JPS617300A - 抗ヒトγ−インタ−フエロンモノクロ−ナル抗体並びにこれらを使用する方法 - Google Patents
抗ヒトγ−インタ−フエロンモノクロ−ナル抗体並びにこれらを使用する方法Info
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- JPS617300A JPS617300A JP12711884A JP12711884A JPS617300A JP S617300 A JPS617300 A JP S617300A JP 12711884 A JP12711884 A JP 12711884A JP 12711884 A JP12711884 A JP 12711884A JP S617300 A JPS617300 A JP S617300A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒトｒ−インターフェロン（以下ヒ） ｒ
−Ｉ ＦＮと略す）に対して特異性があるモノクローナ
ル抗体、それらの製法及びこれらの抗体をヒトγ−ＩＦ
Ｎの精製処理或は微１・定量に使用する方法に関する。
−Ｉ ＦＮと略す）に対して特異性があるモノクローナ
ル抗体、それらの製法及びこれらの抗体をヒトγ−ＩＦ
Ｎの精製処理或は微１・定量に使用する方法に関する。
ヒトγ−ＩＦＮけ、ヒト白血球が産生ずる糖蛋白質で、
生住がウィルスに感染したとキ、或は生体内で免疫反応
が生じたとき産生されるものであシ、とのものけモデル
１物の隔挟患モデルにおりてβ型やβ型よりも強し１勅
の成長抑制がみられ、とのものＦｉ極めて微量で高す活
性を持ったものである。
生住がウィルスに感染したとキ、或は生体内で免疫反応
が生じたとき産生されるものであシ、とのものけモデル
１物の隔挟患モデルにおりてβ型やβ型よりも強し１勅
の成長抑制がみられ、とのものＦｉ極めて微量で高す活
性を持ったものである。
従来、ヒト白血球からヒトγ−ＩＦＮを製造する方法は
、アイ、テール、シー、ニス、メディカル、サイエンス
エフ巻、５５９負、１９７９（エッチ、エイ、シエンソ
ン）、ユーロビ了ン、ジャーナル、オブ、インユノロジ
ー＝１０巻、８７１〜８８３頁、１９８０（マタデリー
）、プロシーディンゲス。オブ、ザ、ナショナル、了カ
デキー、オプ、サイエンス、ニー、ニス、エイニア８巻
、３号、１６０１〜１６０５頁、１９８１（ソイ。ケイ
、イップ）などにより知られている。しかし、これらの
方法により得られた培養濾液□中にけ、訪発物質として
加えられた異種蛋白や毒素及び多くのｍ清蛋白が混在し
て込るため、これを人体に投与するｌ：は充分精製する
必要がある。
、アイ、テール、シー、ニス、メディカル、サイエンス
エフ巻、５５９負、１９７９（エッチ、エイ、シエンソ
ン）、ユーロビ了ン、ジャーナル、オブ、インユノロジ
ー＝１０巻、８７１〜８８３頁、１９８０（マタデリー
）、プロシーディンゲス。オブ、ザ、ナショナル、了カ
デキー、オプ、サイエンス、ニー、ニス、エイニア８巻
、３号、１６０１〜１６０５頁、１９８１（ソイ。ケイ
、イップ）などにより知られている。しかし、これらの
方法により得られた培養濾液□中にけ、訪発物質として
加えられた異種蛋白や毒素及び多くのｍ清蛋白が混在し
て込るため、これを人体に投与するｌ：は充分精製する
必要がある。
とのｆｉ！！製法につ騒て培養濾液から吸着剤を用いて
ヒトγ−ＩＦＮを吸着、溶出する方法、例、ｊｔハｓ
Ｐセフ了デツクス％ＣＭセフ丁デツクス（以上特開昭５
５−６４７９９）％コンカナバリンＡセフ了り一ス、バ
イオ、ケルＰ−２００（プロシーデイングヌ、オブ、ザ
、ナショナル−”’ カブミーオフ。サイエンス、ニー
、ニス、エイニア８轡、３丹、１６０１〜１６０５頁、
１９８１）などの吸着剤を用いる方法は公知である。し
かしながら、より有効、動車的なインターフェロンのｉ
ｌＪ法が求められている。本発明者鯨は、鋭意研究の結
果、抗ヒトγ−ＩＦＮモノクローナル抗体に着目し、ヒ
トｒ−ＩＦＮに対する特異性を有する新規な２種類の抗
ヒトγ−ＩＦＮモノクローナル抗体を取得し、この抗ヒ
トγ−ＩＦＮモノクローナル抗体を用いて高純度のヒト
γ−ＩＦＮに精製することができるとｂう知見を得１本
発明を完成した。
ヒトγ−ＩＦＮを吸着、溶出する方法、例、ｊｔハｓ
Ｐセフ了デツクス％ＣＭセフ丁デツクス（以上特開昭５
５−６４７９９）％コンカナバリンＡセフ了り一ス、バ
イオ、ケルＰ−２００（プロシーデイングヌ、オブ、ザ
、ナショナル−”’ カブミーオフ。サイエンス、ニー
、ニス、エイニア８轡、３丹、１６０１〜１６０５頁、
１９８１）などの吸着剤を用いる方法は公知である。し
かしながら、より有効、動車的なインターフェロンのｉ
ｌＪ法が求められている。本発明者鯨は、鋭意研究の結
果、抗ヒトγ−ＩＦＮモノクローナル抗体に着目し、ヒ
トｒ−ＩＦＮに対する特異性を有する新規な２種類の抗
ヒトγ−ＩＦＮモノクローナル抗体を取得し、この抗ヒ
トγ−ＩＦＮモノクローナル抗体を用いて高純度のヒト
γ−ＩＦＮに精製することができるとｂう知見を得１本
発明を完成した。
すなわち、本発明はヒトｒ−ＩＦＮに対して特異性があ
シ、還元剤存在下でのＳＤＳ電気泳動法による分子−ｉ
！・カ２６．０００及び５０．０００を示し、ＩｇＧ１
サブクラスに属するものであって、ヒトｒ−インターフ
ェロンの吸着容量が１０７Ｕ以上／ ｍｇであることを
特徴とする、抗ヒトｒ−ＩＦＮモノクローナル抗体、そ
れらの製造方法及びこれらの抗体をヒ） ｒ −Ｉ Ｆ
Ｎの′＃製処理或は倣倉足蓋に使Ｗする方法である。
シ、還元剤存在下でのＳＤＳ電気泳動法による分子−ｉ
！・カ２６．０００及び５０．０００を示し、ＩｇＧ１
サブクラスに属するものであって、ヒトｒ−インターフ
ェロンの吸着容量が１０７Ｕ以上／ ｍｇであることを
特徴とする、抗ヒトｒ−ＩＦＮモノクローナル抗体、そ
れらの製造方法及びこれらの抗体をヒ） ｒ −Ｉ Ｆ
Ｎの′＃製処理或は倣倉足蓋に使Ｗする方法である。
本発明における抗ヒトｒ−ＩＦＮモノクローナル抗体の
製造方法としては、ヒトｒ−ＩＰ’Ｎで免疫したＢＡＬ
Ｂ／Ｃマウスの抗体産生細胞とＢＡＬＢ／Ｃマウヌの骨
髄腫細胞との間にへイブリド０−マを形成させ％該ハイ
ブリＶ −マｆクローン化して抗ヒトｒ−ＩＦＮ抗体を
産生ずるクローンを選択し、このように選択されたクロ
ーンを使用する方法である。
製造方法としては、ヒトｒ−ＩＰ’Ｎで免疫したＢＡＬ
Ｂ／Ｃマウスの抗体産生細胞とＢＡＬＢ／Ｃマウヌの骨
髄腫細胞との間にへイブリド０−マを形成させ％該ハイ
ブリＶ −マｆクローン化して抗ヒトｒ−ＩＦＮ抗体を
産生ずるクローンを選択し、このように選択されたクロ
ーンを使用する方法である。
ことでいう抗体産生細胞としては、ヒトｒ−ＩＦＮで免
疫したＢＡＬＢ／Ｃマウスの肺臓またはリンパ節の細胞
中に存在する抗体産生細胞であシ、こζで周込るヒトｒ
−ＩＦＮとしては、ヒト末梢白血球由来のもので、フェ
ニルセフ了ロース、ケイ酸、コンカナローンＡセフ了ロ
ー’−ｘ、ＣＭ−トヨパール６５０８及びバイオ。
疫したＢＡＬＢ／Ｃマウスの肺臓またはリンパ節の細胞
中に存在する抗体産生細胞であシ、こζで周込るヒトｒ
−ＩＦＮとしては、ヒト末梢白血球由来のもので、フェ
ニルセフ了ロース、ケイ酸、コンカナローンＡセフ了ロ
ー’−ｘ、ＣＭ−トヨパール６５０８及びバイオ。
ゲルＰ−１００の願に用いて籾゛製したものがよ−。Ｂ
ＡＬＢ／Ｃマウスの骨髄Ｍ却Ｉ胞としてけ、Ｘ６３−Ａ
ｇ８．６５３、Ｐ ３− Ｘ ６ Ｂ −Ａｇ８−Ｕｌ
などが甲いられる。
ＡＬＢ／Ｃマウスの骨髄Ｍ却Ｉ胞としてけ、Ｘ６３−Ａ
ｇ８．６５３、Ｐ ３− Ｘ ６ Ｂ −Ａｇ８−Ｕｌ
などが甲いられる。
ハイブリドーマの形Ｉ＋２とクローン化Ｆｉ１例えば次
のようにして行なう、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）、センダイウィルス（ＨＶＪ）などを用いて、前記抗
体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させる。生じたバイブ
リド°−マはヒボキサンチン、了ミノブデリン、チミジ
ンを含む培地中で生育する。融合しなかった抗体産生細
胞と骨髄腫細胞に′ｉ％骸培地中では共に死滅し、ハイ
ブリドーマだけが個々のクローンから増殖してくる。生
育したバイブｌ ）Ｉ−マから抗γ−Ｉ Ｆ’ Ｎ抗体
を産生するクローンが選択される。
のようにして行なう、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）、センダイウィルス（ＨＶＪ）などを用いて、前記抗
体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させる。生じたバイブ
リド°−マはヒボキサンチン、了ミノブデリン、チミジ
ンを含む培地中で生育する。融合しなかった抗体産生細
胞と骨髄腫細胞に′ｉ％骸培地中では共に死滅し、ハイ
ブリドーマだけが個々のクローンから増殖してくる。生
育したバイブｌ ）Ｉ−マから抗γ−Ｉ Ｆ’ Ｎ抗体
を産生するクローンが選択される。
全テノハイプリドーマクローンが抗体を産生ずるわけで
はない。また個々のクローンによって産生される抗体は
特異性が異なシ、全てのクローンが抗ヒ１ｒ−ＩＦ’Ｎ
抗体を産生ずるのではなし。従って、ヒ） ｒ −ＩＦ
Ｎに対して特異性を示す抗体を産生ずるクローンを選択
しなければならない。
はない。また個々のクローンによって産生される抗体は
特異性が異なシ、全てのクローンが抗ヒ１ｒ−ＩＦ’Ｎ
抗体を産生ずるのではなし。従って、ヒ） ｒ −ＩＦ
Ｎに対して特異性を示す抗体を産生ずるクローンを選択
しなければならない。
抗ヒトγ−ＩＦＮ抗体産生クローンの選択は、例えば予
めうさぎの抗マウス１ｇＧ抗体をコーティングしたウェ
ル内にハイブリドーマクローンの培誉上清を入れ、抗ヒ
トｒ−ＩＦＮモノクローナル抗体を吸着させた後、一定
ｆａｋのヒトγ−ＩＦＮ溶液を加え、このものを吸着さ
せる。充分洗浄した後、ヒトｒ−ＩＦＮを溶出し、溶出
液中のヒトｒ−ＩＦＮ含１′は、ＦＬｍｍに対するシン
ドビスウィルスの細胞病変効果によって測定する。
めうさぎの抗マウス１ｇＧ抗体をコーティングしたウェ
ル内にハイブリドーマクローンの培誉上清を入れ、抗ヒ
トｒ−ＩＦＮモノクローナル抗体を吸着させた後、一定
ｆａｋのヒトγ−ＩＦＮ溶液を加え、このものを吸着さ
せる。充分洗浄した後、ヒトｒ−ＩＦＮを溶出し、溶出
液中のヒトｒ−ＩＦＮ含１′は、ＦＬｍｍに対するシン
ドビスウィルスの細胞病変効果によって測定する。
選択されたバイブリド°−マは、インビトロで長期連続
継代培養することができる。或はｍｌ繊織適合動物また
は胸腺欠如ヌードマウス中にお−て生育することができ
る。
継代培養することができる。或はｍｌ繊織適合動物また
は胸腺欠如ヌードマウス中にお−て生育することができ
る。
前述の培地、腹水中に産生された目的とするモノクロー
ナル抗体は、通常の塩析、アフィニティークロマトグラ
フィー等の精製操作により回収できる。
ナル抗体は、通常の塩析、アフィニティークロマトグラ
フィー等の精製操作により回収できる。
而して、本発明によ〕得られた抗ヒトγ−ＩＦＮモノク
ローナル抗体を担体樹脂などに結合サセて、アフィニテ
ィークロマトグラフィーを行なうことによって、ヒトｒ
−ＩＦＮを特異的に精製して極めて純度の高込ヒトｒ−
ＩＦＮを容易に得ることができる。ｔた従来、微量にし
か血中に存在しなりために困難とされていた血中ヒトｒ
−ＩＦＮの定量が可能となった。すなわち、血中のヒト
ｒ−ＩＦＮは、抗ヒトｒ−ＩＦＮを用いたラジオイム／
アッセイ或はエンザイムイム／了ツセイにより容易に定
１することができる。
ローナル抗体を担体樹脂などに結合サセて、アフィニテ
ィークロマトグラフィーを行なうことによって、ヒトｒ
−ＩＦＮを特異的に精製して極めて純度の高込ヒトｒ−
ＩＦＮを容易に得ることができる。ｔた従来、微量にし
か血中に存在しなりために困難とされていた血中ヒトｒ
−ＩＦＮの定量が可能となった。すなわち、血中のヒト
ｒ−ＩＦＮは、抗ヒトｒ−ＩＦＮを用いたラジオイム／
アッセイ或はエンザイムイム／了ツセイにより容易に定
１することができる。
ヒトγ−ＩＦＮｔ？特異的に精製する方法としては、抗
ヒトｒ−ＩＦＮモノクローナル抗体をブロモシアンで活
性化したセフ丁ロース等の支持体に結合させ、カラムを
作成し、アフィニティークロマトグラフィーを行なうこ
とによって精製することができる。すなわち、ＰＨが中
性付近の溶媒を用いてヒ） ｒ −Ｉ Ｆ Ｎを！異的
に抗体カラムに吸着させた径、同一の溶媒で充分洗浄し
、ＰＨを１０〜ｌｌ付近の溶媒で結合しティたヒトｒ−
ＩＦＮを溶出し、得られた溶出液をただちにＰＨを中性
付近に戻すことにより、活性を失うことなく、高純度の
ヒトγ−ＩＦＮｆｔ得ることができる。
ヒトｒ−ＩＦＮモノクローナル抗体をブロモシアンで活
性化したセフ丁ロース等の支持体に結合させ、カラムを
作成し、アフィニティークロマトグラフィーを行なうこ
とによって精製することができる。すなわち、ＰＨが中
性付近の溶媒を用いてヒ） ｒ −Ｉ Ｆ Ｎを！異的
に抗体カラムに吸着させた径、同一の溶媒で充分洗浄し
、ＰＨを１０〜ｌｌ付近の溶媒で結合しティたヒトｒ−
ＩＦＮを溶出し、得られた溶出液をただちにＰＨを中性
付近に戻すことにより、活性を失うことなく、高純度の
ヒトγ−ＩＦＮｆｔ得ることができる。
次に、本発明の抗ヒトγ−ＩＦＮモノクローナル抗体を
製造するための一例を挙げるが、本発明をさらに詳細に
するためのものである。
製造するための一例を挙げるが、本発明をさらに詳細に
するためのものである。
（１）抗仕産生ハイブリド−マの製造側抗原に用いたヒ
トγ−ＩＦＮは、比活性が１ ｘ １ａ’ Ｕ／ｍｇ／
白の粗材料をフェニルセフ了ロース（）了ルマシ丁社製
）、ケイ酸、コンカナバリンＡセフ了ロース（ファルマ
シア社！ｌ！Ｉ）、ＣＭ−）ヨバール６ｓＯ８（＊洋ソ
ーダ社製）及びバイオ、ゲルＰ−１００（バイオ、ラッ
ド社製）の順に用−て精製して、比活性４ Ｘ １０”
Ｕ／ｍｇ蛋白としたものである、このヒトｒ−ＩＦＮ８
Ｘ１０’Ｕを雌ＢＡＬＢ／Ｃマウヌの皮下に注射し免疫
する。３０日ｖ％さらにこのヒトｒ−ＩＦＮ７Ｘ１０’
Ｕを皮下に注射し、補助免疫する。さらに、２８日俵こ
のヒトｒ−ＩＦＮ１．８Ｘ１ｏ’ Ｕを腹腔内注射し、
補助免疫する。
トγ−ＩＦＮは、比活性が１ ｘ １ａ’ Ｕ／ｍｇ／
白の粗材料をフェニルセフ了ロース（）了ルマシ丁社製
）、ケイ酸、コンカナバリンＡセフ了ロース（ファルマ
シア社！ｌ！Ｉ）、ＣＭ−）ヨバール６ｓＯ８（＊洋ソ
ーダ社製）及びバイオ、ゲルＰ−１００（バイオ、ラッ
ド社製）の順に用−て精製して、比活性４ Ｘ １０”
Ｕ／ｍｇ蛋白としたものである、このヒトｒ−ＩＦＮ８
Ｘ１０’Ｕを雌ＢＡＬＢ／Ｃマウヌの皮下に注射し免疫
する。３０日ｖ％さらにこのヒトｒ−ＩＦＮ７Ｘ１０’
Ｕを皮下に注射し、補助免疫する。さらに、２８日俵こ
のヒトｒ−ＩＦＮ１．８Ｘ１ｏ’ Ｕを腹腔内注射し、
補助免疫する。
最終補助免疫から３日後に、この雌ＢＡＬＢ／Ｃマウス
のｎ臓を摘出し、細胞浮遊液をユーロビ了ン。ジャーナ
ル。オブ、インユノロジー＝５巻、７２０頁、１９７５
（ゲルハルト）の方法に従って調整し、融合のための
抗体産生細胞とする。
のｎ臓を摘出し、細胞浮遊液をユーロビ了ン。ジャーナ
ル。オブ、インユノロジー＝５巻、７２０頁、１９７５
（ゲルハルト）の方法に従って調整し、融合のための
抗体産生細胞とする。
次に、上記で調整した抗体並生細胞と、１５％半胎児血
清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（田水製薬社製）中で
増殖させたＢＡＬＢ／Ｃマウスの骨髄腫細胞Ｘ６３−Ａ
ｇ８ 、６５３とをブロシーデインダス、オプ、ザ、ナ
ショナル、了カデミー、オプ、サイエンス、ニー。
清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（田水製薬社製）中で
増殖させたＢＡＬＢ／Ｃマウスの骨髄腫細胞Ｘ６３−Ａ
ｇ８ 、６５３とをブロシーデインダス、オプ、ザ、ナ
ショナル、了カデミー、オプ、サイエンス、ニー。
ニス、エイ＝７４巻、２９８５頁、３９７７（コブロア
スキー）の方法に従ってポリエチレングリコール１５０
０（ＢＤＨケミカルズ社Ｍ）任在下に融合させる、 融合処１！！彼、これらの細胞を■■Ｔ培地に懸濁し％
組稙培誉プレートの１９２個のウェルにそれぞれ接種す
る。培養開始後１８目、２Ｈ目、４日１．７日月、ｅＥ
１１．１０日目に培地の半量を）ＩＡ’ｌ＠地に交換す
る。
スキー）の方法に従ってポリエチレングリコール１５０
０（ＢＤＨケミカルズ社Ｍ）任在下に融合させる、 融合処１！！彼、これらの細胞を■■Ｔ培地に懸濁し％
組稙培誉プレートの１９２個のウェルにそれぞれ接種す
る。培養開始後１８目、２Ｈ目、４日１．７日月、ｅＥ
１１．１０日目に培地の半量を）ＩＡ’ｌ＠地に交換す
る。
培養開始後１５日月に、この培養上清の一部を取り、予
めうさぎの抗マウスＩｇＧ抗体をコーティングしたウェ
ル内に入れ、抗ａ＝１吸着させた後、ヒト’ｒ −Ｉ
ＦＮ １０”Ｕ／ｍｌ溶液０．ｌ耐を加えて、ヒトγ−
ＩＦ’Ｎを成鳥させる。ｂｈＲ緩衝液で十分洗浄した後
％０．５Ｍ塩化ナトリウム及び０．１％牛血清了ルブミ
ンを含有する５ ０ ｍＭ戻酸ナトリウム溶液（ＰＨＩ
Ｉ）にて、ヒトｒ−ＩＦＮを溶出する。溶出液中のヒト
ｒ−ＩＦＮ含せをＦＬａＩＪＩ民に対するシンドビスウ
イルスの細胞病変効果によって測定した。１９２ウエル
中１１ウエルの培養上清にヒトγ−ＩＦＮ吸着活性を認
めた。活性を認めた１１ウエル中５ウエルのバイブリド
°−マにつＡて限界希釈法によりクローニングを行い、
１６３のモノクローンを得、うち１ｏ４クローンについ
てヒトｒ−ＩＦＮ吸着活性を認めた。これらのうちから
、活性の高い２クローン（Ｅ４−１８及びＧ４−１５）
を選択した。
めうさぎの抗マウスＩｇＧ抗体をコーティングしたウェ
ル内に入れ、抗ａ＝１吸着させた後、ヒト’ｒ −Ｉ
ＦＮ １０”Ｕ／ｍｌ溶液０．ｌ耐を加えて、ヒトγ−
ＩＦ’Ｎを成鳥させる。ｂｈＲ緩衝液で十分洗浄した後
％０．５Ｍ塩化ナトリウム及び０．１％牛血清了ルブミ
ンを含有する５ ０ ｍＭ戻酸ナトリウム溶液（ＰＨＩ
Ｉ）にて、ヒトｒ−ＩＦＮを溶出する。溶出液中のヒト
ｒ−ＩＦＮ含せをＦＬａＩＪＩ民に対するシンドビスウ
イルスの細胞病変効果によって測定した。１９２ウエル
中１１ウエルの培養上清にヒトγ−ＩＦＮ吸着活性を認
めた。活性を認めた１１ウエル中５ウエルのバイブリド
°−マにつＡて限界希釈法によりクローニングを行い、
１６３のモノクローンを得、うち１ｏ４クローンについ
てヒトｒ−ＩＦＮ吸着活性を認めた。これらのうちから
、活性の高い２クローン（Ｅ４−１８及びＧ４−１５）
を選択した。
（２１抗ヒトγ−ＩＦＮモノクローナル抗体の裏造例
前記工程で得られたＥ４−１８クローン或けＧ４−１５
クローンの各々の細胞１０丁個をＢＡＬＢ／Ｃマウスの
腹腔内に郡部し、２〜３週間後に腹水を採取するｎ採取
した腹水は、遠心分離により、細胞を除去し、各々の上
清を得た。この上清を５ＯＮ飽和の硫酸アンモニウムで
塩析し、生じた沈澱を少−扉の燐酸緩衝液（ＰＩ（７，
２）に溶解する。溶液を２０％飽和の硫酸アンモニウム
で再度塩析し、生じた沈澱を除去し、上清に５０％飽和
となるよう硫酸アンモニウムを添加し、再度塩析を行な
一１生じた沈澱を採取する。沈澱を少量の１０ ｍＭ、
燐酸緩衝液（ＰＨ８）ｌ：、ｉ解した後、同じ緩衝液で
一昼夜透析を行なう。
クローンの各々の細胞１０丁個をＢＡＬＢ／Ｃマウスの
腹腔内に郡部し、２〜３週間後に腹水を採取するｎ採取
した腹水は、遠心分離により、細胞を除去し、各々の上
清を得た。この上清を５ＯＮ飽和の硫酸アンモニウムで
塩析し、生じた沈澱を少−扉の燐酸緩衝液（ＰＩ（７，
２）に溶解する。溶液を２０％飽和の硫酸アンモニウム
で再度塩析し、生じた沈澱を除去し、上清に５０％飽和
となるよう硫酸アンモニウムを添加し、再度塩析を行な
一１生じた沈澱を採取する。沈澱を少量の１０ ｍＭ、
燐酸緩衝液（ＰＨ８）ｌ：、ｉ解した後、同じ緩衝液で
一昼夜透析を行なう。
透析稜の各々のサンプルＶ！、予め同じ緩衝液で”ｌ（
ｌたプロティンＡセフ丁ロース（７アルマシフ社製）の
カラムに吸着させ１次−で０．５Ｍ。塩化ナトリウムを
含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ５）で溶出する。溶
出した蛋白含有画分を集め％ ０．５Ｍ塩化ナトリウム
を含む燐酸緩衝液（ＰＩ−Ｉ７．２）で透析する。
ｌたプロティンＡセフ丁ロース（７アルマシフ社製）の
カラムに吸着させ１次−で０．５Ｍ。塩化ナトリウムを
含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ５）で溶出する。溶
出した蛋白含有画分を集め％ ０．５Ｍ塩化ナトリウム
を含む燐酸緩衝液（ＰＩ−Ｉ７．２）で透析する。
得られた抗体溶液は０．０５％のナト１１ウム了ザイド
を添加して４℃で保存する。
を添加して４℃で保存する。
Ｅ４−１８クローンから得られた抗ヒトｒ−Ｉ ＦＮモ
ノクローナル抗体は、還元剤（２−メルカプトエタノー
ル）の存在下での、ＳＤＳ電気泳動法で、分子−５０，
０００と２６゜０００と０２本のバント”が得られ、Ｇ
４−１５クローンから得られた抗ヒトｒ −Ｉ ＦＮモ
ノクローナル抗体Ｆｉ、同様にして、分子：１ｔ５０゜
０００と２６．０００との２本のバンドが得られた。
ノクローナル抗体は、還元剤（２−メルカプトエタノー
ル）の存在下での、ＳＤＳ電気泳動法で、分子−５０，
０００と２６゜０００と０２本のバント”が得られ、Ｇ
４−１５クローンから得られた抗ヒトｒ −Ｉ ＦＮモ
ノクローナル抗体Ｆｉ、同様にして、分子：１ｔ５０゜
０００と２６．０００との２本のバンドが得られた。
（３−１） ｔニドｒ −ＩＦＮの精製例前記工程で
得られたＥ４−１８クローン由来の抗ヒトγ−ＩＦＮモ
ノクローナル抗体をプロムシアンで活性化したセフ了ロ
ース（ファルマシア社製）に結合させ、ヒトγ−ＩＦＮ
ｆ＃製用ゲル製作ゲル、このゲル２ｙ＋／（抗体吸着ｉ
２ｍｇ）でカラム（直！１．３ｃｍ、長さ１．５ｓｍ）
を作成した。
得られたＥ４−１８クローン由来の抗ヒトγ−ＩＦＮモ
ノクローナル抗体をプロムシアンで活性化したセフ了ロ
ース（ファルマシア社製）に結合させ、ヒトγ−ＩＦＮ
ｆ＃製用ゲル製作ゲル、このゲル２ｙ＋／（抗体吸着ｉ
２ｍｇ）でカラム（直！１．３ｃｍ、長さ１．５ｓｍ）
を作成した。
ヒトγ−ＩＦＮを含有するヒト末梢血リンパ球培養液１
９５０ｍ（蛋白質： １７８７ｍｇ、比活性： １ ｘ
１０’Ｕ／ｍｇ 蛋白）を、フェニル、セフ了ロース
、カラム（ファルマシア社製）を通して前処理し、次す
て限外濾過法で濃縮し％濃縮物２２６ｉｉｔ（蛋白質：
１４６６ ｍｇ ％比活性：ｌＸ１０番Ｕ／ｍｇ蛋白
）を得た。
９５０ｍ（蛋白質： １７８７ｍｇ、比活性： １ ｘ
１０’Ｕ／ｍｇ 蛋白）を、フェニル、セフ了ロース
、カラム（ファルマシア社製）を通して前処理し、次す
て限外濾過法で濃縮し％濃縮物２２６ｉｉｔ（蛋白質：
１４６６ ｍｇ ％比活性：ｌＸ１０番Ｕ／ｍｇ蛋白
）を得た。
前記工程で得た濃縮物２２６ｍＡ’を前記工程テ作ＢＹ
ｔ、たカラムに吸着させ、十分量の燐酸緩衝液で洗浄
した後、０．５ Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ炭
酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ１１）で、ヒトｒ −Ｉ Ｆ
Ｎを溶出した。溶出液はただちに０．５ Ｍ 、燐酸二
水素す） １３ウムで中和し、ヒトγ−ＩＦＮ含蓄をＦ
Ｌｍ胞に対するシンドビヌウイルスの細胞病変効果によ
って電音した、この結果、抗ヒトγ−ＩＦＮ抗体カラム
からの溶出画分１ｌｔ８．７ ｍｌであり％蛋白質は０
．２４ｍｇであり、比活性は１゜３ Ｘ １０” Ｕ
／ｍｇ蛋白であった。ここで抗体１ｍｇ当りのヒトγ−
ＩＦＮの吸着答督は１゜５５Ｘ１０７Ｕで、精製度σ１
８．０００倍であることがわかる。
ｔ、たカラムに吸着させ、十分量の燐酸緩衝液で洗浄
した後、０．５ Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ炭
酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ１１）で、ヒトｒ −Ｉ Ｆ
Ｎを溶出した。溶出液はただちに０．５ Ｍ 、燐酸二
水素す） １３ウムで中和し、ヒトγ−ＩＦＮ含蓄をＦ
Ｌｍ胞に対するシンドビヌウイルスの細胞病変効果によ
って電音した、この結果、抗ヒトγ−ＩＦＮ抗体カラム
からの溶出画分１ｌｔ８．７ ｍｌであり％蛋白質は０
．２４ｍｇであり、比活性は１゜３ Ｘ １０” Ｕ
／ｍｇ蛋白であった。ここで抗体１ｍｇ当りのヒトγ−
ＩＦＮの吸着答督は１゜５５Ｘ１０７Ｕで、精製度σ１
８．０００倍であることがわかる。
祷られた精製ヒトγ−ＩＦＮけＳＤＳ電気泳動法により
第１図に示すように、分子１約２５．０００．２０，０
００，１５．０００に相当する３棟のバンドを与え、ｂ
ずれもヒトｒ−ＩＦＮ活性を示した。ここで、下記の略
図により％ｖ１図を説明する。
第１図に示すように、分子１約２５．０００．２０，０
００，１５．０００に相当する３棟のバンドを与え、ｂ
ずれもヒトｒ−ＩＦＮ活性を示した。ここで、下記の略
図により％ｖ１図を説明する。
（１の列）分子量算出用の分子量既知蛋白質群を示す。
上よ〕各々６８，０００ 、４５゜０００．３１．００
０％ ２１，０００．１７゜８００及び１２．６００の
分子ｌ・をもち、各々１μｇ（０重量をもつ。
０％ ２１，０００．１７゜８００及び１２．６００の
分子ｌ・をもち、各々１μｇ（０重量をもつ。
（２の列）１０列と同じ分子量既知の蛋白質群を示し、
各々５Ｐｇ の′Ｍ譬をもつ。
各々５Ｐｇ の′Ｍ譬をもつ。
（３の＋ＩＪ）Ｅ４−１８丁フイニテイーカラムから溶
出した精製ヒトγ−ＩＦＮ分子を示し２士より各々約２
５．０００．２０．Ｏｎｏ及び１ｓ、ｏｏｏの分子量の
位置に相当することがわかる。
出した精製ヒトγ−ＩＦＮ分子を示し２士より各々約２
５．０００．２０．Ｏｎｏ及び１ｓ、ｏｏｏの分子量の
位置に相当することがわかる。
（４の列）３の列と同じ精製ヒトγ−ＩＦＮ分子を示す
。
。
鉱１図は％Ｅ４−１８クローン由来の抗体をＦｆ３ｂて
精製されたヒトｒ−ＩＦＮのＳＤＳ電気泳動法による分
子量約２５．０００．２０，０００．１５，０００に相
当する３釉のバンドである。 特許出願人 石原産業株式会社 図面の浄書（内容に変更なし） 籍 １阻 手続補正器（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５９年特許願第１２７：１１８
号２、 発明の名称 抗ヒトγ−インターフェロンモ
ノクローナル抗体並びにこれらを使用する方法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 ４、補正命令の日付 昭和５９年９月２５日（発送
日）５、補正の対象 明細書全文及び図面６、
補正の内容 願書に最初に添付した明細書及び
図面の浄書・別紙のとおり （内容に変更なし） 手続補正器 １、事件の表示 昭和５９年特許願第１２７１１８号
２、 発明の名称 抗ヒトγ−インターフェロンモア
クローナル抗体並びにこれらを使用する方法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 ６、補正の内容 （１）昭和５９年１０月２３日提出の全文訂正明細書第
１６真下から２行目〜最下行の「ここで、下記の略図に
より、第１図を説明する。」を［ここで添付の図面第１
図について説明する。」に訂正する。 （２）同第１７頁１行目〜同頁下から１０行目の略図を
削除する。 （３）同第１６頁下から２行目の［ｌＦＮの活性を示し
た。］の後にｒ（３−２）前記工程（２）で得られたＧ
４１５クローン由来の抗ヒトγ−ＩＦＮモノクローナル
抗体について、前述の（３−１）と同様にしてほぼ同等
の結果が得られる。」を挿入する。 （４）昭和５９年ＪＯ月２３日提出の浄書図面を別紙の
ように訂正する。
精製されたヒトｒ−ＩＦＮのＳＤＳ電気泳動法による分
子量約２５．０００．２０，０００．１５，０００に相
当する３釉のバンドである。 特許出願人 石原産業株式会社 図面の浄書（内容に変更なし） 籍 １阻 手続補正器（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５９年特許願第１２７：１１８
号２、 発明の名称 抗ヒトγ−インターフェロンモ
ノクローナル抗体並びにこれらを使用する方法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 ４、補正命令の日付 昭和５９年９月２５日（発送
日）５、補正の対象 明細書全文及び図面６、
補正の内容 願書に最初に添付した明細書及び
図面の浄書・別紙のとおり （内容に変更なし） 手続補正器 １、事件の表示 昭和５９年特許願第１２７１１８号
２、 発明の名称 抗ヒトγ−インターフェロンモア
クローナル抗体並びにこれらを使用する方法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 ６、補正の内容 （１）昭和５９年１０月２３日提出の全文訂正明細書第
１６真下から２行目〜最下行の「ここで、下記の略図に
より、第１図を説明する。」を［ここで添付の図面第１
図について説明する。」に訂正する。 （２）同第１７頁１行目〜同頁下から１０行目の略図を
削除する。 （３）同第１６頁下から２行目の［ｌＦＮの活性を示し
た。］の後にｒ（３−２）前記工程（２）で得られたＧ
４１５クローン由来の抗ヒトγ−ＩＦＮモノクローナル
抗体について、前述の（３−１）と同様にしてほぼ同等
の結果が得られる。」を挿入する。 （４）昭和５９年ＪＯ月２３日提出の浄書図面を別紙の
ように訂正する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ヒトγ−インターフェロンに対して特異性があり、
還元剤存在下でのＳＤＳ電気泳動法による分子量が２６
，０００及び５０，０００を示し、ＩｇＧ１サブクラス
に属するものであつて、ヒトγ−インターフェロンの吸
着容量が１０＾７Ｕ以上／ｍｇであることを特徴とする
、抗ヒトγ−インターフェロンモノクローナル抗体。 ２、吸着されたヒトγ−インターフェロンが活性を失わ
ずに回収することができる、特許請求の範囲第１項記載
の抗ヒトγ−インターフェロンモノクローナル抗体。 ３、ヒトγ−インターフェロンで免疫したＢＡＬＢ／Ｃ
マウスの抗体産生細胞とＢＡＬＢ／Ｃマウスの骨髄腫細
胞との間にハイブリドーマを形成させ、該ハイブリドー
マをクローン化して抗ヒトγ−インターフェロン抗体を
産生するクローンを選択し、このように選択されたクロ
ーンを使用して抗ヒトγ−インターフェロンモノクロー
ナル抗体を製造することを特徴とする、モノクローナル
抗体の製造方法。 ４、免疫化に用いるヒトγ−インターフェロンが、ヒト
末梢白血球由来のものである、特許請求の範囲第３項記
載の方法。 ５、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの骨髄腫細胞がＸ６３−Ａｇ８
．６５３である、特許請求の範囲第３項記載の方法。 ６、ヒトγ−インターフェロンに特異性があり、還元剤
存在下でのＳＤＳ電気泳動法による分子量が２６，００
０及び５０，０００を示し、ＩｇＧ１サブクラスに属す
るものであつて、ヒトγ−インターフェロンの吸着容量
が１０＾７Ｕ以上／ｍｇであり、吸着されたヒトγ−イ
ンターフェロンが活性を失わずに回収することができる
抗ヒトγ−インターフェロンモノクローナル抗体を結合
させた担体樹脂を用いて、アフイニティークロマトグラ
フィーを行い、ヒト末梢白血球由来のγ−インターフェ
ロンを精製する方法。 ７、ヒトγ−インターフェロンに特異性があり還元剤存
在下でのＳＤＳ電気泳動法による分子量が２６，０００
及び５０，０００を示し、ＩｇＧ１サブクラスに属する
ものであつて、ヒトγ−インターフェロンの吸着容量が
１０＾７Ｕ以上／ｍｇである抗ヒトγ−インターフェロ
ンモノクローナル抗体を用いてラジオイム／アッセイま
たはエンザイムイム／アッセイを行い、ヒトγ−インタ
ーフェロンを定量する、ヒトγ−インターフェロンの微
量定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12711884A JPS617300A (ja) | 1984-06-20 | 1984-06-20 | 抗ヒトγ−インタ−フエロンモノクロ−ナル抗体並びにこれらを使用する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12711884A JPS617300A (ja) | 1984-06-20 | 1984-06-20 | 抗ヒトγ−インタ−フエロンモノクロ−ナル抗体並びにこれらを使用する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS617300A true JPS617300A (ja) | 1986-01-13 |
| JPH0527394B2 JPH0527394B2 (ja) | 1993-04-21 |
Family
ID=14952047
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12711884A Granted JPS617300A (ja) | 1984-06-20 | 1984-06-20 | 抗ヒトγ−インタ−フエロンモノクロ−ナル抗体並びにこれらを使用する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS617300A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62180270A (ja) * | 1986-02-05 | 1987-08-07 | Takeda Chem Ind Ltd | インタ−フエロン−γの免疫化学的測定法および測定用試薬 |
-
1984
- 1984-06-20 JP JP12711884A patent/JPS617300A/ja active Granted
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| THE EMBO JOURNAL=1983 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62180270A (ja) * | 1986-02-05 | 1987-08-07 | Takeda Chem Ind Ltd | インタ−フエロン−γの免疫化学的測定法および測定用試薬 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0527394B2 (ja) | 1993-04-21 |
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