JP2003504378A - 顆粒球コロニー刺激因子の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ａ）疎水性相互作用クロマトグラフィーによりＧ−ＣＳＦを含有する生体試料の容積を減少させて濃縮され脱塩され富化された画分を得、ｂ）濃縮した画分をヒドロキシアパタイトにＧ−ＣＳＦが弱く結合する条件で通して濃縮され脱塩され富化されたＧ−ＣＳＦを含有する画分を得、ｃ）Ｇ−ＣＳＦを集める、ことからなる工程を含む生体試料からＧ−ＣＳＦを精製するための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦと呼ぶ）をヒドロキシアパタ
イトでのクロマトグラフィー段階を使用するクロマトグラフィーにより精製する
ための方法に関する。

【０００２】 哺乳類細胞の分化や増殖を調節するコロニー刺激因子のうちで、顆粒球コロニ
ー刺激因子が、例えば国際特許出願ＷＯ８７／０１１３２又は欧州特許出願ＥＰ
１６９５６６に記載されている。

【０００３】 異なる起源からのＧ−ＣＳＦの調製及びその精製は、多数の科学刊行物や特許
公報に記載されている。例えば、欧州特許出願ＥＰ２４３１５３は、膀胱ガンＨ
ＢＴ５６３７の細胞系からヒトＧ−ＣＳＦを調製するための方法について記載し
た。欧州特許出願ＥＰ２１５１２６は、エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で
産生した組換え体ヒトＧ−ＣＳＦの精製について記載した。上記の方法は、出発
生体調製物の初期の濃縮液が、一般的に、限外濾過及び塩による沈殿の定法で、
次に逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣと呼ぶ）の逐次段階により達
成される多段階精製に相当するが、この方法には、例えば蛋白質が有機溶媒によ
り変性してしまうため収率が大きく減少するという周知の欠点がある。さらに、
米国特許ＵＳ５０５５５５５には、酵母で産生した組換え体ヒトＧ−ＣＳＦを、
陽イオン交換カラム（Ｓセファロース又はモノＳ）でのクロマトグラフィーによ
る濃縮の後にＮａＣｌによる沈殿によって大規模で精製するための選択的且つ単
純化された方法が記載されているが、得られた収率及び純度については言及され
ていない。

【０００４】 さらに、ＲＰ−ＨＰＬＣを除くいくつかのクロマトグラフィー段階を使用する
こともＧ−ＣＳＦを精製するために記載された。

【０００５】 マウス白血病細胞により自然に産生されたＧ−ＣＳＦを精製するために、フェ
ニルセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）の使用がニコラ等によるJour
nal of Biological Chemistry , Vol. 258, p. 9017-9023, 1983に記載された。
中空繊維での培養液の予備濃縮及び「塩析」クロマトグラフィーの後、Ｇ−ＣＳ
Ｆはフェニルセファロースカラムに直接固定され、次に減少する塩勾配、その後
エチレングリコールの直線勾配を使用して溶出された。

【０００６】 ヒドロキシアパタイトの使用が、形質転換したＣＨＯ細胞から産生されたＧ−
ＣＳＦの精製の最後の段階として、荒川等によりArchives of Biochemistry an
d Biophysics, Vol. 316, p. 285-289, 1995に記載された。

【０００７】 形質転換されたエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から産生されたＧ−
ＣＳＦ精製を精製するために、S-H Kang等によるBiotechnology Letters, Vol.
17, p. 687-692, 1995にＳＰセファロース速流（ファルマシア社）の使用が記載
された。封入体の可溶化及び再生の後、Ｇ−ＣＳＦは０〜０．５Ｍの範囲のＮａ
Ｃｌ勾配を使用して溶出された。

【０００８】 本発明の主題の一つは、Ｇ−ＣＳＦを、疎水性相互作用クロマトグラフィーを
使用して予め濃縮させ富化させた生体試料からヒドロキシアパタイトでのクロマ
トグラフィー段階により大規模で且つ高収率で単離及び精製することを可能にす
る方法を提供することである。

【０００９】 本発明の方法は、例えば臨床で使用するのに好適な純度を有するＧ−ＣＳＦを
調製するための多段階方法においてＧ−ＣＳＦを精製する第１段階として使用す
ることができる。

【００１０】 本発明の主題は、生体試料からＧ−ＣＳＦを精製するにあたり、 ａ）Ｇ−ＣＳＦを含む生体試料の容積を疎水性相互作用クロマトグラフィーによ
り減少させて濃縮され脱塩され富化された画分を得、 ｂ）濃縮された画分をヒドロキシアパタイトにＧ−ＣＳＦが弱く結合する条件下
で通して濃縮され脱塩され富化されたＧ−ＣＳＦを含む画分を得、及び ｃ）Ｇ−ＣＳＦを集める 段階を含むＧ−ＣＳＦの精製方法である。

【００１１】 上記の方法は、Ｇ−ＣＳＦを変性させない条件下で精製すること及び生物学的
に活性なＧ−ＣＳＦを単離することを可能にする。

【００１２】 本発明の方法に従って精製されるＧ−ＣＳＦは生物学的及び薬学的に重要な既
知のＧ−ＣＳＦのどれであってもよい。Ｇ−ＣＳＦには、細胞により、例えば、
ワトソン等がJ. Immunol. Vol. ，137, p. 854-857, 1986に記載したような腫瘍
細胞から確立された細胞系により本質的に産生したＧ−ＣＳＦ、国際特許出願Ｗ
Ｏ９５／３１５６０に記載されたようなヒト細胞においてＧ−ＣＳＦ遺伝子の活
性化により産生したＧ−ＣＳＦ（「Gene Activation-GCSF」であるからＧＡ−Ｇ
ＣＳＦと呼ぶ）又は宿主細胞により組換えＤＮＡ技術によって産生したＧ−ＣＳ
Ｆが包含される。宿主細胞は、真核細胞、例えば、サルＣＯＳ細胞、ハムスター
ＣＨＯ細胞若しくはマウスＣ１２７細胞のような哺乳類細胞又は、例えば、サッ
カロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母或いは、例
えば、エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような原核細胞とすることができ
る。組換え体Ｇ−ＣＳＦの例は、例えば、Ｃ１２７細胞又はＣＨＯ細胞において
産生したＧ−ＣＳＦについて記載した欧州特許出願ＥＰ２１７４０４、サッカロ
ミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）により産生したＧ−ＣＳＦに
ついて記載した米国特許５０５５５５５又はＣＯＳ細胞だけでなくエシェリヒア
・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において産生したＧ−ＣＳＦについて記載した国際特許
出願ＷＯ８７／０１１３２に記載されている。この方法では、グリコシル化又は
非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦの双方をも精製することができる。

【００１３】 本発明の方法でＧ−ＣＳＦを精製できる生体試料は、例えば、細胞溶解液、封
入体又はＧ−ＣＳＦが排出された培養上層液のような細胞培養の生物学的流体を
含む。Ｇ−ＣＳＦを精製するのに使用される生体試料は、細胞から又は当業者に
周知の方法、例えば、濾過、遠心分離若しくは限外濾過により細胞破壊物から予
め分離されることが好ましい。

【００１４】 疎水性相互作用クロマトグラフィーとは、物質分離用担体上での、イオン基な
しで基材に付着した疎水性基との相互作用の相違を基礎とするクロマトグラフィ
ーを意味する。疎水性基は、例えばブチル若しくはオクチル基のような脂肪族リ
ガンド又は、例えばフェニル基若しくはフェニルブチルアミン基のような芳香族
リガンドとすることができ、基材は一般的にゲル、例えば、セファロースのよう
なアガロースである。使用される担体は商業的に入手できる商品である。疎水性
相互作用クロマトグラフィーを使用する全ての方法において、蛋白質の疎水性ゲ
ルへの固定は、高濃度の塩の存在下で行われる。全く予想外で、また有利な態様
では、本発明に係る方法は、低い導電率又は低い塩含有量（例えば、硫酸アンモ
ニウム若しくはＮａＣｌ）での蛋白質の固定を特徴とする疎水性相互作用クロマ
トグラフィーを含み、塩並びに高率の汚染性蛋白質を除去しながら初期の生体試
料の容積を減少させることを可能にする。従って、本発明の方法は、濃縮され脱
塩され富化された変性していないＧ−ＣＳＦ画分を得るのを可能にし、このもの
は次いでヒドロキシアパタイトに通される。

【００１５】 Ｇ−ＣＳＦが０．１ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭの燐酸塩緩衝液（ｐＨ７
）中で平衡化されたヒドロキシアパタイトに固定しなかった画分として集められ
る、上記の荒川等（１９９５）が記載した精製の最終段階としてのヒドロキシア
パタイトの使用とは反対に、本発明に係る方法は、Ｇ−ＣＳＦがヒドロキシアパ
タイトに弱く結合する条件を使用し、従って、精製したＧ−ＣＳＦの濃縮され脱
塩された溶液を集めることを可能にさせる。

【００１６】 本発明の詳しい主題は、集めたＧ−ＣＳＦが少なくとも９０％の純度を有して
いる上記の方法である。

【００１７】 また、本発明の詳しい主題は、生体試料が細胞培養上層液である上記の方法並
びにＧ−ＣＳＦがヒトＧ−ＣＳＦ（ｈ Ｇ−ＣＳＦ）である上記の方法である。

【００１８】 また、本発明の詳しい主題は、容積減少段階が、生体試料をフェニル型の疎水
性相互作用クロマトグラフィー担体上にＧ−ＣＳＦの固定を許容する条件下で置
くこと、及び次いでそれを溶出することを含む上記の方法である。

【００１９】 本発明のさらに詳しい主題は、フェニル型の担体がフェニルセファロースであ
る上記の方法である。

【００２０】 本発明のかなり詳しい主題は、フェニルセファロース上の固定が０〜６０ｍＳ
のイオン強度の緩衝液中で行われ、溶出が固定用緩衝液中でイオン強度又は塩濃
度を低下させることにより行われる上記の方法である。

【００２１】 また、本発明のさらに詳しい主題は、フェニルセファロース上の固定が０．１
〜１Ｍの濃度でＮａＣｌを含有する緩衝液中で行われる上記の方法である。

【００２２】 本発明のかなり詳しい主題は、フェニルセファロース上の固定が０．１〜０．
５Ｍの濃度でＮａＣｌを含有する緩衝液中で行われ、溶出が水により行われる上
記の方法である。

【００２３】 本発明に係る方法を例示するフェニルセファロースでの疎水性相互作用クロマ
トグラフィーを使用する例は、実験の部でさらに説明する。

【００２４】 また、本発明の詳しい主題は、ヒドロキシアパタイトに通す段階が、２〜３０
ｍＳのイオン強度及び５．５〜７．５のｐＨの緩衝液で行われる本発明に係る上
記方法である。

【００２５】 本発明のさらに詳しい主題は、その緩衝液が１〜１０ｍＭの濃度で燐酸塩を含
む上記の方法である。

【００２６】 また、本発明のさらに詳しい主題は、その緩衝液が１ｍＭの燐酸塩緩衝液であ
り、そのｐＨが６．０〜７．５である上記の方法である。

【００２７】 本発明に係る方法を例示するフェニルセファロースでのクロマトグラフィーの
後にヒドロキシアパタイトを使用する例は、実験の部でさらに説明する。

【００２８】 また、本発明は、生体試料からＧ−ＣＳＦを精製するための多段階の方法で含
有しうるＧ−ＣＳＦを精製するにあたり、 ａ）Ｇ−ＣＳＦを含有する生体試料の容積を疎水性相互作用クロマトグラフィー
により減少させて濃縮され脱塩され富化された画分を得、 ｂ）濃縮された画分をヒドロキシアパタイトにＧ−ＣＳＦが弱く結合する条件下
で通して濃縮され脱塩され富化されたＧ−ＣＳＦを含む画分を得、及び ｃ）Ｇ−ＣＳＦを集める 段階を含むＧ−ＣＳＦの精製方法に関する。

【００２９】 本発明は、特に、多段階の方法が、イオン交換、ゲル濾過、逆相又は親和性ク
ロマトグラフィーよりなる群から選択される１又は２以上のクロマトグラフィー
段階をさらに含む上記の方法に関する。

【００３０】 本発明に係る方法をＧ−ＣＳＦを精製するための多段階の方法で使用すること
を例示するイオン交換及びゲル濾過クロマトグラフィーの段階の例は、実験の部
でさらに説明する。

【００３１】 また、本発明はＧ−ＣＳＦと汚染性蛋白質を含む溶液から汚染性蛋白質を除去
するにあたり、 ａ）その溶液をヒドロキシアパタイトに通して、汚染性蛋白質がヒドロキシアパ
タイトに固定され且つＧ−ＣＳＦが弱く結合するようにし、及び ｂ）Ｇ−ＣＳＦを溶出させる 汚染性蛋白質の除去方法に関する。

【００３２】 本発明は、特に、Ｇ−ＣＳＦの溶出が固定用緩衝液を用いた単純な洗浄により
行われる上記の方法に関する。

【００３３】 Ｇ−ＣＳＦを含有する溶液中に存在する汚染性蛋白質は、例えば、細胞培養培
地に添加されていたものである。その添加蛋白質は、例えば、ウシ血清又はウシ
胎仔血清のような血清や、例えば、アルブミン若しくはトランスフェリン又はそ
れらの混合物のような部分的に精製された血清蛋白質でありうる。

【００３４】 本発明に係る方法では、Ｇ−ＣＳＦを含有する溶液をヒドロキシアパタイトに
通すうちに、望ましくない蛋白質が担体に強固に固定されると共にＧ−ＣＳＦ溶
出の間にも保持されることによってこれらの汚染性蛋白質を除去することができ
る。

【００３５】 本発明はまた、詳しくは、Ｇ−ＣＳＦを含有する溶液がＧ−ＣＳＦを含む生体
試料の疎水性相互作用作用クロマトグラフィーにより調製される上記の方法に関
する。

【００３６】 疎水性相互作用クロマトグラフィーは、実験の部でさらに説明するように、例
えば、フェニルセファロースのようなフェニル型担体で行われることが好ましい
。本発明に係る方法では、生体試料からＧ−ＣＳＦを精製する第１段階の間にこ
れらの汚染性蛋白質を有利に除去することができる。

【００３７】 分析方法 １．ＨＰＬＣによるＧ−ＣＳＦの検定 クロマトグラフィー後に収集した画分を、Ｈ_２Ｏ／ＴＦＡ０．１％中で平衡化
した、３００オングストローム、５ミクロンのＶｙｄａｃＣ４カラム（０．４６
Ｘ１５）で２ｍｌ／ｍｎの流量で４０〜８０％の変化をつけ、１０分以上のアセ
トニトリル／ＴＦＡ０．１％の直線勾配を用いる分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ、及び２
１４ｎｍでの分光光度法による検出によって分析した。 Ｇ−ＣＳＦを、ほぼ６５％のアセトニトリル濃度で溶出する。Ｇ−ＣＳＦ濃度
を標準Ｇ−ＣＳＦとの比較により測定する。純度の評価を、Ｇ−ＣＳＦピークの
領域と注入ピーク以外の全てのピーク領域との比率により測定する。

【００３８】 ２．ＥＬＩＳＡによるＧ−ＣＳＦの検定 Ｇ−ＣＳＦ濃度は、ＲアンドＤシステム社のＥＬＩＳＡキット及びこの供給会
社が奨励する実験記録を使用して測定する。

【００３９】 ３．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 試料を、１０％〜２０％のポリアクリルアミド及び銀染料を含有する即使用可
能なポリアクリルアミドゲル（ノベックス社）上で、５０ｎｇ〜１μｇのＧ−Ｃ
ＳＦの堆積物のためのバイオラド社銀染色キットを使用して分析する。 添付した図は、本発明の側面を例示する。

【００４０】 図１は、ＧＡ−ＧＣＳＦを発現すると共に０．１ＭのＮａＣｌを含有する細胞
上層液のフェニルセファロースでの分画を示すクロマトグラムである。任意単位
は、カラム溶出液の導電率及び光学密度（ＯＤ）のそれぞれを百分率として表し
ている。

【００４１】 図２は、ＧＡ−ＧＣＳＦを発現すると共に０．５ＭのＮａＣｌを含有する細胞
上層液のフェニルセファロースでの分画を示すクロマトグラムである。任意単位
は、図１と同じ意味を持つ。

【００４２】 図３は、フェニルセファロースの後のヒドロキシアパタイトマクロプレップセ
ラミック型ＩでのＧＡ−ＧＣＳＦの分画を示すクロマトグラムである。

【００４３】 図４は、フェニルセファロース及びヒドロキシアパタイト型Ｉ後のＧＡ−ＧＣ
ＳＦの分析用ＲＰ−ＨＰＬＣのクロマトグラムである。

【００４４】 図５は、フェニルセファロース後のヒドロキシアパタイトマクロプレップセラ
ミック型IIでのＧＡ−ＧＣＳＦの分画を示すクロマトグラムである。任意単位は
図１と同じ意味を持つ。

【００４５】 図６は、フェニルセファロース及びヒドロキシアパタイト型II後のＧＡ−ＧＣ
ＳＦの分析用ＲＰ−ＨＰＬＣのクロマトグラムである。

【００４６】 図７は、濾過した培地の上層液（ウェル３）、フェニルセファロースの溶出液
（ウェル４）、ヒドロキシアパタイトの溶出液（ウェル５）、ＳＰセファロース
の溶出液（ウェル５）、ＵＦ濃縮液（ウェル７）、ＰＢＳ緩衝液中のゲル濾過溶
出液（ウェル９）、酢酸塩緩衝液中のゲル濾過溶出液（ウェル１１）におけるＧ
Ａ−ＧＣＳＦの連続精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析と標準分子量マーカー（
ウェル１）を表している。ＧＡ−ＧＣＳＦの見かけ上のＭＷに相当するバンドを
矢印で示す。

【００４７】 例１ フェニルセファロースでのクロマトグラフィーによるＧ−ＣＳＦの生体
試料の濃縮

【００４８】 出発材料は、エンドトロニクス中空繊維バイオリアクターにおいて０．９％の
ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ハイクローン社製）中で国際特
許出願ＷＯ／３１５６０に従って得た、ヒトＧＡ−ＧＣＳＦを発現するヒト細胞
系の培養液の遠心分離上層液である。遠心分離の後、その上層液を使用前に−２
０℃で保存した。

【００４９】 解凍した上層液に０．１ＭＮａＣｌを必要量添加し、ほぼ１５〜２０℃の温度
で０．２２μｍのミリポア膜で濾過した後、フェニルセファロースでクロマトグ
ラフィーした。

【００５０】 ２５％エタノール中で保存し、次いで使用前にＭｉｌｌｉ−Ｑ脱塩水で洗浄し
た後、０．１ＭのＮａＣｌ溶液で平衡化しておいた５０ｍｌのフェニルセファロ
ース速流高度置換型（ファルマシア社製）を備えたファルマシアＸＫ１６カラム
を使用して、フェニルセファロースでのクロマトグラフィーによる濃縮を以下の
方法で行った。

【００５１】 上で得た２２９ｍｌの塩を加え且つ濾過した上層液（導電率１７．７ｍＳ・ｃ
ｍ^−１）を、１３ｍｌ／ｍｎの流量でカラムに適用し、カラム溶出液を５００ｍ
ｌの画分として集める。次いで、カラムを、４ｍｌ／ｍｎの流量で２２０ｍｌの
０．０５ＭＮａＣｌ溶液により洗浄し、カラム溶出液を４０ｍｌの画分として集
める。次いで、カラムを同じ流量で１５０ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ脱塩水により溶
出し、カラムから溶出液を２ｍｌの画分で集める。最後にカラムを同じ流量で８
Ｍの尿素溶液で洗浄することにより再生する。

【００５２】 カラム溶出液中の総蛋白質を２８０ｎｍでの吸収により検出し、塩濃度を導電
率計を使用して監視する。カラム溶出液中に水によって溶出した蛋白質の第１ピ
ーク、次いで尿素での洗浄により溶出した蛋白質の第２ピークが存在することを
図１に示す。

【００５３】 水による溶出の間に集めた画分をそのＧ−ＣＳＦ含有量について分析用ＲＰ−
ＨＰＬＣクロマトグラフィー及び先に記載した条件を使用するＥＬＩＳＡにより
分析した。一緒にしたＧ−ＣＳＦを含有する画分（４０ｍｌ）は、ＨＰＬＣによ
る滴定で２９．３ｍｇのＧＡ−ＧＣＳＦを含んでおり、５６％の収率及び５８％
の純度に相当する。 このようにして得られたＧＡ−ＧＣＳＦフェニルセファロースの溶液は０．１
６１ｍＳ・ｃｍ^−１の導電率を有する。

【００５４】 例２ フェニルセファロースでのクロマトグラフィー、次いでＧ−ＣＳＦ精製
の第１段階としてのヒドロキシアパタイトでのクロマトグラフィー

【００５５】 出発材料は、例１のようにするが、ただしエンドトロニクスバイオリアクター
の代わりに５リットルのバイオリアクターを用いて得たヒトＧＡ−ＧＣＳＦを発
現するヒト細胞系の培養液の上層液である。解凍した上層液を、０．５ＭのＮａ
Ｃｌを所要量添加し及び０．４５μｍミリポア膜での濾過の後、フェニルセファ
ロースでクロマトグラフィーした。

【００５６】 ２５％エタノール中で保存し、次いで使用前にＭｉｌｌｉ−Ｑ脱塩水で洗浄し
たフェニルセファロース速流高度置換型（ファルマシア社製）を備えたファルマ
シアＸＫ１６カラムを使用することにより、フェニルセファロースでのクロマト
グラフィーによる濃縮を以下の方法で行った。

【００５７】 上で得た塩を加え且つ濾過した１６４０ｍｌの上層液（導電率５６．３ｍＳ・
ｃｍ^−１）を、４ｍｌ／ｍｎの流量でカラムに適用し、カラムの溶出液を４００
ｍｌの画分として集める。その後このカラムを４ｍｌ／ｍｎの同じ流量で２４０
ｍｌの０．５ＭＮａＣｌにより溶出して、カラム溶出液を４０ｍｌの画分として
集める。次いでこのカラムを同じ流量で１５０ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ脱塩水によ
り溶出して、カラム溶出液を２ｍｌの画分として集める。最終的にこのカラムを
同じ流量で８Ｍの尿素溶液により洗浄して再生する。

【００５８】 カラム溶出液中の総蛋白質及び塩濃度を例１のように検出する。カラム溶出液
中に、水によって洗浄することにより溶出した蛋白質の第１ピーク、次いで尿素
によって洗浄することにより溶出した蛋白質の第２ピークが存在していることを
図２に示す。

【００５９】 水による溶出の間に集めた画分を、そのＧ−ＣＳＦ含有量について分析用ＲＰ
−ＨＰＬＣクロマトグラフィー及びＥＬＩＳＡにより分析した。一緒にしたＧ−
ＣＳＦを含有する画分（５０ｍｌ）は、ＨＰＬＣよる滴定で４５．１ｍｇのＧ−
ＣＳＦを含んでおり、これは９０％の収率、６１％の純度に相当する。

【００６０】 このようにして得たＧ−ＣＳＦフェニルセファロース溶液は、これをその後の
ヒドロキシアパタイトでのクロマトグラフィーの段階にそのまま使用するのを可
能にさせる４．２２ｍＳ・ｃｍ^−１の導電率を有している。

【００６１】 予めｐＨ７．３で２５０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液（２５０ｍＭ緩衝液、ｐ
Ｈ７．３）中に懸濁し、次いで１／２５０に希釈した２５０ｍＭ緩衝液（１ｍＭ
緩衝液、ｐＨ７．３）の５００ｍｌを５ｍｌ／ｍｎの流量でパーコレーションさ
せることにより平衡化した２９ｇのヒドロキシアパタイトマクロプレップセラミ
ック、型Ｉ（バイオラド社製）を備えたファルマシアＸＫ１６カラムを使用して
、ヒドロキシアパタイトでのクロマトグラフィーによる濃縮を以下の方法で行っ
た。

【００６２】 ＋２℃で終夜保存しておいた上で得られた２４ｍｌのＧ−ＣＳＦフェニルセフ
ァロース溶液を、同じ流量でヒドロキシアパタイトに適用する。次にこのカラム
を１５０ｍＭの１ｍＭ緩衝液、ｐＨ７．３により溶出し、次いで２５０ｍＭ緩衝
液、ｐＨ７．３により同じ流量で洗浄することによって再生し、カラム溶出液を
５ｍｌの画分として集める。カラム溶出液中の総蛋白質及び塩濃度を例２と同様
に検出する。

【００６３】 カラム溶出液中に、１ｍＭ緩衝液、ｐＨ７．３により溶出した蛋白質の第１ピ
ーク、次いで２５０ｍＭ緩衝液、ｐＨ７．３により溶出した蛋白質の第２ピーク
が存在することを図３に示す。

【００６４】 １ｍＭ緩衝液、ｐＨ７．３による溶出の間に集めた画分を、分析用ＲＰ−ＨＰ
ＬＣクロマトグラフィー及びＥＬＩＳＡにより分析した。一緒にした画分２５〜
４９まで（２５ｍｌ）は、ＨＰＬＣよる滴定で２１．３ｍｇのＧＡ−ＧＣＳＦを
含んでおり、これは、９８．４％の収率、９７．８％の純度に相当すると共にＨ
ＰＬＣ（図４）の場合と同質のピークを与える。

【００６５】 例３ フェニルセファロースでのクロマトグラフィー、次いでＧ−ＣＳＦ精製
の第１段階としてのヒドロキシアパタイトでのクロマトグラフィー

【００６６】 例２において得た２４ｍｌのＧＡ−ＧＣＳＦフェニルセファロース溶液を、例
２に記載した条件に従うが、ただしヒドロキシアパタイトマクロプレップセラミ
ック型IIを型Ｉの代わりに使用してヒドロキシアパタイトのカラムでクロマトグ
ラフィーした。

【００６７】 カラム溶出液中に、１ｍＭ緩衝液、ｐＨ７．３により溶出した蛋白質の第１ピ
ーク、次いで２５０ｍＭ緩衝液、ｐＨ７．３により溶出した蛋白質の第２ピーク
が存在することを図５に示す。１ｍＭ緩衝液による溶出の間に集めた画分を、分
析用ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー及びＥＬＩＳＡにより分析した。一緒に
した画分（２５ｍｌ）は、ＨＰＬＣよる滴定で２１．７ｍｇのＧＡ−ＧＣＳＦを
含んでおり、これは、１００．２％の収率、９４．５％の純度に相当すると共に
ＨＰＬＣ（図６）の場合と同質のピークを与える。

【００６８】 例４ フェニルセファロースでのクロマトグラフィー、次いでＧ−ＣＳＦの大
規模精製の第１段階としてのヒドロキシアパタイトでのクロマトグラフィー

【００６９】 出発材料は、例２に従うが、ただし１００リットルのバイオリアクター及びウ
シ血清を除いた培地を使用して得たＧＡ−ＧＣＳＦを発現するヒト細胞系の培養
液上層液である。 予め限外濾過により濃縮し、次いで使用前に−２０℃で保存した、８４リットル
の出発液に相当する１０．５リットルの上層液を、０．３０７ＫｇのＮａＣｌ（
０．５Ｍ）とするのに要する量を添加し、次いでDurieuxＮｏ．１２７紙で濾過
した後、フェニルセファロースでクロマトグラフィーした。このようにして得た
濾過培養物の上層液のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を図７に示す（ウェル３）。

【００７０】 ２５％エタノール中で保存し、次いで使用前に０．５ＭＮａＣｌ溶液により平
衡化した５００ｍｌのフェニルセファロース速流高度置換型（ファルマシア社製
）を備えたファルマシアＸＫ５０／３０カラムを使用することにより、フェニル
セファロースでのクロマトグラフィーによる濃縮を以下の方法で行った。

【００７１】 上で得た濃縮し、塩を加えた上層液（導電率４０ｍＳ・ｃｍ^−１）を４０ｍｌ
／ｎｍの流量でカラムに適用する。次いでこのカラムを同じ流量で１．５リット
ルの０．５ＭＮａＣｌ溶液、次に１．５リットルのＭｉｌｌｉ−Ｑ脱塩水により
連続溶出し、カラム溶出液を２０ｍｌの画分として集める。総蛋白質及び塩濃度
を例１と同様に検出する。

【００７２】 水により溶出した蛋白質のピークに一致する画分を、そのＧ−ＣＳＦ含量つい
て分析用ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー及びＥＬＩＳＡにより分析した。Ｇ
−ＣＳＦを含む一緒にした画分（４００ｍｌ）は、ＨＰＬＣよる滴定で３５７ｍ
ｇのＧＡ−ＧＣＳＦを含んでおり、これは６７．９％の収率、２０．６％の純度
に相当する。このように得たＧＡ−ＧＣＳＦフェニルセファロースの溶液は２０
℃で２ｍＳ・ｃｍ^−１の導電率を有する。

【００７３】 また、フェニルセファロースの溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図７
、ウェル４）。ペファブロック（０．２ｍｇ／ｍｌ）及びベンズアミジン（１ｍ
Ｍ）を加えることにより安定化させた後、この溶液を、次のヒドロキシアパタイ
トでのクロマトグラフィーの段階に直ちに使用した。

【００７４】 予め５リットルのｐＨ６の１ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（１ｍＭ緩衝液、ｐＨ
６）中に懸濁し、次いで１リットルのｐＨ６の２５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液
（２５０ｍＭ緩衝液、ｐＨ６）により５０ｍｌ／ｍｎの流量で、次いで５リット
ルの１ｍＭ緩衝液、ｐＨ６でパーコレーションすることにより平衡化した２９０
ｇのヒドロキシアパタイトマクロプレップセラミック、型II（バイオラド社製）
を備えたファルマシアＸＫ５０／３０カラム（これにより５００ｍｌのヒドロキ
シアパタイトのカラムが生じる）を使用することにより、ヒドロキシアパタイト
でのクロマトグラフィーを以下の方法で行った。

【００７５】 上で得た４００ｍｌの安定化したフェニルセファロースのＧＡ−ＧＣＳＦ溶液
を、ヒドロキシアパタイトのカラムに５０ｍｌ／ｍｎの流量で適用した。次いで
カラムを１．５０リットルの１ｍＭ緩衝液、ｐＨ６で溶出し、カラム溶出液を５
０ｍｌの画分として集める。カラム溶出液の総蛋白質並びに導電率を例１に示し
たように検出する。

【００７６】 集めた画分を分析用ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー及びＥＬＩＳＡにより
分析した。一緒にした画分（４００ｍｌ）は、ＨＰＬＣよる滴定で３３１ｍｇの
ＧＡ−ＧＣＳＦを含み、これはＨＰＬＣにより見積もった９２．５％のクロマト
グラフィー収率と９０％以上の純度に相当する。

【００７７】 また、このように得たヒドロキシアパタイトの溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
分析した（図７、ウェル５）。

【００７８】 例５ ヒドロキシアパタイトでのクロマトグラフィー後の次に行うＧ−ＣＳＦ
の精製

【００７９】 この例では、多段階精製方法においてヒドロキシアパタイトに通した後に使用
することができるその次のＧ−ＣＳＦを精製する段階を説明する。

【００８０】 本発明の方法に従って得たヒトＧＡ−ＧＣＳＦのヒドロキシアパタイト溶液か
ら、カチオン交換体でのクロマトグラフィーの段階、次いでゲル濾過クロマトグ
ラフィーでの段階を以下の方法で行った。

【００８１】 １）カチオン交換体でのクロマトグラフィー １７０ｍｌのＳＰセファロース速流（ファルマシア社製）を備えたファルマシ
アＸＫ２６／４０カラムを１３．２ｍｌ／ｍｎの流量で１．３８０リットルのＭ
ｉｌｌｉ−Ｑ水、次いでｐＨ５．３で１．３８０リットルの２０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム緩衝液（２０ｍＭ緩衝液、ｐＨ５．３）で洗浄することにより平衡化した。

【００８２】 例４で得た３９０ｍｌのＧＡ−ＧＣＳＦのヒドロキシアパタイト溶液をＳＰセ
ファロースのカラムに１３．２ｍｌ／ｍｎの流量で適用する。その後このカラム
を、同じ流量で４１４ｍｌの２０ｍＭ緩衝液、ｐＨ５．３により、次いで、の５
カラム容積（８５０ｍｌ）の２０ｍＭ緩衝液、ｐＨ５．３の中で０〜２５０ｍＭ
の変化をつけたＮａＣｌの勾配に相当する１リットルの溶出緩衝液により、５２
分以上洗浄し、カラム溶出液を１３．２ｍｌの画分として集める。カラム溶出液
中の総蛋白質を２８０ｎｍでの吸収による検出により、蛋白質ピークの溶出を観
察する。集めた画分を、そのＧ−ＣＳＦ含有量について分析用ＲＰ−ＨＰＬＣク
ロマトグラフィー及びＥＬＩＳＡにより分析した。一緒にした画分（２３７ｍｌ
）は、ＨＰＬＣよる滴定で２５５ｍｇのＧＡ−ＧＣＳＦを含んでおり、これは７
８．７％の収率及び９８．７％の純度に相当する。

【００８３】 また、このように得たＳＰセファロースの溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析
した（図７、ウェル６）。

【００８４】 ２）ゲル濾過クロマトグラフィー 上で得た２２０ｍｌのＧＡ−ＧＣＳＦのヒドロキシアパタイト溶液を、予めＰ
ＬＧＣ膜（ミリポア社製）に備えた３００ｍｌのアミコンセルにおいて＋４℃及
び２ｂａｒの窒素圧力下で限外濾過することによりほぼ１０倍に濃縮した。この
ように得たＵＦ濃縮液（２１ｍｌ）は、ＨＰＬＣによる滴定で２５３ｍｇのＧＡ
−ＧＣＳＦを含み、これは１０７．１％の収率に相当する。また、このＵＦ濃縮
液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図７、ウェル７）。

【００８５】 次いで、このＵＦ濃縮液を以下の方法でゲル濾過クロマトグラフィーの段階に
供した。

【００８６】 ２つのファルマシアＸＫ２６／４０カラムであって、それぞれに１５０ｍｌの
スーパーデックス２００プレップ等級（ファルマシア社製）を備え且つ１．３５
リットルのＭｉｌｌｉ−Ｑ水により３．３ｍｌ／ｍｎの流量で洗浄することによ
って平衡化したものを連続させ、次いで２．６５０リットルのＰＢＳ緩衝液（１
Ｘ）により同じ流量で平衡化した。これにより、２つのカラムを使用する２６５
ｍｌのスーパーデックス２００プレップ等級が得られた。

【００８７】 上で得た１０ｍｌのＧＡ−ＧＣＳＦのＳＰセファロース濃縮液を一連のカラム
に３．３ｍｌ／ｍｎの流量で適用する。このカラムを同じ流量で３００ｍｌのＰ
ＢＳ緩衝液（１Ｘ）により洗浄する。カラム溶出液中の総蛋白質を２８０ｎｍで
の吸収による検出で、蛋白質ピークの溶出液を観察する。集めた画分を、Ｇ−Ｃ
ＳＦ含有量について分析用ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより分析した。
一緒にした画分（４２．９ｍｌ）は、ＨＰＬＣによる滴定で８５．３ｍｇのＧＡ
−ＧＣＳＦを含み、これは７０．７％の収率及び９９％以上の純度に相当する。

【００８８】 同様に、上で得た１０ｍｌのＧＡ−ＧＣＳＦのＳＰセファロースの濃縮液を上
に示した条件下で行うが、ただしＰＢＳ緩衝液（１Ｘ）の代わりに２０ｍＭの酢
酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５、Ｔｗｅｅｎ２０（０．００５％）を使用して
ゲル濾過によりクロマトグラフィーする。一緒にした画分（４２．９ｍｌ）はＨ
ＰＬＣによる滴定で９５．４ｍｇのＧＡ−ＧＣＳＦを含み、これは７９．１％の
収率及び９９％の純度以上に相当する。

【００８９】 図７は、それぞれＰＢＳ緩衝液（ウェル９）及び酢酸塩緩衝液、ｐＨ７（ウェ
ル１１）で得られたゲル濾過溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＧＡ−ＧＣＳＦを発現すると共に０．１ＭのＮａＣｌを含有する細胞上層液の
フェニルセファロースでの分画を示すクロマトグラムである。

【図２】 ＧＡ−ＧＣＳＦを発現すると共に０．５ＭのＮａＣｌを含有する細胞上層液の
フェニルセファロースでの分画を示すクロマトグラムである。

【図３】 フェニルセファロースの後のヒドロキシアパタイトマクロプレップセラミック
型ＩでのＧＡ−ＧＣＳＦの分画を示すクロマトグラムである。

【図４】 フェニルセファロース及びヒドロキシアパタイト型Ｉ後のＧＡ−ＧＣＳＦの分
析用ＲＰ−ＨＰＬＣのクロマトグラムである。

【図５】 フェニルセファロース後のヒドロキシアパタイトマクロプレップセラミック型
IIでのＧＡ−ＧＣＳＦの分画を示すクロマトグラムである。

【図６】 フェニルセファロース及びヒドロキシアパタイト型II後のＧＡ−ＧＣＳＦの分
析用ＲＰ−ＨＰＬＣのクロマトグラムである。

【図７】 濾過した培地の上層液（ウェル３）、フェニルセファロースの溶出液（ウェル
４）、ヒドロキシアパタイトの溶出液（ウェル５）、ＳＰセファロースの溶出液
（ウェル５）、ＵＦ濃縮液（ウェル７）、ＰＢＳ緩衝液中のゲル濾過溶出液（ウ
ェル９）、酢酸塩緩衝液中のゲル濾過溶出液（ウェル１１）におけるＧＡ−ＧＣ
ＳＦの連続精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析と標準分子量マーカー（ウェル１
）である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ (72)発明者 エドアルド サルビ フランス国 エフ94120 フォントネイ スー ブワ、リュ ド ネイイ、16ビス Ｆターム(参考） 4H045 AA20 BA10 CA40 DA11 EA20 GA21 GA24

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生体試料からＧ−ＣＳＦを精製するにあたり、 ａ）Ｇ−ＣＳＦを含む生体試料の容積を疎水性相互作用クロマトグラフィーによ
   り減少させて濃縮され脱塩され富化された画分を得、 ｂ）濃縮された画分をヒドロキシアパタイトにＧ−ＣＳＦが弱く結合する条件下
   で通して濃縮され脱塩され富化されたＧ−ＣＳＦを含む画分を得、及び ｃ）Ｇ−ＣＳＦを集める 段階を含むＧ−ＣＳＦの精製方法。
2. 【請求項２】 集めたＧ−ＣＳＦが少なくとも９０％の純度を有する請求項
   １に記載の方法。
3. 【請求項３】 生体試料が組織培養上層液である請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 Ｇ−ＣＳＦがヒトＧ−ＣＳＦ（ｈＧ−ＣＳＦ）である請求項
   １に記載の方法。
5. 【請求項５】 容積減少段階が、生体試料をフェニル型の疎水性相互作用ク
   ロマトグラフィー担体上にＧ−ＣＳＦの固定を許容する条件下で置くこと、次い
   でその溶出を行うことを含む請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 フェニル型担体がフェニルセファロースである請求項５に記
   載の方法。
7. 【請求項７】 フェニルセファロース上の固定が０〜６０ｍＳのイオン強度
   の緩衝液中で行われ、溶出が固定用緩衝液中でイオン強度又は塩濃度を低下させ
   ることによって行われることを含む請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 フェニルセファロース上の固定が０．１〜１Ｍの濃度でＮａ
   Ｃｌを含む緩衝液中で行われる請求項６に記載の方法。
9. 【請求項９】 フェニルセファロース上の固定が０．１〜０．５Ｍの濃度で
   ＮａＣｌを含有する緩衝液中で行われ、溶出が水によって行われる請求項８に記
   載の方法。
10. 【請求項１０】 ヒドロキシアパタイトに通す段階が２〜３０ｍＳのイオン
    強度及び５．５〜７．５のｐＨの緩衝液中で行われる請求項１に記載の方法。
11. 【請求項１１】 緩衝液が１〜１０ｍＭの濃度で燐酸塩を含む請求項１０に
    記載の方法。
12. 【請求項１２】 緩衝液が１ｍＭの燐酸塩緩衝液であり、そのｐＨが６．０
    〜７．５である請求項１０に記載の方法。
13. 【請求項１３】 生体試料からＧ−ＣＳＦを精製するための多段階の方法で
    含有しうるＧ−ＣＳＦを精製するにあたり、 ａ）Ｇ−ＣＳＦを含む生体試料の容積を疎水性相互作用クロマトグラフィーによ
    り減少させて濃縮され脱塩され富化された画分を得、 ｂ）濃縮された画分をヒドロキシアパタイトにＧ−ＣＳＦが弱く結合する条件下
    で通して濃縮され脱塩され富化されたＧ−ＣＳＦを含む画分を得、及び ｃ）Ｇ−ＣＳＦを集める 段階を含むＧ−ＣＳＦの精製方法。
14. 【請求項１４】 多段階の方法がイオン交換、ゲル濾過、逆相又は親和性ク
    ロマトグラフィーよりなる群から選択される１又は２以上のクロマトグラフィー
    段階をさらに含む請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 Ｇ−ＣＳＦと汚染性蛋白質を含有する溶液から汚染性蛋白
    質を除去するにあたり、 ａ）その溶液をヒドロキシアパタイトに通して、汚染性蛋白質がヒドロキシアパ
    タイトに固定され且つＧ−ＣＳＦを弱く結合させ、及び ｂ）Ｇ−ＣＳＦを溶出させる 汚染性蛋白質の除去方法。
16. 【請求項１６】 Ｇ−ＣＳＦの溶出が固定用緩衝液による単純な洗浄により
    行われる請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 Ｇ−ＣＳＦを含む溶液がＧ−ＣＳＦを含む生体試料の疎水
    性相互作用クロマトグラフィーにより調製される請求項１５に記載の方法。