerpo anti-FHF-2 o sonda de ácido nucleico con una célula que se sospecha que tiene un trastorno asociado con FHF-2 y detectar la unión de un antígeno de FHF-2 o ARNm al anticuerpo o sonda de ácido nucleico, respectivamente. El anticuerpo o sonda de ácido nucleico reactivo con FHF-2 se marca preferiblemente con un compuesto que permite la detección de la unión a FHF-2. Puede usarse cualquier muestra que contenga una cantidad detectable de antígeno. Una muestra preferida de esta invención es tejido neural o tejido cardíaco. Puede compararse el nivel de FHF-2 en la célula de la que se sospecha con el nivel en una célula normal para determinar si el sujeto tiene un trastorno de proliferación celular asociado con FHF-2. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano.

Cuando el componente celular es un ácido nucleico, puede ser necesario amplificar el ácido nucleico antes de la unión con una sonda específica de FHF-2. Preferiblemente, se usa la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), sin embargo, pueden usarse otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), transcripción activada ligada (LAT) y amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA).

Los anticuerpos de la invención pueden usarse en cualquier sujeto en el que se desea administrar in vitro o in vivo inmunodiagnóstico o inmunoterapia. Los anticuerpos de la invención son adecuados para su uso, por ejemplo, en inmunoensayos en los que pueden utilizarse en fase líquida o unidos a un soporte en fase sólida. Además, los anticuerpos en estos inmunoensayos pueden marcarse de manera detectable de diversas maneras. Son ejemplos de tipos de inmunoensayos que pueden utilizar anticuerpos de la invención los inmunoensayos competitivos y no competitivos en un formato o bien directo o bien indirecto. Son ejemplos de tales inmunoensayos el radioinmunoensayo (RIA) y el ensayo intercalado (inmunométrico). Puede realizarse la detección de los antígenos usando los anticuerpos de la invención utilizando inmunoensayos que se ejecutan en cualquiera de los modos directo, inverso o simultáneo, incluyendo ensayos inmunohistoquímicos en muestras fisiológicas. Los expertos en la técnica sabrán, o podrán discernir fácilmente, otros formatos de inmunoensayo sin excesiva experimentación.

Los anticuerpos de la invención pueden unirse a muchos soportes diferentes y usarse para detectar la presencia de un antígeno que comprende el polipéptido de la invención. Los ejemplos de soportes bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, amilasas, celulasas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del soporte puede ser o bien soluble o bien insoluble para los fines de la invención. Los expertos en la técnica conocerán otros soportes adecuados para la unión de anticuerpos, o podrán determinarlos, usando experimentación rutinaria.

Existen muchos marcadores y métodos de marcado diferentes conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos de los tipos de marcadores que pueden usarse en la presente invención incluyen enzimas, radioisótopos, compuestos fluorescentes, metales coloidales, compuestos quimioluminiscentes, compuestos fosforescentes y compuestos bioluminiscentes. Los expertos en la técnica conocerán otros marcadores adecuados para la unión al anticuerpo; o podrán determinarlos, usando experimentación rutinaria.

Otra técnica que también puede dar como resultado una mayor sensibilidad consiste en acoplar los anticuerpos a haptenos de bajo peso molecular. Estos haptenos pueden detectarse entonces específicamente por medio de una segunda reacción. Por ejemplo, es común utilizar haptenos tales como biotina, que reacciona con avidina, o dinitrofenilo, puridoxal y fluoresceína, que pueden reaccionar con anticuerpos anti-hapteno específicos.

También se describe en el presente documento el uso de los anticuerpos monoclonales de la invención para la detección in vivo de antígenos. El anticuerpo marcado de manera detectable se administra como una dosis que es eficaz para diagnóstico. La expresión "eficaz para diagnóstico" significa que la cantidad de anticuerpo monoclonal marcado de manera detectable se administra en cantidad suficiente para permitir la detección del sitio que tiene el antígeno que comprende un polipéptido de la invención para el que son específicos los anticuerpos monoclonales.

La concentración de anticuerpo monoclonal marcado de manera detectable que se administra debe ser suficiente de manera que la unión a aquellas células que tienen el polipéptido sea detectable en comparación con el fondo. Además, es deseable que el anticuerpo monoclonal marcado de manera detectable se elimine rápidamente del sistema circulatorio con el fin de proporcionar la mejor razón de señal de diana con respecto al fondo.

Como norma, la dosificación de anticuerpo monoclonal marcado de manera detectable para el diagnóstico in vivo variará dependiendo de factores tales como la edad, el sexo y la extensión de la enfermedad en el individuo. Tales dosificaciones pueden variar, por ejemplo, dependiendo de si se administran múltiples inyecciones, la carga antigénica y otros factores conocidos por los expertos en la técnica.

Para la obtención de imágenes para diagnóstico in vivo, el tipo de instrumento de detección disponible es un factor importante en la selección de un radioisótopo dado. El radioisótopo elegido debe tener un tipo de desintegración que sea detectable para un tipo dado de instrumento. Todavía otro factor importante en la selección de un radioisótopo para el diagnóstico in vivo es que se minimice la radiación perjudicial con respecto al huésped. De manera ideal, un radioisótopo usado para la obtención de imágenes in vivo carecerá de emisión de partículas, pero producirá una gran cantidad de fotones en el intervalo de 140-250 keV, que puede detectarse fácilmente mediante cámaras gamma convencionales.

Para el diagnóstico in vivo, pueden unirse los radioisótopos a inmunoglobulina o bien directa o bien indirectamente usando un grupo funcional intermedio. Grupos funcionales intermedios que se usan a menudo para unir radioisótopos que existen como iones metálicos a inmunoglobulinas son agentes quelantes bifuncionales tales como ácido dietilentriaminopentacético (DTPA) y ácido etilendiaminotetraaacético (EDTA) y moléculas similares. Ejemplos típicos de iones metálicos que pueden unirse a los anticuerpos monoclonales de la invención son ^{111}In, ^{97}Ru, ^{67}Ga, ^{68}Ga, ^{72}As, ^{89}Zr y ^{201}Tl.

Los anticuerpos monoclonales de la invención también pueden marcarse con un isótopo paramagnético para los fines de diagnóstico de in vivo, como en la obtención de imágenes mediante resonancia magnética (IRM) o resonancia de espín electrónico (ESR). En general, puede utilizarse cualquier método convencional para visualizar la obtención de imágenes para diagnóstico. Normalmente se usan radioisótopos que emiten positrones y radiación gamma para obtención de imágenes con cámara e isótopos paramagnéticos para IRM. Los elementos que son particularmente útiles en tales técnicas incluyen ^{157}Gd, ^{55}Mn, ^{162}Dy, ^{52}Cr y ^{56}Fe.

Los anticuerpos monoclonales o polinucleótidos de la invención pueden usarse in vitro e in vivo para monitorizar el transcurso de la mejora de una enfermedad asociada con FHF-2 en un sujeto. Por tanto, por ejemplo, midiendo el aumento o la disminución del número de células que expresan antígeno que comprende un polipéptido de la invención o cambios en la concentración de tal antígeno presente en diversos fluidos corporales, sería posible determinar si un régimen terapéutico particular destinado a mejorar la enfermedad asociada con FHF-2 es eficaz. El término "mejorar" indica una reducción del efecto perjudicial de la enfermedad asociada con FHF-2 en el sujeto que recibe la terapia.

La presente invención identifica una secuencia de nucleótidos que puede expresarse de manera alterada en comparación con la expresión en una célula normal, por tanto, es posible diseñar técnicas terapéuticas o de diagnóstico apropiadas dirigidas a esta secuencia. Se logra la detección de niveles elevados de expresión de FHF-2 mediante la hibridación de ácidos nucleicos aislados a partir de una célula que se sospecha que tiene un trastorno proliferativo asociado con FHF-2 con un polinucleótido de FHF-2 de la invención. Se utiliza análisis, tales como el análisis de inmunotransferencia de tipo Northern, para cuantificar la expresión de FHF-2. Los expertos en la técnica conocerán otras técnicas de detección de ácidos nucleicos habituales.

También se describe en el presente documento el tratamiento de un trastorno de proliferación celular asociado con FHF-2. El tratamiento incluye la modulación de la expresión del gen de FHF-2 y la actividad de FHF-2. El término "modular" prevé la supresión de la expresión de FHF-2 cuando está sobreexpresado, o el aumento de la expresión de FHF-2 cuando está subexpresado. Cuando un trastorno de proliferación celular está asociado con la expresión de FHF-2, pueden usarse secuencias de ácido nucleico que interfieren en la expresión de FHF-2 a nivel traduccional. Este enfoque utiliza, por ejemplo, ácido nucleico antisentido, ribozimas o agentes tríplex para bloquear la transcripción o traducción de un ARNm de FHF-2 específico, o bien enmascarando ese ARNm con un ácido nucleico antisentido o agente tríplex, o escindiéndolo con una ribozima. Tales trastornos incluyen enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo.

Los ácidos nucleicos antisentido son moléculas de ADN o ARN que son complementarias a al menos una parte de una molécula de ARNm específica (Weintraub, Scientific American, 262:40, 1990). En la célula, los ácidos nucleicos antisentido se hibridan con el correspondiente ARNm, formando una molécula bicatenaria. Los ácidos nucleicos antisentido interfieren en la traducción del ARNm, puesto que la célula no traducirá un ARNm que sea bicatenario. Se prefieren oligómeros antisentido de aproximadamente 15 nucleótidos, puesto que se sintetizan fácilmente y es menos probable que produzcan problemas que las moléculas más grandes cuando se introducen en la células productora de FHF-2 diana. El uso de métodos antisentido para inhibir la traducción in vitro de genes se conoce bien en la técnica (Marcus-Sakura, Anal.Biochem., 172:289, 1988).

El uso de un oligonucleótido para detener la transcripción se conoce como la estrategia del tríplex dado que el oligómero se enrolla alrededor del ADN de doble hélice, formando una hélice de tres hebras. Por tanto, estos compuestos tríplex pueden diseñarse para reconocer un sitio único en un gen seleccionado (Maher, et al., Antisense Res. and Dev., 1(3):227, 1991; Helene, C., Anticancer Drug Design, 6(6):569, 1991).

Las ribozimas son moléculas de ARN que tienen la capacidad para escindir específicamente otro ARN monocatenario de manera análoga a las endonucleasas de restricción de ADN. A través de la modificación de secuencias de nucleótidos que codifican para estos ARN, es posible modificar mediante ingeniería moléculas que reconocen secuencias de nucleótidos específicas en una molécula de ARN y escindirla (Cech, J.Amer.Med. Assn., 260:3030, 1988). Una ventaja importante de este enfoque es que, dado que son específicos de secuencia, sólo se inactivan ARNm con secuencias particulares.

Existen dos tipos básicos de ribozimas, concretamente, de tipo Tetrahymena (Hasselhoff, Nature, 334:585, 1988) y de tipo "cabeza de martillo". Las ribozimas de tipo Tetrahymena reconocen secuencias que tienen cuatro bases de longitud, mientras que las ribozimas de tipo "cabeza de martillo" reconocen secuencias de bases de 11-18 bases de longitud. Cuanto más larga es la secuencia de reconocimiento, mayor es la posibilidad de que la secuencia aparezca exclusivamente en la especia de ARNm diana. En consecuencia, las ribozimas de tipo cabeza de martillo son preferibles a las ribozimas de tipo Tetrahymena para inactivar una especie de ARNm específica y son preferibles las secuencias de reconocimiento de 18 bases a otras secuencias de reconocimiento más cortas.

También se describe en el presente documento una terapia génica para el tratamiento de trastornos de proliferación celular o inmunológicos que están mediados por la proteína FHF-2. Una terapia de este tipo conseguiría su efecto terapéutico mediante la introducción del polinucleótido antisentido de FHF-2 en células que tienen el trastorno proliferativo. Puede lograrse la inserción del polinucleótido de FHF-2 antisentido usando un vector de expresión recombinante tal como un virus quimérico o un sistema de dispersión coloidal. Se prefiere especialmente para la inserción terapéutica de secuencias antisentido el uso de liposomas dirigidos.

Los diversos vectores virales que pueden utilizarse para la terapia génica tal como se enseña en el presente documento incluyen adenovirus, herpesvirus, vaccinia, o, preferiblemente, un virus de ARN tal como un retrovirus. Preferiblemente, el vector retroviral es un derivado de un retrovirus murino o aviar. Los ejemplos de vectores retrovirales en los que puede insertarse un único gen foráneo incluyen, pero no se limitan a: virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV) y virus del sarcoma de Rous (RSV). Preferiblemente, cuando el sujeto es un ser humano, se utiliza un vector tal como el virus de la leucemia del gibón (GaLV). Varios vectores retrovirales adicionales pueden incorporar múltiples genes. Todos estos vectores pueden transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable de modo que puedan identificarse y generarse células transducidas. Mediante la inserción de una secuencia de FHF-2 de interés en el vector viral, junto con otro gen que codifica el ligando para un receptor en una célula diana específica, por ejemplo, el vector es ahora específico de la diana. Pueden hacerse específicos de diana vectores retrovirales uniendo, por ejemplo, un azúcar, un glicolípido o una proteína. La selección como diana preferida se logra usando un anticuerpo para dirigir el vector retroviral. Los expertos en la técnica conocerán, o podrán determinar fácilmente sin excesiva experimentación, secuencias de polinucleótido específicas que pueden insertarse en el genoma retroviral o unirse a una envuelta viral para permitir la inserción específica de la diana del vector retroviral que contiene el polinucleótido antisentido de
FHF-2.

Puesto que los retrovirus recombinantes son defectuosos, requieren asistencia con el fin de producir partículas de vector infecciosas. Puede proporcionarse esta asistencia, por ejemplo, usando líneas de células cooperadoras que contienen plásmidos que codifican para todos los genes estructurales del retrovirus bajo el control de secuencias reguladoras dentro del LTR. Estos plásmidos carecen de una secuencia de nucleótidos que permita que el mecanismo de empaquetamiento reconozca un transcrito de ARN para su encapsidación. Las líneas celulares cooperadoras que tienen deleciones de la señal de empaquetamiento incluyen, pero no se limitan a, \psi2, PA317 y PA12, por ejemplo. Estas líneas celulares producen viriones vacíos, puesto que no hay genoma empaquetado. Si se introduce un vector retroviral en tales células en el que la señal de empaquetamiento está intacta, pero se sustituyen los genes estructurales por otros genes de interés, el vector puede empaquetarse y se produce un virión de vector.

Alternativamente, NIH 3T3 u otras células de cultivo tisular pueden transfectarse directamente con plásmidos que codifican para los genes estructurales retrovirales gag, pol y env, mediante transfección con fosfato de calcio convencional. Estas células se transfectan con el plásmido vector que contiene los genes de interés. Las células resultantes liberan el vector retroviral en el medio de cultivo.

Otro sistema de administración dirigida para polinucleótidos antisentido FHF-2 es un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidales incluyen complejos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. El sistema coloidal preferido de esta invención es un liposoma. Los liposomas son vesículas de membrana artificiales que son útiles como vehículos de administración in vitro e in vivo. Se ha mostrado que vesículas unilamelares grandes (LUV), cuyo tamaño oscila desde 0,2-4,0 \mum pueden encapsular un porcentaje sustancial de un tampón acuoso que contiene macromoléculas grandes. Pueden encapsularse ARN, ADN y viriones intactos dentro del interior acuoso y administrarse a células en una forma biológicamente activa (Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6: 77, 1981). Además de células de mamífero, se han usado liposomas para administrar polinucleótidos en células vegetales, de levaduras y bacterianas. Para que un liposoma sea un vehículo de transferencia génica eficaz, deben estar presentes las siguientes características: (1) encapsulación de los genes de interés con alta eficacia al tiempo que no se compromete su actividad biológica; (2) unión preferible y sustancial a una célula diana en comparación con células no diana; (3) administración del contenido acuoso de la vesícula al citoplasma de la célula diana con alta eficacia; y (4) expresión precisa y eficaz de la información genética (Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988).

La composición del liposoma es normalmente una combinación de fosfolípidos, particularmente fosfolípidos de alta temperatura de transición de fase fosfolípidos, habitualmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. También pueden usarse otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de liposomas dependen del pH, la concentración iónica y la presencia de cationes divalentes.

Ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposoma incluyen compuestos de fosfatidilo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos. Son particularmente útiles los diacilfosfatidilgliceroles, en los que el resto lípido contiene desde 14-18 átomos de carbono, particularmente desde 16-18 átomos de carbono, y está saturado. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y diestearoilfosfatidilcolina.

El direccionamiento de liposomas puede clasificarse basándose en factores anatómicos y mecanísticos. La clasificación anatómica se basa en el nivel de selectividad, por ejemplo, específica de órgano, específica de célula y específica de orgánulo. El direccionamiento mecanístico puede distinguirse basándose en si es pasivo o activo. El direccionamiento pasivo utiliza la tendencia natural de los liposomas para distribuirse en células del sistema reticuloendotelial (RES) en órganos que contienen capilares sinusoidales. Por otra parte, el direccionamiento activo implica la alteración del liposoma mediante acoplamiento del liposoma con un ligando específico tal como un anticuerpo monoclonal, azúcar, glucolípido o proteína, o cambiando la composición o el tamaño del liposoma con el fin de lograr el direccionamiento a órganos y tipos de célula distintos de los sitios de localización que se producen de manera natural.

La superficie del sistema de administración dirigida puede modificarse de una variedad de formas. En el caso de un sistema de administración dirigida liposomal, pueden incorporarse grupos lipídicos en la bicapa lipídica del liposoma con el fin de mantener el ligando de direccionamiento en asociación estable con la bicapa liposomal. Pueden usarse diversos grupos ligadores para unir las cadenas de lípido con el ligando de direccionamiento.

Debido a la expresión de FHF-2 en el tejido cardíaco, ocular y cerebral, o neural, hay una variedad de aplicaciones que utilizan el polipéptido, polinucleótido y anticuerpos de la invención, relacionadas con estos tejidos. Tales aplicaciones incluyen el tratamiento de trastornos inmunológicos y de proliferación celular que implican estos y otros tejidos. Además, FHF-2 puede ser útil en diversos procedimientos de terapia génica.

La identificación de un miembro novedoso de la familia de FGF proporciona una herramienta útil para estrategias de diagnóstico, pronóstico y terapéuticas asociadas con trastornos mediados por FHF-2. La medición de los niveles de FHF-2 usando anticuerpos anti-FHF-2 es útil para el diagnóstico tras la progresión o recuperación de enfermedades del sistema nervioso, incluyendo: cáncer, accidente cerebrovascular, enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Parkinson o enfermedad de Alzheimer, enfermedades retinales tales como retinitis pigmentosa, o encefalitis viral. La presencia de altos niveles de FHF-2 en el sistema nervioso central sugiere que el bajo nivel observado de FHF-2 en varios tejidos periféricos podría reflejar FHF-2 en nervio periférico, y por tanto la medición de los niveles de FHF-2 usando anticuerpos anti-FHF-2 podría ser diagnóstico para la neuropatía periférica. La presencia de altos niveles de FHF-2 en el corazón sugiere que la medición de los niveles de FHF-2 usando anticuerpos anti-FHF-2 es útil como diagnóstico para el infarto de miocardio, endocarditis viral u otros trastornos cardíacos.

Como otros miembros de la familia de FGF, FHF-2 tiene probablemente actividad mitogénica y/o de supervivencia celular, por tanto podría usarse FHF-2 o un análogo que imite la acción de FHF-2 para estimular la reparación o sustitución de tejidos. La presencia de FHF-2 en el SNC sugiere un papel terapéutico de este tipo en enfermedades del sistema nervioso central, incluyendo: accidente cerebrovascular, enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Parkinson o enfermedad de Alzheimer, o en enfermedades degenerativas retinales tales como retinitis pigmentosa o degeneración macular, o en neuropatías periféricas. La presencia de altos niveles de FHF-2 en el corazón sugiere que podría usarse FHF-2 o un análogo de FHF-2 para acelerar la recuperación del infarto de miocardio o podría estimular un aumento del gasto cardíaco aumentando el músculo cardíaco. A la inversa, el bloqueo de la acción de FHF-2 o bien con anticuerpos anti-FHF-2 o bien con un antagonista de FHF-2 podría ralentizar o mejorar enfermedades en las que el exceso de crecimiento celular es patológico, de la manera más obvia el cáncer.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar pero no limitar la invención. Aunque son típicos de los que podrían usarse, alternativamente podrían usarse otros procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.

Ejemplo 1 Aislamiento de FHF-2, un miembro novedoso de la familia de FGF

Para identificar productos génicos novedosos expresados en la retina humana, se secuenciaron parcialmente segmentos al azar de clones de ADNc de retina humana, y se compararon las secuencias parciales resultantes con las secuencias disponibles en las bases de datos públicas.

En detalle, se amplificó una biblioteca de ADNc de retina humana adulta en lambda gt10 (Nathans, et al., Science, 232: 193, 1986), y se cortaron en masa los insertos de ADNc mediante escisión con EcoR I y se liberaron del vector mediante purificación mediante electroforesis en gel de agarosa. Tras la desnaturalización por calor de los insertos de ADNc purificados, se usó un oligonucleótido sintético que contenía un sitio EcoR I en su extremo 5' y seis nucleótidos al azar en su extremo 3' (5' GACGAGATATTAGAATTCTACTCGNNNNNN) (SEQ ID NO: 3) para cebar dos rondas secuenciales de síntesis de ADN en presencia del fragmento Klenow de la ADN polimerasa de E. coli. Se amplificaron las moléculas dúplex resultantes usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con un cebador que correspondía a la secuencia flanqueante en 5' única (5' CCCCCCCCCGACGAGATATTAGAATTCTACTCG) (SEQ ID NO: 4). Estos productos de PCR, que representan una toma de muestras al azar de los insertos de ADNc originales, se escindieron con EcoR I, se fraccionaron por tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa preparativa para que incluyesen sólo segmentos de aproximadamente 500 pb en longitud y se clonaron en lambda gt10. Se presentaron tres mil placas únicas de esta biblioteca de derivados en bandejas de 86 pocillos y de estos clones se amplificaron los insertos mediante PCR usando cebadores de vector flanqueantes y luego se secuenciaron usando el método de didesoxi y detección fluorescente automatizada (Applied Biosystems). Se tradujo conceptualmente una única ejecución de secuenciación de un extremo de cada inserto en ambas hebras en los tres marcos de lectura y se usaron las seis secuencias de aminoácidos resultantes para buscar homología en la base de datos de proteínas no redundante GenBank usando el algoritmo de búsqueda BLASTX.

Se encontró que una secuencia de ADNc parcial mostraba homología estadísticamente significativa con miembros descritos previamente de la familia de FGF. Usando este ADNc parcial como sonda, se aislaron múltiples clones de ADNc independientes a partir de la biblioteca de ADNc de retina humana, incluyendo dos que abarcaban el marco de lectura abierto completo y de los cuales se determinaron las secuencias de nucleótidos completas. Esta secuencia se denominó FHF-1 y es el objeto de una solicitud de patente pendiente. Una búsqueda de secuencias de ADNc parciales ("etiquetas de secuencia expresada", EST) en las bases de datos públicas reveló un fragmento de ADNc de cerebro fetal humano (NCBI ID 28057, EST ID EST06895, Genbank ID T09003; Adams, et al., Nature Genetics, 4: 373, 1993) con fuerte homología con FHF-1, pero sólo una homología débil con otros miembros de la familia de FGF. La homología entre esta EST y otros miembros de la familia de FGF es suficientemente baja para que no hubiese indicación de que se observase homología en la descripción asociada con el clon en Genbank o en la publicación que describe la secuencia EST (Adams, et al., citado anteriormente, 1993). Basándose en la secuencia EST, se amplificó este fragmento mediante PCR a partir de una biblioteca de ADNc de retina humana y se usó como una sonda para aislar múltiples clones de ADNc independientes a partir de esa biblioteca, incluyendo dos que abarcaban el marco de lectura abierto completo y de los cuales se determinaron las secuencias de nucleótidos completas. Esta secuencia se denominó FHF-2.

Ejemplo 2 Estructura primaria deducida de FHF-2

La figura 1 muestra la secuencia de FHF-2 humana deducida a partir de las secuencias de nucleótidos de dos clones de ADNc de retina humana independientes. Se pronostica que el producto de traducción primario de FHF-2 tiene 245 aminoácidos de longitud. El codón de metionina iniciador de FHF-2 humano mostrado en la figura 1 en la posición 352-354 corresponde a la ubicación del codón de metionina iniciador de FHF-1 cuando las dos secuencias se alinean; se encuentra en esta posición un buen sitio de unión de ribosoma consenso (TGGCCATGG; Kozak, Nucleic Acids Res., 15: 8125, 1987) (SEQ ID NO: 5). El siguiente codón de metionina dentro del marco de lectura abierto se encuentra a 124 codones en 3' respecto al codón de metionina iniciador supuesto. Tal como se observa para FGFa y FGFb, el extremo amino terminal del producto de traducción primario de FHF-2 no se ajusta a la secuencia consenso para un péptido señal para dirigir la inserción cotraduccional a través de la membrana del retículo endoplasmático. La secuencia de FHF-2 tiene un sitio asn-X-ser/thr potencial para la glicosilación ligada a asparagina de cuatro aminoácidos del extremo carboxilo terminal.

La alineación de FHF-2 con los otros miembros conocidos de la familia de FGF se muestra en la figura 2 y en la figura 3 se muestra un dendrograma que muestra el grado de similitud de aminoácidos. El miembro de la familia de FGF más homólogo es FGF-9 que muestra una identidad de aminoácidos del 28% con FHF-2 cuando se alinea con 6 huecos. Obsérvese que en la región central de cada polipéptido todos los miembros de la familia de FGF, incluyendo FHF-2, comparten 11 aminoácidos invariantes.

Ejemplo 3 Ubicación cromosómica de FHF-2

Se determinó la ubicación cromosómica de FHF-2 explorando con sonda una transferencia de tipo Southern que contenía ADN digerido con enzimas de restricción derivado de un panel de 24 líneas celulares de ser humano-ratón y de ser humano-hámster, que contenían cada una un cromosoma humano diferente (Oncor, Gaithersburg, MD). Tal como se observa en la figura 4, la hibridación de la sonda de FHF-2 humano con ADN genómico de ser humano, ratón y hámster produce distintos tamaños de fragmentos de hibridación. Se observa sólo el patrón de hibridación específico de ser humano en el carril correspondiente a la línea celular híbrida que porta el cromosoma X humano.

Ejemplo 4 Producción de FHF-2 en células humanas transfectadas

Para expresar FHF-2 en células humanas, se insertó el marco de lectura abierto completo en el vector de expresión eucariota pCIS (Gorman, et al., ADN Protein Eng. Tech., 2: 3, 1990). Para aumentar la eficacia de la traducción, se convirtió la región inmediatamente en 5' del codón de metionina iniciador en un sitio de unión a ribosoma óptimo (CCACCATGG) (SEQ ID NO: 5) cortando la región que codifica FHF-2 en la metionina iniciadora con Nco I (que reconoce CCATGG) y ligando en el vector de expresión. Tras la transfección transitoria de células renales embrionarias humanas con el constructo de expresión y un plásmido que expresa el antígeno T grande del virus de simio 40 (SV40) (pRSV-TAg; Gorman et al., citado anteriormente), se marcaron metabólicamente las células con ^{35}S metionina durante 6 horas en ausencia de suero. Tal como se muestra en la figura 5, las células transfectadas con FHF-2 sintetizan un único polipéptido con una masa molecular aparente de 30 kD que no se produce por células no transfectadas o por células transfectadas con un constructo no relacionado. Este polipéptido se corresponde estrechamente con la masa molecular pronosticada del producto de traducción primario, 27,6 kD. La figura 5 también muestra que las células transfectadas con un plásmido de expresión de hormona del crecimiento humana (hGH) secretan eficazmente hGH, mientras que se acumula FHF-2 dentro de las células transfectadas y no puede secretarse en cantidades detectables.

Ejemplo 5 Distribución tisular del ARNm de FHF-2

Para determinar la distribución tisular del ARNm de FHF-2, se realizó un análisis de protección con ARNasa sobre ARN total de cerebro, ojo, corazón, riñón, hígado, pulmón, bazo y testículos de ratón, así como un control negativo de ARNt de levadura. Se derivó la sonda usada de un segmento del gen de FHF-2 de ratón aislado mediante hibridación con el ADNc de FHF-2 humano de longitud completa. Tal como se observa en la figura 6, los niveles más altos de expresión de FHF-2 están en el cerebro, ojo y corazón. Se detectaron muy bajos niveles de expresión de FHF-2 en todos los otros tejidos en una exposición más larga de la autorradiografía.

Aunque la invención se ha descrito con referencia a la realización actualmente preferida, debe entenderse que pueden realizarse diversas modificaciones sin apartarse del espíritu de la invención. Por consiguiente, la invención se limita sólo por las siguientes reivindicaciones.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: The Johns Hopkins University School of Medicine (Escuela de medicina de la universidad Johns Hopkins)

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: FACTOR 2 HOMÓLOGO AL FACTOR DE CRECIMIENTO DE FIBROBLASTOS (FHF-2) Y MÉTODOS DE USO

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 5

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Fish & Richardson P.C.

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(B)

CALLE: 4225 Executive Square, Suite 1400

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(C)

CIUDAD: La Jolla

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(D)

ESTADO: California

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(E)

PAÍS: EE.UU.

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 92037

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(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B)

ORDENADOR: PC IBM compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.30

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 10 de mayo de 1996

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN DEL AGENTE/APODERADO:

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(A)

NOMBRE: Haile, Ph.D., Lisa A.,

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 38.347

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 07265/046WO1

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A)

TELÉFONO: (619) 678-5070

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(B)

TELEFAX: (619) 678-5099

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1150 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(vii)

FUENTE INMEDIATA:

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(B)

CLON: FHF-2

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

UBICACIÓN: 353..1087

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

1

2

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 245 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

3

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

UBICACIÓN: 1..30

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

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{}\hskip1cm4

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

UBICACIÓN: 1..33

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

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{}\hskip1cm5

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 9 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

UBICACIÓN: 1..9

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

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{}\hskip1cm6

Claims (31)

1. Secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de factor 2 homólogo al factor de crecimiento de fibroblastos (FHF-2) que se selecciona del grupo que consiste en:

(a)

un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; y

(b)

SEQ ID NO:1, en la que T también puede ser U.

2. Secuencia de ácido nucleico totalmente complementaria a SEQ ID NO:1 o totalmente complementaria a un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.

3. Fragmento de la secuencia de polinucleótido según la reivindicación 1, de al menos 15 bases de longitud que hibrida selectivamente con ADN que codifica la proteína FHF-2 de SEQ ID NO:2, en condiciones rigurosas, en el que dicho fragmento codifica un polipéptido que tiene la actividad biológica de FHF-2.

4. Secuencia de polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el polinucleótido se aísla de una célula de mamífero.

5. Polinucleótido según la reivindicación 4, en el que la célula de mamífero es una célula humana.

6. Vector de expresión que incluye el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Vector según la reivindicación 6, en el que el vector es un plásmido o un virus.

8. Una célula huésped transformada establemente con el vector de la reivindicación 6 ó 7.

9. Célula huésped según la reivindicación 8, en la que la célula es procariota o eucariota.

10. Polipéptido codificado por el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3 ó 5.

11. Polipéptido según la reivindicación 10, que tiene un peso molecular de aproximadamente 30 kD tal como se determina mediante SDS-PAGE reductora.

12. Método de producción de un polipéptido como se define en la reivindicación 10 u 11, o codificado por un polinucleótido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 8 ó 9 y aislar el polipéptido producido.

13. Anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de la reivindicación 10 u 11, o fragmentos inmunorreactivos del mismo.

14. Anticuerpo según la reivindicación 13, en el que el anticuerpo es policlonal o monoclonal.

15. Método in vitro de detección de un trastorno de proliferación celular que comprende poner en contacto una muestra de un sujeto de que se sospecha que tiene un trastorno de proliferación celular asociado a FHF-2 con un reactivo seleccionado de:

(a)

un anticuerpo según la reivindicación 13 ó 14;

(b)

un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y

(c)

un fragmento de un polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2 de al menos 15 bases de longitud y que hibrida selectivamente en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que codifica un polipéptido de FHF-2 según se expone en SEQ ID NO: 2; y

detectar la unión del reactivo a FHF-2.

16. Método según la reivindicación 15, en el que la célula se selecciona del grupo que consiste en célula cerebral, cardíaca y ocular.

17. Método según la reivindicación 15 ó 16, en el que el reactivo está marcado de manera detectable.

18. Método según la reivindicación 17, en el que el marcador detectable se selecciona del grupo que consiste en un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente y un compuesto quimioluminis-
cente.

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19. Composición farmacéutica que comprende un reactivo seleccionado de un anticuerpo anti-FHF-2 según la reivindicación 13 ó 14 y una secuencia antisentido de FHF-2 que es complementaria a al menos una parte de la secuencia de SEQ ID NO:1 y suprime la actividad de FHF-2.

20. Composición farmacéutica según la reivindicación 19, en la que el reactivo que suprime la actividad de FHF-2 se introduce a una célula usando un vector.

21. Composición farmacéutica según la reivindicación 20, en la que el vector es un sistema de dispersión coloidal.

22. Composición farmacéutica según la reivindicación 21, en la que el sistema de dispersión coloidal es un liposoma.

23. Composición farmacéutica según la reivindicación 22, en la que el liposoma es esencialmente específico de la diana.

24. Composición farmacéutica según la reivindicación 23, en la que el liposoma se direcciona anatómicamente.

25. Composición farmacéutica según la reivindicación 24, en la que el liposoma se direcciona mecanísticamente.

26. Composición farmacéutica según la reivindicación 25, en la que el direccionamiento mecanístico es pasivo o activo.

27. Composición farmacéutica según la reivindicación 26, en la que el liposoma se direcciona activamente mediante acoplamiento con un resto seleccionado del grupo que consiste en un azúcar, un glicolípido y una proteína.

28. Composición farmacéutica según la reivindicación 27, en la que el resto de proteína es un anticuerpo.

29. Composición farmacéutica según la reivindicación 20, en la que el vector es un virus, preferiblemente un virus de ARN, y más preferiblemente un retrovirus.

30. Composición farmacéutica según la reivindicación 29, en la que el retrovirus es esencialmente específico de la diana.

31. Polipéptido según la reivindicación 10 u 11,

(a)

que tiene una secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO: 2; o

(b)

variaciones conservativas del mismo, en el que el polipéptido que tiene variaciones conservativas tiene la actividad biológica del polipéptido de SEQ ID NO:2.