FI89061C - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt aktiva antikroppar av biologiskt aktiva polypeptider samt i foerfarandet anvaenda polypeptider och oligopeptider - Google Patents

Description

1 89061

Menetelmä biologisesti aktiivisten polypeptidien terapeuttisesti aktiivisten vasta-aineiden valmistamiseksi sekä menetelmässä käytettävät polypeptidit ja oligopeptidit 5

Jakamalla erotettu hakemuksesta 883765

Keksintö koskee menetelmää vasta-aineiden valmistamiseksi biologisesti aktiivisille polypeptide!Ile tai 10 niistä johdetuille oligopeptideille sekä näitä vasta-aineita valmistettaessa käytettäviä biologisesti aktiivisia polypeptidejä, joita tuotetaan luonnossa esiintyvistä tai synteettisistä lähteistä, ja näistä polypeptideistä johdettuja oligopeptidejä. Näillä polypeptideillä on yleinen 15 polypeptidirakenne, joka määrittelee proteiineja, joilla on solukasvua edistävä aktiivisuus, ja ne ovat uusia muun-tokasvutekijä-(TGF)-polypeptidejä, joilla on ominaisuus palautuvasti antaa muunnettu fenotyyppi normaalisoluille in vitro ja jotka siten näyttävät olevan pahanlaatuisen 20 fenotyypin välittömiä efektoreita, sekä erityisesti antigeenisiä oligopeptidejä, jotka on johdettu TGF-polypep-tideistä.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut vasta-aineet ovat hyödyllisiä pahanlaatuisuuksien, erityisesti syövän -'"25 ja muiden proliferatiivisten tautien hoitamiseksi sekä luukatoon liittyvien sairauksien, kuten osteoporoosin ja hyperkalsemian hoidossa.

Joukko polypeptidihormoni- ja hormoninkaltalsia .. . kasvutekijöitä on löydetty kudosnesteistä ja niiden yhteys 30 normaalin solukasvun tai mitoosin säätelyyn on vahvistettu. Nämä mitogeeniset polypeptidikasvutekijät käsittävät insuliinin, insuliinin kaltaiset kasvutekijät, verihiuta-leperäisen kasvutekijän, hermokasvutekijän, fibroblasti-kasvutekijän ja orvaskesikasvutekijän (EGF). Ainakin joil-35 lakin näistä tunnetuista kasvutekijöistä on vaikutus muun- 2 89061 nettujen solujen kasvuun, mutta in vitro -testien perusteella näyttää siltä, että muunnetut solut tarvitsevat vähemmän näitä tunnettuja kasvutekijöitä optimaalista kasvua ja monistumista varten kuin normaalit solut. Erityi-5 sesti on osoitettu kokeilla soluviljelyssä, että ulkosyntyisten kasvutekijöiden, kuten insuliinin ja EGF:n, lisääminen voi saada normaalit solut jäljittelemään tiettyjä soluominaisuuksien muutoksia, jotka ovat analogisia muuntamisen kanssa. Ne eivät kuitenkaan pysty tuottamaan kaik-10 kia muutoksia, jotka liittyvät muunnettuun fenotyyppiin, ks. esim. Sporn et ai., The New Eng. J. of Med. 15 (1981) 878 - 880.

Polypeptidikasvutekijöiden uusia tyyppejä, jotka on nimetty muuntokasvutekijöiksi eli TGFriksi, on äsket-15 täin löydetty tietyistä ihmis- ja eläinsyöpä- ja sarkooma-soluista, joilla on enemmän ominaisuuksia, jotka ilmeisesti ovat olennaisia fenotyyppimuunnoksille [Roberts et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 (1980) 3494 - 3498 ja Todaro et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 (1980) 5258 - 5262]. 20 TGF-polypeptideille luokkana ovat ominaisia muutokset, joita ne aiheuttavat, kun niitä käytetään muuntamattomiin normaaleihin indikaattorisoluihin, jotka kasvavat viljelyssä. Nämä muutokset käsittävät a) solukasvun tiheydestä riippuvan kasvun estymisen puutteen yksisolukerrosvilje-25 lys-sä, b) solujen liikakasvun yksisolukerrosviljelyssä, c) muutoksen solun muodossa, mistä on tuloksena, että in-dikaattorisolut omaksuvat kasvainfenotyppin, ja d) kiinnity sr tippuma ttomuuden saavuttamisen, mistä on tuloksena kyky kasvaa pehmytagarissa. Solujen kiinnittymisestä riip-30 pumattoman kasvun ominaisuus viljelyssä on erityisen voimakkaasti vastaavuussuhteessa neoplastisen kasvun kanssa in vivo. Ainakin tietyt TGF-polypeptidit ovat jonkin verran samanlaisia kuin EGF siinä, että ne sekä ovat kuumuutta ja happoa kestäviä, pelkistimme ja proteaaseille 35 herkkiä peptidejä, että näyttävät spesifisesti olevan vuo- 3 89061 rovaikutuksessa solumembraanin EGF-reseptorien kanssa ja tuottavat biologisia vaikutuksia niiden kautta, jolloin TGF kilpailee EGF:n kanssa sitoutumisesta solun EGF-resep-toriin. TGF on kuitenkin erotettavissa EGF:sta useissa 5 tärkeissä suhteissa. Erityisesti EGF ei indusoi kiinnittymisestä riippumatonta solujen kasvua viljelyssä, eivätkä EGF:ää vastaan muodostetut vasta-aineet havaitse TGF:ää radiolmmuunianalyysi- eikä immuunisaostuskokeissa. Lisäksi EGFillä on ainoastaan vähäinen vaikutus viljeltyjen solu-10 jen fenotyyppiin, kun taas TGF tuottaa korostuneemman fe-notyypin muutoksen viljellyissä soluissa ja antaa niille kyvyn käyttäytyä kuten muunnetut solut. Mikä mielenkiintoisinta, TGF:n aiheuttama muuntuminen ei ole pysyvä vaan palautuva TGF:n poissa ollessa, eikä ole olemassa mitään 15 todistusta siitä, että TGF toimii itse täydellisenä syöpää synnyttävänä aineena [Todaro et ai., J. of Supramolecular Structure and Cell Biochem. 15 (1981) 287 - 301].

Siten TGF-polypeptidit muodostavat proteiinien ainutlaatuisen luokan, joka voidaan erottaa muista kasvute-20 kijöistä, kuten EGF:stä, sekä biologisten ominaisuuksien että kemiallisen rakenteen kannalta. Näillä TGF:illä on vuorostaan joukko erilaisia, arvokkaita ominaisuuksia, kuten voimakkaat mutta palautuvat solukasvu- tai mitogeeni-set ominaisuudet. Lisäksi TGF-polypeptidin tuotannolle tai : 25 tuotannon lisääntyneille tasoille on ominaista, ellei olennaista, tiettyjen solulinjojen morfologinen muuntaminen sekä ihmis- että hiirikudoksessa ja/tai -nesteissä; siten TGF-polypeptidit tai niille antigeeniset fragmentit .. . ovat arvokkaita normaalisolujen erottamisessa kasvainso- 30 luista ja niitä vastaan valmistetuilla vasta-aineilla on käyttöä pahanlaatuisuuksien diagnoosissa. Lisäksi oivallus, että tietyt TGF-polypeptidit ovat spesifisesti vuorovaikutuksessa solumembraanin EGF-reseptoreiden kanssa ja tuottavat biologiset vaikutuksensa niiden kautta, antaa 35 mahdollisuuden, kun TGF-polypeptidin perusrakenne on mää- 4 89061 ritetty, saattaa rakenne vastaavuussuhteeseen EGF:n rakenteen kanssa oligopeptldien kehittämiseksi, joilla on kemialliset ominaisuudet, jotka sallivat sitoutumisen EGF-reseptoreihin ilman solun samanaikaista fenotyypin muun-5 tumista.

Vasta-aineiden valmistamiseksi tämän keksinnön mukaisesti on ensin kehitetty menetelmä TGF-polypeptidien valmistamiseksi riittäviä määriä ja riittävän puhtaina sallimaan täydellisen rakenteen määrittämisen, ja tulokse-10 na tästä määrityksestä ja muista havainnoista, mukaan lukien olennaisen homologian löytäminen ihmisen ja hiiren TGF:ien välillä, on löydetty peruspeptidirakenne, jolla on laaja käyttö solumitoosin ja solun kasvuun liittyvällä alueella. Lisäksi saadaan homogeenisiä TGF-polypeptidejä, 15 joita vastaan muodostetuilla vasta-aineilla on käyttöä sekä solukasvun alueella että syövän ja muiden prolifera-tiivisten sairauksien toteamisessa ja hoidossa. TGF-poly-peptidejä ja -oligopeptidejä vastaan muodostettuja vasta-aineita voidaan käyttää luukatoon liittyvien sairauksien, 20 kuten osteoporoosin, hyperkalsemian ja luuresorption, toteamiseen ja hoitoon. Lisäksi vasta-aineita muodostetaan antigeenisille oligopeptideille ja oligopeptideille, joilla on kyky sitoutua solukasvutekijäreseptoreihin, jotka oligopeptidit on johdettu peruspeptidirakenteesta ja mää-25 ritetyistä TGF-polypeptidirakenteista.

Marquardt ja Todaro, J. of Bio. Chem. 257 (9) (1982) 5220 - 5225 (julkaistu 10.5.1982) kuvaavat pienimo-lekyylipainoisen ihmis-TGF:n eristämisen seerumittomasta väliaineesta, jota oli käsitelty ihmisen metastaattisella 30 melanoomakasvainlinjalla, käyttäen sarjaa menetelmävaihei- ta, jotka käsittävät uuttamisen 1 M etikkahappoon ja peräkkäisen puhdistuksen käänteisfaasikorkeapainenestekroma-tografialla eluoiden ensin asetonitriili-liuottimella ja sen jälkeen 1-propanolilla, jolloin saadaan puhdistettu 35 TGF, jolla on luonteenomainen TGF:n biologinen aktiivi- 5 89061 suus, esim. kiinnittymisestä riippumattoman solukasvun indusointi. Twardzik et ai., Science 216 (1982) 894 - 897 (julkaistu 21.5.1982) esittävät saman puhdistusmetodolo-gian käytön TGF:n puhdistamiseksi viruksella muunnetusta 5 rottasolusta. Myös puhdistettujen aineiden biologinen aktiivisuus soluviljelyssä osoitetaan. Pike et ai., J. of Bio. Chem. 257 (24) (1982) 14 628 - 14 631 (julkaistu 25.12.1982) esittävät, että sekä osittain puhdistetulla rotan että ihmisen TGF:llä on kyky aktivoida proteiiniki-10 naasia ihmisen kasvainsolumembraaneissa ja siten stimuloida synteettisen, tyrosiinia sisältävän peptidin fosfory-lointia. Ainoat muut tähän asti selostetut molekyylit, joilla on tämä aktiivisuus, ovat EGF, insuliini ja veri-hiutaleperäinen kasvutekijä, joista kaikilla uskotaan ole-15 van tärkeitä fysiologisia funktioita ihmisessä ja eläimessä. Muita kiinnostavia kirjallisuusviitteitä on esitetty edellä mainituissa artikkeleissa.

Vasta-aineiden valmistamiseksi tämän keksinnön mukaisesti on kehitetty perusproteiinirakenne, joka määrit-20 telee uuden luokan biologisesti aktiivisia molekyylejä. Tämän runkopolypeptidin, joka antaa biologisen aktiivisuuden erityisesti solukasvun edistämisen alueella, löytyminen perustuu havaintoon, että on olemassa selvä vastaavuussuhde tiettyjen, useita disulfidisidoksia sisältävien 25 polypeptidien, TGF:t mukaan lukien, kolmiulotteisen rakenteen ja polypeptidistä aiheutuvan biologisen aktiivisuuden välillä. Siten tämän keksinnön kohteena on menetelmä vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka vasta-aineet muodoste--- . taan biologisesti aktiivisille polypeptideille, joilla on 30 kaava 6 89061 5 10

Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-R-Cys-Pro-Asp-Ser-His-Thr- 15 20 25

Gln-R'-Cys-Phe-His-Gly-Thr-Cys-Arg-R"-Leu-Val-Gln- 5 30 35

Glu-R1-Lys-Pro-Ala-Cys-Val-Cys-His-Ser-Gly-R’"- 40 45 50

Val-Gly-R2-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala 10 jossa R on Asp tai Lys, R' on Phe tai Tyr, R" on Ser tai Phe, R,M on Phe tai Tyr, R1 on Asp tai Glu ja R2 on Ala tai Vai, tai näiden polypeptidien aminohapposekvenssin 1-13, 34 - 43, 34 - 50 tai 39 - 50 käsittäville oligopeptidi-fragmenteille, jossa menetelmässä 15 a) polyklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi hyperimmunisoidaan selkärankainen, tyypillisesti kotieläin, mainitulla biologisesti aktiivisella polypeptidillä tai sen oligopeptidifragmentilla tai näiden immunogeeni-konjugaatilla, ja veri kerätään kohta toistuvien immuni-20 sointien jälkeen ja gammaglobuliini eristetään, tai b) monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi hyperimmunisoidaan pieni eläin, tyypillisesti hiiri tai rotta, mainitulla biologisesti aktiivisella polypeptidillä tai sen oligopeptidifragmentilla tai näiden immunogeeni-25 konjugaatilla, perna poistetaan ja lymfosyytit yhdistetään myeloomasolujen kanssa sopivan fuusiopromoottorin läsnä ollessa ja syntyvät hybridisolut seulotaan yksittäisten, yhtä ainoata vasta-ainelajia antigeenille erittävien kloonien eristämiseksi.

30 Keksinnön erään edullisen kohdan mukaisesti sen kohteena on menetelmä vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka muodostuvat edellä olevan kaavan mukaisille polypepti-deille, joissa R on Asp, R' on Phe, R'" on Tyr, R1 on Asp ja R2 on Ala.

35 Menetelmät polyklonaalisten vasta-aineiden valmis tamiseksi ovat sinänsä hyvin tunnettuja ja niitä on esitetty käsikirjassa Handbook of Experimental Immunology, 3.

7 89061 painos, Weir, toimittaja, Blackwell Scientific Publications, Oxford ja Lontoo, 1978. Samoin menetelmät mono-klonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi ovat alan ammattimiesten hyvin tuntemia ja yleisen menetelmän mono-5 klonaalisten vasta-aineiden saamiseksi ovat kuvanneet Kohler ja Milstein, Nature 256 (1975) 495 - 497. Jokainen saatu monoklonaalinen vasta-ainelaji on yhden ainoan immuunin eläimen B-solun tuote, joka on kehittynyt vasteena spesifiselle antigeeniselle kohdalle, joka tunnistetaan 10 immunogeenisessä aineessa.

Keksinnön mukaisesti vasta-aineiden tuottamiseen käytettyjä polypeptidejä ja antigeenisiä oligopeptidejä voidaan suoraan käyttää immunisoimisprosessissa tai ne voidaan edullisesti sitoa sopivaan kantajaproteiiniin 15 käyttäen alalla tunnettuja menetelmiä; katso esimerkiksi Ganfield et ai.'in US-patentti 4 341 761. Kantajaproteiinin käyttö on erityisen edullista, kun immunisointi suoritetaan käyttäen edellä kuvattuja antigeenisiä oligopeptidejä.

20 Keksinnön mukaisesti valmistettuja, edellä esitet tyjä polypeptidi-ja oligopeptidirakenteita vastaan muodostettuja vasta-aineita voidaan käyttää pahanlaatuisuuksien havaitsemiseen ja hoitoon. Vasta-aineet leimataan mahdollisesti merkkiaineella, esimerkiksi sytotoksisella aineel-’25 la käytettäväksi syövän tai proliferatiivisen sairauden hoidossa.

Kuten edellä on kuvattu, keksinnön mukaiselle menetelmällä valmistetut vasta-aineet ovat sekä monoklonaali-sia että polyklonaalisia vasta-aineita, joita syntyy edel-30 lä esitetyn kaavan mukaisille TGF-polypeptideille, antigeenisille oligopeptideille, jotka ovat peräisin edellä olevan kaavan mukaisista TGF-polypeptideistä, sekä homogeenisille TGF-polypeptideille, jotka on saatu käyttäen seraavassa kuvattua eristämismenetelmää nisäkkäiden, joil- β 89061 la on pahanlaatuisuuksia, erilaisista muunnetuista solu-linjoista ja kehon nesteistä tai muunnetuista soluista.

Tämän keksinnön kohteena ovat myös keksinnön mukaisessa vasta-aineiden valmistusmenetelmässä käytettävät 5 biologisesti aktiiviset polypeptidit, joilla on kaava 5 10

Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-R-Cys-Pro-Asp-Ser-His-Thr- 15 20 25

Gln-R'-Cys-Phe-His-Gly-Thr-Cys-Arg-R"-Leu-Val-Gln- 10 30 35

Glu-R1-Lys-Pro-Ala-Cys-Val-Cys-His-Ser-Gly-R'"- 40 45 50

Val-Gly-R2-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala 15 jossa R on Asp tai Lys, R* on Phe tai Tyr, R” on Ser tai Phe, R'" on Phe tai Tyr, R1 on Asp tai Glu ja R2 on Ala tai Vai, tai näiden polypeptidien aminohapposekvenssin 1-13, 34-43, 34 - 50 tai 39 - 50 käsittävät oligopeptidifrag-mentit. Edullisesti R on Asp, R' on Phe, R,M on Tyr, R1 on 20 Asp ja R2 on Ala.

Keksinnön mukaisesti vasta-aineita muodostetaan edellä esitetyn kaavan mukaisia homogeenisiä muuntokasvu-tekijäpolypeptidejä vastaan, jotka on eristetty näitä po-lypeptidejä sisältävistä puhtaista vesipitoisista väliai-25 neista tai kehon nesteistä, jotka on saatu muuntokasvuteki jää tuottavista kasvainta kantavista nisäkkäistä. Edellä olevan kaavan mukaiset biologisesti aktiiviset polypeptidit voidaan eristää vesipitoisesta väliaineesta, joka sisältää tätä muuntokasvutekijäpolypeptidiä epäpuhtaassa 30 muodossa, menetelmällä, joka käsittää seuraavat vaiheet: (1) dialysoidaan vesipitoinen väliaine, joka sisältää muuntokasvutekijän epäpuhtaassa muodossa, vesipitoista etikkahappoa vastaan antamaan liuotinfaasi, joka sisältää muuntokasvutekijäpolypeptidiä ja joka faasi väkevöldään ja 35 valinnaisesti selkeytetään, (2) muodostetaan vaiheen 1) väkevöity liuotinfaasi uudelleen vesipitoisella etikkahapolla ja saatetaan uudel- 9 89061 leenmuodostettu liuos geelisuodatuskromatografiaan viemällä uudelleenmuodostettua liuosta geelisuodatuskromatogra-fia-pylvääseen, joka on tasapainotettu vesipitoisella etikkahapolla, ja eluoidaan vesipitoisella etikkahapolla 5 eluaatin valittujen fraktioiden saamiseksi, jotka sisältävät muuntokasvutekijäpolypeptidiä puhtaampana, ja valitut fraktiot yhdistetään ja väkevöidään, jolloin saadaan osittain puhdistettu, muuntokasvutekijäpolypeptidiä sisältävä tuote, 10 (3) saatetaan vaiheen (2) osittain puhdistettu, muuntokasvutekijäpolypeptidiä sisältävä tuote peräkkäiseen käänteisfaasikorkeapainekromatografiaan viemällä tuote uudelleenmuodostamisen jälkeen vesipitoiseen trifluori-etikkahappoon, yhden tai useamman hiilivetysidottujen pii-15 happomatriisipylväiden läpi, jotka on tasapainotettu vesipitoisella trifluorietikkahapolla, korkeapainenestekroma-tografian olosuhteissa, jolloin pylvään alkueluointi suoritetaan käyttäen lineaarista asetonitriili-gradienttia vesipitoisessa trifluorietikkahapossa ja sen jälkeen pyl-20 väseluointi, joka suoritetaan ensimmäisestä korkeapaine-nestekromatografiavaiheesta saaduille, yhdistetyille, muuntokasvutekijäpolypeptidiä sisältäville fraktioille, toteutetaan käyttäen lineaarista 1-propanoli-gradienttia vesipitoisessa etikkahapossa, jolloin 1-propanolin gra-25 dienttia nostetaan riittävän pieninä 1-propanolin väke-vyyslisäyksinä antamaan muuntokasvutekijä-polypeptidi yhtenä ainoana selvänä huippuna homogeenisena polypeptidinä.

Peptidisekvenssi, joka luonnehtii esitetyn kaavan mukaista perusproteiinirakennetta, sisältää kuusi kysteii-30 nitähdettä sijoitettuina ratkaiseviin asemiin polypeptidi-rungossa. Arvellaan, että kysteiinitähteiden sijoittelu sallii polypeptidin laskostua erityisellä tavalla pariutuneiden kysteiinien välille muodostuneiden disulfidisilto-jen johdosta ja siten tuottaa kolmiulotteisen rakenteen, 35 joka edistää osaltaan saadun proteiinin biologista aktii- 10 89061 visuutta. On olemassa jonkin verran todistusaineista, joka viittaa erityiseen disulfidi-siltajärjestykseen, jossa (numeroimalla edellä olevassa kaavassa Cys-tähteet l:stä 6:een vasemnmalta oikealle) Cys-1 on sitoutunut Cys-3:een, 5 Cys-2 on sitoutunut Cys-4:ään ja Cys-5 on sitoutunut Cys-6:een disulfidisidoksin perusproteiinirakenteen biologisesti aktiivisissa muodoissa.

Kuten seuraavassa yksityiskohtaisemmin esitetään, edellä mainitun kaavan mukaisia TGF-polypeptidejä saadaan 10 sopivasti erilaisista muunnetuista ihmis- ja hiirisolulin-jöistä, tietyistä sikiön solulinjoista ja kasvainta kantavien nisäkkäiden kehon nesteistä käyttäen myöhemmin kuvattua eristysmenetelmää tai tavanomaista synteettistä tai rekombinanttimenetelmää polypeptidien syntetisoimiseksi. 15 Tyypillisesti mainitun kaavan mukaisten TGF-polypeptidien ja niiden oligomeerien molekyylipaino on alueella n. 5 000 - 35 000. Tässä suhteessa edullisia ovat TGF-poly-peptidit, joiden molekyylipaino on n. 5 000 - 8 000.

Keksinnön mukaisesti vasta-aineita (sekä polyklo-20 naalista että monoklonaalisia) voidaan valmistaa koko TGF-polypeptidimolekyyliä vastaan, mutta on mahdollista ja edullista kustannusten ja teknisen ponnistelun kannalta valmistaa vasta-aineita myös hapteeneille, jotka sisältävät todennäköisiä determinanttikohtia TGF-polypeptidisek-25 venssin eri alueilta ja jotka sisältävät vähintään n. 8 aminohapon, tyypillisesti vähintään n. 10 eikä enemmän kuin n. 20 aminohapon oligopeptidejä.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä oligopeptidi sidotaan sopivaan immunogeeniin ja viedään selkärankaiseen 30 haluttujen vasta-aineiden muodostamiseksi. Siten tämän keksinnön mukaisesti saadaan aikaan myös sarja vasta-aineita oligopeptideille, jotka vastaavat antigeenisiä alueita TGF-polypeptldeissä. Esimerkkejä antigeenisistä oligopeptideistä, jotka ovat käyttökelpoisia valmistet- 11 89061 taessa vasta-aineita tämän keksinnön mukaisesti, luetellaan seuraavassa.

A) Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-Lys-Cys-Pro-Asp-Ser-His-Thr 5 B) Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys C) Cys-His-Ser-Gly-Try-Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala- tai D) Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala.

10 Edellä esitettyjen kaavojen mukaisia polypeptidejä ja oligopeptidejä voidaan valmistaa käyttäen synteettisiä menetelmiä, menetelmiä, joissa peptidi eristetään luonnossa esiintyvästä lähteestä, esim. soluiinjoista ja kehon nesteistä, sekä menetelmiä, joissa käytetään hybridi-DNA-15 teknologiaa. Niinpä polypeptideille ja oligopeptideille käytetään sopivasti tavanomaista kiinteäfaasipeptidisyn-teesiä. Tässä yleisessä synteesimenetelmässä peptidien valmistamiseksi, joka menetelmä on kuvattu esimerkiksi Ganfield et ai.'in US-patentissa 4 341 761, käytetään tun-20 nettuja sivuketjusuojaryhmiä ja tavanomaisia polystyreeni-hartsimatriiseja esim. kloorimetyloituja hartseja, hydrok-simetyylihartseja tai bentshydryyliamiinihartseja, amino-happokytkennän toteuttamiseksi. Polypeptideille voidaan sopivasti käyttää myös edellä mainittua ja jäljempänä yk-25 sityiskohtaisemmin kuvattua menetelmää homogeenisten TGF:ien eristämiseksi luonnon lähteistä halutun peptidin puhtaiden muotojen saamiseksi. Tässä suhteessa erityisen sopivia TGF-polypeptidien lähteitä ovat seerumiton väliaine, jota on käsitelty retroviruksella muunnetuilla 30 Fischer'in rotan sikiön fibroblasteilla, erityisesti fib- roblasteilla, jotka on muunnettu Snyder-Theilen kissan sarkoomaviruksella, Moloneyn hiiren sarkoomaviruksella muunnetuilla hiiri-3T3-soluilla ja ihmisen metastaattisil-la melanoomasolulinjoilla A2058 ja A375. Lähteitä ja mene-35 telmiä sopivia hiirisolulinjoja varten ovat kuvanneet 12 89 061

DeLarco et ai., J. Biol. Chem. 255 (1980) 3685 - 3690 ja Ozanne et ai., J. Cell. Physiol. 105 (1980) 163 - 180. Lähteitä ja menetelmiä ihmisen solulinjoja varten ovat samalla tavalla kuvanneet Todaro et ai., (1980) Proc.

5 Natl. Acad. Sei. USA 77, 5258 - 5262 sekä Giard et ai., J. Natl. Cancer Inst., 51 (1973) 1417 - 1423. Seuraavassa yksityiskohtaisemmin selostettua eristämismenetelmää voidaan myös käyttää TGF-polypeptidien saamiseksi erilaisista kehon nesteistä, kuten ihmisten tai hiirten, joilla on 10 pahanlaatuisuuksia, virtsasta, seerumista, plasmasta, ko-koverestä tai aivoselkäydinnesteestä, tai muunnetuista soluista, jotka tuottavat TGF-polypeptidejä. Tässä suhteessa sopiva TGF-polypeptidien lähde on virtsa tai muu kehon neste hiiristä, joihin on siirretty kasvainsoluja 15 (ihmisen melanooma- tai muunnettuja rotan soluja), joiden tiedetään tuottavan TGF-polypeptidejä. Kaikissa tapauksissa TGF-polypeptidin identifiointia ja puhtautta voidaan tarkkailla radioreseptorimääritysmenetelmällä, joka perustuu ristiin reaktiivisuuteen EGF:n kanssa reseptoriin si-20 toutumisesta (ks. koe-esimerkit seuraavassa). Menetelmissä, joissa käytetään yhdistelmä- tai hybridi-DNA-teknologiaa, voidaan oligopeptidejä tai polypeptidien segmenttejä, jotka sisältävät korkeintaan esimerkiksi 20 aminohappoa, käyttää kodonisekvenssin johtamiseksi yksisäikeisiä 25 nukleotidi (DNA) -koettimia varten. Nämä nukleotidikoetti-met voidaan sitten syntetisoida käyttäen tunnettuja synteesimenetelmiä ja käyttää koettimena lähetti-RNA:n (mRNA) saamiseksi, joka koodaa kasvutekijätyyppisiä polypeptidejä sekä normaaleissa että muunnetuissa soluissa tai kehon 30 nesteissä, jotka sisältävät näitä peptidejä. Kun lähetti-RNA on saatu, voidaan käyttää tavanomaisia menetelmiä mRNA:n käänteiskopioimiseksi cDNA:ksi ja sen jälkeen kloonata cDNA sopivassa vektorissa halutun polypeptidin ilmentymisen aikaansaamiseksi.

13 8 9 061

Menetelmää voidaan käyttää edullisesti homogeenisten TGF:ien eristämiseksi seerumittomista väliaineista, joita on käsitelty muunnetuilla, TGF:ää tuottavilla solu-linjoilla. Tällöin käsitelty väliaine selkeytetään edulli-5 sesti esimerkiksi sentrifugoimalla ja väkevöidään ennen dialyysiä ja TGF:ää sisältävä dialyysistä saatu liuotin-faasi selkeytetään sopivasti esimerkiksi sentrifugoimalla sekä väkevöidään myös ennen geelisuodatuskromatografiaa. Kaikissa tapauksissa dialyysi suoritetaan sopivasti käyt-10 täen vesipitoista et ikkahappol luot intä, jonka etikkahappo-pitoisuus on 0,01 -1 M, jolloin 0,1 M etikkahappo on edullinen. Geelisuodatuskromatografia voidaan toteuttaa käyttäen joukkoa erilaisia geelejä, joita tavanomaisesti käytetään proteiinien tai polypeptidien erottamiseen molekyy-15 likokoon perustuen. Sopivia geelejä ovat dekstraanigeelit, agaroosigeelit ja polyakryyliamidigeelit. Tässä suhteessa edullisia ovat polyakryyliamidigeelisuodatushartsit (Bio-GelR-hatrsit), kuten Bio-Gel P-10, Bio-Gel P-30 ja Bio-Gel P-60, joista Bio-Gel P-10 on erityisen edullinen. Vesipi-20 toisen etikkahapon, jota käytetään pylvään tasapainottamiseen ja TGF:ää sisältävien fraktioiden eluointiin, etikka-happopitoisuus on sopivasti 0,2 -2,0 M, jolloin 1,0 M etikkahappo on edullinen. TGF:ää sisältävät fraktiot, jot- ____ ka eluoituvat pylväästä, voidaan tunnistaa määrittämällä - 25 niiden EGF:n kanssa kilpaileva aktiivisuus ja kasvua edis tävä aktiivisuus pehmytagarissa (ks. koe-esimerkit seuraa-vassa). Geelisuodatuskromatografiästä saadut fraktiot. Jotka sisältävät TGF-polypeptidejä puhtaudeltaan parantuneina, yhdistetään ja väkevöidään, esimerkiksi kylmäkui-:30 vaarnalla, valmistavana vaiheena lisäpuhdistusta varten käänteisfaasikorkeapainenestekromatografiällä (HPLC).

Puhdistusprosessin loppuvaihe käsittää peräkkäiset HPLCit eluoiden asetonitriiIillä ja 1-propanolilla vesipitoisen trifluorietikkahapon läsnäollessa. Nämä peräkkäi-35 set HPLC-ajot voidaan toteuttaa käyttäen yhtä tai useampia 1« 89061 HPLC-pylväitä, mutta on edullista toteuttaa peräkkäiset HPLC-vaiheet käyttäen yhtä ainoata HPLC-pylvästä. Käytetty pylvään täyte on sopivasti huokoista piihappomatriisia, johon on sidottu pitkäketjuinen hiilivety, esimerkiksi 5 16-22 hiiliatomia sisältävä hiilivety. Edullisia täyt teitä ovat pBondapak-hiilivetypylväät, erityisesti pBondapak C10 -pylväs (partikkelikoko 10 pm, 0,39 x 30 cm, Waters Associates). Menetelmä toteutetaan tyypillisesti paineen alaisena, edullisesti paineessa väliltä n. 3,45 x 10 105 - 3,45 x 107 Pa (50-5 000 psi). Ennen pylvääseen vie mistä väkevöidyt TGF:ää sisältävät fraktiot muodostetaan uudelleen 1 - 10-%:iseen trifluorietikkahappoon ja säädetään pH-arvoon 2-5, edullisesti 3-5, lisäämällä tri-fluorietikkahappoa. Pylväs tasapainotetaan sopivasti 15 0,01 - O, l-%:isella vesipitoisella trifluorietikkahapolla, edullisesti 0,05-%:isella vesipitoisella trifluorietikkahapolla, ennen näytteen ruiskuttamista. Ensimmäinen e-luointi suoritetaan asetonitriilillä 0,01 - 0,l-%:isessa, edullisesti 0,05-%:isessa trifluorietikkahapossa käyttäen 20 lineaarista asetonitriiligradienttia (asetonitriiliväke- vyys kasvaa lineaarisesti gradientilla n. 0,1 %/min - n. 1 %/min). Eluointi suoritetaan ajanjaksona 0,2:sta 3 tuntiin virtausnopeudella n. 0,2 - 2 ml/min ja lämpötilassa n. 10 - 50 eC, edullisesti n. 40 °C:ssa. Yhdistetyt frak-25 tiot, jotka sisältävät TGF-aktiivisuuden määritettynä EGF:n kanssa kilpailulla ja pehmytagar-analyysillä, väke-vöidään esimerkiksi kylmäkuivaamalla ennen toista HPLC-vaihetta käyttäen 1-propanoliliuotinta. Peräkkäisen HPLCrn toista vaihetta varten yhdistetyt ja väkevöidyt fraktiot 30 ensimmäisestä HPLC-eluoinnista muodostetaan uudelleen 0,01 - 0,l-%:iseen trifluorietikkahappoon ja kromatogra-foidaan uudelleen samassa pylväässä tai toisessa pylväässä, joka on tasapainotettu trifluorietikkahapolla samalla tavalla, jota käytettiin ensimmäistä pylvästä varten. 35 Tämä toinen eluointi suoritetaan 1-propanolilla, 0,01 - is 8 9 061 0,1-%:isessa, edullisesti O, 035-%:isessa trifluorietik-kahapossa käyttäen lineaarista 1-propanoligradienttia. Optimituloksia varten on tärkeätä käyttää tässä vaiheessa matalaa lineaarista 1-propanoligradienttia. Erityisesti 5 1-propanolipitoisuutta tulisi lisätä lineaarisesti gra-dientilla, joka ei ylitä 0,1 %/min ja edullisesti lineaarinen 1-propanoligradientti tulisi pitää välillä 0,01%/min ja 0,05 %/min eluoinnin aikana. Tämä toinen eluointi suoritetaan sopivasti aikana yhdestä viiteen tun-10 tiin virtausnopeudella n. 0,5 - 5 ml/min ja lämpötilassa alueella 10 -60 °C, edullisesti n. 40 °C:ssa. Säätämällä lineaarista 1-propanolipitoisuusgradienttia edellä annetuilla matalilla tasoilla on mahdollista eluoida TGF-poly-peptidit hyvin määriteltyinä TGF-aktiivisuuden huippuina 15 homogeenisinä polypeptideinä.

Tällä eristysmenetelmällä on mahdollista ottaa talteen n. jopa 70 %:a alku-TGF-aktiivisuudesta epäpuhtaassa lähtöaineesta, jolloin saavutetaan yli 200 000 -kertaisia puhdistumiasteita. Eristämismenetelmällä saatujen homogee-20 nisten TGF-polypeptidien molekyylipainot ovat tyypilli sesti alueella n. 5 000 - 35 000 ja ne ovat riittävän puhtaita sallimaan peptidisekvenoinnin. Edullisia homogeenisiä TGF-polypeptidejä, joita saadaan tällä menetelmällä, ovat TGF:t, joiden näennäiset molekyylipainot ovat 7 400, ... 25 20 000 ja 30 000 - 35 000. Näillä homogeenisillä TGF-poly- peptideillä on luonteenomaisia TGF-polypeptidien biologi--·· siä ominaisuuksia, kun niitä käytetään viljelmässä kasva viin muuntamattomiin, normaaleihin indikaattorisoluihin, mukaan lukien kiinnittymisriippumattomuuden saavuttaminen, ' : 30 mistä on tuloksena kyky kasvaa pehmytagarissa. Kun näitä homogeenisiä TGF-polypeptidejä käytetään nostattamaan vasta-aineita ei ole olennaista, että jokainen TGF:n muodoista puhdistetaan homogeenisyyteen vasta-aineiden tuottamiseksi eri TGF-peptideille.

35 16 89 061

Hoitotarkoituksissa voidaan käyttää joko ksenogee-nisiä tai allogeenisiä vasta-aineita riippuen hoidon luonteesta ja siitä, aiheuttavatko vieraat vasta-aineet immuunivasteen. Kirjallisuudessa on selostettu monia tapoja 5 ihmisvasta-aineiden valmistamiseksi, kun on havaittu, etteivät hiiren tai muun nisäkkään vasta-aineet ole tyydyttäviä. Vasta-aineita voidaan käyttää monilla eri tavoilla. Käyttämällä sopivaa IgG:tä (muuta kuin IgGx:tä), voidaan luonnollisen komplementtiprosessin kautta saada aikaan 10 solujen hajoaminen. Vaihtoehtoisesti toksiinin hajoittava osa voidaan liittää vasta-aineisiin, erityisesti Fab-frag-menttiin. Vasta-aineet voidaan sitoa liposomeihin liposo-mien ohjaamiseksi pahanlaatuisiin soluihin, jolloin solut syövät ne yhteensulattamalla membraanit. Myös muita leimo-15 ja, kuten radionuklideja, voidaan sitoa vasta-aineisiin. Vietäessä vasta-aineet elimistöön ne ohjaavat leiman pahanlaatuiseen soluun, jossa pahanlaatuisuutta voidaan hoitaa.

Vasta-aineiden valmistemuoto vaihtelee laajasti 20 riippuen merkkiaineen luonteesta ja paikasta, johon vasta-aineet on suunnattava jne. Tavallisesti vasta-aineet formuloidaan fysiologisesti hyväksyttävään kantajan, esim. fysiologiseen suolaliuokseen tai fosfaatilla puskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen ja injektoidaan isäntään ha-25 luttuun kohtaan, kun tämä on mahdollista, ja kun tämä ei ole mahdollista, kiertävään järjestelmään, kuten vereen.

Keksinnön mukaisella menetelmällä TGF-oligopepti-dejä ja -polypeptidejä vastaan valmistetut vasta-aineet ovat tehokkaita luukatoon liittyvien sairauksien toteami-: 30 seen. TGF-aktiivisuutta esiintyy esimerkiksi materiaalissa, joka vastaa hyperkalsemiaan liittyvien kasvainten luun resorptioaktiivisuudesta [Ibbatson et ai., Science 221 (1983) 1292]. Kohonnut luun resorptio voi olla kasvainso-lujen erittämien TGF-molekyylien endokriinista vaikutusta.

17 89 061

Kohonneet TGF-tasot edistävät lisäksi luun resorp-tiota liuottamalla kalsiumia, mikä liittyy sairauksiin, kuten osteoporoosiin. Osteoporoosi on sairaus, joka yleensä esiintyy vanhemmilla ihmisillä ja joka aiheuttaa luuka-5 toa. TGF-vasta-aineita voidaan käyttää tämän tärkeän sairauden hoitamisessa. Vasta-aineet voidaan antaa koostumuksina yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantaja-aineen kanssa.

Seuraavat esimerkit annetaan valaisemaan keksintöä 10 eikä millään tavalla sitä rajoittamaan:

Esimerkki I

Ihmisen plenimolekyyllpainoisen muuntokasvutekljän (hTGF) tuottaminen, puhdistaminen ja karakterisointi A. Kokeellisia menetelmiä 15 hTGF:ien lähde hTGF:t puhdistettiin seerumittomasta väliaineesta, jota oli käsitelty ihmisen metastaattisella melanoomalin-jalla Ά2058 [Todaro et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 (1980) 5258 - 5262], joka oli peräisin aivometastaasista 20 43 vuoden ikäiseltä mieheltä. Soluja kasvatettiin 90 %:n yhteenkasvuun kiertopulloissa, jotka sisälsivät Dulbecco'n modifioitua Eagle'n väliainetta (Grand Island Biological Co., 430-2100), jota oli täydennetty 10-%:isella vasikan seerumia (Colorado Serum Co.) 37 eC:ssa. Soluja pestiin 25 1 tunti 50 ml:11a seerumitonta Waymouth'in väliainetta (Grand Island Biological Co., MD 705/1). Tämä ja toinen 24 tuntia myöhemmin kerätty supernatantti hylättiin. Myöhemmät supernatantit otettiin talteen joka toinen päivä tai joka kolmas päivä kahden viikon ajan.

V 30 Väliaine kerättiin talteen dekantoimalla, varastoi tiin korkeintaan 24 h 4 °C:ssa proteaasi-inhibiittori-fe-nyylimetaanisulfonyylifluoridin (1 pg/ml) läsnäollessa ja selkeytettiin jatkuvavirtaussentrifugoinnilla kierrosno-peudella 32 000 rpm 4 °C:ssa. Käytettiin virtausnopeuk-35 siä 5 1/h CF-32-jatkuvavirtausroottorissa (Beckman) L5-50 ie 89061 -mallisessa ultrasentrifugissa (Beckman). Suurnopeuksisen sentrifugolnnin jälkeen saatua supernatanttia nimitetään A2058-käsitellyksi väliaineeksi.

A2058-käsitelty väliaine väkevöitiin välittömästi 5 onttokuitu-dialysoimis/väkevöimislaitteessa (Model DC10,

Hl095-20-tyyppinen patruuna Amicon Corp.) 10 °C:ssa. Kon-sentraatti valutettiin, kun tilavuus oli pienentynyt 150-kertaisesti. Patruuna pestiin 1000 ml:11a Waymouth'in väliainetta. Ultrasuodos hylättiin.

10 hTGF;ien puhdistaminen

Dialyysi ja sentrlfugoiminen

Yhdistettyä retentaattinestettä ja patruunan pesunestettä A2058-käsitellyn väliaineen ultrasuodatuksen jälkeen dialysoitiin 60 h 0,1 M etikkahappoa vastaan Spec-15 trapor 3 -dialyysiletkussa (Spectrum Medical Industries).

Retentaattia sentrifugoitiin 1 000 000 x g:ssa 1 h 4 °C:ssa. Pelletti hylättiin. Sypernatantti väkevöitiin kylmäkuivaamalla ja liuotettiin 0,15 ml:aan 1 M etikkahappoa litraa alkuperäistä A2058-käsiteltyä väliainetta koh-20 ti.

Kromatografia Bio-Gel P-10 -pylväällä Väkevöinnin, dialyysin ja sentrifugolnnin jälkeen hTGF-aktiivisuuden sisältävä supernatantti puhdistettiin edelleen geelisuodatuskromatografialla Bio-Gel P-10 -pyl-25 väässä, 2,5 x 8,5 cm, patsaan tilavuus 420 ml, 200 - 400 mesh, Bio-Rad Laboratories). Pylväs tasapainotettiin 1 M etikkahapolla 22 eC:ssa. Proteiininäytteet (65 - 115 mg) vietiin pylvääseen 1 M etikkahapossa (5 ml). Muuttumattoman virtausnopeuden varmistamiseksi nesteen ulosvirtaus 30 pylväästä asetettiin 12 ml/h:ksi peristalttisella pumpul la. Koottiin 4,8 ml:n fraktioita. Pieni määrä fraktioita kylmäkuivattiin myöhempiä EGF:n kanssa kilpailevan aktiivisuuden määrityksiä ja kasvua edistävän aktiivisuuden määrityksiä pehmytagarissa varten. Fraktiot, jotka edus- is 39061 tivat tietyn huipun pääosia, yhdistettiin ja väkevöitiin kylmäkuivaamalla.

Käänteisfaasikorkeapainenestekromatografia hTGF:n lopullinen puhdistaminen tapahtui käänteis-5 faasi-HPLC:11a käyttäen yleistä menetelmää, jonka ovat selostaneet Marquardt et ai., J. of Biol. Chem., 256 (1981) 6859 - 6865. Kaikki erottamiset suoritettiin pBondapak C18 -kolonnilla (partikkelikoko 10 ym, 0,39 x 30 cm, Waters Associates) virtausnopeudella 1 ml/min 10 40 °C:ssa. Kylmäkuivatut näytteet muodostettiin uudelleen 0,05-%:iseen (v/v) trifluorietikkahappoon vedessä, säädettiin pH 2:een 10-%:isella (v/v) trifluorietikkahapolla ja vietiin näyteinjektorin avulla pylvääseen, joka oli tasapainotettu 0,05-%:isella trifluorietikkahapolla. Pylväs 15 eluoitiin sitten lineaarisella asetonitriili-gradientilla 0,045-%:isessa trifluorietikkahapossa. Pylväästä ulosvir-taava neste kerättiin 1,5 ml:n fraktioina. Pienet määrät fraktioita kylmäkuivattiin EGF:n kanssa kilpailu- ja kasvun stimulointi-määrityksiä varten. Yhdistetyt fraktiot, 20 jotka sisälsivät pääosan hTGF-aktiivisuudesta, väkevöitiin kylmäkuivaamalla.

Yhdistetyt, hTGFtää sisältävät erät liuotettiin 0,05-%:iseen trifluorietikkahappoon ja kromatografoitiin uudelleen samassa pylväässä, joka oli sitä ennen tasapai-... 25 notettu 0,05-%:isella trifluorietikkahapolla vedessä. Pylväs eluoitiin sitten lineaarisella 1-propanoli-gradientil-la 0,035-%:isessa trifluorietikkahapossa. Pylväästä ulos-virtaava neste kerättiin 1,5 ml:n fraktioina. Pienet määrät fraktioita kylmäkuivattiin EGF:n kanssa kilpailu- ja 30 kasvun stimulointimäärityksiä varten.

SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi suoritettiin, kuten Laemmli on selostanut. Nature (Lond) 227 (1980) 680 - 685. Valmistettiin 15 - 30-%:inen akryyliami-·...' 35 digradienttilevy (140 x 120 x 0,75 mm), jossa oli 4 %:n 20 85 061 konsentrointigeeli. Geelejä ajettiin ajojännitteellä 30 V käyttäen elektrodipuskuria, joka sisälsi Tris:ä (0,05 M), glysiiniä (0,38 M) ja SDS (0,1 % w/v), kunnes merkkiväri-aine (bromifenolisininen) oli kulkenut pois geelin päästä.

5 Elektroforeesin jälkeen geelit kiinnitettiin 50-%:isessa metanolissa, joka sisälsi 10 % etikkahappoa, 2 tuntia, pestiin 5-%:isessa metanolissa, joka sisälsi 7 % etikkahappoa, yli yön ja värjättiin hopealla [Oakley et ai., Anals. Biochem. (1980) 361 - 363].

10 Protelinimäärltys

Kokonaisproteiini määritettiin käyttäen naudan seerumin albumiinia standardina. Ennen proteiinimääritystä lähtöaine dialysoitiin fosfaattipuskuroitua fysiologista suolaliuosta vastaan värireaktioita häiritsevien viljely-15 väliaineen aineosien poistamiseksi tai kylmäkuivattiin, jos näytteet oli liuotettu haihtuviin happoihin. Proteiini määritettiin myös aminohappoanalyysillä. Kylmäkuivatut näytteet hydrolysoitiin 110 °C:ssa 24 h tyhjennetyissä Pyrex-putkissa käyttäen 0,1 ml 6 M HC1, joka sisälsi 0,1 % 20 nestemäistä fenolia, ja analysoitiin Durrum D-500 -analysaattorilla, joka oli varustettu PDP 8/A -tietokoneinteg-raattorilla, käyttäen o-ftaalialdehydiä primaaristen amiinien fluorogeenista havaitsemista varten [Bensen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72 (1975) 619 - 622].

25 Radioreseptorimäärltys

Puhdistettu EGF leimattiin Na125I:lla kloramiini-T-menetelmän muunnoksella, kuten ovat selostaneet DeLarco et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1978) 4001-4005.125I-EGF-sitoutumisanalyysi suoritettiin käyttäen formaliinilla 30 kiinnitettyjen A431-ihmissyöpäsolujen lähes yhteneviä yk-sisolukerroksia, kuten aikaisemmin on selostettu [DeLarco et ai., J. of Biol. Chem. 255 (1980) 3685 - 3690]. Kiinnitetyt solut pestiin kahdesti 0,5 ml:11a sidepuskuria (Dulbecco'n modifioitua Eagle'n väliainetta, joka sisälsi 35 1 mg/ml naudan seerumin albumiinia ja 50 mM 2-[bis(2-hyd- 2i 89061 roksietyyli)amino]etaanisulfonihappoa, pH 6,8). Reaktio käynnistettiin lisäämällä 0,2 ml sidepuskuria, joka sisälsi 0,4 ng 125I-EGF:ää mahdollisen inhibiittorin kanssa tai ilman sitä. 1 tunnin inkuboinnin jälkeen 22 "C:ssa spesi-5 fisesti sitoutunut 125I-EGF määritettiin. TGF-sisältö ilmaistiin sen 125I-EGF:n sitoutumista EGF-reseptoriin in-hibointiasteen avulla. Yksi EGFrn kanssa kilpaileva ak-tiivisuusyksikkö määritellään määräksi proteiinia, joka estää 125l-EGF-sitoutumisen reseptoriinsa 50-%:isesti.

10 Kasvumääritys pehmytagarilla

Pesäkekasvumääritys pehmytagarissa käyttäen normaalin rotan munuaisfibroblasteja, kloonia 49F, suoritettiin kuten Todaro et ai. ovat esittäneet julkaisussa Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 (1980) 5258 - 5262. Testattavat 15 kylmäkuivatut näytteet muodostettiin uudelleen 0,5 ml:aan Dulbecco'n modifioitua Eagle'n väliainetta, jota oli täydennetty 10 %:lla vasikan seerumia. Lisättiin 1,5 ml 0,5-%:ista (w/v) agaria (Difco) täydennetyssä väliaineessa ja 0,5 ml täydennettyä väliainetta, joka sisälsi 2,3 x 104 20 solua. 2,3 ml syntynyttä seosta pipetoitiin 2 ml:n pohjakerrokselle (0,5 % agaria täydennetyssä väliaineessa) 60 mm:n petrimaljoissa (Falcon). Soluja inkuboitiin 37 °C:ssa kosteutetussa 5 % C02 ja 95 % ilmaa sisältävässä atmosfäärissä. Määritys luettiin kiinnittämänä ja värjää-... 25 mättömänä 5. päivänä ja 10 - 14. päivinä.

B. Tulokset hTGF:ien lähde, väkevöinti ja alkufraktiointi hTGF:t eristettiin ihmisen erittäin muunnetun meta-staattisen melanoomasolulinjan, A2058, seerumittomasta, : 30 käsitellystä väliaineesta. hTGF:ien kvantitatiivinen määritys perustui kahteen sen ominaisuuteen: kykyyn indusoida normaalin rotan munuaisfibroblastien kiinnittymisestä riippumaton kasvu pehmytagarissa ja kykyyn kilpailla 125I-EGF:n kanssa EGF-reseptorikohdista ihmisen syöpäsoluissa 35 A431. Yhteenveto vaiheista, jotka johtavat hTGF:ien eris tämiseen ja sen talteenottoon, on esitetty taulukossa I.

22 89061 :ti :ti

— P

rv _ rH I U) o o *. -v in ο a)

I O O O ID ID tO

β rH rH OO ' ' G P <0

0) ^ ^ (N Ot Qjat X

0) o in σι en o ro r-- O) O

P O <#> O cr> - v v —' x; C ·η HP rH in “U· ID -r| 0) ti P *r c*) .—. njd) ^ O oo > +| ti

ti G oo P H

p (U rv _ m . >1 G

“ β r—t ιΗ r^- (0:(O. H

I Q) ·Η — >— in id ·Η β tn ‘rl ti tn P id >— —« g tn E ti

β -H U) -P Ι-H rH VD (N -H -rH \ P

•η Ό flj P rH M (N ID -H ti Md O

<u ΓΟ ro βΛί:θΡ -r] 3 3 Λί 00 ΙΟ 3 Λί Λί ^

H(^+J I v v Λ ti .V

•J rH ro H G H rl

** «N ti β W

tn tn m h h ji * c β E E Λ >i f

P <U 3 3 M

m I β tn :<d p · io :fJ

>1 rH H rl :θ H* rH o o en o (UCO1^

ή <u **h > λ; ' - o· m o a) -h .h E

rH 0) d -rl -H M H" in rH o o in H

m +· m ω h h ιηχβ P 43 G ti P W oo Ν' β>ι :;0 •H 3 -H O,.* M oo <ö >1 in ;β tn in rH in ie eri ό <h v ή

:td 3 Id rH rH

* - m β i <u _ d td rH p 00 P <0 O rl m p tn in .q tdDrd^ o <u in td 3 :nj q a ti :(ö (N P G > 3 :0 in σ\ I ro oo id -H <d > :<tf · < O td 1) tn x m en r~- ro in r-'· t) ^ a) E -h

C rl H m IN O O ID N1 p O rH P

C 0) *H k »H *» ^ v w k. *. ίΟβΟ ·0 CO

0) <D β ti -H tn -rr Ν' CNtNrHrH Ό -H Λί aj ΤΓϋ/'θ'Τΐ £ β E β -¾ tn

3 rH tn rH +J >, ti Id H Ή -H

rH Id O -r) 44 _p -H tn ..

O E~* U 44 ti in -H 4J X «i «n td 3 P >1 l

to -H d P -H «j O

Β I β <U in ti β m : O d -H m :ti 3 > β O <D 3 H (N >H PPtitnti C φ p tl) o r~ r^inoo *j m ^ h m ttJPPP tn in m vv(no >, ex > β

rl rl ID O Eo 00 en N- VV Iti C rt H

ti ti P P V IN rH O O 44 tn (U -P -H

E E· O Oi rH >1 Ό P P

— β P 3 X O

β -H *r| Ή 3 tt3 4J

0) rH H p in O, tn -h -h p ad h m <u •rj -H >H P :ti > > tn β O) PO 11 E -H ® 01 p β I P β P H rH p •rl Ή :ti H ti -rl d p rl _ td rH <3 m β a p <u 44 5 β β -H rH I l O O ad e Id öt o

ti rH :ti O O P P Md rl rH (Q

β Md :td rH rH Q) Q, E > d rl -H

rj > (¾ i i tn i h o 44 g β Λ Λ ti rH H in 3

Id 3β ~ ~ **"l 4-> *H ti 4J

P P ti >ί>ι β ti iw <η 3 tn ·Η β OPPCOOO -H u H »I o •H (1) O-HtUrHP-PrHrH H-HinC-p

tl 43 H O P I ti ti O O ti p φ ti H

•β ri 44 44 m m p p P d O» ^ in β td ti 3 ti in tn M M o 3 tn i mQ< > > H d rl -H -h m td m > ββ ti I rH ti Ό Ό Οι Οι 0» 44 G " ·· οβ β oo0id04343titi in a» tn ti 44 ti P m p, > i :« >ι ό ό -ΗΛιηυυ

44 rl ui O Oi ti O ββ Id .3 -H M M

3 H IN ti rH H O O fi .. P I

h h Ό e m o m mm ophP-hh 3043 44 O 3 tn in ti H 3 ·· · ·· O H 3 Λί nl

tn 43 m H N ro N· in « 43 rH >H rH

ti 4Ϊ 23 8 9061

Seerumiproteiinien poistamiseksi A2058-soluja pestiin perusteellisesti Waymouth'in väliaineella ennen niiden viljelemistä seerumittomassa väliaineessa. Superna-tanttinesteet otettiin talteen joka toinen päivä kahden 5 viikon ajan. Viljelyolosuhteet olivat sellaiset, että vil-jelyjakson lopussa yli 90 % soluista oli vielä elinvoimaisia ja kiinnittyivät yksisoluisina kerroksina. Ensimmäinen selkeytetty 136 l:n määrä A-2058-käsiteltyä väliainetta, joka sisälsi 1,02 g kokonaisproteiinia ja 4525 yksikköä 10 EGF:n kanssa kilpailevaa aktiivisuutta, väkevöitiin n. 900 ml:ksi käyttäen onttokuituväkevöimislaitetta, jonka patruunoiden molekyylipainoraja oli 5 000. Koko EGF:n kanssa kilpaileva aktiivisuus pidättyi ja saanto oli yli 95 %.

15 Väkevöidyn, A2058-käsitellyn väliaineen dialyysi etikkahappoa vastaan ja senjälkeinen sentrifugointi tuottivat 95 %:n saannon alkuperäisestä EGF:n kanssa kilpailevasta kokonaisaktiivisuudesta. 18 % proteiinista oli happoon liukenematonta ja hylättiin. Happoliukoinen, osittain 20 puhdistettu hTGF saatettiin geelisuodatuskromatografiaan käyttäen Bio-Gel P-10 -geeliä. Pylväs eluoitiin 1 M etikka-hapolla. Kontaminoivan proteiinin päämassa eluoitiin yhdellä pylvään tilavuudella ja erottui hyvin EGF:n kanssa kilpailevasta aktiivisuudesta ja kasvua stimuloivasta ak-25 tiivisuudesta. Kahden aktiivuushuipun havaittiin olevan hyvin erillään toisistaan. Fraktioiden, joilla oli sekä EGF:n kanssa kilpaileva että kasvua stimuloiva aktiivisuus (P-10-A ja P-10-B), näennäiset molekyylipainot olivat 10 500 ja 680, vastaavasti. Fraktioita, joilla oli vain 30 toinen näistä kahdesta aktiivisuudesta, ei havaittu.

hTGF:ää sisältävät fraktiot yhdistettiin, kuten on esitetty, kylmäkuivattiin ja puhdistettiin edelleen. Suurempimo-lekyylipainoinen TGF eluoitui pylväästä leveänä piikkinä (P-10-A) ja näytti liittyvän erikokoisiin polypeptideihin.

.. 35 P-10-A sisälsi 46 % alkuperäisestä EGF:n kanssa kilpaile- 24 89061 vasta aktiivisuudesta. Pienimolekyylipainoinen TGF eluoi-tui pylväästä terävänä piikkinä (P-10-B) ja edusti 45 % alkuperäisestä EGF:n kanssa kilpailevasta kokonaisak-tiivisuudesta. Pylvääseen viedyn EGF:n kanssa kilpailevan 5 aktiivisuuden yhteinen saanto vaiheesta 1 geelisuodatus-kromatografia-vaiheen läpi oli 91 % (taulukko I). hTGF eluoitui kahtena erillisenä pääpiikkinä, jotka vaihtelivat kvantitatiivisesti valmistuksesta toiseen. A2058-käsitel-lyn väliaineen joissakin valmisteissa oleellisesti kaikki 10 kasvua edistävä aktiivisuus oli hTGF:ien alueella. hTGF:ien puhdistaminen hTGF:t puhdistettiin edelleen käänteisfaasi-HPLC:llä. Väkevöidyn, A2058-käsitellyn väliaineen happo-liukoisen, EGF:n kanssa kilpailevan aktiivisuuden geeli-15 suodatuskromatografiän jälkeen Bio-Gel P-10 -geeliä käyt täen yhdistetty P-10-B-erä muodostettiin uudelleen 0,05-%:iseen trifluorietikkahappoon vedessä ja kromatogra-foitiin sitten pBondapak Cie -kolonnilla. Yksittäisten fraktioiden EGF:n kanssa kilpaileva ja kasvua stimuloiva 20 aktiivisuus pehmytagarissa määritettiin. hTGF:t erotettiin hyvin kontaminoivan proteiinin päämassasta, joka eluoitui orgaanisen liuottimen suuremmilla väkevyyksillä. hTGF:t sisältävät fraktiot yhdistettiin, kylmäkuivattiin ja otettiin uudelleen kromatografoitaviksi. Saatiin hTGF:ien 57-25 kertainen puhdistuminen geelisuodatuskromatografiän jäl keen. 80 % alkuperäisestä EGF:n kanssa kilpailevasta aktiivisuudesta P-10-B-erässä otettiin talteen (taulukko I).

hTGF: t sisältävien fraktioiden uudelleenkromatogra-fointi yBondapak C18 -kantajalle valittiin lopulliseksi 30 puhdistusvaiheeksi, koska näillä pylväillä havaittiin ainoastaan suhteellisen pieniä EGF:n kanssa kilpailevan aktiivisuuden häviöitä. hTGF:ien selvän erottumisen epäpuhtauksista saavuttamiseksi oli tarpeen käyttää loivaa lineaarista 1-propanoli-gradienttia 0,035-%:isessa trifluo-35 rietikkahapossa. Kontaminoivan peptidiaineksen päämassa 25 89 061 erottui hyvin määritellystä aktiivisuuspiikistä. EGF:n kanssa kilpaileva ja kasvua stimuloiva aktiivisuus puhdistuivat rinnakkain ja niillä oli selvästi erottuvat absor-ptiopiikit 13-%:isessa 1-propanolissa. hTGF:t sisältävät 5 fraktiot yhdistettiin ja analysoitiin edelleen. hTGF:ien puhdistuminen oli n. 7 000-kertainen geelisuodatuskromato-grafian jälkeen saannon ollessa 33 % alkuperäisestä EGF:n kanssa kilpailevasta kokonaisaktiivisuudesta. hTGF:ien kokonaissaanto vaiheesta 3 lopullisen käänteisfaasi-HPLC-10 vaiheen läpi oli 73 % ja saanto vaihetta kohti oli 80 -100 % (taulukko I).

hTGF:ien karakterisointi

Lopullisen hTGFrt sisältävän valmisteen puhtaus määritettiin analyyttisellä SDS-polyakryyliamidigeelielek-15 troforeesilla. Geeli värjättiin hopealla. Havaittiin yksi pääpolypeptidinauha, jonka näennäinen MP oli 7 400. Sama malli saatiin, kun näytteitä ajettiin elektroforeesi pel-kistämättömissä olosuhteissa, mikä osoittaa, että TGF on yksiketjuinen molekyyli.

20 hTGF:ien reseptorireaktiivisuutta verrattiin EGF:n kanssa radioreseptorimäärityksellä. hTGF:ien kvantitatiivinen määritys perustui rinnakkaisnäytteen aminohappoana-lyysiin. Sekä hTGF:t että EGF kilpailivat 125I-EGF:n kanssa ihmisen A431-syöpäsolujen EGF-reseptoripaikoista. hTGF:ien 25 spesifisen EGF:n kanssa kilpailevan aktiivisuuden havaittiin olevan 1 - 1,5 x 106 yksikköä/mg; hTGF:iä tai EGF:ää tarvittiin 1,1 ng estämään EGF:n sitoutuminen 50-%:isesti.

hTGF:t mahdollistivat normaalien kiinnittymisestä riippuvaisten rotan munuaissolujen, kloonin 49F, kasvami-30 sen pehmytagarissa. hTRF:ien puolimaksimaalinen vaste peh-mytagarissa saavutettiin 1 EGF:n kanssa kilpailevalla yksiköllä tai 1,1 ng:lla hTGF:iä, kun taas EGF ei stimuloi näiden solujen kasvua pehmytagarissa edes testattuna jopa 10 pg:lla.

26 8 9061

Esimerkki II

Ihmisen (hTGF), rotan (rTGF) ja hiiren (mTGF) muun-tokasvutekljöiden tuotanto suuressa mittakaavassa, puhdistaminen ja aminohapposekventointl 5 A. Kokeelliset menetelmät TGF:n lähde rTGF, mTGF ja hTGF puhdistettiin seerumittomasta väliaineesta, joka oli käsitelty Fisher'in rotan sikiö-fibroblasteilla, FRE CLIO, FRE 3A:n alakloonilla [Sacks et 10 ai., Virology 97 (1979) 231 - 240], joka oli muunnettu ei-tuottavaksi Snyder-Theilen'in kissan sarkoomaviruksella [Snyder et ai., Nature (Lond) 221 (1969) 1074 - 1075], Moloney'n hiirien sarkoomaviruksella muunnetulla 3T3-solu-linjalla 3B11-IC [Bassin et ai., Int. J. Cancer 6 (1970) 15 95 - 107], ja kahdella ihmisen metastaattisella melanooma- solulinjalla, A2058 (ks. esimerkki I) ja A375 [Girad et ai., J. Natl. Cancer Inst. 51 (1973) 1417 - 1423], vastaavasti. Soluja kasvatettiin 2 l:n muovisissa kiertopul-loissa, jotka sisälsivät Dulbecco'n modifioitua Eagle'n 20 väliainetta täydennettynä 10 %:isella vasikan seerumia, ja ylläpidettiin sen jälkeen seerumittomassa Weymouth'in väliaineessa, kuten DeLarco et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1978) 4001 - 4005, ovat selostaneet. Seerumiton, käsitelty väliaine koottiin talteen joka 24. tunti 3 päi-25 vän ajan, selkeytettiin jatkuvavirtaussentrifugoinnilla ja supernatantti väkevöitiin [Marquardt et ai., J. of Biol. Chem. 255 (1980) 9177 - 9181]. Käsitellyn väliaineen kon-sentraatti oli lähtöaine TGF:ien puhdistusta varten.

TGF:n puhdistaminen 30 TGF:t valmistettiin oleellisesti edellä esimerkis sä I melanoomaperäisen hTGF:n puhdistamiselle selostetuin menetelmin. Käsitellyn väliaineen ultrasuodatuksen jälkeinen retentaatti dialysoitiin 0,1 M etikkahappoa vastaan ja sentrifugoinnin jälkeen saatu supernatantti väkevöitiin 35 kylmäkuivaamalla ja liuotettiin uudelleen 1 M etikkahap- 27 35 061 poon myöhempää geelisuodatuskromatografiaa varten Bio-Gel P10 -pylväällä (2,5 x 85 cm, 200 - 400 mesh, Bio-Rad

Laboratories). Pylväs tasapainotettiin 1 M etikkahapolla. Fraktiot, jotka sisälsivät pääosan EGF:n kanssa kilpaile-5 vasta aktiivisuudesta ja joiden näennäinen molekyylipaino oli 7 000, yhdistettiin ja kylmäkuivattiin.

rTGF:n, mTGF:n ja hTGF:n lopullinen puhdistaminen tapahtui käänteisfaasi-HPLC:llä käyttäen esimerkissä I kuvattua kromatografiasysteemiä. Erotukset suoritettiin 10 pBondapak C18 -kolonnilla (partikkelikoko 10 pm, 0,39 x 30 cm, Waters Associates). Liikkuva faasi oli 0,05-%:inen trifluorietikkahappo ja liikkuvan faasin modifioija oli asetonitriili, joka sisälsi 0,045 % trifluorietikkahap-poa. Asetonitriilin väkevyyttä nostettiin lineaarisesti 15 (0,083 %/min) 2 tunnin aikana virtausnopeudella 1 ml/min 40 °C:ssa peptidien eluoimiseksi. Yhdistetyt TGF:ää sisältävät erät kylmäkuivattiin ja liuotettiin uudelleen 0,05-%:iseen trifluorietikkahappoon ja kromatografoitiin uudelleen samassa pylväässä käyttäen liikkuvan faasin mo-20 difioijana 1-propanolia, joka sisälsi 0,035 % trifluori-etikkahappoa. 1-propanolin väkevyyttä nostettiin lineaarisesti (0,05 %/min) 2 tunnin aikana virtausnopeudella 1 ml/min 40 °C:ssa. Fraktioiden yhdistetyt erät, jotka sisälsivät pääosan EGF:n kanssa kilpailevasta aktiivisuudes-.25 ta, kylmäkuivattiin.

TGF;n määritysmenetelmä TGF määritettiin kvantitatiivisesti radioreseptori-määrityksellä, joka perustuu reseptorin ristin reaktiivisuuteen hiiren leuanalussylkirauhasen orvaskeden kasvute-- 30 kijän (mEGF) kanssa. Puhdistettu mEGF leimattiin Na125I:lla kloramiini-T -menetelmän muunnoksella, kuten esimerkissä I selostettiin. 125I-EGF:n sitomisanalyysi suoritettiin formaliinilla kiinnitetyillä ihmisen A431 -syöpäsoluilla, 8 x 103, Micro Test II-levyillä (Falcon). TGF:n väkevyys il-35 maistiin mEGF:n ng-ekvivalentteina/ml ja perustui TGF:n 28 89061 määrään, joka tarvitaan aikaansaamaan yhtä suuri 125I-EGF:n sitoutumisen A431-soluihin estyminen kuin tunnetulla määrällä leimaamatonta mEGF:ä.

TGF:n aminohapposekvenssin määritys 5 Aminohapposekvenssianalyysiä varten rTGF (3 μg) pelkistettiin ditiotreitolilla (20 mM) 100 pl:ssa Tris-HCl-puskuria (0,4 M), joka sisälsi guanidiini-HCl (6 M) ja Na2-EDTA (0,1 %), pH 8,5, 2 h 50 eC:ssa, ja S-karboksiami-dometyloitiin sen jälkeen jodiasetamidilla (45 mM) 30 min 10 22 °C:ssa. S-karboksiamidometyloidusta rTGFista poistet tiin suolat pBondapak C18 -kolonnilla. Peptidi eluoitiin vesipitoisen asetonitriilin, joka sisälsi 0,045 % trifluo-rietikkahappoa, gradientilla. Asetonitriilin väkevyyttä nostettiin lineaarisesti (1 %/min) 1 h ajan virtausnopeu-15 della 1 ml/min 40 °C:ssa.

S-karboksiamidometyloidun rTGF:n ja modifioimatto-man mTGF:n ja hTGF:n automatisoidut sekvenssianalyysit [Edman et ai., Eur. J. Biochem. 1 (1967) 80 - 91] suoritettiin kaasu-neste-kiinteäfaasimikrosekvenaattorilla 20 [Hewick et ai., J. of Biol. Chem. 256 (1981) 7990 - 7997]. Sekvenaattorifraktiot analysoitiin käänteisfaasi-HPLC:llä [Hunkapiller et ai., Science 219 (1983) 650 - 659].

B. Tulokset TGF:n puhdistus 25 Pienimolekyylipainoisen rTGF:n, mTGF:n ja hTGF:n puhdistettuja valmisteita saatiin retroviruksella muunnettujen rotan ja hiiren fibroblastien ja ihmisen kahden me-lanoomasolulinjan käsitellystä väliaineesta vastaavasti. Puhdistaminen tapahtui happoliukoisen EGF:n kanssa kil-30 pailevan aktiivisuuden geelisuodatuskromatografialla Bio-Gel P-10 -geelillä 1 M etikkahapossa, mitä seurasi kään-teisfaasi-HPLC pBondapak C18 -kantajalla käyttäen peräkkäin vesipitoisen asetonitriilin lineaarista gradienttia ja sen jälkeen 1-propanolin, joka sisälsi 0,035 % trifluorietik-35 kahappoa, lineaarista gradienttia. rTGF:n, mTGF:n ja 29 89061 hTGF:n lopullisen puhdistusvaiheen eluutiomallit osoittavat, että EGF:n kanssa kilpaileva aktiivisuus puhdistui rinnan selvästi erottuvan absorbanssipiikin kanssa ja erottui tehokkaasti kontaminoivasta, UV-absorboivasta ai-5 neksesta. Proteiinin pääpiikki rTGF-, mTGF- ja hTGF-val-misteissa eluoitui μΒοη-dapak C18 -pylväästä standardiolo-suhteissa ajassa 48 - 55 minuuttia.

Geelisuodatuskromatografia Bio-Gel P-10 -geelillä aikaansai pienimolekyylipainoisten TGFrien erottumisen 10 suurempimolekyylipainoisista TGFristä ja vähensi pBondapak C18 -pylvääseen lisättyä proteiinimäärää seuraavassa puh-distusvaiheessa. Pienimolekyylipainoiset TGF:t edustivat 45 - 80 % alkuperäisestä EGF:n kanssa kilpailevasta koko-naisaktiivisuudesta. TGF:ien käänteisfaasi-HPLC pBondapak 15 C18 -kantajalla seuraavassa kahdessa puhdistusvaiheessa oli hyvin tehokas kummankin antaessa tyypillisellä valmisteella saannon 80 - 100 % vaihetta kohti. Pienimolekyylipainoisten TGFrien lopullinen saanto oli n. 70 % laskettuna maksimaalisesta puhdistuksen kuluessa havaitusta EGFrn 20 kanssa kilpailevasta kokonaisaktiivisuudesta. Puhdistetun rTGF:n keskisaanto oli 90 ng/1, mTGF:n 50 ng/1 ja hTGFrn 10 ng/1 käsiteltyä väliainetta. Tämä laskelma perustuu spesifiseen aktiivisuuteen, joka on määritetty eristetyille TGFrille olettaen, että EGFrn kanssa kilpaileva aktii-... 25 visuus mitattuna radioreseptorimääritysmenetelmällä hei jastaa pelkästään pieni- ja suurimolekyylipainoisten TGFrien kokonaispitoisuuksia. Immunoreaktiivista mEGFrää ei havaittu käsitellyssä väliaineessa.

TGFrn puhtaus '30 rTGFrn, mTGFrn ja hTGFrn puhtaus saatuna kromato grafisilla elutioprofiileilla määritettiin EGF-radioresep-torimääritysmenetelmällä ja aminohapposekvenssianalyysil-lä. rTGF, mTGF ja hTGF kilpailivat 125I-EGF:n kanssa EGF-reseptoripaikoista ihmisen A431-syöpäsoluilla ja olivat 30 89061 kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti lähes erottumattomia mEGF:stä. Siten lopullisten TGF-valmisteiden uskottiin olevan erittäin puhtaita ja pääasiallisesti homogeenisiä. Yksi ainoa aminoterminaalinen sekvenssi määritettiin 5 rTGF:lle, mTGF:lle ja hTGF:lle automatisoidulla Edman-ha-joituksella. Mikä tahansa suojaamaton vähäinen peptidisek-venssi, jota on läsnä yli 5 %, olisi voitu havaita käytetyillä menetelmillä. hTGF:n homogeenisyys vahvistettiin lisäksi analyyttisellä natriumdodekyylisulfaattipolyakryy-10 liamidigeelielektroforeesilla. Puhdistettu valmiste antoi yhden suuren polypeptidinauhan.

TGF;n aminohapposekventointi rTGFrn, mTGF:n ja hTGF:n täydellinen sekventointi suoritettiin ja näiden kolmen polypeptidin aminohapposek-15 venssit on annettu seuraavassa. Esitetyistä sekvensseistä havaitaan, että rTGF ja mTGF ovat kemialliselta rakenteeltaan identtisiä ja lisäksi, että oleellinen homologia on olemassa hiirien TGFiien ja hTGF:ien välillä ja erilaisia aminohappotähteitä esiintyy ainoastaan harvoissa asemissa 20 (7, 15, 23 ja 38) sekvensseissä.

3i 89061 (1) rTGF 5 10

Val-Val-i>er-His-Phe-Asn-Lys-Cys-Pro-Asp-Ser-His- 15 20

Thr-Gln-Tyr-Cys-Phe-His-Gly-Thr-Cys-Arg-Phe-Leu- 25 30 35 5 Val-Gln-Glu-Glu-Lys-Pro—Ala-Cys-Val-Cys-His-Ser- 40 45

Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu- 50

Leu-Ala (2) tnTGF 5 10 i Λ Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-Lys-Cys-Pro-Asp-Ser-His- ° 15 20

Thr-Gln-Tyr-Cys-Phe-His-Gly-Thr-Cys-Arg-Phe-Leu-25 30 35

Val-Gln-Glu-Glu-Lys-Pro-Ala-Cys-Val-Cys-His-Ser-40 45

Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu- 50 15 Leu-Ala (3) hTGF 5 10

Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-Asp-Cys-Pro-Asp-Ser-His-15 20

Thr-Gln-Phe-Cys-Phe-His-Gly-Thr-Cys-Arg-Phe-Leu-25 30 35 on Val-Gln-Glu-Asp-Lys-Pro-Ala-Cys-Val-Cys-His-Ser- 40 45

Gly-Tvr-Val-Gly-Ala-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-: '· Leu-Ala

Esimerkki 111 25 TGFin tuottaminen In vivo ,1a sen eristäminen

Kasvainsolulinjoja (1 x 106), joiden tiedetään tuottavan (ihmisen melanooma- ja muunnettuja rotan) TGF:iä, siirrettiin kateenkorvattomiin “karvattomiin" hiiriin ja .. . kasvainten annettiin kehittyä. Kasvainta kantavien hiirten 30 virtsa koottiin ja analysoitiin TGF:n läsnäolon suhteen käyttäen edellä esimerkissä I annettuja eristämismenetelmää ja analyyttisiä menetelmiä. Kasvainta kantavien hiirien virtsasta havaittiin TGF, jolla on sama koko ja eluoltumisomlnaisuudet HPLCissä kuin soluviljelystä saa-- 35 dulla TGF:llä, jota on edellä selostettu esimerkeissä I ja 32 89 061 II. Edelleen käyttäen edellä esimerkissä I selostettuja menetelmiä havaittiin hiirien virtsassa läsnäolevalla TGF:llä olevan luonteenomaiset TGF:n biologiset ominaisuudet siinä, että se stimuloi solujen kiinnittymisestä riip-5 pumatonta kasvua ja sitoutuu EGF-reseptoriin. Sen jälkeen kasvaimet poistettiin kasvainta kantavista hiiristä ja hiirien virtsa testattiin kasvaimen poiston jälkeen TGF:n läsnäolon suhteen käyttäen edellä mainittuja menetelmiä. Tässä tapauksessa ei havaittu TGF:ää, jolla olisi luon-10 teenomaiset eluoitumisominaisuudet HPLCtssä tai TGFtn kal tainen biologinen aktiivisuus. Nämä tulokset osoittavat, että kasvainsolut tuottavat TGF:ää kokonaisissa eläimissä yhtä hyvin kuin soluviljelmissä ja että TGF voidaan havaita kehon nesteissä ja eristää niistä käyttäen edellä ku-15 vattuja menetelmiä. Samanlaisia kokeita suoritettiin myös rotilla, joilla oli kemiallisesti karsinogeenilla indusoituja kasvaimia ja niillä havaittiin olevan TGF:ää virtsassaan edellä lueteltujen biologisten ja biokemiallisten ominaisuuksien perusteella, kun taas käsittelemättömillä 20 rotilla ei ollut.

Esimerkki IV

Retroviruksella muunnettujen solujen kasvun estäminen in vitro vasta-aineilla antigeeniselle TGF-oligopep-tidille 25 Oligopeptidi, jolla oli seuraava aminohapposekvens si (joka vastaa rotan TGF:n aminohapposekvenssejä 34 -50):

Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys-His-Ala-

Asp-Leu-Leu-Ala 30 syntetisoitiin käyttäen Ohgak et ai.'in, Journal of Immunol. Meth. 57 (1983) 171 - 184, kiinteäfaasimenetelmää. Tämä oligopeptidi kytkettiin sitten tulivuorikotilon hemo-syaniiniin Baron et al.'in, Cell 28 (1982) 395 - 404, menetelmän mukaisesti ja käytettiin kaniinien immunisointiin 35 [Baron et ai., Cell 28 (1982) 395 - 404] ja lampaiden 33 89061 [Lerner, Nature 299 (1982) 592 - 596] immunisointiin. An-tiseerumeita analysoitiin peptidiä vastaan peroksidaasi-kytketyllä immunoanalyysillä (Kirkegaard ja Perry Laboratories Gaithersberg, MD) ja homogeenistä rotan TGF:ää 5 vastaan (puhdistettu edellä esimerkin 11 mukaisesti), immuunisaostamalla [Bister et ai., J. Virol. 36 (1980) 617 - 621] ja Western-blotting-menetelmin [Burnetti,

Analyt. Biochem. 112 (1981) 195 - 203]. 125I-leimatun rotan TGF:n ja hiiren EGF:n (Bethesda Research Labs, Bethesda 10 MD) sitoutuminen A431-soluihin, jotka oli kasvatettu 96-kuoppaisilla mikrotiitterilevyillä, oli kuten Pruss et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 3918 - 3921, ovat selostaneet.

Antiseerumit, jotka oli valmistettu yhdessä kanii-15 nissa ja kahdessa lampaassa, saatettiin reagoimaan vastaavan peptidin kanssa peroksidaasi-kytketyissä immunoana-lyyseissä tiittereinä vähintään 104. Kaniinin antiseerumin reaktiot rotan TGF:n kanssa varmistettiin immuunisaostuk-sella ja Vfestern-blotting-menetelmällä. Antipeptidianti-20 seerumit eivät immuunisaostaneet jodattua hiiren EGF:tä tässä tutkimuksessa. Ihmisen A431-orvaskesisyöpäsoluissa on 106 ylimääräistä EGF-reseptoria solua kohti [Fabricant et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 565 - 569]. TGF kilpailee EGF:n kanssa sitoutumisesta näihin resepto-25 reihin. 125I-leimatun rotan TGF:n sitoutuminen näihin soluihin estettiin ylimäärällä leimaamatonta EGF:ää ja antiseerumilla peptidiä vastaan. Antiseerumin estovaikutus TGF:n sitoutumiseen havaittiin myös, vaikka vasta-aine-TGF-komp-leksia ei poistettu A431-soluja ympäröivästä väliaineesta '30 S. aureuksen proteiini A:11a helpotetulla immuunisaostuksella. Estyminen vasta-aineella johtui vuorovaikutuksesta TGF-molekyylin kanssa eikä reseptorin kanssa, koska anti-seerumit eivät reagoineet immuunisaostusanalyyseissä puhdistetun jodatun EGF-reseptorin kanssa. Kuten immuunisaos-35 tustuloksien perusteella voitiin odottaa, peptidejä vas- 34 89 061 taan muodostettu antiseerumi ei häirinnyt hiirien EGF:n sitoutumista A431-soluihin.

Kun oli käytettävissä antiseerumeja, jotka estivät TGF:n mutta eivät EGF:n sellulaarisen sitoutumisen, oli 5 mahdollista testata, toimiiko TGF autokriinisellä mekanismilla stimuloiden pahanlaatuisten solujen kasvua ja voiko vasta-aine täten estää tällaisen kasvun in vitro. Niinpä muuntamattomia, normaaleja rotan munuaissoluja (NRK) ja joukko erilaisia retrovirussolulinjoja levitettiin levylle 10 pienissä tiheyksissä (500 - 2 000 solua/malja) seerumia sisältävässä väliaineessa ja vaihdettiin lyhyen tarttumis-ajan jälkeen seerumittomaan väliaineeseen. Väliaineeseen lisättiin lampaan tai kaniinin vasta-aineita TGF-peptidil-le tai erilaisille asiaankuulumattomille, ristiin reagoi-15 mattomille peptideille ja tarkkailtiin vaikutusta solukas-vuun, mikroskooppiseen ja makroskooppiseen pesäkemuodos-tukseen sekä pesäkemorfologiaan. Kaikki vasta-aineet olivat yhtäläisesti puhdistettuja peptidipylväissä, perusteellisesti dialysoituja, väkevöityjä ja uudelleenmuodos-20 tettuja antipeptiditiitteriin 103 - 104. Tulokset annetaan seuraavassa taulukossa II.

35 8 9 O 61 *

Taulukko II

Antlpeptidi-vasta-aineiden vaikutus solujen kasvuun in vitro

Pesäkkeen muodos-

Vasta-aine Lähde Tilavuus Muu lisä- tumisen estymis-% 5 (pg/l) aine NRK- CL10- so- so- Ki- src- luil- luil- NRK: 3T3 : _______la la 11a 11a

Anti-TGF

oligopeptidi Kaniini 5 - 0 85 NT 53 10 5 TGF peptidi NT 36 NT 6

Anti-TGF

oligopeptidi Lammas 2 0 50 49 NT

5 0 68 85 77 15 10 0 79 73 100 5 TGF peptidi NT 9 20 43

5 asiaankuulu- NT 85 NT NT

maton peptidi

Anti-hetero- Lammas & 2Q peptidit (4) kaniini 0 <15 <5 0 " Kuten edellä esitetystä taulukosta II nähdään, ei kaniinin eikä lampaan anti-TGF-oligopeptidi estänyt pesäkkeen muodostumista NRK-soluilla, mutta esti 48 tunnissa 25 Kirsten-muunnettujen NRK-solujen, kissan sarkoomaviruksel-la muunnettujen rotan sikiöfibroblastien (CLIO) solujen ja Rousin sarkoomaviruksella muunnettujen 3T3-solujen kasvun. CLIO-solujen tiedettiin olevan tuotteliaita TGF:n tuottajia [Marquardt et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 30 (1983) 4684 - 4688]. Muutamat eloonjääneet pesäkkeet anti- TGF-vasta-aineella käsitellyissä soluissa näyttivät olevan pienempiä ja niistä puuttui normaalien pesäkkeiden kiinteä ulkonäkö. Tarttumattornia, hajolttamattomia soluja kellui vapaana väliaineessa. Tämä estyminen kumoitui osittain, 35 kun TGF-peptidiä, mutta ei ristiin reagoimatonta asiaan- 36 89061

kuulumatonta peptidiä, lisättiin samanaikaisesti TGF:n vastaan muodostetun vasta-aineen kanssa. Kaniinin ja hiiren vasta-aineilla neljälle erilaiselle ristiin reagoimattomalle peptidille ei ollut vaikutusta NRK:n pesäkkeiden 5 tai retroviruksella muunnettujen solulinjojen kasvuun. Vasta-ainetta sisältävän väliaineen korvaamisella tuoreella, vasta-ainetta sisältämättömällä väliaineella 72 tunnin kuluttua ei onnistuttu kumoamaan pesäkkeen muodostuksen estämistä, mutta eloonjääneet pesäkkeet kasvoivat rajusti. 10 Esimerkki V

Rotan TGF:n synteesi ja karakterisointi Rotan TGF:n (rTGF), jolla oli esimerkissä II annettu kemiallinen kaava, kemiallinen synteesi suoritettiin käsin vaiheittaisella kiinteäfaasimenetelmällä 15 Merrifield'in, J. Amer. Chem. Soc. 85 (1963) 2149 - 2156, selostamien yleisten periaatteiden mukaisesti. Differentiaalinen happolabiili suojaryhmä -strategiaa sovellettiin tähän synteesiin yhdessä N-aminopään tert.-butyylioksikar-bonyylin ja sivuketjujen bentsyylialkoholijohdannaisten 20 tavanomaisen yhdistämisen kanssa. Paremmin happoa kestävää bentsyyliesterisidontaa, joka kiinnitti suojatut aminohapot polymeerikantajaan, käytettiin peptidihäviöiden minimoimiseksi toistuvien happokäsittelyjen aikana [Mitchell et ai., J. Amer. Chem. Soc. 92 (1976) 7357 - 7362]. Täy-25 dellinen suojauksen purkaminen ja peptidin poistaminen hartsista tapahtuivat Tam et ai.'in. Tetrahedron Lett. 23 (1982) 4435 - 4438, Low-High HF -menetelmän mukaisesti, joka poikkesi tavanomaisesta HF-suojauksenpurkumenetelmäs-tä ja poisti bentsyyli-suojaryhmät SH2-mekanismilla lai-30 meassa HF-liuoksessa vakavien sivureaktioiden minimoimi seksi, jotka aiheutuvat hiilikationeista, joita kehittyy tavanomaisessa SNl-suojauksenpurkumenetelmässä. Lisäksi se on myös suunniteltu vähentämään monia kysteinyyll-sivu-reaktiolta, jotka usein estävät monia disulfidisldoksia 35 sisältävien proteiinien, synteesin.

37 8 9 0 61 HF-käsittelyn jälkeen ja ennen mitään puhdistamista raaka ja pelkistetty synteettinen rTGF hapetettiin ja regeneroitiin seka-disulfidi-menetelmällä pelkistetyn ja hapetetun glutationin yhdistelmän läsnäollessa [Ahmed et 5 ai., J. Biol. Chem. 250 (1975) 8477 - 8482]. Tällä vältettiin polymeeristen ainesten muodostuminen puhdistamisen aikana. Regeneroitu, raaka rTGF-Ι sisälsi 40-50 % EGF-ra-dioreseptoria ja tyrosiinispesifisiä proteiinikinaasiak-tiivisuuksia verrattuna luonnon-rTGF-I:een. Puhdistamaton 10 synteettinen rTGF puhdistettiin homogeenisyyteen kolmessa vaiheessa: (1) geelisuodatuksella Bio-Gel P-10- pylvääl lä; (2) ioninvaihtokromatografiällä CM-Sephadex-pylväällä; ja (3) preparatiivisella korkeapainenestekromatografiällä (HPLC) C-18 -käänteisfaasikolonnilla. Kokonaissaanto, las-15 kettuna Ala:n lähtömäärästä hartsiin, oli 31 %.

Pelkistävissä tai pelkistämättömissä olosuhteissa puhdistetun synteettisen rTGF:n havaittiin antavan yhden ainoan nauhan, jonka näennäinen molekyylipaino oli 7 000 SDS-PAGE-elektroforeesilla. Aminohappoanalyysi 6 mol/1 20 HCl:lla ja entsymaattisella hydrolyysillä antoivat ehdotetun sekvenssin odotetun teoreettisen moolisuhteen. Vapaata tiolla ei havaittu Ellman'in sulfhydryylin määritysmenetelmällä synteettisestä rTGF:stä, mutta tiolyyttises-ti pelkistettäessä saatiin kuuden kysteiinin odotettu teo-25 reettinen arvo. Nämä havainnot tukevat sitä johtopäätöstä, että synteettinen rTGF on yksiketjuinen polypeptidi, joka sisältää kuusi kysteiiniä disulfidisidoksissa, mikä on sopusoinnussa luonnon rTGF:n odotettujen kemiallisten omi-... naisuuksien kanssa. Lisäksi synteettinen rTGF eluoitui 30 yhdessä luonnon rTGF:n kanssa yhtenä ainoana symmetrisenä huippuna C-18-käänteisfaasi-HPLC:ssä.

Esimerkki VI

Anti-TGF-vasta-aineella tehdyt in vivo -tutkimukset

Anti-TGF-seerumi valmistettiin immunisoimalla rotta 35 edellä esimerkissä IV kuvatun rotan rTGF:n 17 aminohapon 38 8 9 061 sekvenssin ja KLH:n (tulivuorikotilon hemosyaniini) glu-taraldehydikonjugaatilla, ja Ig-fraktio valmistettiin sitten seostamalla seerumi kahdesti 45-%:isella, kylläisellä ammoniumsulfaattiliuoksella, liuottamalla se takaisin al-5 kuperäiseen tilavuuteen ja dialysoimalla PBSrää vastaan.

Anti-TGF-seerumi ja vertailuseerumi laimennettiin alkuperäisestä 0,5 ml: n tilavuudesta 3 mlrksi. Saadut liuokset injektoitiin intraperitoneaalisesti hiiriin annoksina 0,1 ml/hiiri. Kymmeneen noin 3 kk:n ikäiseen hii-10 reen oli kuhunkin istutettu ihon alle kaksi pientä palaa rotan kasvainta, joka oli peräisin Snyder-Theilen kissan sarkoomaviruksesta. (Kukin istute laskettiin yhdeksi kohteeksi, joten tuloksena oli kaikkiaan 20 kohdetta, joista 10 oli vertailuryhmässä ja 10 hoidettavassa ryhmässä.) 15 Hiiret injektoitiin istuttamisen jälkeisenä päivänä ja sitten päivinä 4, 7 ja 11.

Seitsemännestä päivästä lähtien kasvainten läpimitat mitattiin työntötulkilla kahteen suuntaan. Kasvaimet mitattiin säännöllisin väliajoin päivinä 9, 11, 14, 16, 18 20 ja 24.

Ensimmäisen mittauksen yhteydessä havaittiin merkkejä kasvaimen kasvusta 7 kohteessa 10:stä vertailuryhmässä, kun taas hoidetussa ryhmässä kasvua esiintyi vain 4 kohteessa 10:stä. Lisäksi vertailuryhmässä 6 kohteessa 25 10:stä oli kasvaimen läpimitta oli vähintään 3 mm, kun taas hoidetussa ryhmässä vain 3 kohteessa kasvaimen koko 011 näin suuri. Vertailuryhmässä oli 4 kohdetta läpimitaltaan vähintään 5 mm päivänä 9, kun taas hoidetussa ryhmässä vain 2 kohdetta oli tämänkokoisia. Päivään 11 mennessä 30 vertailuryhmän ja hoidetun ryhmän kasvaimet olivat samanlaiset.

39 8 9 0 61

Esimerkki VII

TGF:n toteaminen monospepsifisellä, synteettistä peptidiä vastaan muodostetulla antiseerumilla

Peptidisynteesi 5 Peptidit, jotka vastaavat aminohappoja osista rTGF- aminohapposekvenssiä, jotka kuvattiin edellä esimerkissä II, syntetisoitiin kaupallisesti (Peninsula Labs) tavanomaisella kiinteäfaasimenetelmällä [Ohgak et ai., Journal of Immunol. Meth., 57 (1983) 171 - 184]. Peptidit puhdis-10 tettiin tarpeen vaatiessa käänteisfaasikorkeapaineneste-kromatografiällä (RP-HPLC:llä) ennen käyttöä.

Käytetyt sekvenssit olivat:

Peptidi I - Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-Lys-Cys-Pro-Asp-Ser-His-Thr 15 Peptidi II - Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-

Arg-Cys

Peptidi III - Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-

Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala

Peptidi IV - Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-Ala-20 Asp-Leu-Leu-Ala

Peptidien konjugointi ja immunisointi

Peptidinäyte (10 mg) sekoitettiin tulivuorikotilon hemosyaniiniin (10 mg, Calbiochem) 3,5 ml:ssa 0,1 M nat-25 riumfosfaattia (pH 7,4). Lisättiin 4 ml 25 mM glutaralde-hydiä ja seosta inkuboitiin ravistellen 1 tunti lämpötilassa 23 ®C. Sitten lisättiin glysiiniä loppupitoisuudeksi 0,1 mol/1 ja seosta ravisteltiin yön yli lämpötilassa 23 eC. Saatu konjugaatti sekoitettiin yhtä suureen tila-30 vuuteen Freundin täydellistä apuainetta ennen injektoin-tia.

Kaniinit immunisoitiin injektoimalla ihon alle 1 mg konjugaattia neljään eri kohtaan. Ensimmäisen injektion jälkeen annettiin kaksi tehostetta kahden viikon väli-35 ajoin. Tässä kokeessa käytetty seerumi kerättiin 80 vrk:n 40 8 9 061 kuluttua ensimmäisestä injektiosta. Tästä seerumista preparoitiin immunoglobuliinifraktio ammoniumsulfaattisaos-tuksella. Immunisoivalle peptidille spesifistä vasta-ainetuotetta seurattiin kiinteäfaasi-ELISA:11a.

5 Peptidien leimaus radioaktiivisella jodilla

Peptidit leimattiin Na125I:lla käyttämällä kloramii-ni-T-menettelyä, joka oli oleellisilta osiltaan Dasin et ai.'in kuvaaman menettelyn mukainen [Proc. Natl. Acad. Sei. 74 (1977) 2790 - 2794]. Liuoksiin, jotka sisälsivät 10 hiiren leuanalussylkirauhas-EGF:ää (mEGF, 170 pmol), synteettistä rTGF:ää (4 pmol) tai peptidiä III (400 pmol), sekoitettiin 1-2 mCi Na125I:a (Amersham 2 mCi/nmol) 2 M kaliumfosfaatissa (pH 7,5). Lisättiin 50 - 100 pg klor-amiini-T:tä ja inkubointia jatkettiin lämpötilassa 4 °C 15 1 min (mEGF ja rTGF) tai 7 min (peptidi III). Reaktiot pysäytettiin lisäämällä 10 - 20 pg Na2S205:a ja leimatut proteiinit erotettiin reagoimattomasta Na125I:sta kromato-grafisesti Sephadex G-10:llä (Pharmacia). Tällä tavalla leimattujen peptidien ominaisaktiivisuudet olivat: 1 x 20 1010 cpm/nmol (EGF), 6 x 108 cpm/nmol (rTGF) ja 1 - 109 cpm/nmol (peptidi III).

Radiorespetorimäärltys 125I-EGF:n sitoutuminen reseptoriinsa formaliinilla kiinnitettyjen A431-solujen yksisolukerroksilla mitattiin 25 edellä esimerkissä I kuvatulla tavalla. 125I-EGF:ää lisättiin loppupitoisuudeksi 0,33 nmol/1 kilpailevien aineiden läsnä- tai poissaollessa. Leimaamattoman EGF:n lisääminen pitoisuudeksi 0,3 - 0,5 nmol/1 johti puoleen 125I-EGF:n sitoutumisen maksimi-inhibitiosta. TGF-pitoisuudet ilmoitet-30 tiin määränä, joka vaaditaan saamaan aikaan tunnettua TGF-määrää vastaava 125I-EGF:n sitoutumisen esto.

RIA (radioimmuunianalyysi)

Reagenssit sekoitettiin 50 mikrolitran lopputila-vuudessa liuosta, joka sisälsi 20 mmol/natriumfosfaattia 35 (pH 7,4), 200 mmol/1 NaCl:a, 40 mmol/1 ditiotreitolia, 4i 8 9 061 0,1 % (w/v) BSA:ta, 0,1 % (w/v) NaN3:a, 125I-peptidi III:a (104cpm), lopullista laimennusastetta 1/15 000 vastaavan määrän antiseerumia, ja muita aineita ilmoitettaessa. Reaktio käynnistettiin lisäämällä antiseerumi ja sen an-5 nettiin jatkua lämpötilassa 23 eC 90 min. Sitten lisättiin yhtä suuri tilavuus 10-%:isella formaliinilla kiinnitettyä Staphylococcus A -valmistetta (Pansorbin, Calbiochem) ja inkubointia jatkettiin vielä 30 min lämpötilassa 23 °C. Immunoadsorbantti poistettiin sedimentoimalla 10-%:isen 10 (w/v) sakkaroosi liuoksen läpi ja sitoutuneen 125I-peptidi III:n määrä määritettiin käyttämällä gammalaskuria. Näissä olosuhteissa vasta-aine sitoi noin 25 % 125I-:peptidistä kilpailijan poissa ollessa. Sitoutuneen peptidi III:n määrä korjattiin epäspesifisen sitoutumisen suhteen, joka 15 mitattiin vasta-aineen poissaollessa (alle 5 % kokonaissi-toutumisesta) ja ilmoitettiin prosentteina maksimisitoutu-misesta. Kilpailijoiden pitoisuudet ilmoitettiin siinä määränä peptidi III:a, joka tarvittiin saamaan aikaan vastaava saostumisen esto.

20 Kromatograf ia

Geelisuodatuskromatografia tehtiin valmistajan ohjeiden mukaan Bio Gel P-10 -kolonneilla (BioRad), jotka tasapainotettiin 1 N etikkahapolla. HPLC tehtiin Novapak C1B -kolonnilla (0,39 x 10 cm, Waters Associates) käyttä-25 mällä virtausnopeutta 1 ml/min lämpötilassa 23 eC.

Käsitellyn alustan valmistus

Snyder Theilen käsiteltyjen Fischer-rotan alkioso-lujen (ST-FrSV-RFE klooni 10) seerumiton modifioitu alusta kerättiin Twardzikin et ai. kuvaamalla tavalla [Virology, 30 124 (1983) 201 - 207]. Kasvualusta selkeytettiin sentrifu- goimalla pienellä nopeudella ja kylmäkuivattiin. Jäännös suspendoitiin sitten 1 N etikkahappoon ja dialysoitiin perusteellisesti 0,1 N etikkahappoa vastaan. Liukenematon proteiini poistettiin sentrifugoimalla ja supernatantti 35 kylmäkuivattiin. Lopuksi jäännös suspendoitiin takaisin sadasosatilavuuteen alkuperäisestä 1 N etikkahappoa ja säilytettiin lämpötilassa 4 °C.

42 8 9 061

Immunoblotting-analyysi

Analysoitaville näytteille tehtiin ensin natrium-5 dodekyylisulf aattipolyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) käyttäen akryyliamidigradienttia 15 -> 20 % ja elektroforeesi ajettiin pelkistävissä olosuhteissa Laemmlin kuvaamalla tavalla [Nature 227 (1970) 680 - 682]. Erottamisen jälkeen proteiinit siirrettiin elektroforeet-10 tisesti nitroselluloosalle (Schleicher and Schuell, BA85, 0,45 μ) Burnetten kuvaamalla tavalla [Anal. Biochem. 112 (1981) 195 - 203]. Siirto tehtiin jännitteellä 5 V/cm 3 -4 tuntia 23 °C:ssa. Tuloksena olevaa proteiiniblottia in-kuboitiin yön yli maitopohjaisessa BLOTTO-seoksessa 15 (Johnson et ai., Gene Anal. Techn. 1 s. 3 - 8). Antiseeru mi laimennettiin BLOTTO:11a ja lisättiin hiottiin peptidi III -ylimäärän läsnä- tai poissaollessa. Inkubointia vasta-aineen kanssa jatkettiin usein sekoittaen 2-3 tuntia lämpötilassa 23 ®C. Sitten blotti pestiin, sitä inkuboi-20 tiin 125I-proteiinin kanssa (4 x 106 cpm/ml, 4 x 107 cpm/pg) 1 tunti lämpötilassa 23 eC ja pestiin BLOTTO:11a. Vasta-aineen sitoutumiskohdat visualisoitiin tekemällä autora-diografia Kodak XAR-5 -filmille lämpötilassa -70 °C käyttäen kuvanvahvistuslevyjä.

25 Edellä kuvatun radioimmuunianalyysin yhteydessä li sätty 125I-:peptidi III saostui lähes kvantitatiivisesti antiseerumin laimennusasteen ollessa pieni; antiseerumille saatiin tiitteri > 10 000. Vasta-aineaffiniteetti mitattiin inkuboimalla antiseerumia suhteessa 1/5 000 laimen-30 nettuna vaihtelevien 125I-peptidi III -pitoisuuksien läsnä ollessa. Näiden tulosten analysointi Scatchardin menetelmällä antoi tulokseksi yhden ryhmän sitoutuvaa/sitoutuvia komponenttia/komponentteja, jonka affiniteettivakio (Ka) 125I-peptidi III:n suhteen oli 8,3 x 10® M'1.

43 8 9 061 RIA:n spesifisyys RIA:n spesifisyyden määrittämiseksi tutkittiin erilaisista peptideistä niiden kyky estää 12Sl-peptidi lll:n saostuminen. Leimaamaton peptidi III esti 125I-peptidi Iii:n 5 saostumisen suurin piirtein lineaarisesti alueella 0,13 -11 nmol/1; leimaamattoman peptidi III:n pitoisuus, joka sai aikaan puolet saostumisen maksimi-inhibitiosta, oli 0. 7 nmol/1. Peptidi IV oli vain hieman tehottomampi saostumisen estäjänä kuin peptidi III, kun taas peptidi II oli 10 täysin tehoton pitoisuuksiin 1,1 pmol/l asti. Myös peptidi 1, joka vastaa 11 aminoterminaalista ryhmää, oli tehoton kilpailijana. Nämä tulokset osoittavat, että tavanomaisissa koeolosuhteissa detektoitu epitooppi oli paikallistuneena peptidi III:n 11 karboksiterminaaliseen aminohap- 15 poon. Taulukossa III esitetään yhteenveto eri peptidien suhteellisista inhiboivista pitoisuuksista.

Taulukko III

20 Lisäys Suhteellinen inhibointiaktiivisuus peptidi III 1 peptidi IV 3,5 peptidi I > 1500 peptidi II > 1500 25 rTGF 0 ditiotreitoli 1 rTGF - ditiotreitoli 20 mEGF > 1500

Ilmoitetuista lisätyistä aineista tutkittiin niiden kyky 30 estää standardi-RIA edellä kuvatulla tavalla. Kullekin lisätylle aineelle määritettiin pitoisuus, joka tarvittiin saamaan aikaan puolet saostumisen maksimi-inhibitiosta, ja se ilmoitetaan suhteessa peptidi III -pitoisuuteen, joka vaaditaan saamaan aikaan vastaava inhibitio. Merkintä ">" 35 osoittaa suurimman tutkitun pitoisuuden. (Peptidien I-IV

44 8S061 inhibitioaktiivisuuteen ei vaikuttanut ditiotreitolin läsnäolo määrityksessä. )

Myös rTGF:n kyky estää 125I-leimatun peptidi III:n saostuminen tutkittiin. Synteettinen rTGF, joka vastasi 5 biologiselta aktiivisuudeltaan täysin luontaista molekyyliä, oli yhtä tehokas (molaarisen pitoisuuden perusteella arvioituna) inhibiittorina kuin peptidi III. rTGF:n suhteellinen inhibitiokapasiteetti aleni merkittävästi, kun pelkistin jätettiin pois reaktioseoksesta (taulukko). mEGF 10 oli täysin tehoton kilpailijana pitoisuuksiin yli 1 pmol/l asti. Tämä osoittaa, että tässä kuvattu RlA eroaa muista käytettävissä olevista TGF-määrityksistä siinä suhteessa, että se on spesifinen TGF:lle muttei EGF:lle.

Jotta osoitettaisiin suoraan, että antiseerumi si-15 too rTGFrää, korvattiin 125I-peptidi III 125I-leimatulla rTGF:llä tavanomaisessa RIA:ssa. Havaittiin annoksesta riippuva 125I-TGF:n saostuminen, jota esti oleellisesti ylimääräisen peptidi III:n lisääminen. Tällä tavalla saatujen sitoutumistulosten Scatchard-analyysi osoitti, että anti-20 seerumin K. 125I-TGF:n suhteen oli 2,3 x 108 M'1. Tämä arvo sopii kohtuullisen hyvin yhteen 125I-peptidille III määritetyn Ka:n kanssa (8,3 x 108 M'1) ja osoittaa, että antiseerumi sitoutuu rTGF:ään, rTGF;n toteaminen muunnettujen solujen käsitellystä 25 kasvualustasta

Eräs TGF-lähde on RNA-kasvainviruksilla muunnettujen solujen kasvualusta. rTGF:n toteamiseksi viljeltyjen muunnettujen solujen käsitellystä kasvualustasta käytettiin seuraavaa menettelyä. Kissan sarkoomaviruksen Snyder-30 Theilen -kannalla (ST-FeSV FRE klooni 10) muunnetun

Fischer-rotan alkiosolulinjan on aiemmin osoitettu tuottavan kohonneita määriä rTGF:ää [Gray et ai., Nature 303 (1983) 722 - 725]. Seerumiton käsitelty alusta kerättiin, prosessoitiin ja väkevöitiin edellä kuvatulla tavalla. 35 Osalle alustasta tehtiin sitten geelisuodatuskromatografia 45 89061

Bio-Gel P-10:llä happamassa olosuhteissa. Fraktiosta analysoitiin rTGF EGF-reseptorikilpailumäärityksellä tai RIA:lla.

Näissä olosuhteissa havaittiin EGF:n kanssa kilpai-5 levää aktiivisuutta kahdessa molekyylikokoryhmässä, toinen noin MP = 10 000 ja toinen MP «= 20 000; kummatkin molekyy-lilajit eluoituivat selvästi näytteen proteiinin pääosan jälkeen. Kumpikin kokoluokka, jolla oli EGF:n kanssa kilpaileva aktiivisuus, oli myös immunologisesti aktiivinen. 10 Immunologista aktiivisuutta havaittiin lisäksi kolonnin patsaan tilavuudessa, jossa ei havaittu EGF:n kanssa kilpailevaa aktiivisuutta. Nämä havainnot osoittavat, että edellä kuvatut rTGF-kokoryhmät ovat aktiivisia RlA:ssa. EGF:n kanssa kilpaileva aktiivisuuden suhde immunologiseen 15 aktiivisuuteen pieneni voimakkaasti suurimolekyylisissä TGF-fraktioissa, mikä osoittaa, että näiden TGF-molekyylila j ien biologinen aktiivisuus on pienempi kuin pienimolekyylisten fraktioiden.

Sen vahvistamiseksi, että immunologinen aktiivisuus 20 esiintyi samassa molekyylilajissa kuin EGF:n kanssa kilpaileva aktiivisuus, tehtiin RP-HPLC yhdistetyille fraktioille, jotka saatiin toistamalla tämä koe preparatiivi-sessa mittakaavassa ja jotka sisälsivät rTGF-kokoryhmät MP = 10 000 ja MP =* 20 000; käytetyt olosuhteet olivat 25 samanalaiset kuin ne, joita käytettiin rTGF:n puhdistamiseen Marquardt et ai. mukaisesti [Proc. Natl. Acad. Sei. 80 (1983) 4684 - 4688]. Yhdistettyjen TGF-fraktioiden, joiden MP oli 10 000, ollessa kyseessä sekä EGF:n kanssa kilpaileva että immunologinen aktiivisuus puhdistuivat 30 rinnakkain suurin piirtein kvantitatiivisella saannolla. Kummankin aktiivisuuden puhdistuminen rinnan sekä geeli-suodatuskromatografiässä että HPLC:ssä viittasi vahvasti siihen, että kumpikin aktiivisuus esiintyy samassa molekyylilajissa. Kun EGF:n kanssa kilpailevalle kokoryhmälle 35 MP 20 000 tehtiin HPLC, havaittiin samanlainen EGFrn 46 89051 kanssa kilpailevan ja immunologisen aktiivisuuden rinnak-kaispuhdistuminen. Nämä kokeet osoittavat, että suuri osa immunologisesta aktiivisuudesta, joka havaittiin St-FeSV-FRE-kloonin 10 käsitellyssä kasvualustassa, oli rTGF:n 5 aiheuttamaa.

Eri rTGF-kokoryhmien immunoblotting-analyysi Retroviruksilla muunnettujen rotan solujen käsitellyssä alustassa esiintyvät suuremmat TGF-kokoryhmät voisivat edustaa joko aggregoituneita tiloja tai TGF-molekyyli 10 erillisiä molekyylimuotoja. Näiden kahden vaihtoehdon erottamiseksi toisistaan tehtiin synteettiselle rTGF:lie ja luonnon TGF:n kokoluokille MP 10 000 ja MP = 20 000 immunoblotting-analyysi, kun polypeptidikomponentit oli erotettu SDS-PAGE:lla pelkistävissä olosuhteissa. Immuuni-15 reaktiivinen, synteettinen rTGF ja pienimolekyylinen luon non rTGF liikkuivat rinnakkain kumpikin yhtenä polypepti-diketjuna, jonka MP oli 6 000, ja antiseerumin inkubointi peptidi III -ylimäärän kanssa salpasi näiden molekyylien immunologisen reaktiivisuuden. Suurimolekyylinen kokoluok-20 ka sitä vastoin sisälsi kolmea immuunireaktiivista peptidiä, MP - 24 000, MP - 40 000 ja MP = 42 000; peptidi III -ylimäärän lisääminen salpasi myös näiden peptidien immunologisen reaktiivisuuden. Kaikissa kaistoissa havaittiin radioaktiivinen vyöhyke, jonka liikkumisnopeus vas-25 tasi molekyylipainoa 43 500. Peptidi III -ylimäärän lisääminen poisti epätäydellisesti tämän materiaalin ja se havaittiin yhtäläisesti kaikissa kokeissa analysoitavasta näytteestä riippumatta; siksi se näyttää edustavan kokeessa muodostunutta keinotekoista tuotetta. On huomionarvots-30 ta, ettei suurimolekyylisessä kokoluokassa havaittu TGF;ää, jonka MP - 6 000. Nämä tulokset osoittavat, että suurempimolekyyliset rTGF-kokoluokat edustavat erillisiä TGF:n muotoja.

47 89 061

Esimerkki VIII

Synteettinen rTGF-fragmentti, joka sitoutuu reseptoreihin ja on antigeeninen

Peptidit

5 Hiiren leuanalussylkirauhasista eristettiin EGF

uuttamalla 1 M HCl:lla, joka sisälsi 1 % trifluorietikka-happoa (TFA), 5 % muurahaishappoa ja 1 % NaCl:a, konsentroimalla Sep-Pak -kolonneilla (Waters) ja tekemällä RP-HPLC Bondapak C-18 -kolonneilla (Waters) Elsonin et ai.'in 10 kuvaamalla tavalla [Biochemistry Int., 8 (1984) 427 - 435]. Luonnon rotan TGF:n kokonaissynteesi on kuvattu edellä esimerkissä V.

Synteettiset peptidifragmentit valmistettiin 1 % divinyylibentseeniä sisältävällä kloorimetyyli-polystyree-15 nihartsilla (Bio-Rad) käyttämällä Na-t-butoksikarbonyyli-suojausta. Peptideistä poistettiin suojaus ja ne irrotettiin hartsista käyttämällä HF:a tai, C-päästä suojattujen analogien ollessa kyseessä, peptidi irrotettiin ensin am-monolyysillä (NH3/MeOH). Raakapeptidit, joista oli poistet-20 tu suojaus, laimennettiin ja syklisoitiin disulfidimuotoon hapettamalla 0,01 M K3Fe(CN)6:11a. Peptidiliuos laitettiin Bio-Rex 70 -kationinvaihtokolonnille, pestiin H20:lla (300 ml) ja eluoitiin AcOH-gradientilla (-> 50 %). Peptidi puhdistettiin preparatiivisella HPLCillä kolonnissa (2,5 x 25 100 cm, Altex), joka oli täytetty Vydac 218TP C-18:11a, käyttäen eluenttina 20-%:ista CH3CN-liuosta, joka sisälsi 0,03 mol/1 NH40Ac:a (pH 4,5) (10). Peptidit 1 ja 2 edustavat rTGF:n aminohapposekvenssejä 34 - 43, joilla on suojaamattomat tai vastaavasti suojatut päät (N - Ac, C -30 amidi). Peptidi 3 on vastaavan hTGF-silmukan metyyliesteri (Ac-Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Ala-Arg-CysOMe), joka on valmistettu siirtoesteröinnillä hartsista (emäs/MeOH).

Immunogeenin valmistus ja immunologinen määritys TGF-peptidi 1 liitettiin tulivuorikotilon hemosya-.35 niinin (KLH) tai naudan seerumin albumiiniin tioli/ma- 48 8 9061 leimidisidoksella [King et ai., J. Inununol. Methods 28 (1979) 201 - 206]. Kantaja-peptidikompleksit puhdistettiin geelisuodatuksella. Saatiin keskimäärin 60 mol peptidiä/1 mol KLH:a ja 20 ml peptidiä/1 mol BSA:a. Kaniinit immuni-5 soitiin KLH:n ja peptidin 1 konjugaatilla injektoimalla useaan kertaan 2 mg proteiinia täydellisessä Freundin apuaineessa ihonalaisesti (s.c.) tai lihaksensisäisesti (i.m.). Kaniineille annettiin tehosteet kahden viikon väliajoin injektoimalla s.c. immunogeeniä epätäydellisessä 10 Freundin apuaineessa. Viiden tehosteen jälkeen kerätyn antiseerumin IgG-fraktio käytettiin immunologisiin määrityksiin ja se leimattiin radionuklidilla käyttämällä Na125I:a (NEN) ja Enzymobeads-helmiä (Bio-Rad) siten, että laskentatulos oli 4 x 105 cpm/yg proteiinia. 94-kuoppaiset 15 polyvinyylikloridilevyt (Costar) päällystettiin liuoksella, joka sisälsi 200 pg/ml BSA:n ja peptidin 1 konjugaat-tia, ja vastapäällystettiin fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella, joka sisälsi 10 % normaalin kaniinin seerumia. Levyjä inkuboitiin 4 tuntia lämpötilas-20 sa 37 eC [l25I] anti (KLH - peptidi l)-IgG:n kanssa (50 000 cpm/kuoppa) inhibiittorien läsnä- tai poissaollessa, pestiin ja yksittäisten kuoppien radioaktiivisuus laskettiin.

Radioreseptorimääritys

Ihmisen orvaskesisyöpäsoluja A-431 tai ihmisen esi-25 nahkafibroblasteja (HFF), jotka oli kerätty primaarivil-jelmistä, kasvatettiin yhtenäiseksi pinnaksi 24-kuoppai-sissa ryhmämaljoissa (Costar) Dulbeccon minimialustassa (Dulbecco's minimal essential medium, DMEM, Gibco), joka sisälsi 10 % naudan sikiön seerumia (FCS, Hyclone). EGF 30 leimattiin radiojodilla edellä kuvatulla tavalla pulssi-määrällä 4 x 104 - 8 x 104 cpm/mg proteiinia. Soluja inkuboitiin lämpötilassa 4 "C 60 min DMEM:ssä (pH 7,4, 20 mmol/1 Hepe-siä), joka sisälsi 1 mmol/1 [125I]-EGF:ää ja 0,1 % BSA:ta, inhibiittoripeptidien läsnäollessa. Solut . 35 pestiin kolmesti kylmällä puskuriliuoksella, hajoitettiin 49 89061 0,1 M NaOH:lla, ja soluihin kytkeytynyt radioaktiivisuus mitattiin (ganunalaskuri). Epäspesifinen sitoutuminen, joka määritettiin 100-kertaisen ylimäärän kylmää EGF:ää läsnä ollessa, oli alle 5 % ja alle 10 % spesifisestä sitoutumi-5 sesta A431-soluille ja vastaavasti HFF-soluille.

Solujen proliferaatiomääritys HFF-soluja kasvatettiin yhtenäiseksi kerrokseksi 48kuoppaisissa ryhmämaljoissa DMEM:ssä, joka sisälsi 10 % FCS:a, Ja lisääntyminen pysäytettiin pitämällä soluja 2 10 vrk ravintovajauksessa DMEM:ssä, joka sisälsi 0,5 % FCS:a. Mitogeeneja ja peptidejä inkuboitiin solujen kanssa lämpötilassa 37 “C 18 tuntia ennen 4 tunnin käsittelyä 1 pCi:llä [3H]-metyylitymidiinä (NEN) ja määritettiin tri-kloorietikkahapolla saostuva radioaktiivisuus.

15 KLH:n ja peptidin 1 konjugaattia vastaan muodoste tut kaniinin vasta-aineet reagoivat BSA-TGF-peptidin kanssa kiinteäfaasi-RIA:n mukaan. Tätä reaktiota inhiboi kon-sentraatiosta riippuvalla tavalla peptidi 1 ja hieman vähemmän luonnon TGF. EGF ei sitä vastoin aiheuttanut mer-20 kittävää inhibitiota.

Rotan TGF syrjäyttää kompetitiivisesti EGF:n sitoutumisen reseptoreihinsa. TGF-peptidien kyky kilpailla [125I]-EGF:n kanssa sitoutumisesta joko A-431-soluihin tai HFF-soluihin arvioitiin. Peptidi 1 esti osittain [125I]-25 EGF:n sitoutumisen A-431-soluihin pitoisuuden ollessa > 10'6 mol/1. Peptidien 2 ja 3 kyky estää sitoutumista oli parempi; IC50-arvot olivat 4 x 10*6 mol/1 ja vastaavasti 4 x 10‘7 mol/1 (ts. noin 0,02 ja 0,2 % EGF:n tai TGF-a:n sitou-tumistehosta). Samanlaisia havaintoja tehtiin EGF:n inhi-30 bitiosta HFF-soluilla (taulukko IX). Näiden vuorovaikutusten reseptorispesifisyyttä valaisee näiden peptidien kyvyttömyys estää endoteelisolukasvutekijän sitoutuminen tai mitogeeninen vaikutus HFF-soluihin (ei esitetä).

Millään TGF-peptideistä ei ollut luontaisia mito-35 geenisiä ominaisuuksia pitoisuuteen 10~5 mol/1 asti inku- so 89 061 hoitaessa niitä lisääntymättömien HFF-solujen kanssa (tuloksia ei esitetä). TGF-peptidit estivät kuitenkin pitoisuudesta riippuvalla tavalla DNA-synteesin indusoinnin lisääntymättömissä HFF-soluissa EGF:n vaikutuksesta. Nämä 5 antagonistit olivat yhtä tehokkaita käytettäessä TGF:ää mitogeenina (taulukko IV). Samoin kuin sltoutumistehokin TGF-peptidien antagonistinen teho parani suljettaessa amino- ja karboksipäät.

Taulukko IV

10 Synteettisten TGF-fragmenttien biologinen aktiivisuus ---— —— ' b

Mitogeneesin esto

Sitoutuminen3 IC^g (M) *^50 ^ _A-431_HFF_EGF_TGF <>C_ 15 Peptidi 1 8 + 2 x 10-5 6 + 2 x 10 5 >10 5 >10 5

Peptidi 2 4 +_ 2 x 10-6 2 ± 2 x lO-6 5 + 2 x 10 6 3 t 1 χ 10 6

Peptidi 3 4 ♦ 1 x 10 3 _+_ 1 x 10 6 + 2 x 10 5 +_ 3 x 10 20 *IC50-arvot laskettu inhibitiokäyristä, jotka kuvaa vat [125I]-EGF:n (1 nM) sitoutumista soluihin. bIC50-arvot ovat pitoisuuksia, jotka alentavat puoleen vertailunäyt-teen kyvyn edistää [3H]-metyylityrniidin ottoa lisääntymät-tömiin HFF-soluihin, jotka on indusoitu EGF:llä tai 25 TGF:11a (1 nM).

Claims (14)

1. Menetelmä terapeuttisesti aktiivisten vasta-aineiden valmistamiseksi, joita vasta-aineita muodostuu bio-* 5 logisesti aktiivisille polypeptide!Ile, joilla on kaava 5 10 Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-R-Cys-Pro-Asp-Ser-His-Thr- 15 20 25

10 Gln-R’-Cys-Phe-His-Gly-Thr-Cys-Arg-R"-Leu-Val-Gln- 30 35 Glu-R1-Lys-Pro-Ala-Cys-Val-Cys-His-Ser-Gly-R’”- 40 45 50 Val-Gly-R2-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala 15 jossa R on Asp tai Lys, R' on Phe tai Tyr, R" on Ser tai Phe, R'" on Phe tai Tyr, R1 on Asp tai Glu ja R2 on Ala tai Vai, tai näiden polypeptidien aminohapposekvenssin 1-13, 20 34 - 43, 34 - 50 tai 39 - 50 käsittäville oligopeptidi- fragmenteille, tunnettu siitä, että a) polyklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi hyperimmunisoidaan selkärankainen, tyypillisesti kotieläin, mainitulla biologisesti aktiivisella polypeptidillä : 25 tai sen oligopeptidifragmentilla tai näiden immunogeeni-konjugaatilla, ja veri kerätään kohta toistuvien immunisointien jälkeen ja gammaglobuliini eristetään, tai b) monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi hyperimmunisoidaan pieni eläin, tyypillisesti hiiri tai 30 rotta, mainitulla biologisesti aktiivisella polypeptidillä tai sen oligopeptidifragmentilla tai näiden immunogeeni-konjugaatilla, perna poistetaan ja lymfosyytit yhdistetään myeloomasolujen kanssa sopivan fuusiopromoottorin läsnä ollessa ja syntyvät hybridisolut seulotaan yksittäisten, : 35 yhtä ainoata vasta-ainelajia antigeenille erittävien kloo nien eristämiseksi. 52 8 9 061

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R on Asp, R’ on Phe, R'" on Tyr, R1 on Asp ja R2 on Ala.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että vasta-aineet muodostetaan oli-gopeptidifragmentille, joka käsittää aminohapposekvenssin A) Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-Lys-Cys-Pro-Asp-Ser-His-Thr B) Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys C) Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-

10 Ala-Asp-Leu-Leu-Ala tai D) Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aineet muodostetaan oligopeptidifragmentille, joka käsittää aminohapposekvens- 15 sin Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Ala-Arg-Cys.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine on poly-klonaalinen.

6. Biologisesti aktiivinen, oleellisesti puhdistet- 20 tu polypeptidi, jolla on kaava 5 10 Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-R-Cys-Pro-Asp-Ser-His-Thr- 15 20 25

25 Gln-R'-Cys-Phe-His-Gly-Thr-Cys-Arg-R"-Leu-Val-Gln- 30 35 Glu-R1-Lys-Pro-Ala-Cys-Val-Cys-His-Ser-Gly-R'"- 40 45 50 Val-Gly-R2-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala 30 jossa R on Asp tai Lys, R' on Phe tai Tyr, R" on Ser tai Phe, R'" on Phe tai Tyr, R1 on Asp tai Glu ja R2 on Ala tai Vai, tai tämän polypeptidin aminohapposekvenssin 1-13, 35 34 - 43, 34 - 50 tai 39 - 50 käsittävä oligopeptidifrag- mentti. 53 89061

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että R on Asp, R' on Phe, R' " on Tyr, R1 on Asp ja R2 on Ala.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen polypeptidi, • 5 tunnettu siitä, että se on oligopeptidifragmentti, joka käsittää aminohapposekvenssin A) Val-Val-Ser-His-Phe-Asn-Lys-Cys-Pro-Asp-Ser-His-Thr B) Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys C) Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-

10 Ala-Asp-Leu-Leu-Ala tai D) Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-His-Ala-Asp-Leu-Leu-Ala.

9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että se on oligopeptidifragmentti, joka käsittää aminohapposekvenssin

15 Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Ala-Arg-Cys. 54 8 9 Ο β 1