JPS62180270A - インタ−フエロン−γの免疫化学的測定法および測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はインターフェロン−γの測定法および測定用試
薬に関ずろ。

従来の技術 ヒトのインターフェロン（ＩＦＮ）には、抗原的に異な
るα、β、γ型の少くとも３種のタイプが存在すること
が知られている［ネイチャー、２８６゜１１０（＋９８
０）］。］インターフェロンーγ［ＦＮ−γ）について
は、マイト−ツエンや抗原刺激によって、主としてＴリ
ンパ球から産生されろことが判っており、別名免疫イン
ターフェロン（Ｉ−ＩＦＮ）とも呼ばれている［ザ　イ
ンターフェロン　システム、スプリンガー社、ニューヨ
ーク。

１１頁−２６頁、１９７９年］。ＩＦＮ−γは生体内で
、種々の免疫反応にともなって産生されることが予想さ
れ、免疫調節に重要な役割を果たしていると考えられて
いる。また、ＩＦＮ−γの性質としては、インターフェ
ロン−α（ＩＦＮ−α）やインターフェロン−β（ＩＦ
Ｎ−β）と抗原性が異なることや、誘起剤の種類が異な
ることの他に、酸や熱に対する安定性が悪いことなどら
判っている［ザ　インターフェロン　システム、スブリ
ンガー社、ニューヨーク、１１頁−２６頁、（１９７９
年）］。

一般的にＩＦＮは、生体の産生ずる抗ウィルス作用をも
つものとして定義されているが、この他に多くの生物活
性をもつことが証明されており、特に抗腫瘍効果を有す
る点で注目されている［ブラット、５５，７１１−７２
１（１９８０）；同誌。

５５．８７５−８８４（１９８０月。

腫瘍の増殖を抑制する方法として、腫瘍細胞の増殖を直
接抑制する方法と、宿主の免疫反応を介して、間接的に
腫瘍を抑制する方法が考えられ、後者の場合、例えばナ
ヂュラルキラー細胞（ＮＫ）や、マクロファージの活性
化、或いはキラーＴ細胞の活性化などが考えられる。実
際、ＩＦＨには直接作用の他に、この様な種々の免疫増
強活性があることが証明されている［バイオケミ力　エ
トバイオフイジカ　アクタ、５１６，２３１−２４７（
１９７８）コ。ＩＦＮ−γはインビトロでのこれら抗腫
瘍につダがる各種の活性、およびインビボ於ける抗□腫
瘍活性が、ＩＦＮ−αやＩＦ’Ｎ−βに比べはるかに高
いことから、その重要性が強く指摘されている［セルラ
ーイムノロジー、４９゜３９０−３９４（１９８０）コ
。

上記状況のもとで、ＩＦＮ−γの医薬品としての開発が
行われており、特に遺伝子工学に基づくＩＦＮ−γ精製
蛋白質の大量製造法［特開昭５９−１８６９９５号公報
ｊも確立され、実用化も間近に来ている。

これに伴い、ＩＦＮ−γの精製過程、最終製品の純度決
定や品質管理、動物投与時の生体内挙動を調べるため、
ＩＦＮ−γの抗ウィルス活性に基づく方法［蛋白質核酸
酵素、別冊Ｎｏ、２５．“インターフェロン研究の進歩
”、Ｐ２Ｓ５−３６３．共立出版、東京（１９８１）］
やＩＦＮ−γ関連抗体を用いる免疫化学的方法［ザ・エ
ンボ・ジャーナル。

ん、１５２７−１５３０（１９８３）；特開昭５９−１
８６９９５号公報；特開昭６０−１０７５６９号公報な
どコなどが発表されまた用いられている。

発明が解決しようとする問題点 上述のとおり、数種のＩＦＮ−γの検出・測定法が知ら
れているが、これらの方法は測定感度が限られておりＩ
ＦＮ−γの医薬品としての使用において必須である、品
質管理上あるいは生体内挙動観察上必要なその極微量測
定に適用するには不充分である。

また測定感度のみならず正確にＩＦＮ−７活性物質のみ
を認識して行なう方法が要求される。

本発明は、測定用賦科を、（Ｔ）第１図で示されるポリ
ペプチド（１）と結合し、ペプチド＜Ｇｌｕ−Ａｓｐ−
Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−、Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ　
−Ｇ　ｌｕ　−Ａｓｎ　−Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ
　−Ｔｙｒ　−Ｐｈｅ　−Ａｓｎ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　
Ｉｙ（ｎ　）およびペプチドＬｙｓ−ＡｒｇＬｙＳ　　
Ａｒｇ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｎ　　Ｍｅｔ−Ｌｅｕ　　Ｐ
ｈｅ−Ａｒｇ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａｒｇ　−Ａｒｇ　−Ａ
ｌａ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ（ＩＩＩ）のいずれとも結
合しないモノクローナル抗体および■ポリクローナル抗
インターフェロン−γ抗体のいずれか一方を含有する固
定相と他方を含有する標識体とをサンドイツチ法に付す
ことを特徴とするインターフェロン−γの免疫化学的測
定法ならびに ■ポリペプチド（１）と結合し、ペプチド（ＩＩ）およ
びペプチド（Ｉ［［）のいずれとも結合しないモノクロ
ーナル抗体および■ポリクローナル抗インターフェロン
−γ抗体のいずれか一方を含有する固定相と他方を含有
する標識体とを組合せてなるインターフェロン−γの免
疫化学的測定用試薬を提供するものである。

以下本願明細書において特に注記した場合を除きＩＦＮ
−７とは、天然のＩＦＮ−γ（ｎＩＦＮ−γ）および遺
伝子組み換え技術で製造されたＩＦＮ−γ（ｒＩＦＮ−
γ）双方を包含する。

ｎ１ＦＮ−γとは、天然から得られるＩＦＮ−γ（例え
ば、ヒト末稍血リンパ球をインデューサーで誘導したも
の）やそのＮ末端部分またはＣ末端部分を欠くフラグメ
ント［ジャーナル　オブバイオロジカル　ケミストリー
、２５９°、６７９０−６７９７（１９８４）］の中、
抗ウィルス活性を有するものを意味し、通常糖鎖を有す
る。

ｒＩＦＮ−γには、第１図に示される１４６個のアミノ
酸からなるポリペプチド（１）ならびにポリペプチド（
１）の９番目のアミノ酸がＧｌｎのものおよび１４０４
０番目ミノ酸がＧｌｎのものが包含される。またポリペ
プチド（］）のＮ末端アミノ酸から１３１３１番目のア
ミノ酸残基を含み１３２番目以降のいずれかの部分で切
断された１５にスピーシーズやその他のフラグメントも
包含する。

さらにポリペプチド（Ｉ）のＮ末端アミノ酸から４番目
までのいずれかのアミノ酸残基またはペプチドを欠除し
たポリペプチドならびにこれらのＣ末端部分を欠く対応
するフラグメントをも包含する。

上記モノクローナル抗体は、例えば第１図における２２
番目から１３０３０番目のアミノ酸配列を含育するポリ
ペプチド（■）で免疫した動物のリンパ球と、同種また
は異種の動物のリンパ球様細胞株とを細胞融合し、上記
モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマをクロー
ン化して製造し、該ハイブリドーマを接養することによ
り製造することができる。

動物の免疫に用いる第１図における２２番目から１３０
３０番目のアミノ酸配列を含育するポリペプチド（ＩＶ
）に関し、前記ポリペプチド（［）が好ましく、とりわ
け大腸菌を用いて製造された精製ｒｌＦＮ−７蛋白質Ｃ
ＢＰＣ公開第０１１００４４号公報）が有利に使用でき
る。

免疫する動物は、羊、山羊、兎１モルモット、ラット、
マウス等の哺乳動物、とりわけそれらの実験動物やニワ
トリ、七面鳥、ウズラ等の鳥類が使われるが、モノクロ
ーナル抗体を得るためには、ラット、マウスが好ましい
。免疫方法は、例えばマウスを免疫する場合、皮下、腹
腔内、静脈内、筋肉内。

皮肉等のいずれのルートからでも可能であるが、主とし
て皮下、腹腔内、静脈内に（とりわけ皮下）注入する′
のが好ましい。また、接種間隔、接種量等も可変度は高
く、種々の方法が可能であるが、例えば２週間隔で２〜
８回接種し、最終免疫後、１〜５日、好ましくは２〜４
日後の牌細胞を用いる方法がよく用いられる。接種量は
１回にポリペプチド量として、マウス当り０．１μｇ以
上、好ましくはＩＯμｇ〜３００μｇ用いることが望ま
しい。

またＩＦＮ−γのアミノ酸配列の一部を何するペプチド
、例えば前記したペプチド（［Ｉ）を用いて、上記ポリ
ペプチド（１）と二重免疫によっても製造することがで
きる。すなわち、例えばまずポリペプチド（Ｉ）を接種
し、その後ペプチド（ＩＩ）の蛋白質複合体を接種し、
さらにポリペプチド（Ｉ）およびペプチド（ｎ）の蛋白
質複合体を合わせて接種す゛　　ろ、なおこの免疫方法
においては、接坏の順序および免疫原の構成は自由に変
更でき、各接種時の免疫原の総量は上記の範囲で行う。

リンパ球源として膵臓細胞を用いる場合において、膵臓
を摘出する場合はその前に、部分採血を行い、血中の抗
体価の上昇を確認した上で、融合実験を行うことが望ま
しい。

上記リンパ球とリンパ球様細胞株との細胞融合は、例え
ば免疫したマウスのリンパ球（とりわけ膵臓細胞由来の
もの）をヒボキサンチン−グアニン−ホスホリボシルト
ランスフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ−）やチミジンキナ
ーゼ欠損（ＴＫ−）の様なマーカーを持った適切な同種
または異種動物（好ましくは同Ｎ）のミエローマ等の、
リンパ球様細胞株との間で融合させる。融合には、セン
ダイウィルス、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の
融合剤が用いられる。もちろんジメチルスルホキシド（
ＤＭＳＯ）その他の融合促進剤を加えることも可能であ
る。ＰＥＧの重合度は、ふつう１０００〜６０００．時
間は０．５〜３０分、ａ度は１０％〜８０％等か用いら
れるが、好ましい条件の一例として、ＰＥＧ６０００を
３５〜５５％で４〜ＩＯ分処理することにより、効率よ
く融合させることが出来る。融合細胞は、ヒポキサンチ
ン−アミノプテリン−チミジン培地［ＨＡＴ培地；ネイ
チャー、２５６，４９５−４９７（１９７５）］等を用
いて、選択的に増殖させることが出来る。

マウスの血清や増殖して来た細胞の培養上清は、目的と
する抗体産生があるか否かについてスクリーニングを行
うことができるが、抗体価のスクリーニングは次の様に
行うことが出来る。即ち、放射線免疫測定法（ＲＩＡ法
）または酵素免疫測定法（Ｅ　Ｉ　Ａ法）等の方法で調
べることが出来るが、これらの方法についても種々の変
法が可能である。

好ましい測定法の一例として、ＥＩＡを用いる方法につ
いて述べる。固相にｒｌＦＮ−γを常法に従って固定（
例えば９６大のマイクロタイタープレートを固相として
用いるとマルチスキャン等を用いた迅速な測定が可能と
なり有利である）させておき、これに測定したい培養上
清や、マウスの血清を加え、一定時間、定温（以下４〜
４０℃を示す）で反応させる。この後、反応物をよく洗
った後、酵素で標識した抗マウス抗体（山羊、兎などの
ポリクローナル抗体に例えばホースラディツシュペルオ
キシダーゼ等の酵素を結合したものを市販品として入手
出来る）を加え、一定時間、定温で反応させる。反応物
をよく洗った後、酵素基質を加え、一定時間、定温で反
応させ、その後、生成発色物を吸光度または蛍光強度等
で測定することができる。

選択培地で増殖を示し、かつＩＦＮ−γへの結合能や免
疫に用いたポリペプチド（Ｉ＋／）に対する抗体活性の
みられたウェルの細胞は、限界希釈法等によりクローニ
ングを行うことが望ましい。クローン化された細胞の上
清について同様にスクリーニングを行い抗体価の高いウ
ェルの細胞を増やすことにより、免疫したポリペプチド
（■）と反応性を示すと考えられるモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマクローンが得られる。

これらポリペプチド（■）と反応性を示すハイブリドー
マやそのクローンの産生ずるモノクローナル抗体がＩＦ
Ｎ−γのどの部分を認識するかということを調べること
は、・単にモノクローナル抗体を特定化するという意味
だけでなく、ＩＦＮ−γの検出や精製におけるモノクロ
ーナル抗体の使い方を明確にし、また認識部位の異なる
複数のモノクローナル抗体の組み合わせによる応用展開
を広くする上で一重要である。

この目的のためには、例えばペプチド（■）、ペプチド
（Ｉ）および第１図における５番目から１４６番目まで
のアミノ酸からなるポリペプチド（Ｖ）［特開昭６１−
５０９６号公報号公報−ることにより、上記により得ら
れるモノクローナル抗体が、ｒｌＦＮ−γのＮ末端部分
を認識しているか、Ｃ末端部分を認識しているか、或い
はＮ末端、Ｃ末端以外の部分を認識しているかを容易に
知ることができる。即ち、ポリペプチド（ＩＶ）に反応
性のあるモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ
のスクリーニング法について前に述べたが、この方法の
中で、固相にポリペプチド（１’Ｖ）を固定する代りに
、ペプチド（ｎ）またはペプチド（Ｉｎ）を用いる方法
により有利にこの目的を達成することができる。

さらにこれらクローンの産生ずる抗体がｎ１ＦＮ−γ（
例えばヒト末梢血リンパ球からレクチンとホルボールエ
ステル等で誘導したもの）およびｒＩＦＮ−γ（例えば
ポリペプチド（■）、ポリペプチド（Ｖ）など）を吸収
する能力について生物活性を用いて調べることができる
。その方法として有利に用いられる一例を次に述べるが
、もちろん種々の変法も可能である。例えばウサギ抗マ
ウスイムノグロブリン抗体をセルロースビーズ等の担体
に常法に従いカプリングさせておき、これに測定したい
ハイブリドーマ上清またはマウスの血清を加え、一定時
間、定温で反応させる。この後反応物をよく洗い一定量
のＩＰＮ−γを加える。ＩＦＮ−γとして、例えばｎＩ
ＦＮ−γやｒＩＦＮ−γを加えた後、一定時間、定温で
反応させ、反応上清中に含まれるＩＦＮ−γの活性を測
定する。この様にして目的とする抗体のＩＦＮ−γ活性
の吸収能を測定することができる。

次に、これらクローンの産生ずる抗体が、ｒＩＦＮ−γ
（例えばポリペプチド（１）、ポリペプチド（Ｖ）など
）やｎＩＦＮ−γのもつ抗ウィルス作用（以後ＡＶＡと
略す）を中和する能力があるか否かを調べることもでき
る。中和活性のある抗体の取得は、該抗体が直接生物活
性に関連した部位を認識していることになるのでＩＦＮ
−γを含むサンプルから、［ＦＮ−γを精製したり、Ｅ
ＩＡ法やＲＩＡ法を用いて定量したりする上に於て、極
めて重要である。抗体の中和活性は例えば次の様にして
測ることができる。即ち、一定量のＩＦＮ−γに対して
大過剰量の抗体を加え、一定時間、一定温度で反応させ
た後、反応物をＡＶＡにて測定することができる。

このようにしてクローン化されたハイブリドーマは、液
体培地中または哺乳動物の腹腔内で増殖させる。例えば
、液体培地たとえばＰＭＩ−１６４０に０．１〜４０％
の牛血清を加えた培地等で２〜１０日間、好ましくは３
〜５日間培養することにより、培養液から該モノクロー
ナル抗体を得ることができるが、この他にマウス等の適
切な哺乳動物の腹腔内に接種し、細胞を増殖させ、腹水
を採取するこれにより、細胞培養上清よりも遥かに高力
価の抗体を、多量に効率よく取得することができる。こ
のためには、例えばマウスの場合、ミネラルオイル等を
前もって接種したＢＡＬＢ／Ｃ等のマウスに１ＸＩＯ′
〜１ｘ１０７個、好ましくは５ｘｌＯ’〜２ＸＩＱ’個
のハイブリドーマを腹腔内等に接種し、７〜２０日後、
好ましくは１０〜１４日後に腹水液等を採取する。腹水
に生成蓄積した抗体は、例えば硫安分画、ＤＥＡＥ−セ
ルロースカラムクロマト等により容易にモノクローナル
抗体を純粋な免疫グロブリンとして単離することかでき
る。

上記で得られるモノクローナル抗体は、下記の性状を有
する。

（１）ｎＩＦＮ−γおよびホペペプチド（Ｉ）と結合す
る。

（２）第１図における第１番目から第１３１番目までの
アミノ酸からなるポリペプチド（１５にスピーシーズ）
と結合する。

（３）ペプチド（ｎ）およびペプチド（Ｉ［［）のいず
れとも結合しない。

（４）　　ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βとは結合しない
。

（５）ｎｌＦＮ−γおよびポリペプチド（Ｉ）の抗ウィ
ルス活性を中和する。

（６）ポリペプチド（Ｖ）を認識しその抗ウィルス活性
を中和する。

（７）オフタロニー法による検定によりＩｇＧ１のサブ
クラスの抗体に属する。

（８）　　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
おいて、標準免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖の分子量
に完全に一致する２本のバンドのみを示す。

本発明においては、上記モノクローナル抗体に包含され
るモノクロルナル抗体ＷＮγ３−２９４３がとりわけ有
利に使用できる。

上記本発明に用いられるポリクローナル抗インＩＦＮ−
γなどＩＦＮ−７に対するポリクローナル抗体で、例え
ばｒＩ　ＦＮ−γもしくはｎ１ＦＮ−γを人以外の温血
動物に接種して抗体を形成せしめ、これを採取すること
により得られるポリクローナル抗体が挙げられる。人以
外の温血動物としては、たとえば哺乳動物（例、ウサギ
、ヒツジ、ラット、マウス、モルモット、ウシ、ウマ、
ブタ）、鳥類（例、ニワトリ、ハト、アヒル、ガチョウ
、ウズラ）などが挙げられ、とりわけウサギが有利に用
いられる。

抗原として用いるＩｌ？Ｎ−γとして、ｒＩＦＮ−γ、
なかでも前記ポリペプチド（Ｉ）が好ましく、とりわけ
大腸菌を用いて製造された精製ｒｒＦＮ−γが好ましい
。ＩＦＮ−γを人以外の温血動物に接種する方法として
動物に接種する抗原量は抗体産生ずるに有効な量でよく
、たとえばウサギに１回約０．１ｍｇないし約２ｍｇを
ほぼ等容量の生理食塩水およびフロイントの完全アジュ
バント（たとえば容量で前者ｌに対し後者０．５〜２の
割合）で乳化して、背部および（または）後肢掌皮下に
約と良好な抗体を産生させ得る場合が好ましい。このよ
うにして、温血動物中に形成された抗体を採取する方法
としては、たとえばウサギでは、通常最終接種後約７日
から１２日の間に耳静脈から採血し、遠心分離して血清
として得られる。得られた抗血清は所望により、公知の
方法に従って塩析し、通常ｒＩ　ＦＮ−γを保持させた
担体を用いるアフィニティ・クロマトグラフィーで吸着
した両分を回収することによりポリクローナル抗体とし
て得ることができる。

本発明においては上記モノクローナル抗体およびポリク
ローナル抗体の２種の抗体はイムノグロブリンでもよく
、またはそのフラクション（例、Ｆ　（ａｂ’）ｔ、　
Ｆ　ａｂ’もしくはＦ　ａｂ）であってもよい。

本発明の上記モノクローナル抗体もしくはポリクローナ
ル抗体のいずれか一方を含有する固定相は担体に保持さ
れた該抗体である。担体としては、たとえば、ゲル粒子
（例、アガロースゲル［例、セファロース４Ｂ、セファ
ロース６Ｂ（ファルマシア・ファインケミカル社（スエ
ーデン社）製］デキストランゲル［例、セファデックス
Ｇ−７５，セファデックスＧ−１００，セファデックス
Ｇ−２００（ファルマシア・ファインケミカル社製）］
、ポリアクリルアミドゲル［例、バイオゲルＰ−３０，
バイオゲルＰ−６０，バイオゲルＰ−１００（バイオラ
ッド・ラボラトリーズ社（米国））コ、セルロース粒子
［例、アビセル（脂化成製）、イオン交換セルロース（
例、ジエチルアミノエチルセルロース、カルボキシメチ
ルセルロース）］、物理的吸着剤［例、ガラス（例、ガ
ラス球、ガラスロッド、アミノアルキルガラス球、アミ
ノアルキルガラスロッド）、シリコン片、スチレン系樹
脂（例、ポリスチレン球、ポリスチレン粒子）］、イオ
ン交換樹脂Ｃ例、弱酸性陽イオン交換樹脂［例、アンバ
ーライトＩＲＣ−５０（ローム・ハース社（米国）製）
、ゼオカーブ２２６（パームチット社（西ドイツ）製）
］１１弱塩基性陰イオン交換樹脂例、アンバーライトＩ
Ｒ−４Ｂ、ダウエックス３（ダウケミカル社（米国）製
）封などが挙げられる。

とりわけ本発明において、ポリスチレン球、ポリスチレ
ン粒子などスチレン系樹脂、ガラス、シリコン片、ポリ
アクリルアミドゲルなどが有利に用いられる。

抗体を担体上に保持するには、公知の常套手段を応用し
得るが、たとえば“代謝”、第８巻（＋９７１年）、第
６９６頁に記載されているブロムシアン法゛、ゲルター
ルアルデヒド法などが挙げられる。また、より簡単な方
法として物理的に担体表面に吸着さ仕てもよい。

本発明の、上記モノクローナル抗体もしくはポリクロー
ナル抗体の他方を含有する標識体は、抗体と標識剤の結
合物として用いる。標識剤としては、放射性同位元素、
酵素、蛍光物質１発光物質などが挙げられる。

放射性同位元素としてはたとえばＩＩＪ　、＋３１　■
。

３Ｈ，′４．Ｃなどが、上記酵素としては、安定で比活
性の大きなものが好ましく、その例としてはたとえば（
１）カルボヒドラーゼ［例、グリコシダーゼ（例、β−
ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ−８−ゲルケロ
ニゲーゼ　Ａ−−ｙル々ｋパノゲ−ゼ、α−ガラクトシ
ダーゼ、α−グルコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、）
、アミラーゼ（例、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、
イソアミラーゼ、グルコアミラーゼ、タカアミラーゼＡ
）、セルラーゼ、リゾチームコ、（２）アミダーゼ（例
、ウレアーゼ、アスパラギナーゼ）、（３）エステラー
ゼ［例、コリンエステラーゼ（例、アセチルコリンエス
テラーゼ）、ホスファターゼ（例、アルカリホスファタ
ーゼ）、スルファダーゼ、リパーゼコ、（４）ヌクレア
ーゼ（例、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアー
ゼ）、（５）鉄・ポルフィリン酵素（例、カタラーゼ、
ペルオキシダーゼ、チトクロームオキシダーゼ）、（６
）銅酵素（例、チロシナーゼ、アスコルビン酸オキシダ
ーゼ）、（７）脱水素酵素（例、アルコール脱水素酵素
、リンゴ酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、イソクエン酸
脱水素酵素）などが、蛍光物質としては、フルオレスカ
ミン、フルオレッセンスイソチオシアネートなどが、発
光物質としてはルミノール、ルミノール誘導体、ルシフ
ェリン。

ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。上記標識剤のう
ち、酵素とりわけペルオキシダーゼが有利に用いること
ができる。

本発明においては、モノクローナル抗体を含有する固定
相およびポリクローナル抗体を含有する１票識体を用い
るのが好ましい。またポリクローナル抗体は抗体フラク
ション（とりわけＦ　ａｂ’が好ましい）として用いる
のが好ましい。

標識体の製造法をより具体的に説明するため、以下上記
の場合について説明するが、ポリクローナル抗体を含有
する固定相およびモノクローナル抗体を含有する標識体
を用いる場合ら、公知手段に基づき同様に製造すること
ができる。

ポリクローナル抗体と標識剤とを結合させるには公知の
常套手段であるクロラミンＴ法［ネイチャー、１９４．
４９５（１９６２）］、過ヨウ素酸法［ジャーナル・オ
ブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリー
、２２．Ｉ　Ｑ　８４（１９７４月ぎレイミド法［ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリー、７９，２３３（１
９７６）］などが用いられる。

標識剤としてペルオキシダーゼを用いる場合、とりわけ
特開昭５８−１４９７００号公報記載の一般式 ［式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または
６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。１で表わされる
結合剤が有利に用いられる。

次にサンドイツチ法について、その測定原理を説明する
。未知量の抗原を含む被検液に担体上に保持された過剰
量の抗体を加えて反応させ（第１反応）２次に標識剤で
標識した過剰量の抗体の一定量を加えて反応させる（第
２反応）。担体上に保持された標識剤もしくは担体上に
保持されなかった標識剤の活性を測定する。第１反応、
第２反応は同時に行なってもよいし時間をずらして行な
ってもよい。

本発明のサンドイツチ法によるｒｌ　ＰＮ−γもしくは
ｎＩＦＮ−γの高感度は免疫化学的測定方法は、未知量
のｒＩＦＮ−γもしくはｎＩＦＮ−γを含有する被検試
料に固定相を加えて反応させる（第１反応）。固定相を
洗浄したのち、標識体の一定量を加えて反応させる（第
２反応）。次に通常、固相をよく洗浄し、固相上に結合
してシ、）る標識剤の活性を測定する。標識剤が放射性
同位元素である場合、ウェルカウンターもしくは液体シ
ンチレーノヨンカウンターで測定する。標識剤が酵素で
ある場合、基質を加えて放置し、比色法もしくは蛍光法
で酵素活性を測定する。標識剤が蛍光物質。

発光物質であっても、それぞれ公知の方法に従って測定
する。上述のアッセイ方法１こおいて、第１反応と第２
反応の間における洗浄を省略してもよいし、さらに簡略
化するために被検液、抗体結合固＋［Ｉおよび標識剤で
標識した抗体を同時に加えて反応させてもよい。

上記本発明のインターフェロン−γの免疫化学的測用試
薬は、例えば下記測定試薬キットとすることができる。

（１）担体上に保持された該モノクローナル抗体（２）
標識化された該ポリクローナル抗体（３）０〜１０ｎｇ
の…準ｒｌＦＮ−７もしくはれＩＦＮ−γ （４）上記（１）〜（３）の試薬および被検試料の希釈
に用いる緩衝液（該試薬および該被検試料の希釈に用い
るとかできる緩衝液であればいずれでもよいが、その−
例としてはｐＨ６〜９のリン酸緩衝液またはグリシン緩
衝液が挙げられる。） （５）インキュベーション後、担体の洗浄に用いる緩衝
液（該担体の洗浄に用いることができろ緩衝液であれば
いずれでもよいが、その−例としてはリン酸緩衝液また
はグリシン緩衝液が挙げられる。） （６）標識剤として酵素を用いる場合は、酵素の測定に
必要な試薬。その−例として、酵素にペルオキシダーゼ
を用いた場合、ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬
、比色法を利用する場合、０−フェニレンジアミンと過
酸化水素、酵素基質の溶解に用いる緩衝液（好ましくは
クエン酸緩衝液）および反応停止液が挙げられる。

上記キットはたとえば下記の方法により使用することが
できる。

標争ｒＩＦＮ−γ、ｎ１ＦＮ−γもしくは被検液約１０
ないし２００μＱに試薬（４）を加えて希釈し、一定量
の試薬（１）と接触させて約０ないし４０°Ｃで約１な
いし４８時間反応させる。担体を水洗後、試薬（２）の
約ＩＯないし３００μｅを加えたのち、約０ないし４０
℃で反応させる。約１ないし４８時間反応後、試薬（５
）で洗浄し担体上に結合している標識剤の活性を測定す
る。標識剤が放射性同位元素である場合、ウェルカウン
ターもしくは液体シンチレーションカウンターで測定す
る。標識剤が酵素である場合、基質液約１０〜１０００
μ（！を加えて約２０〜４０℃で約０．２〜２４時間反
応させたのち、酵素反応を停止させ、反応液中の吸光度
もしくは蛍光強度を測定する。

本発明のＩＦＮ−γの測定法は、用いるモノクローナル
抗体の性状が明確化されており、また標識体の感度が高
い。従ってＩＦＮ−γの活性部位を正確に認識し、分解
物等を明確に区別して極めて高感度な信頼性の高いＩＦ
Ｎ−γの測定ができる。

作用および実施例 以下に参考例および実施例を挙げて本発明を更に具体的
に説明するが、これらが本発明の範囲を制限するもので
ないことはいうまでもない。

参考例に開示するマウス　Ｂ　ハイブリドーマＷＮγ３
−２９．３３は、財団法人発酵研究所（［ｎ５ｔｔｔｕ
ｔｅ　　ｆｏｒ　　Ｆ　ｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ、　　
Ｏ５ａｋａ）にＩＦＯ−５０００１として寄託されてい
る。

参考例１ （ｉ）　　免疫原の製造 免疫原として用いた、ポリペプチド（ＩＸｒｌＰＮ−γ
）はＥＰＣ公開第０１１００４４号公報記載の方法によ
り、ポリペプチド（ｎ）と牛サイログロブリンの結合物
（ＩＦＮ−γＮＰ−ＴＧ）は特願昭５８−２１５１６８
号明細書記載の方法により製造した。

（１１）免疫 ポリペプチド（Ｉ）をタンパク量として５０ｄｇ。

フロイントコンプリートアジュバントとよく混合し、７
〜８週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスの皮下に接種した（初
回接種）。初回接種の２週後、同量のポリペプチド（Ｉ
）をフロイントインコンプリートアジュバント（Ｆ　Ｉ
　Ａ）とよく混合し、皮下に接種した（二次接種）。三
次・四次接種は２週間隔で二　”次接種と同じ方法で行
なった。五次、六次、七次接匝は、ポリペプチド（［）
をタンパク量として４０μｇおよびＴＦＮ−γｌ’ＪＰ
−ＴＧをタンパク量として４０μｇ、ＩｌＡとよく混合
し、皮下に２週間隔で接種した。上次接種の２週後、ポ
リペプチド（Ｉ）２５μｇ、ＩＦＮ−γＮＰ　　Ｔ０４
０μｇに０．５ｄの生理食塩水を加え、静脈内に最終免
疫を行なった。

（ｉｉｉ）　　ＥＬＩＳＡ法を用いた抗体アッセイ法上
記（１１）の方法で免疫したマウスの血清あるいは参考
例１（ｉｖ）および（ｖ）で得られたハイブリドーマ培
養上清中の抗体活性はエンザイム　リンクド　イムノソ
ーベント　アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を用いて検索した
。即ち、ポリペプチド（１）に１５μｇ／ｄになるよう
°０．ＩＭ重炭酸ナトリウムを含有したリン酸緩衝液（
ｐＨ８，０）を加え、９６ウエルマイクロプレートの各
ウェルに１００μｅずつ分注し、４℃で２４時間反応さ
せた。反応後、ウェルの余剰の結合部位をふさぐため２
％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液を１０
０μｅずつ分生し、４°Ｃ２４時間処理し、ＥＬＩＳＡ
に使用するプレートを作成した。

以上のように調製したプレートに血清あるいはハイプリ
ドーマ培養上清１００μｇを加え、２４℃で３時間反応
させた。反応後、生理食塩水でよく洗浄し、ホースラデ
イシュベルオキシダーゼ（ＨＲＰ）でラベルしたヤギ抗
マウスイムノグロブリン抗体を各ウェルに１００μρ加
え、室温で３時間反応後させた。反応終了後、各ウェル
をリン酸緩衝液でよく洗浄し、１０ｄの０．１Ｍクエン
酸緩衝液に２２ｍｇのオルソフェニレンジアミン。

１０μＱのＨ２Ｏ，を加えた酵素基質溶液１００μりを
各ウェルに加えて、酵素反応を室温で１５分行ない、４
規定硫酸で反応を停止させた。反応停止後、タイターチ
ックマルチスキャン（フロー社製）を用いて波長４９２
ｎｍで発色色素量を測定し、抗体の活性を判定した。

（ｉｖ）　　細胞融合およびハイブリドーマ上清の抗体
の測定 参考例１（ｉｉ）の最終免疫の３日後マウスの膵臓を摘
出し、ステンレスメツシュで圧迫、ろ過し、イーグルズ
・ミニマムφエッセンシャルメディウム（ＭＥＭ）に浮
遊させ、膵臓細胞浮遊液を得た。

細胞融合に用いる細胞として、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウ
ス由来ミエローマ細胞Ｐ３−ｘ６３．Ａｇ８．Ｕｌ（Ｐ
３Ｕｌ）を用いた［カレント　トピックス　インマイク
ロバイオロジー　アンド　イムノロジー。

８１．１−７（１９７８）］。細胞融合は、原注［ネイ
チャー、２５６，４９５−４９７（１９７５）］に準じ
て行なった。即ち、リンパ球含有膵臓細胞およびＰ３Ｕ
１をそれぞれ血清を含有しないＭＥＭで３度洗浄し、膵
臓細胞とＰ３Ｕ１数の比率を５＝１になるように混合し
て、８００回転で１５分間遠心分離を行なって細胞を沈
殿させた。上清を充分に除去した後、沈殿を軽くほぐし
、４５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００（
コツホライト社製）を０，３顧加え、３７℃温水槽中で
７分間静置して融合を行なった。融合後細胞に毎分２成
の割合でＭＥＭを添加し、合計１２１ｎ１．のＭＥＭを
加えた後６００回転１５分間遠心して上清を除去した。

この細胞沈殿物をｌＯ％牛脂児血清を含有するＲＰＭ１
１６４０メディウム（ＲＰＭｌ　１６４０−１０ＦＣ９
）にＰ３Ｕｌが１顧当り２×１０５個になるよう浮遊し
、２４穴マルチデイシユ（リンプロ社製）にｌウェル１
７ｎ！ｌずつ１４４ウエルに播種した。播種後、細胞を
３７°Ｃで５％炭酸ガスフラン器中培養した。２４時間
後、ＨＡＴ（ヒポキサンチンｌＸｌ０″″４Ｍ、アミノ
プテリン４　Ｘ　１０−’Ｍ、チミジン１，６ｘｔＯ−
５Ｍ）を含んだＲＰＭＩ　１６４０−１０Ｆｃｓ培地（
ＨＡＴ培地）をｌウェル当りｌｄずつ添加することによ
り、ＨＡＴ選択培養を開始した。ＨＡＴ選択培養は、培
養開始３，５．７日後に旧液を１ｄ捨てたあと、ｔｙの
ＨＡ　Ｔ培地を添加す、ることにより継続した。ハイブ
リドーマの増殖は、細胞融合後１０〜１４日で播種した
全ウェルに認められ、培養液が黄変したとき（約１ｘｌ
Ｏ’個／−）、上清を採取し、ポリペプチド（Ｉ）をコ
ートしたマイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ法（参考
例１（ｉｉｉ）記載）で、抗体の有無を検討した。抗体
活性は、１４４ウエル中３ウエルに認められた。

次に、これら３ウエルの抗体が、ＩＦＮ−γを認識する
かどうか抗ウィルス活性の吸収により検索しｆこ。すな
わち、ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を結合させた３％セル
ロース溶液５００μＱに培養上清を５００μρを加え、
４°Ｃで２４時間反応さＵ・た。反応後セルロースを生
理食塩水でよく洗浄し、２２００　Ｕ／蔵のＩＦＮ−γ
を加え、４°Ｃで２・１時間反応させ、上清中のＩＦＮ
活性を測定した。ＩＦＮ−γサンプルとして、参考例１
（ｉ）記載のポリペプチド（Ｄを用いた。

ＩＦＮ活性の画定は、マイクロプレートを用いた細胞変
性効ｉ（ＣＰ　Ｅ）リーディング法で測定した［アプラ
イド　マイクロバイオロジー、１６゜１７０６−１７０
７（１’９６８）］。すなわち、９６穴マイクロプレー
ト（ヌンク社製）全てのウェルに５０μＱのＭＥＭを入
れ、最初のウェルにＩＦＮサンプルを５０μＱ加えて、
連続的に２倍希釈を行なった、このようにした各ウェル
に、ＷＩＳＨ細胞を２０％ＦＣＳ含有ＭＥＭに１ｄ当り
４×１０５個になるよう調整した細胞浮遊液５０μりを
加え、２４時間、３７℃、炭酸ガスフラン器で培養した
。培養後、水泡性口内炎ウィルスにュージャージー株）
を２０００ＴＣＩＤ５ｏ（ティッシューカルチュアイン
フエクティングドーズ５０）になるようＭＥＭで調整し
、その５０μρを各々のウェルに加え、３７°Ｃ１炭酸
ガスフラン器内で培養した。約３５時間後、ＩＦＮサン
プルを加えていないウェル細胞が１００％ＣＰＥを起こ
した時点で、各ウェルのＣＰＥを顕微鏡で観察し、５０
％のＣＰＥを起こしているウェルのＩＦＮ−サンプルの
希釈数の逆数をもってＩＦＮの力価とした。

その結果、３ウエル（ＷＮγ３−１６．２９．４５）か
らの抗体がｒｌＦＮ−γ（ポリペプチド（（））の抗ウ
ィルス活性を吸収することが分り、そのうちの１つ（Ｗ
Ｎγ３−２９）は、強い吸収能を示した（第１表）。

第１表 ハイブリドーマ上清中の各抗体のｒｌ　ＦＮ−γ活性の
吸収能 残存ＩＦＮ活性 ｒｌＦＮ−ｒ　　　　　ＷＮ７３−１６　　１１ＱＱ（
ポリペプチド（１））　　　　　　　２９　　　５５０
（ｖ）クローニング 上記（ｉｖ）で得られたポリペプチド（Ｉ）に強い結合
性を示す抗体を産生ずるハイブリドーマＷＮ７３−２９
を、限界希釈法によりクローニングを行なった。すなわ
ち、ハイブリドーマが２個／旙になるようＲＰＭＩ−２
０ＦＣＳに浮遊させ、９６穴マイクロプレート、（ヌン
ク社製）に１ウェル当り、ｏ、ｔｙずつ分注した。分注
する際、フィーダー細胞として１３　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマ
ウスの胸腺細胞をウェル当り５Ｘ１０５個になるように
加えた。このようにして、約２週間後に細胞の増殖が認
められろようになった細胞の培養上清を採取して、抗体
の有無を参考例１（ｉｉｉ）記載のＥＬＩＳＡ法で調べ
た。

その結果、得られた４８クローン中３８クローンに抗体
活性を認めた。

以後の実験ではこれらクローンの中の代表的なりローン
としてマウス　Ｂ　ハイブリドーマＷＮγ３−２９．３
３を選んで実験に用いた。

（ｖｉ）　　抗体の認識部位の検討 上記（Ｖ）で得られたポリペプチド（Ｉ）に強い結合性
を示すモノクローナル抗体が、ＩＦＮ−γのどの部位を
認識するかを検討した。すなわち、ハイブリドーマＷＮ
γ３−２９．３３の培養上清５０μＱとペプチド（ｎＸ
ＩＦＮ−γＮＰ）またはペプチド（ＩＩ［ＸＩＦ’Ｎ−
γＣＰ）をそれぞれ２０μｇ／！ｎ１に調製したもの５
０μｅとを混合し、３７℃で１時間反応させた後、この
混合液中の抗体価を、参考例１（ｉｉｉ）記載のＥＬＩ
ＳＡ法で検討した。なお対照はペプチド（ＩＩ）または
ペプチド（ＩＩＩ）溶液のかわりにＨＡＴ培地を用いた
。この実験で、抗体がＩＦＮ−γＮ末部を認識するもの
ならばＩＦＮ〜γＮＰにより、ＩＦＮ−γＣ末部を認識
するものならば、ｒＦＮ−γＣＰにより抗体の活性基が
マスクされ、マイクロプレート上のｒｌＦＮ−γに結合
しない筈である。結果は第２表に示したように、ＷＮγ
３−２９．３３モノクロ一ナル抗体のマイクロプレート
上のｒｌ　ＦＮ−γへの結果は、ＩＦＮ−γＮＰまたは
ＩＦ’Ｎ−γＣＰによって阻害されなかった。

（以下余白） 第２表 モノクローナル抗体のＩＦＮ−γ認識部位の特異性１ 拮抗物質 ＷＮγ３−２９．３３　１．１０５　１．０２１　０．
９８０１Ｎγ２−７６．５３　１．５１７　　Ｇ、２０
６　　Ｌ、３６３γ２−１１．１　　＞２．（１＞２．
０　０．１００１表中の数字は４９２賎における吸光度
の値を示す。

従ってこの抗体は、第１図における４番目から２１番目
および１３１番目から１４６番目以外のアミノ酸部分を
認識することが分かった。なお、対照として用いたＩＦ
Ｎ−γＮ末部を認識するＷＮγ２−７６．５３モノクロ
一ナル抗体（特開昭６０−１０７５６９号公報参照）、
Ｃ末部を認識するγ２−１１．１モノクローナル抗体（
ＲＰ　Ｃ公開第０１０３８９８号公報参照）のマイクロ
プレート上のポリペプチド（１）への結合は、それぞれ
ペプチド（Ｉｆ）およびペプチド（１）によって阻害さ
れた。

参考例２　モノクローナル抗体の製造 （１）抗体産生ハイブリドーマの腹水化および腹水から
の抗体精製 クローニングによって得られたマウスＢ／Ｓイブリドー
マＷＮγ３−２９．３３細胞ｌＸＩＯ３個を、あらかじ
め０，５成のミネラルオイルを腹腔内に投与しておいた
ＢＡＬＢ／Ｃマウス腹腔内に接種することにより腹水化
を行なった。ノｚ４ブリドーマを腹腔に投与して１０日
後、腹水を採取した。得られた腹水９．７成から、ステ
ーリンら［ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミスト
リー。

２５６．９７５０−９７５４（１９８１）コの方法に準
じてモノクローナル抗体を精製した。まず腹水からフィ
ブリン様物質を除去するため１０．００Ｏｒｐｍ１５分
間遠心した後、リン酸緩衝液−食塩水（ＰＢＳ：８．１
ｍＭ　　Ｎａ、ＨＰＯ，，１，５ｍＭ　ＫＨｚＰＯ，，
２，７ｍＭ　ＫＣＩ、１３７ｍＭ　ＮａＣ１，ＰＨ７，
２）で２８０ｎｍの紫外部吸収（Ａｘ８ｏ）が１２〜１
４の値を示す濃度に希釈した。希釈後サンプルに飽和硫
酸アンモニウム溶液を４７％の濃度になるように加え、
４℃で攪拌しながら６０分間塩析を行ない、その後遠心
（１０、ＯＯＯｉ／／ｆｒｐｍ、　１５分間）を行なっ
て沈殿物を得た。沈殿物を５０ｍＭＮａＣ１含有２０ｍ
Ｍトリス緩衝溶液（ｐＩ−１７、９）に溶解し、同溶液
２Ｑに対して透析を行なった。２時間後、２ｅの新しい
透析液に換え、さらに１５時間透析を行なった。透析後
、沈殿を除去するため１００００　ｒｐｍ、　１５分間
遠心を行ない、上清をＡ２８０の値が２０〜３０の濃度
になるように調整した。このサンプルを充分量の５０ｍ
Ｍ−ＮａＣ１含有トリス緩衝溶液で平衡化した１７−の
ＤＥＡＥセルロースカラム（ワットマンＤＥｓｔ）にか
け、５０ｍＭＮａＣ１含有トリス緩衝溶液でよく洗った
後、５０ｍＭ−５００ｍＭ　ＮａＣ１を含む同緩衝液の
濃度勾配塩溶液を用いて１．５ｄ／分の流出速度で分画
を行なって素通り分画を濃縮し、モノクローナル抗体Ｗ
Ｎγ３−２９．３３を得た。抗体の純度の確認にはラエ
ムリらの方法［ネイチャー。

２２７．６８０−６８５（１９７０）］に準じて５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた。

すなイつち、硫安塩析し、ＤＥＡＥセルロースカラムで
索通りした分画を、２−メルカプトエタノールで還元し
、アクリルアミド濃度ｌＯ％のゲルを用いて１８０ボル
トで２．５時間泳動を行なった。

その結果、分子ｆｆ１５２に前後にＨ鎖、２８に前後に
Ｌ鎖の２つのバンドが認められた。

（ｉｉ）　　モノクローナル抗体のＩＦＮ−γに対する
結合能および中和能 ＷＮγ３−２９．．３３モノクロ一ナル抗体のＩＦＮ−
γに対する結合能、および中和能を、γ２−１１．１モ
ノクローナル抗体、ＷＮγ２−７６５３モノクロ一ナル
抗体と比較検討した。

結合能；ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を結合させた３％セ
ルロース溶液５００μＱにそれぞれ精製したモノクロー
ナル抗体を５００μＱ、（約２５μｇの抗体含有）加え
、４°Ｃで２４時間反応させた。反応後セルロースを生
理食塩水でよく洗浄し、５５０Ｕ／鵠のｒ　Ｉ　Ｆ　’
Ｎ−γを加え、４℃で２４時間反応させ、上清中のＩＦ
Ｎ活性を参考例１（ｉｖ）記載のＣＰＥリーチーティン
グ法定した。ＩＦＮ−γサンプルとして、ポリペプチド
（１）およびヒト末梢血リンパ球をコンカナバリンＡ４
０μｇ／ｄと１２−Ｏ−テトラデカノイル−ホルボール
−１３＝アセテートＬ　５　ｎｇ／ｄで刺激して７２時
間後採取した上清（ｎｌＦＮ−γ）を用いた。また対照
として５００μｅのＩＦＮ−α（ナマルバ細胞をセンダ
イウィルスｌ０ＨＡユニツトで刺激して４８時間後の培
養上清で５５０　Ｕ／ｄのＩＦＮ−αを含む）、５００
μｅのＩＦＮ−β（リー・バイオモレキュラー・リサー
チラボラトリーズ社から購入した乙の５５０　Ｕ／Ｔｎ
１のＩＦＮ−βを含む）を用いｆコ。

その結果、ＷＮγ３−２９．３３モノクロ一ナル抗体は
、これまでに得られていたモノクローナル抗体よりＩＦ
Ｎ−γに対して強い結合能を示すこと、およびＩＦＮ−
α、ｒＦＮ−βには全く結合性を示さないこと等が分か
った（第３表）。中和能二上記の２種のＩＦＮ−γ（ｎ
ｌＦＮ−γ、ポリペプチド（１））、ＩＦＮ−αおよび
ＩＦＮ−β（力価は何れも上記と同じ）それぞれ５００
μＱに、精製した抗体５００μＱ（約２５μｇの抗体含
有）を加え、４℃で２４時間反応させた。反応後反応液
中のＩＦＮ活性をＣＰＥリーチーティング法定した。そ
の結果、ＷＮγ３−２９．３３モノクロ一ナル抗体は、
ｎｒ　ＦＮ−γ、ポリペプチド（１）の抗ウィルス活性
をほぼ完全に中和し、ＷＮγ２−７６．５３抗体より強
い中和能を示したが、ＩＦＮ−α、βに対しては中和活
性を持たないことが分かった（第４表）。

（以下余白） 第３表 残存ＩＦＮ活性 ＩＦＮ−α　　ＷＮγ３−２９．３３　　５５０ＩＦＮ
−β　　ＷＮγ３−２９．３３　　５５０ｎｌＦＮ−７
ＷＮ７３−２９．３３　　　５２ＷＮγ２−７６．５３
　　２７５ γ２−１１．１　　　　　２７５ ｒＩ　ＦＮ−７ＷＮ７３−２９．３３　　　５２（ポリ
ペプ　　　ＷＮγ２−７６．５３　　　１３８チド（■
））　　　γ２−１１．１　　　　　　２０６第４表 残存ＩＦＮ活性 ［’Ｎ−α　　ＷＮγ３−２９．３３　　５５０ＩＦＮ
−β　　ＷＮγ３−２９．３３　　５５０ｎｌ　ＰＮ−
７ＷＮ７３−２９．３３　　　＜１３ＷＮγ２−７６．
５３　　　６９ γ２−１１．１　　　　　５５０ ＝５５０ ポリペプチド　ＷＮγ３−２９．３３　　　２５（Ｉ）
　　　　　　ＷＮγ２−７６．５３　　　６９γ２−１
１．１　　　　　５５０ ＝５５０ （ｉｉｉ　）　　モノクローナル抗体のポリペプチド（
Ｖ）に対する中和能 ポリペプチド（Ｖ）に対してＷＮγ３−２９４３モノク
ロ一ナル抗体が反応するかどうかを参考例２：ｉｉ）記
載の中和法で検討した。すなわち、１３７０Ｕ／ｄの抗
ウィルス活性を示すポリペプチド（Ｖ）含有上清５００
μａと等量の精製した抗体（約２５μｇの抗体含有）を
加え２４℃で２４時間反応させ、残存するＩＦＮ活性を
ＣＰＥリーチーティング法定した。その結果、ＷＮγ３
−２９．３３モノクロ一ナル抗体は、ポリペプチド（Ｖ
）の抗ウィルス活性をほぼ完全に中和することが分かっ
た（第５表）。本実験の結果および、参考例２（ｉｉ）
の結果から、該モノクローナル抗体は、第１図における
２２番目から１３０３０番目のアミノ酸配列の何れかの
エピトープを認識するものであることが判明した。

（以下余白） 第５表 モノクローナル抗体によるポリペプチド残存ＩＦＮ活性 ＩＦＮザンプル　　抗体　　　　（Ｕ／滅）ポリペプチ
ド　ＷＮγ３−２９．３３　　　＜３４（ｉｖ）　　モ
ノクローナル抗体のサブクラスハイブリドーマＷＮγ３
−２９．３３培養上清中のモノクローナル抗体とウサギ
抗マウスＩｇＧ１　、Ｇ　２ａ、Ｇ　２ｂ、Ｇ　３抗体
（マイルス社）との寒天内沈降反応（イムノロジカルメ
ソッド　ゲル　ディフュージョンテクニック　ブラック
ウエルオックスフォード　１９６４年）により抗体のサ
ブクラスを検討した。結果は、モノクローナル抗体とウ
サギ抗マウスＩｇＧ１抗体との間に著明な１つのバンド
が認められ、他の抗マウスＩｇＧ抗体との間には、バン
ド形成はみられなかった（第６表）。

従って当モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１サブクラスに
属するものであることが判明した。

第６表 モノクローナル抗体の属するサブクラス実施例１　標識
剤としてペルオキシダーゼを用いる酵素免疫測定法 （１）ＷＮγ３−２９．３３結合固相の作成９６ウエル
のマイクロテスト用プレート（ヌンクーイムノプレート
ｆ：ヌンク社（デンマーク）製）の各ウェルに参考例２
で得たＷＮγ３−２９．３３溶液（３０Ｍｇ／Ｍ１．ｏ
、ＩＭ炭酸緩衝液ｐＨ９，６）１５０μＱを注入し、４
℃で一晩放置した。ＰＢＳ（０，１５Ｍ　ＮａＣ１を含
む１）Ｈ７，４の０，０１Ｍリン酸緩衝液）３００μＱ
で洗浄後、１％ＢＳＡおよび０．００５％チメロサール
を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（１）Ｈ７，０）３００
μＱを注入し、４℃で保存した。

（２）ポリクローナル抗体の製造 ＥＰＣ公開第０１１００４４号公報記載の方法で得られ
た精製ｒｌＦＮ−γ蛋白質２ｍｇを生理食塩水１１ｎ１
．に溶解し、これにフロイントの完全アジュバント［免
疫の生化学、橘ら著、共立出版株式会社（１９６７年）
１１．５ｄを加えてよく混合して乳剤を作り、ｔｙをウ
サギの両大腿部筋肉内および背部皮下数箇所に注射した
。以上の操作を４週毎に・１回行ない最終免疫後１週間
で採血して抗血清を得た。硫酸アンモニウム法で塩析し
てグロブリン画分を調製したのち、ｒ（ＦＮ−γ結合セ
ファロース４Ｂカラムを用いるアフィニティ・クロマ画
分を０．１７Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，３）で
溶出することにより、ｒＩＦＮ−γに強い新和性を有す
るポリクローナル抗体を得た。

（３）ポリクローナル抗体Ｐ　ａｂ’フラグメントの製
造 前項で得られたポリクローナル抗体５ｍｇに０．１ｍｇ
のペプシンを加え３０℃で一夜反応後、セファデックス
Ｇ−１５０カラム（直径２　、５　ｃｍ。

長さ５５ｃｍ）で精製した。得られた抗体Ｆ　（ａｂ’
）を画分を２−メルカプトエヂルアミンで還元し、セフ
ァデックスＧ−２５のカラムによるゲルクロマトグラフ
ィーで精製してポリクローナル・ウサギ抗ｒｌＦＮ−γ
抗体（Ｆ　ａｂ’フラグメント）を得た。

（４）ポリクローナル抗ｒｌＦＮ−７抗体（Ｆａｂ’）
−ＨＲＰ複合体の製造 （ａ）　　マレイミド基の導入 ６ｍｇの西洋わさびペルオキシダーゼ［ベーリンガーマ
ンハイム社（西ドイツ）製］を１旙の０．　１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、５０μＱの［Ｎ−ジメ
チルホルムアミドにとかした結合試薬ＭＭＣ（一般式［
１］において、ｎ＝１．Ｒ＝シクロヘキシレンである化
合物）４．８ｍｇを加えて３０℃で６０分間攪拌しなが
ら反応させた。生成した沈殿を遠心分離して除去し、上
清をセファデックスＧ−２５のカラム（１，Ｏｘ４５ｃ
ｍ）に通し、０．１Ｍリン酸緩衝液で溶出させた。タン
パクを含む画分を分取し、コロジオン膜を用いて濃縮し
た。このようにして調製したマレイミド化ペルオキシダ
ーゼにおいてペルオキシダーゼ１分子あたり導入された
マレイミド基の数は１．０〜１．２個であった（ペルオ
キシダーゼの分子量を８０ｎｍ ４０．０００．Ｅ　　　　　２２．７５として計算）。

１％ （ｂ）　　マレイミド化ペルオキシダーゼと抗ｒｌＦＮ
−γ抗体（Ｆａｂ’フラグメント）との複合体の製造 上記（ａ）で調製したマレイミド化ペルオキシダーゼ１
．５ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）０．１
５ｄに溶解し、先に（３）項で得たポリクローナル抗ｒ
ｌＦＮ−γ抗体（Ｆａｂ’フラグメント）１．８ｍｇを
とかした５ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を
含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）０．１５ｄを
加えて４℃で２００時間反応せた。反応後、ウルトロゲ
ルＡｃＡ’４４を充てんしたカラム（１、５ｘ４５ｃｍ
）を用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、Ｏ，１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，５）で溶出させた。溶出液の２８
０ｎｍの吸光度ならびに酵素活性を測定しペルオキシダ
ーゼとウザギ抗ｒＩ　ＦＮ−γ抗体（Ｆ　ａｂ’フラグ
メント）との複合体の溶出画分を得た。

（５）操作法 （１）項で作成したプレートをＰＢＳで洗浄後、各ウェ
ルに緩衝液Ｂ（ｌ　Ｏ％仔牛血清、および０．００５％
チメロサールを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，
５）５０μＱおよび緩衝液Ｂで希釈した標準ｒＩＦＮ−
γ　１００μｇを加え、室温で一晩放置した。ＰＢＳで
洗浄後、緩衝液Ｂで酵素濃度として５００　ｎｇ／ＩＲ
１に希釈した第（４）項に作製した酵素標識剤１５０μ
ｌ加え、室温で４時間反応させた。各ウェルをＰＢＳで
洗浄後、基質液として０．２％０−フェニレンジアミン
および０．０２％過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸緩
衝液（ｐＨ５，５）ｌ　００ｕＱを加え、室温テ２０分
間反応させた。２Ｍ硫酸１００μＱを加えて酵素反応を
停止させたのち、各ウェルの４９２ｎｍの吸光度をタイ
ターチック・マルチスキャン（フロー社　米国）で測定
した。

第２図に得られたｒｌＦＮ−γの標準曲線を示した。

実施例２　　ＩＦＮ−γの免疫化学的測定キットおよび
ｒｌ　ＦＮ−γの測定 下記のＩＦＮ−γ免疫化学的測定キットを用い、下記の
操作法に従って、ｒＩ　ＦＮ−γ投与患音血清中ｒｌＦ
Ｎ−γ濃度を測定した。

（１）　　実施例１−（１）で得られたモノクローナル
抗体感作プレート。

（２）実施例１−（４）で得られたペルオキシダーゼ標
識ポリクローナル抗体複合体。

（３）　　０〜ＩＯｎｇの標準ｒｌＦＮ−７゜／Ｊ）　
　　　ｌ−ｆコ／ｎ　　Ｓ　　／Ｑ　　’＋／ｒＸシ会
寸ｖ＋ｒ　　Ｌ　　ｒｅｉｄｙしｈ　：Ａ：　ｒｒｓ　
６　宿プに用いる緩衝液Ｅ：Ｉ　Ｑ％仔牛血清、０，４
Ｍ　ＮａＣｌ、０．００５％チメロサールを含むｐＨ６
，５の０．０５Ｍリン酸緩衝液。

（５）０−フェニレンジアミン。

（６）上記（５）の溶解に用いる緩衝液Ｄ：００２％過
酸化水素、０．００５％チメロサールを含むｐＨ５，５
の０，１Ｍクエン酸緩衝液。

（７）停止液：２Ｍ　硫酸。

測定 緩衝液Ｅに溶解させたｒＩ　ＦＮ−γ標準溶液あるいは
緩衝液Ｅで５倍以上に希釈された被検血清試料１００μ
Ｑを、緩衝液Ａ　（ｐＨ７、０の０，０１Ｍリン酸緩衝
液（ＮａＣｌ二０．１４Ｍ））で洗浄された（１）の各
ウェルに注入し、室温で一晩反応させた。各ウェルを緩
衝液Ａで洗浄後、緩衝液Ｅで希釈された試薬（２）１５
０μＱを加えて、室温で４時間反応させた。各ウェルを
緩衝液Ａで洗浄後、試薬（６）で溶解した０、２％の試
薬（５）１５０μＱを加えて室温で３０分反応させた。

各ウェルに２　Ｍ　ＨｚＳ　Ｏ４１００μＱを添加して
反応を停止させ、４９２ｎｍの吸光度をマイクロプレー
ト用自動比色計［タイターチック・マルチスキャン・フ
ロー社（米国）製］を用いて測定した。

結果を第７表に示す。

第７表 ｒｌＦＮ−γ投与癌患者の血清濃度変化発明の効果 本発明のＩＦＮ−γの測定法は、正確にＩＦＮ−γを認
識し、極めて高感度であり、とりわけ患者血中のＩＦＮ
−γの測定等に有利に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は１４６個のアミノ酸からなるＩＦＮ−γのアミ
ノ酸配列を示す。 第２図は本発明で得られたｒｌＦＮ−γの標準曲線を示
す。 、１１ｎ≧≧四ｄ≧− １ぺ　　　−ｈｑｚｑ。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）測定用試料を、［１］第１図で示されるポリペプ
   チドと結合し、ペプチド【遺伝子配列があります】およ
   びペプチド【遺伝子配列があります】 のいずれとも結合 しないモノクローナル抗体および［２］ポリクローナル
   抗インターフェロン−γ抗体のいずれか一方を含有する
   固定相と他方を含有する標識体とを用いるサンドイッチ
   法に付すことを特徴とするインターフェロン−γの免疫
   化学的測定法。
2. （２）［１］第１図で示されるポリペプチドと結合し、
   ペプチド【遺伝子配列があります】 および【遺伝子配列があります】 のい ずれとも結合しないモノクローナル抗体および［２］ポ
   リクローナル抗インターフェロン−γ抗体のいずれか一
   方を含有する固定相と他方を含有する標識体とを組合せ
   てなるインターフェロン−γの免疫化学的測定用試薬。