JPH0527394B2

JPH0527394B2 -

Info

Publication number: JPH0527394B2
Application number: JP59127118A
Authority: JP
Inventors: Yoshimi Kawade; Yoko Yamamoto; Masamichi Ueda; Keizo Myata
Original assignee: Ishihara Sangyo Kaisha Ltd
Current assignee: Ishihara Sangyo Kaisha Ltd
Priority date: 1984-06-20
Filing date: 1984-06-20
Publication date: 1993-04-21
Also published as: JPS617300A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ヒトγ−インターフエロン（以下ヒ
トγ−IFNと略す）に対して特異性があるモノク
ローナル抗体に関する。

ヒトγ−IFNは、ヒト白血球が産生する糖蛋白
質で、生態がウイルスに感染したとき、或は生体
内で免疫反応が生じたとき産生されるものであ
り、このものはモデル動物の癌疾患モデルにおい
てα型やβ型よりも強い癌の成長抑制がみられ、
このものは極めて微量で高い活性を持つたもので
ある。

従来、ヒト白血球からヒトγ−IFNを製造する
方法は、アイ・アール・シー・エス・メデイカ
ル・サイエンス：７巻、559頁、1979（エツチ・エ
イ・ジエンソン）、ユーロピアン・ジヤーナル・
オブ・イミユノロジー：10巻、871〜883頁、1980
（マクデリー）、プロシーデイングス・オブ・ザ・
ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユ
ー・エス・エイ：78巻、３号、1601〜1605頁、
1981（ワイ・ケイ・イツプ）などにより知られて
いる。しかし、これらの方法により得られた培養
瀘液中には、誘発物質として加えられた異種蛋白
や毒素及び多くの血清蛋白が混在しつているた
め、これを人体に投与するには充分精製する必要
がある。

この精製法について培養瀘液から吸着剤を用い
てヒトγ−IFNを吸着・溶出する方法、例えば
SPセフアデツクス、CMセフアデツクス（以上特
開昭55−64799）、コンカナバリンＡセフアロー
ス、バイオ、ゲルＰ−200（プロシーデイングス・
オブ・ザ・ナチヨナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス・ユー・エス・エイ：78巻、３号、1601〜
1605頁、1981）などの吸着剤を用いる方法は公知
である。しかしながら、より有効、効率的なイン
ターフエロンの精製法が求められている。本発明
者は、鋭意研究の結果、抗ヒトγ−IFNモノクロ
ーナル抗体に着目し、ヒトγ−IFNに対する特異
性を有する新規な２種類の抗ヒトγ−IFNモノク
ローナル抗体を取得し、この抗ヒトγ−IFNモノ
クローナル抗体を用いて高純度のヒトγ−IFNに
精製することができるという知見を得、本発明を
完成した。

すなわち、本発明はヒトγ−IFNに対して特異
性があり、還元剤存在下でのSDS電気泳動法によ
る分子量が26000及び50000を示し、IgG1サブク
ラスに属するものであつて、ヒトγ−インターフ
エロンの吸着容量が1.55×10⁷U／mgであることを
特徴とする、抗ヒトγ−IFNモノクローナル抗体
である。

本発明における抗ヒトγ−IFNモノクローナル
抗体の製造方法としては、ヒトγ−IFNで免疫し
たBALB／Ｃマウスの抗体産生細胞とBALB／
Ｃマウスの骨髄腫細胞との間にハイブリドーマを
形成させ、該ハイブリドーマをクローン化して抗
ヒトγ−IFN抗体を産生するクローンを選択し、
このように選択されたクローンを使用する方法で
ある。

ここでいう抗体産生細胞としては、ヒトγ−
IFNで免疫したBALB／Ｃマウスの脾臓またはリ
ンパ節の細胞中に存在する抗体産生細胞であり、
ここで用いるヒトγ−IFNとしては、ヒト末梢白
血球由来のもので、フエニルセフアロース、ケイ
酸、コンカナバリンＡセフアロース、CM−トヨ
パール650S及びバイオ・ゲルＰ−100の順に用い
て精製したものがよい。BALB／Ｃマウスの骨
髄腫細胞としては、X63−Ag8.653、P3−X63−
Ag8−U1などが用いられる。

ハイブリドーマの形成とクローン化は、例えば
次のようにして行なう、ポリエチレングリコール
（PEG）、センダイウイルス（HVJ）などを用い
て、前記抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させ
る。生じたハイブリドーマはヒポキサンチン、ア
ミノプテリン、チミジンを含む培地中で生育す
る。融合しなかつた抗体産生細胞と骨髄腫細胞
は、該培地中では共に死滅し、ハイブリドーマだ
けが個々のクローンから増殖してくる。生育した
ハイブリドーマから抗γ−IFN抗体を産生するク
ローンが選択される。全てのハイブリドーマクロ
ーンが抗体を産生するわけではない。また個々の
クローンによつて産生される抗体は特異性が異な
り、全てのクローンが抗ヒトγ−IFN抗体を産生
するのではない。従つて、ヒトγ−IFNに対して
特異性を示す抗体を産生するクローンを選択しな
ければならない。

抗ヒトγ−IFN抗体産生クローンの選択は、例
えば予めうさぎの抗マウスIgG抗体をコーテイン
グしたウエル内にハイプリドーマクローンの培養
上清を入れ、抗ヒトγ−IFNモノクローナル抗体
を吸着させた後、一定濃度のヒトγ−IFN溶液を
加え、このものを吸着させる。充分洗浄した後、
ヒトγ−IFNを溶出し、溶出液中のヒトγ−IFN
含量は、FL細胞に対するシンドビスウイルスの
細胞病変効果によつて測定される。

選択されたアイブリドーマは、インビトロで長
期連続継代培養することができ、或は組織適合性
動物または胸腺欠如ヌードマウス中において生育
することができる。

前述の培地、腹水中に産生された目的とするモ
ノクローナル抗体は、通常の塩析、アフイニテイ
ークロマトグラフイー糖の精製操作により回収で
きる。

而して、本発明により得られた抗ヒトγ−IFN
モノクローナル抗体を担体樹脂などに結合させ
て、アフイニテイークロマトグラフイーを行なう
ことによつて、ヒトγ−IFNを特異的に精製して
極めて純度の高いヒトγ−IFNを容易に得ること
ができる。また従来、微量にしか血中に存在しな
いために困難とされていた血中ヒトγ−IFNの定
量が可能となつた。すなわち、血中のヒトγ−
IFNは、抗ヒトγ−IFNを用いたラジオイム／ア
ツセイ或はエンザイムイム／アツセイにより容易
に定量することができる。

ヒトγ−IFNを特異的に精製する方法として
は、抗ヒトγ−IFNモノクローナル抗体をブロモ
シアンて活性化したセフアロース等の支持体に結
合させ、カラムを作成し、アフイニテイークロマ
トグラフイーを行なうことによつて精製すること
ができる。すなわち、PHが中性付近の溶媒を用い
てヒトγ−IFNを特異的に抗体カラムに吸着させ
た後、同一の溶媒で充分洗浄し、PHを10〜11付近
で溶媒で結合していたヒトγ−IFNを溶出し、得
られた溶出液をただちにPHを中性付近に戻すこと
により、活性を失うことなく、高純度のヒトγ−
IFNを得ることができる。

次に、本発明の抗ヒトγ−IFNモノクローナル
抗体を製造するための一例を挙げるが、本発明を
さらに詳細にするためのものである。

(1) 抗体産生ハイブリドーマの製造例抗原に用いたヒトγ−IFNは、比活性が１×
10⁴U／mg蛋白の粗材料をフエニルセフアロー
ス（フアルマシア社製）、ケイ酸、コンカナバ
リンＡセフアロース（フアルマシア社製）、
CM−トヨパール650S（東洋ソーダ社製）及び
バイオ・ゲルＰ−100（バイオ・ラツド社製）の
順に用いて精製して、比活性４×10⁵U／mg蛋
白としたものである。このヒトγ−IFN8×
10⁴Uを雌BALB／Ｃマウスの皮下に注射し免
疫する。30日後、さらにこのヒトγ−IFN7×
10⁴Uを皮下に注射し、補助免疫する。さらに、
28日後このヒトγ−IFN1.8×10⁶Uを腹腔内注
射し、補助免疫する。

最終補助免疫から３日後に、この雌
BALB／Ｃマウスの脾臓を摘出し、細胞浮遊
液をユーロピアン・ジヤーナル・オブ・イミユ
ノロジー：５巻、720頁、1975（ゲルハルト）の
方法に従つて調整し、融合のための抗体産生細
胞とする。

次に、上記で調整した抗体産生細胞と、15％
半胎児血清を含むRPMI−1640培地（日水製薬
社製）中で増殖させたBALB／Ｃマウスの骨
髄腫細胞X63−Ag8.653とをプロシーデイング
ス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス・ユー・エス・エイ：74巻、
2985頁、1977（コプロフスキー）の方法に従つ
てポリエチレングリコール1500（BDHケミカル
ズ社製）存在下に融合させる。

融合処理後、これらの細胞をHT培地に懸濁
し、組織培養プレートの192個のウエルにそれ
ぞれ接種する。培養開始後１日目、２日目、４
日目、７日目、９日目、10日目に培地の半量を
HAT培地に交換する。

培養開始後15日目に、この培養上清の一部を
取り、予めうさぎの抗マウスIgG抗体をコーテ
イングしたウエル内に入れ、抗体を吸着させた
後、ヒトγ−IFN10³U／ml溶液0.1mlを加えて、
ヒトγ−IFNを吸着させる。燐酸緩衝液で十分
洗浄した後、0.5M塩化ナトリウム及び0.1％牛
血清アルブミンを含有する50ｍＭ炭酸ナトリウ
ム溶液（PH11）にて、ヒトγ−IFNを溶出す
る。溶出液中のヒトγ−IFN含量をFL細胞に
対するシントビスウイルスの細胞病変効果によ
つて測定した。192ウエル中11ウエルの培養上
清にヒトγ−IFN吸着活性を認めた。活性を認
めた11ウエル中５ウエルのハイプリドーマにつ
いて限界希釈法によりクローニングを行い、
163のモノクローンを得、うち104クローンにつ
いてヒトγ−IFN吸着活性を認めた。これらの
うちから、活性の高い２クローン（E4−18及
びG4−15）を選択した。

(2) 抗ヒトγ−IFNモノクローナル抗体の製造例前記工程で得られたE4−18クローン或はG4
−15クローンの各々の細胞10⁷個をBALB／Ｃ
マウスの腹腔内に移植し、２〜３週間後に腹水
を採取する。採取した腹水は、遠心分離によ
り、細胞を除去し、各々の上清を得た。この上
清を50％飽和の硫酸アンモニウムで塩析し、生
じた沈澱を小量の燐酸緩衝液（PH7.2）に溶解
する。溶液を20％飽和の硫酸アンモニウムで再
度塩析し、生じた沈澱を除去し、上清に50％飽
和となるよう硫酸アンモニウムを添加し、再度
塩析を行ない、生じた沈澱を採取する。沈澱を
少量の10ｍＭ、燐酸緩衝液（PH８）に溶解した
後、同じ緩衝液で一昼夜透析を行なう。透析後
の各々のサンプルは、予め同じ緩衝液で平衡化
したプロテインＡセフアロース（フアルマシア
社製）のカラムに吸着させ、次いで0.5M、塩
化ナトリウムを含む0.1Mクエン酸緩衝液（PH
５）で溶出する。溶出した蛋白含有画分を集
め、0.5M塩化ナトリウムを含む燐酸緩衝液
（PH7.2）で透析する。得られた抗体溶液は0.05
％のナトリウムアザイドを添加して４℃で保存
する。

E4−18クローンから得られた抗ヒトγ−
IFNモノクローナル抗体は、還元剤（２−メル
カプトエタノール）の存在下での、SDS電気泳
動法で、分子量50000と26000との２本のバンド
が得られ、G4−15クローンから得られた抗ヒ
トγ−IFNモノクローナル抗体は、同様にし
て、分子量50000と26000との２本のバンドが得
られた。

(3-1) ヒトγ−IFN精製例前記工程で得られたE4−18クローン由来の
抗ヒトγ−IFNモノクローナル抗体をプロムシ
アンで活性化したセフアロース（フアルマシア
社製）に結合させ、ヒトγ−IFN精製用ゲルを
作成し、このゲル２ml（抗体吸着量２mg）でカ
ラム（直径1.3cm、長さ1.5cm）を作成した。

ヒトγ−IFNを含有するヒト末梢血リンパ球
培養液1950ml（蛋白質：1787mg、比活性：１×
10⁴U／mg 蛋白）を、フエニル・セフアロー
ス・カラム（フアルマシア社製）を通して前処
理し、次いで限外瀘過去で濃縮し、濃縮物226
ml（蛋白質：1466mg、比活性：１×10U／mg
蛋白）を得た。

前記工程で得た濃縮物226mlを前記工程で作
成したカラムに吸着させ、十分量の燐酸緩衝液
で洗浄した後、0.5Mの塩化ナトリウムを含む
50ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（PH11）で、ヒト
γ−IFNを溶出した。溶出液はただちに0.5M.
燐酸二水素ナトリウムで中和し、ヒトγ−IFN
含量をFL細胞に対するシンドビスウイルスの
細胞病変効果によつて定量した。この結果、抗
ヒトγ−IFN抗体カラムからの溶出画分は3.7
mlであり、蛋白質は0.24mgであり、比活性は
1.3×10⁵U／mg 淡白であつた。ここで抗体１
mg当りのヒトγ−IFNの吸着容量は1.55×10⁷U
で、精製度は13000倍であることがわかる。

得られた精製ヒトγ−IFNはSDS電気泳動法
により第１図に示すように、分子量約25000、
20000、15000に相当する３種のバンドを与え、
いずれもヒトγ−IFN活性を示した。（３−２）
前記工程(2)で得られたG4−15クローン由来の
抗ヒトγ−IFNモノクローナル抗体について、
前述の（３−１）と同様にしてほぼ同等の結果
が得られる。ここで添付の図面第１図について
説明する。

（１の列）分子量算出用の分子量既知蛋白質群を示す。
上より各々68000〜45000、31000、21000、
17800及び12600の分子量をもち、各々μｇの重
量をもつ。

（２の列）１の列と同じ分子量既知の蛋白質群を示し、
各々5μｇの重量をもつ。

（３の列） E4−18アフイニテイーカラムから溶出した
精製ヒトγ−IFN分子を示し、上より各々約
25000、20000及び15000の分子量の位置に相当
することがわかる。

（４の列）３の列と同じ精製ヒトγ−IFN分子を示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、E4−18クローン由来の抗体を用い
て精製されたヒトγ−IFNのSDS電気泳動法によ
る分子量約25000、20000、15000に相当する３種
のバンドである。

Claims

【特許請求の範囲】１ヒトγ−インターフエロンに対して特異性が
あり、還元剤存在下でのSDS電気泳動法による分
子量が26000及び50000を示すIgG1サブクラスに
属するものであつて、ヒトγ−インターフエロン
の吸着容量が1.55×10⁷U／mgであることを特徴と
する、抗ヒトγ−インターフエロンモノクローナ
ル抗体。２吸着されたヒトγ−インターフエロンが活性
を失わずに回収することができる、特許請求の範
囲第１項記載の抗ヒトγ−インターフエロンモノ
クローナル抗体。