JP3998156B2 - 糖タンパク質様エリトロポエチンの精製方法 - Google Patents
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Description
本発明は糖タンパク質を含む生物学的液体からの生物学的に活性な糖タンパク質の簡単でかつ効率的な回収方法に関する。
更に詳細には、本発明の方法は、高度にグリコシル化されたタンパク質、即ちその分子量の約３０％より多い糖含有量を有する糖タンパク質及び糖ペプチドを回収するのに適する。
本発明の方法により便利に精製し得る糖タンパク質の特定かつ好適な例はエリトロポエチンである。
遺伝子操作された細胞を含む種々の原料からのエリトロポエチンの製造は、いくつかのヨーロッパ特許出願または特許、例えばＥＰ−１４８６０５、ＥＰ−２０５５６４、ＥＰ−２０９５３９、ＥＰ−２６７６７８、ＥＰ−６４９４６４及びＥＰ−６７２１６０に報告される。
本明細書において用いる「エリトロポエチン」または「エリトロポエチン生成物」なる用語は、天然のエリトロポエチン、尿誘導されたヒトエリトロポエチン並びにアミノ酸配列及び天然のエリトロポエチンを十分に複製し、骨髄細胞を網状赤血球及び赤血細胞の製造を増大させ得るように生体内生物学的特性を持たせるグリコシリル化を有する非天然のポリペプチドを包含すること、そしてまた本明細書に引用をもって含ませ米国も指定してＰＣＴ／ＵＳ９２／０９６２７として出願された国際特許出願公開番号ＷＯ ９３／０９２２２、または米国特許出願第０７／９８５，５８６号に基づく優先権を主張しているＷＯ ９４／１２６５０に記載されるような、無傷なエリトロポエチンコード遺伝子を哺乳動物細胞中に導入する際に哺乳動物細胞培養液から得られるエリトロポエチンまたは「遺伝子活性化された」エリトロポエチンを含む内因性のエリトロポエチン遺伝子の活性化の際に哺乳動物細胞培養液から得られるエリトロポエチンを含むことを意図するものである。
本発明の方法は殊にエリトロポエチン産生細胞培養物の培養液中に含まれるエリトロポエチンの回収に適する。
本明細書で用いる「培養液」なる用語は、好ましくは人工由来の任意の液、例えば哺乳動物細胞及び殊に遺伝子的に転換された哺乳動物細胞の細胞培養液に関するものであることを意図する。
好ましくは、本出願にいう「培養液」は細胞及び細胞残屑から当該技術分野で通常のように濾過または限外濾過により分離された培養液である。更に、本明細書において、「濾過された培養液」なる用語は、細胞及び細胞残屑から当該技術分野で通常のような濾過または限外濾過により分離された培養液を示すために用いる。
「産生細胞」は、好ましくは適当な媒質中で培養する際に所望の糖タンパク質を回収可能な量で産生し得る真核または好ましくは哺乳動物由来の安定化または非安定化細胞ラインである。これらの細胞の代表例には、繊維芽細胞、表皮ケラチン細胞、上皮細胞（例えば哺乳動物上皮細胞、腸上皮細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液の形成成分（例えばリンパ細胞、骨髄細胞）、筋肉細胞及びこれらの体細胞タイプの先駆体が含まれる。上記のように、これらの細胞は好ましくは哺乳動物由来（例えばマウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、トリ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サル、ヒト）のものであり、そして最も好ましくは霊長動物及びヒトからのものである。殊にまた、「産生細胞」なる用語は、上記の国際特許出願公開ＷＯ ９３／０９２２２またはＷＯ ９４／１２６５０に記載されるような、細胞に直接的または間接的に回収可能な量のエリトロポエチンを産生させる脊椎動物由来、殊に哺乳動物由来、並びに最も好ましくは外因性の遺伝物質で形質転換された霊長動物またはヒト由来の形質転換された第一、第二の、そして不死化された細胞を含む。
エリトロポエチンを産生させるために有用である不死化されたヒト細胞は広く公知であり、そしてこれらに限定されないが、ＨｅＬａ細胞及びＨｅＬａ細胞の誘導体（例えばＡＴＣＣ ＣＣＬ ２、２．１及び２．２）、ＭＣＦ−７肺ガン細胞（例えばＡＴＣＣ ＭＴＢ ２２）、Ｋ−５６２白血病細胞（例えばＡＴＣＣ ＣＣＬ ２３４）、ＫＢガン細胞（例えばＡＴＣＣ ＣＣＬ １７）、２７８０ＡＤ卵巣ガン細胞、Ｖａｎ ｄｅｌ Ｂｌｉｃｋ，Ａ．Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４８：５９２７〜５９３２（１９８８）、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ １５２）、Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４３２）、ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２４０）、ＷｉＤｒ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２１３）、ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １２１９）、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２１３）、ＲＰＭＩ ８２２６細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５５）、Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５９３）、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ９６０７）、ＷＩ−３８ＶＡ１３サブライン２ＲＳ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５．１）及びＷＯＬＴ−４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８２）が入手可能であり、そしてこれらのものを含む。また、第二のヒト繊維芽細胞株例えばＷＩ−３８（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）も使用し得る。
上記のように、本発明の方法は任意のかかる培養液及び産生細胞からの所望の糖タンパク質の回収に適する。
遺伝子工学技術を生物学的に活性なタンパク質の大規模な製造に広く応用することはその高い需要を満たし得る量でこれらのものが得られる期待を実質的に高めた。しかしながら、いくつかの例において、培養液からのその回収は困難で、扱いにくく、かつ経費がかかる。このことは上記のようにタンパク質が高度にグリコシル化される場合にあてはまる。殊にこれらの場合において、大規模生産に適する簡単及び効率的な回収方法に対する当該分野における必要性が引き続き存在する。
エリトロポエチンの特異的活性を本明細書において言及する場合、このものはＥＬＩＳＡ法（例えば本出願に報告されるもの：ヒトエリトロポエチンＥＬＩＳＡ法、Ｒ＆Ｄ Systems,Inc.）により測定され、一方、試料のタンパク質含有量はＢＣＡ Protein Assayにより測定される。これらの分析法は「分析法」なる標題の下で以下に詳細に報告される。
従って、本発明の１つの目的は、ジヒドロキシボロニル担持クロマトグラフィー用マトリックスを用いる全体的な精製方法における適当なクロマトグラフィー工程を提供する。このクロマトグラフィー工程はその効率性及び融通性のために多段工程における第一工程または続いての工程になり得る。第一のクロマトグラフィー工程として、以下に詳細に記載するように、ジヒドロキシボロニルクロマトグラフィーは好ましくはイオン交換クロマトグラフィー工程と組み合わせ、一方、続いてのクロマトグラフィー工程として、このものは多段工程のいずれかの段階に導入し得る。この多段工程には更に適当ならばイオン交換、サイズ排除、疎水性相互作用及びアフィニティークロマトグラフィー工程からなる多数のクロマトグラフィー工程のいずれかが含まれる。
多段工程における続いてのクロマトグラフィー工程として、ジヒドロキシボロニルクロマトグラフィーを好ましくは半精製された物質であるエリトロポエチンを含む物質を予備平衡されたジヒドロキシボロニル担持クロマトグラフィー用マトリックスに適用することにより行う。また半精製された物質はこのものをマトリックスに適用する前にマトリックス平衡用緩衝液中で平衡化させる。この平衡用緩衝液は「第一の平衡用緩衝液」として前に示されており、そして以下に詳細に定義する。本工程は殊にエリトロポエチンの精製に適する。
本発明の１つの目的は、
ａ）単離すべき糖タンパク質を含む濾過された培養液を予備平衡させたジヒドロキシボロニル担持クロマトグラフィー用マトリックスと接触させ、
ｂ）第一の溶離用緩衝液で溶出させ、そしてこの溶離液を直接第四級アンモニウム官能基を担持する陰イオン交換マトリックスと接触させ、そして
ｃ）糖タンパク質を第二の溶離液で溶出させる
ことからなる精製方法である。
本明細書の開示を完全に読めば明らかなように、これらの工程段階は培地中に含まれる糖タンパク質の数倍の精製を可能にし、従ってこれらは多段工程における第一の精製段階として効果的に用いられる。
本発明の方法の好適な具体例によれば、単離すべき糖タンパク質を含む培養液は、
ａ）濾過した培養液をジヒドロキシボロニル担持クロマトグラフィー用マトリックスと接触させ、
ｂ）第一の溶離用緩衝液で溶出させ、そしてこの溶離液を第四級アンモニウム官能基を担持する陰イオン交換マトリックスと直接接触させ、
ｃ）第二の溶離用緩衝液で溶出させ、
ｄ）５，０００〜２５，０００Ｄカットオフ膜上で限外濾過し、
ｅ）場合により緩衝液を次の工程に適するものに交換するために透析し、そして
ｆ）５，０００乃至２５０，０００Ｄ間の分離範囲を有する分離樹脂上でゲル濾過する
ことからなる工程に付される。
他の好適な具体例によれば、本発明の方法は
ａ）ｐＨ７．５〜９．０に調整した濾過された培養液を２乃至２０ｍＳ／ｃｍ2間のイオン強度及び７．５乃至９．０間のｐＨ値を有する２５〜１００ｍＭの濃度の水性緩衝液である第一の平衡用緩衝液で平衡させたジヒドロキシボロニル担持クロマトグラフィー用マトリックスと接触させ、
ｂ）第一の平衡用緩衝液及び次に低分子量物質を含む１０〜１００ｍＭの１，２−シス−ジオールを含む第一の平衡用緩衝液で順次洗浄し、
ｃ）可能であれば２〜８Ｍのカオトロピック剤、２〜４０ｍＭのシアネート受容体、及び０．０１〜０．１％（ｗ／ｗ）の界面活性剤の存在下にて、２０〜２００ｍＭの濃度の１−ヒドロキシ、２−アミノ基を有する化合物を含む７．５乃至１１．０間のｐＨ値を有する水性緩衝液である第一の溶離用緩衝液で溶出させ、
ｄ）この溶離液を７．５乃至１１．０間のｐＨ値及び０．０１〜０．１％（ｗ／ｗ）の界面活性剤を有する水性緩衝液である第二の溶離用緩衝液中で平衡された第四級アンモニウム官能基を担持する陰イオン交換マトリックスと接触させ、
ｅ）第二の平衡用緩衝液及び更に５０ｍＭまでの塩を含む同緩衝液で順次洗浄し、
ｆ）０．０１〜０．１％（ｗ／ｗ）の界面活性剤及び１５０〜３５０ｍＭの塩の存在下にて７．５乃至１１．０間のｐＨ値を有する第二の溶離用緩衝液で溶出させ、
ｇ）５，０００〜３０，０００Ｄカットオフ膜上で限外濾過し、
ｈ）場合により緩衝液を次のゲル濾過工程に適するものに交換するために透析し、そして
ｉ）５，０００乃至２５０，０００Ｄ間の分離範囲を有する分離樹脂上でゲル濾過する
ことからなる。
「ジヒドロキシボロニル担持クロマトグラフィー用マトリックス」は、ホウ素原子が炭素原子鎖に安定的に結合し、ここでその中心部の炭素原子が種々の使用条件下でホウ素に結合するに十分の遊離電子密度を与えるボロネート官能基を担持する任意の既知のクロマトグラフィー用マトリックスをいう。最も好ましくは、この中心炭素原子は芳香族炭素原子、例えば可能であれば置換されたベンゼン環に属する炭素原子である。本発明の方法に殊に好適に使用されるものは、いわゆるフェニルボロネート樹脂である。これらの樹脂の例は引用をもって本明細書の一部とする米国特許第４，５６２，２５１号、同第４，７７８，８８８号及び同第４，２６９，６０５号に報告される。これらの中で、フェニルボロネートアガロースマトリックスが現在最も好ましい。これらのマトリックスは現在例えばＡｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．またはＧｒａｃｅ Ｉｎｃ．から、ＭＡＴＲＥＸ ＧＥＬ ＰＢＡ−１０、ＰＢＡ−３０及びＰＢＡ−６０を包含するＭＡＴＲＥＸ ＧＥＬなる商標名で市販されている。
現在、第一の精製工程としての用途に最も好適なフェニルボロネートアガロースは、ｍ−アミノフェニル硼酸が６０〜１００μＭ硼酸／ｍｌゲルの割合で５０〜１５０μｍ直径の球形ビーズのサイズ範囲を有するアガロースと共有結合されるＭＡＴＲＥＸ ＧＥＬ ＰＢＡ−６０として販売されるものである。しかしながら、続いての精製工程として、フェニルボロネートアガロースマトリックス、例えばｍ−アミノフェニル硼酸が３０〜５０μＭ硼酸／ｍｌゲルの割合で５０〜１５０μｍ直径球形ビーズのサイズ範囲を有するアガロースと共有結合されるＭＡＴＲＥＸ ＧＥＬ ＰＢＡ−３０が好ましい。
現在、これらのクロマトグラフィー用マトリックスの最も好適な用途は、バッチ法または他のシステムを完全に除外するものではないが、カラムクロマトグラフィーシステムにおけるものである。
カラムクロマトグラフィーシステムに用いる場合、ジヒドロキシボロニル担持クロマトグラフィー用マトリックスは好ましくは室温、好ましくは５乃至２５℃間、最も好ましくは１０乃至２０℃間で用いられ、約１５℃が最も好適な温度である。
上記の「第一の平衡用緩衝液」は好ましくは示された濃度範囲、イオン強度及びｐＨ値でグリシン、リン酸塩、炭酸水素トリアルキルアンモニウム及び４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジノエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）から選ばれる。この第一の平衡用緩衝液に対する殊に好適な濃度は約５０ｍＭの濃度であり、一方、殊に好適なｐＨ値は約８．５であり、そして好適な伝導度は約２．５ｍＳ／ｃｍ2である。これらは第一の工程及び続いての工程の精製の両方の場合に好適な条件である。
上記の「１，２−シス−ジオール含有物質」は１，２−シス−ジオール官能基を有し、即ち共面(coplanar)または準共面(quasi-coplanar)立体配置を保持するかまたは仮定し得る隣接炭素原子上に少なくとも２個のヒドロキシ基を有する任意の既知の低分子量化合物である。当該分野においていずれの場合でも通常既知であるこれらの化合物の代表例は、小さい開鎖状(open-chain)ポリオール、例えばソルビトール、マンニトール、アドニトール、アラビトール、グリセリン、エリトリトール及びシス−イノシトール、並びに閉鎖状(closed-chain)単糖類、例えばリボース及びマンノースであり、ソルビトールが現在最も好ましい。殊に好適なものは第一の精製工程の場合には約５０ｍＭの濃度の低分子量物質を含む１，２−シス−ジオールの使用であり、一方、続いての精製工程においては２０〜１００ｍＭの濃度が現在好ましく、１００ｍＭが最も好適なものである。
該「第一の溶離用緩衝液」の主な構成成分である上記の「１−ヒドロキシ、２−アミノ基を有する化合物」は、かかる官能基を有し、かつ上記のｐＨ範囲内の水性緩衝液を生成し得る任意の化合物である。任意のかかる化合物の代表例には次のものがある：ＴＲＩＳまたはトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタンとしても知られている２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール；ビス（ヒドロキシメチル）アミノエタン；トリシンとしても知られているＮ−［２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチルエチル）］グリシン；及びビシンとしても知られているＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン。これらのものは好ましくは約２０〜１００ｍＭの濃度で使用され、第一の精製工程の場合は約５０ｍＭが現在最も好ましい。好ましくは、第一の溶離用緩衝液は約８．５のｐＨ値に調整される。続いての精製工程としての用途に対し、好適な濃度範囲は２０〜１５０ｍＭであり、１００ｍＭが最も好ましい。またこの用途のためには、ＴＲＩＳが現在好適なものである。
フェニルボロネートクロマトグラフィーを第二のクロマトグラフィー工程として用いる場合の好適な溶離条件はＴＲＩＳ １００ｍＭ及びソルビトール１００ｍＭを含む溶離用緩衝液を含む。
好ましくは、「第二の平衡用緩衝液」及び「第二の溶離用緩衝液」は、その主成分として１−ヒドロキシ、２−アミノ基を有する上記定義の化合物を有する。この場合、その好適な濃度は２０乃至２００ｍＭ間である。
「カオトロピック剤」（“chaotropic agent”）は、一般にその解離特性のために、タンパク性物質の塩溶及びすなわちその水性媒質中での可溶化を好適にする試薬である。
カオトロピック剤の代表例は尿素及びその誘導体並びにグアニジンである。カオトロピック剤は、存在する場合、２乃至８Ｍ間の濃度で用い、約４〜６Ｍが好ましい。
シアネート受容体は尿素の加水分解の結果として生成し得るＣＮＯ-イオンを容易に結合し得る任意の既知の物質である。シアネート受容体としてグリシンが好ましい。本発明の工程におけるその用途に対し、グリシンは好ましくは２〜４０ｍＭ、最も好ましくは約２０ｍＭの濃度で用いられる。
本明細書で用いる「界面活性剤」なる用語は、表面張力、即ちその表面積を減少させる液体の表面で作用する力を減少させる任意の既知の物質をいう。界面活性剤の好適な例には「Ｔｗｅｅｎ」として知られている脂肪酸のポリオキシエチレンソルビタン誘導体があり、「Ｔｗｅｅｎ ２０」（即ち、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）が現在好ましい。現在、界面活性剤は、存在する場合、好ましくは約０．０１〜０．１％（ｗ／ｗ）の濃度で用いられ、約０．０１％が現在最も好ましい。
第四級アンモニウム官能基を担持する上記の陰イオン交換体マトリックスは、該官能基を有する任意の既知の、そして市販の陰イオン交換体マトリックスである。本発明の方法に用いるために好ましいものは、アガロースまたはセルロースベースのマトリックス、例えば微結晶性セルロースまたは交差結合されたアガロースである。また、殊に好適なものはジエチルアミノエチル、トリエチルアミノメチルまたはトリメチルアミノメチル官能基を担持するマトリックスである。
殊に好適な陰イオン交換体マトリックスは、例えばQ-Sepharose(Pharmacia AB)として市販されるトリメチルアミノメチル交差結合されたアガロースである。これらのマトリックスを含むクロマトグラフィー工程は最も好ましくは室温で行われるカラムクロマトグラフィーとして行われる。
上記のように塩を洗浄用または溶離用緩衝液に加える場合、このものは当該分野で通常のように緩衝液のイオン強度を増大させるために加えられる。当該分野で通常用いられる任意の塩がこの目的のために本発明の方法に用いることができ、ＮａＣｌが最も頻繁にかつ便利に用いられるものである。
限外濾過工程は当該分野で通常のように接線流システム(tangential flow system)または撹拌セルシステムを用いて行われる。好ましくは、膜は例えばMillipore Inc.またはAmicon Inc.から市販されているタイプのポリスルホン膜または再生セルロース膜である。本発明の方法に現在用いるために好ましいものは１０，０００のカットオフを有するものである。
次に、限外濾過した濾液を場合によりそれ自体当該分野で既知の方法により次のゲル濾過工程に用いるものと好ましくは同様の緩衝液中で透析する。このゲル濾過緩衝液は６乃至８間のｐＨ値を有する水性緩衝液である。塩は好ましくはこの緩衝液中で１００〜２００ｍＭで存在し、そしてより好ましくは塩は１００ｍＭであり、かつｐＨ値は約７．４〜７．５である。
通常のゲル濾過マトリックスを便利にはこの工程段階で使用し得る。これらのマトリックスの代表例は、アクリルアミドで交差結合されたポリデキストラン例えばアリルデキストランをＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド及び交差結合されたセルロースゲルで共有結合的に交差結合させることにより製造される高機械的強度の複合体親水性ゲルである。市販の交差結合されたデキストラン−アクリルアミドはSEPHACRYLなる商標名で既知であり、そしてPharmacia ABから入手できる。好適なSEPHACRYLゲルは２５〜７５μｍのビーズサイズを有し、かつその交差結合をこのものが球形のタンパク質に対して５，０００〜２５０，０００Ｄの分画範囲を有するように制御されたSEPHACRYL S-200 HRである。
交差結合されたセルロースゲルの例には、市販の交差結合された多孔性セルロースゲル例えばAmicon Inc.から入手できるＧＬＣ ３００（平均粒径４４〜１２５μｍ）またはＧＬＣ １，０００（平均粒径５３〜１２５μｍ）である。
本発明の方法は殊に既知のものがもつ大きな欠点なしに容易にスケールアップすることができる一連の工程からなるために、大規模製造に向いている。
更に、本発明の方法は水性溶媒のみが用いられ、そしてこのことは当該分野に精通せる者により認められるようにさらなる利点を表す。
加えて、本発明の方法は何ら溶媒の交換または調整を必要とせずに第一の工程からの溶離液を第二の工程に直接移すことにより、その第一のクロマトグラフィー工程（即ちジヒドロボロニルマトリックスを用いるもの）からその第二のクロマトグラフィー工程（即ち陰イオン交換体マトリックスを用いるもの）に通すことが可能となる。
全体的な操作が容易になることに加え、本発明の方法のこの特徴は回収率を改善することに寄与する。
本発明の工程は事実５００〜２，０００ ＥＬＩＳＡ単位／ｍｇの平均特異活性を有する濾過された細胞液から出発して１４５，０００〜１７５，０００ ＥＬＩＳＡの平均特異活性を有するエリトロポエチン生成物の回収を可能にする。
更に、第一及び第二のクロマトグラフィー工程の組合わせは、完全な工程のに対する１１０〜１５０倍の全体的な精製ファクターで、初期培養液の６０〜１００倍の精製を可能にする。
エリトロポエチンの場合におけるように、本発明の工程の終了時に回収される糖タンパク質は塩除去及び当該分野で通常の凍結乾燥後に固体として単離し得るか、または得られる溶液を例えば透析により溶媒交換し、例えば引用をもって本明細書の一部をなすＥＰ−４３０，２００に記載される製薬学的調製物に適する溶液にし得る。
次の実施例は説明のためのみのものであり、そして本発明の範囲を限定するためのものではない。
実施例１
エリトロポエチン精製における第一の精製工程としてのフェニルボロネートクロマトグラフィー
約２０ｍｇのエリトロポエチンを含むＷＯ ９３／０９２２２の実施例２１またはＷＯ ９４／１２６５０に記載により得られたヒトエリトロポエチン生成細胞の培養液の上澄を混合膜カートリッジ（１．２及び０．５μｍ；Opticap、Millipore Inc.）上で濾過し、次に３０，０００Ｄ再生セルローススパイラルカートリッジＳ１Ｙ３０（Amicon Inc.）上で限外濾過し、そして水及び０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．５、伝導度２．５ｍＳ／ｃｍ2で透析した。限外濾過液を０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．５（緩衝液Ａ）で平衡化したフェニルボロネートアガロースクロマトグラフィー用カラム（１２０ｍｌ膨潤樹脂；ＰＢＡ ６０、Amicon Inc.）上に担持させ、そして水冷により約１０〜１５℃で保持した。流速を約２〜４カラム容量（ＣＶ）／時間に設定した。ベースラインが安定するまで［２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）］緩衝液Ａで洗浄した後、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０及び０．０５Ｍソルビトールを含む０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．５（緩衝液Ｂ）を用いて洗浄を続けた。６Ｍ尿素、０．０２Ｍグリシン及び０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む０．０２Ｍ ＴＲＩＳ ｐＨ８．５（緩衝液Ｃ）を用いて溶出を行い、溶出したピーク（２８０ｎｍでのＯＤ）を捕集し（約４〜５ＣＶ；収率７０〜８０％、精製ファクター約２０倍）、そして０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む０．０２Ｍ ＴＲＩＳ ｐＨ８．５（緩衝液Ｄ）で平衡化したトリメチルアミノメチル交差結合されたアガロース陰イオン交換樹脂（２５ｍｌ膨潤樹脂；Q-Sepharose FF、Pharmacia AB）上に直接担持させた。ベースラインが安定するまで緩衝液Ｄ、及び次にまた０．０５Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｄ（緩衝液Ｅ）を用いて一定流速で洗浄した後、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０及び０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０２Ｍ ＴＲＩＳ ｐＨ８．５（緩衝液Ｆ）を用いて溶出を行った。ピークを捕集し（回収約８０％）、そして１０，０００Ｄカットオフの膜（YM10、Amicon）を有する撹拌されたセルを用いる限外濾過により濃縮した。
濃縮された溶液を０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０２Ｍ ＴＲＩＳ ｐＨ７．４（緩衝液Ｇ）で平衡化した交差結合されたデキストラン−アクリルアミドゲル濾過カラム（Sephacryl S200;Pharmacia AB）上に担持させ、そして同じ緩衝液で溶出させた。フラクションを捕集し、エリトロポエチン生成物を含むもの（ＥＬＩＳＡアッセイ法）をプールし、そして上記のように限外濾過により濃縮した。
実施例２
エリトロポエチン精製における続いての精製工程としてのフェニルボロネートクロマトグラフィー
約２０ｍｇのエリトロポエチンを含む半精製されたヒトエリトロポエチン（ＷＯ ９３／０９２２２の実施例２１またはＷＯ ９４／１２６５０に記載のように得られた生成細胞からのもの）の溶液を水及び０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．５、並びに０．１５Ｍ ＮａＣｌ、伝導度約１８ｍＳ／ｃｍ2を用いて透過濾過または透析し、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．５（緩衝液Ａ’）で平衡化したフェニルボロネートアガロースクロマトグラフィー用カラム（１２０ｍｌ膨潤樹脂；ＰＢＡ ６０、Amicon社）上に担持させ、そして水冷により約１０〜１５℃に保持した。流速を約２〜４カラム容量（ＣＶ）／時間に設定した。ベースラインが安定するまで［２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）］緩衝液Ａ’で洗浄した。０．１Ｍソルビトールを含む０．１０Ｍ ＴＲＩＳ ｐＨ８．５（緩衝液Ｂ’）を用いて溶出を行い、溶出したピーク（２８０ｎｍでのＯＤ）を捕集した（約４〜５ＣＶ；収率約９０％）。
分析方法：
ＥＬＩＳＡ：
上記の方法により得られたエリトロポエチン生成物の特異的活性はQUANTIKINE IVD(R&D SYSTEMS Inc.）として既知でかつ市販されているヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ法により測定した。
タンパク質アッセイ法：
タンパク質アッセイ法はビュレット反応（アルカリ性媒質中でのＣｕ2+からＣｕ1+へのタンパク質還元）をＣｕ1+に対するビシンコニン酸（ＢＣＡ）の高度に特異的な反応を組み合わせた方法であるＢＣＡタンパク質アッセイ試薬方法（Pierce Chemical Co）により行った。
特異的活性：
試料に対する特異的活性は次式により計算される：特異的活性＝ＥＬＩＳＡによるエリトロポエチンの全単位／ＢＣＡアッセイ法によるタンパク質の全ｍｇ。エリトロポエチンの精製した調製物はＢＣＡアッセイ法により約２００，０００ＥＬＩＳＡ単位／ｍｇタンパク質の特異的活性を有していた。エリトロポエチンの単位を定量するためにＥＬＩＳＡを用いる特異的活性はエリトロポエチンの実際の生物学的活性に間接的にのみ関連する。生体内の特異的活性を測定するために一般的に行われる試験は当該分野に精通せる者により既知であるエクスハイポキシック多血球血症（exhypoxic polycythemic）マウスバイオアッセイ法（例えばアッセイ法により当該分野に精通せる者により既知であるようにＩＵ／ｍｇとして特異的活性を測定し得る）である。
ＨＰＬＣ分析：
装置：ＰＤＡ検出器モデル９９６を備えたＷａｔｅｒｓ ６１６ ＬＣシステム
カラム：Ｖｙｄａｃ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ4、３μｍ、４．６×２５０ｍｍ
移動相：Ａ）０．１％水性トリフルオロ酢酸：アセトニトリル、９５：５、Ｂ）０．１％水性トリフルオロ酢酸：アセトニトリル、５：９５ グラジエント：分（％Ｂ）：５（５）、５０（９５）
流速：１ｍｌ／分
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は製造者の指示及び当該分野の通常の知識に従ってＰｈａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ上で行い、そして濃度測定はＦｌｙｉｎｇ Ｓｐｏｔ走査型デンシトメータＣＳ−９３０１ ＰＣ、島津製作所を用いて行った。
分析データ及び結果：
数回の実験から捕集したデータから、細胞上澄のエリトロポエチンの特異的活性は５００〜２，０００ＥＬＩＳＡ単位／ｍｇの範囲内であり；第一のクロマトグラフィー工程後に回収されたエリトロポエチンの特異的活性は約３５，０００〜９５，０００ＥＬＩＳＡ単位／ｍｇであり；実施例１に記載された工程の終了時に回収されたエリトロポエチン生成物の特異的活性は平均して約１４５，０００〜１７５，０００ＥＬＩＳＡ単位／ｍｇであった。
上記の方法により行われたＨＰＬＣ並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は工程の終了時に回収されたエリトロポエチン生成物が９２％より多い曲線下面積（ＡＵＣ）を表す主なピークを有することを示した。
更に詳細には、本発明の方法は、高度にグリコシル化されたタンパク質、即ちその分子量の約３０％より多い糖含有量を有する糖タンパク質及び糖ペプチドを回収するのに適する。
本発明の方法により便利に精製し得る糖タンパク質の特定かつ好適な例はエリトロポエチンである。
遺伝子操作された細胞を含む種々の原料からのエリトロポエチンの製造は、いくつかのヨーロッパ特許出願または特許、例えばＥＰ−１４８６０５、ＥＰ−２０５５６４、ＥＰ−２０９５３９、ＥＰ−２６７６７８、ＥＰ−６４９４６４及びＥＰ−６７２１６０に報告される。
本明細書において用いる「エリトロポエチン」または「エリトロポエチン生成物」なる用語は、天然のエリトロポエチン、尿誘導されたヒトエリトロポエチン並びにアミノ酸配列及び天然のエリトロポエチンを十分に複製し、骨髄細胞を網状赤血球及び赤血細胞の製造を増大させ得るように生体内生物学的特性を持たせるグリコシリル化を有する非天然のポリペプチドを包含すること、そしてまた本明細書に引用をもって含ませ米国も指定してＰＣＴ／ＵＳ９２／０９６２７として出願された国際特許出願公開番号ＷＯ ９３／０９２２２、または米国特許出願第０７／９８５，５８６号に基づく優先権を主張しているＷＯ ９４／１２６５０に記載されるような、無傷なエリトロポエチンコード遺伝子を哺乳動物細胞中に導入する際に哺乳動物細胞培養液から得られるエリトロポエチンまたは「遺伝子活性化された」エリトロポエチンを含む内因性のエリトロポエチン遺伝子の活性化の際に哺乳動物細胞培養液から得られるエリトロポエチンを含むことを意図するものである。
本発明の方法は殊にエリトロポエチン産生細胞培養物の培養液中に含まれるエリトロポエチンの回収に適する。
本明細書で用いる「培養液」なる用語は、好ましくは人工由来の任意の液、例えば哺乳動物細胞及び殊に遺伝子的に転換された哺乳動物細胞の細胞培養液に関するものであることを意図する。
好ましくは、本出願にいう「培養液」は細胞及び細胞残屑から当該技術分野で通常のように濾過または限外濾過により分離された培養液である。更に、本明細書において、「濾過された培養液」なる用語は、細胞及び細胞残屑から当該技術分野で通常のような濾過または限外濾過により分離された培養液を示すために用いる。
「産生細胞」は、好ましくは適当な媒質中で培養する際に所望の糖タンパク質を回収可能な量で産生し得る真核または好ましくは哺乳動物由来の安定化または非安定化細胞ラインである。これらの細胞の代表例には、繊維芽細胞、表皮ケラチン細胞、上皮細胞（例えば哺乳動物上皮細胞、腸上皮細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液の形成成分（例えばリンパ細胞、骨髄細胞）、筋肉細胞及びこれらの体細胞タイプの先駆体が含まれる。上記のように、これらの細胞は好ましくは哺乳動物由来（例えばマウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、トリ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サル、ヒト）のものであり、そして最も好ましくは霊長動物及びヒトからのものである。殊にまた、「産生細胞」なる用語は、上記の国際特許出願公開ＷＯ ９３／０９２２２またはＷＯ ９４／１２６５０に記載されるような、細胞に直接的または間接的に回収可能な量のエリトロポエチンを産生させる脊椎動物由来、殊に哺乳動物由来、並びに最も好ましくは外因性の遺伝物質で形質転換された霊長動物またはヒト由来の形質転換された第一、第二の、そして不死化された細胞を含む。
エリトロポエチンを産生させるために有用である不死化されたヒト細胞は広く公知であり、そしてこれらに限定されないが、ＨｅＬａ細胞及びＨｅＬａ細胞の誘導体（例えばＡＴＣＣ ＣＣＬ ２、２．１及び２．２）、ＭＣＦ−７肺ガン細胞（例えばＡＴＣＣ ＭＴＢ ２２）、Ｋ−５６２白血病細胞（例えばＡＴＣＣ ＣＣＬ ２３４）、ＫＢガン細胞（例えばＡＴＣＣ ＣＣＬ １７）、２７８０ＡＤ卵巣ガン細胞、Ｖａｎ ｄｅｌ Ｂｌｉｃｋ，Ａ．Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４８：５９２７〜５９３２（１９８８）、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ １５２）、Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４３２）、ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２４０）、ＷｉＤｒ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２１３）、ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １２１９）、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２１３）、ＲＰＭＩ ８２２６細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５５）、Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５９３）、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ９６０７）、ＷＩ−３８ＶＡ１３サブライン２ＲＳ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５．１）及びＷＯＬＴ−４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８２）が入手可能であり、そしてこれらのものを含む。また、第二のヒト繊維芽細胞株例えばＷＩ−３８（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）も使用し得る。
上記のように、本発明の方法は任意のかかる培養液及び産生細胞からの所望の糖タンパク質の回収に適する。
遺伝子工学技術を生物学的に活性なタンパク質の大規模な製造に広く応用することはその高い需要を満たし得る量でこれらのものが得られる期待を実質的に高めた。しかしながら、いくつかの例において、培養液からのその回収は困難で、扱いにくく、かつ経費がかかる。このことは上記のようにタンパク質が高度にグリコシル化される場合にあてはまる。殊にこれらの場合において、大規模生産に適する簡単及び効率的な回収方法に対する当該分野における必要性が引き続き存在する。
エリトロポエチンの特異的活性を本明細書において言及する場合、このものはＥＬＩＳＡ法（例えば本出願に報告されるもの：ヒトエリトロポエチンＥＬＩＳＡ法、Ｒ＆Ｄ Systems,Inc.）により測定され、一方、試料のタンパク質含有量はＢＣＡ Protein Assayにより測定される。これらの分析法は「分析法」なる標題の下で以下に詳細に報告される。
従って、本発明の１つの目的は、ジヒドロキシボロニル担持クロマトグラフィー用マトリックスを用いる全体的な精製方法における適当なクロマトグラフィー工程を提供する。このクロマトグラフィー工程はその効率性及び融通性のために多段工程における第一工程または続いての工程になり得る。第一のクロマトグラフィー工程として、以下に詳細に記載するように、ジヒドロキシボロニルクロマトグラフィーは好ましくはイオン交換クロマトグラフィー工程と組み合わせ、一方、続いてのクロマトグラフィー工程として、このものは多段工程のいずれかの段階に導入し得る。この多段工程には更に適当ならばイオン交換、サイズ排除、疎水性相互作用及びアフィニティークロマトグラフィー工程からなる多数のクロマトグラフィー工程のいずれかが含まれる。
多段工程における続いてのクロマトグラフィー工程として、ジヒドロキシボロニルクロマトグラフィーを好ましくは半精製された物質であるエリトロポエチンを含む物質を予備平衡されたジヒドロキシボロニル担持クロマトグラフィー用マトリックスに適用することにより行う。また半精製された物質はこのものをマトリックスに適用する前にマトリックス平衡用緩衝液中で平衡化させる。この平衡用緩衝液は「第一の平衡用緩衝液」として前に示されており、そして以下に詳細に定義する。本工程は殊にエリトロポエチンの精製に適する。
本発明の１つの目的は、
ａ）単離すべき糖タンパク質を含む濾過された培養液を予備平衡させたジヒドロキシボロニル担持クロマトグラフィー用マトリックスと接触させ、
ｂ）第一の溶離用緩衝液で溶出させ、そしてこの溶離液を直接第四級アンモニウム官能基を担持する陰イオン交換マトリックスと接触させ、そして
ｃ）糖タンパク質を第二の溶離液で溶出させる
ことからなる精製方法である。
本明細書の開示を完全に読めば明らかなように、これらの工程段階は培地中に含まれる糖タンパク質の数倍の精製を可能にし、従ってこれらは多段工程における第一の精製段階として効果的に用いられる。
本発明の方法の好適な具体例によれば、単離すべき糖タンパク質を含む培養液は、
ａ）濾過した培養液をジヒドロキシボロニル担持クロマトグラフィー用マトリックスと接触させ、
ｂ）第一の溶離用緩衝液で溶出させ、そしてこの溶離液を第四級アンモニウム官能基を担持する陰イオン交換マトリックスと直接接触させ、
ｃ）第二の溶離用緩衝液で溶出させ、
ｄ）５，０００〜２５，０００Ｄカットオフ膜上で限外濾過し、
ｅ）場合により緩衝液を次の工程に適するものに交換するために透析し、そして
ｆ）５，０００乃至２５０，０００Ｄ間の分離範囲を有する分離樹脂上でゲル濾過する
ことからなる工程に付される。
他の好適な具体例によれば、本発明の方法は
ａ）ｐＨ７．５〜９．０に調整した濾過された培養液を２乃至２０ｍＳ／ｃｍ2間のイオン強度及び７．５乃至９．０間のｐＨ値を有する２５〜１００ｍＭの濃度の水性緩衝液である第一の平衡用緩衝液で平衡させたジヒドロキシボロニル担持クロマトグラフィー用マトリックスと接触させ、
ｂ）第一の平衡用緩衝液及び次に低分子量物質を含む１０〜１００ｍＭの１，２−シス−ジオールを含む第一の平衡用緩衝液で順次洗浄し、
ｃ）可能であれば２〜８Ｍのカオトロピック剤、２〜４０ｍＭのシアネート受容体、及び０．０１〜０．１％（ｗ／ｗ）の界面活性剤の存在下にて、２０〜２００ｍＭの濃度の１−ヒドロキシ、２−アミノ基を有する化合物を含む７．５乃至１１．０間のｐＨ値を有する水性緩衝液である第一の溶離用緩衝液で溶出させ、
ｄ）この溶離液を７．５乃至１１．０間のｐＨ値及び０．０１〜０．１％（ｗ／ｗ）の界面活性剤を有する水性緩衝液である第二の溶離用緩衝液中で平衡された第四級アンモニウム官能基を担持する陰イオン交換マトリックスと接触させ、
ｅ）第二の平衡用緩衝液及び更に５０ｍＭまでの塩を含む同緩衝液で順次洗浄し、
ｆ）０．０１〜０．１％（ｗ／ｗ）の界面活性剤及び１５０〜３５０ｍＭの塩の存在下にて７．５乃至１１．０間のｐＨ値を有する第二の溶離用緩衝液で溶出させ、
ｇ）５，０００〜３０，０００Ｄカットオフ膜上で限外濾過し、
ｈ）場合により緩衝液を次のゲル濾過工程に適するものに交換するために透析し、そして
ｉ）５，０００乃至２５０，０００Ｄ間の分離範囲を有する分離樹脂上でゲル濾過する
ことからなる。
「ジヒドロキシボロニル担持クロマトグラフィー用マトリックス」は、ホウ素原子が炭素原子鎖に安定的に結合し、ここでその中心部の炭素原子が種々の使用条件下でホウ素に結合するに十分の遊離電子密度を与えるボロネート官能基を担持する任意の既知のクロマトグラフィー用マトリックスをいう。最も好ましくは、この中心炭素原子は芳香族炭素原子、例えば可能であれば置換されたベンゼン環に属する炭素原子である。本発明の方法に殊に好適に使用されるものは、いわゆるフェニルボロネート樹脂である。これらの樹脂の例は引用をもって本明細書の一部とする米国特許第４，５６２，２５１号、同第４，７７８，８８８号及び同第４，２６９，６０５号に報告される。これらの中で、フェニルボロネートアガロースマトリックスが現在最も好ましい。これらのマトリックスは現在例えばＡｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．またはＧｒａｃｅ Ｉｎｃ．から、ＭＡＴＲＥＸ ＧＥＬ ＰＢＡ−１０、ＰＢＡ−３０及びＰＢＡ−６０を包含するＭＡＴＲＥＸ ＧＥＬなる商標名で市販されている。
現在、第一の精製工程としての用途に最も好適なフェニルボロネートアガロースは、ｍ−アミノフェニル硼酸が６０〜１００μＭ硼酸／ｍｌゲルの割合で５０〜１５０μｍ直径の球形ビーズのサイズ範囲を有するアガロースと共有結合されるＭＡＴＲＥＸ ＧＥＬ ＰＢＡ−６０として販売されるものである。しかしながら、続いての精製工程として、フェニルボロネートアガロースマトリックス、例えばｍ−アミノフェニル硼酸が３０〜５０μＭ硼酸／ｍｌゲルの割合で５０〜１５０μｍ直径球形ビーズのサイズ範囲を有するアガロースと共有結合されるＭＡＴＲＥＸ ＧＥＬ ＰＢＡ−３０が好ましい。
現在、これらのクロマトグラフィー用マトリックスの最も好適な用途は、バッチ法または他のシステムを完全に除外するものではないが、カラムクロマトグラフィーシステムにおけるものである。
カラムクロマトグラフィーシステムに用いる場合、ジヒドロキシボロニル担持クロマトグラフィー用マトリックスは好ましくは室温、好ましくは５乃至２５℃間、最も好ましくは１０乃至２０℃間で用いられ、約１５℃が最も好適な温度である。
上記の「第一の平衡用緩衝液」は好ましくは示された濃度範囲、イオン強度及びｐＨ値でグリシン、リン酸塩、炭酸水素トリアルキルアンモニウム及び４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジノエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）から選ばれる。この第一の平衡用緩衝液に対する殊に好適な濃度は約５０ｍＭの濃度であり、一方、殊に好適なｐＨ値は約８．５であり、そして好適な伝導度は約２．５ｍＳ／ｃｍ2である。これらは第一の工程及び続いての工程の精製の両方の場合に好適な条件である。
上記の「１，２−シス−ジオール含有物質」は１，２−シス−ジオール官能基を有し、即ち共面(coplanar)または準共面(quasi-coplanar)立体配置を保持するかまたは仮定し得る隣接炭素原子上に少なくとも２個のヒドロキシ基を有する任意の既知の低分子量化合物である。当該分野においていずれの場合でも通常既知であるこれらの化合物の代表例は、小さい開鎖状(open-chain)ポリオール、例えばソルビトール、マンニトール、アドニトール、アラビトール、グリセリン、エリトリトール及びシス−イノシトール、並びに閉鎖状(closed-chain)単糖類、例えばリボース及びマンノースであり、ソルビトールが現在最も好ましい。殊に好適なものは第一の精製工程の場合には約５０ｍＭの濃度の低分子量物質を含む１，２−シス−ジオールの使用であり、一方、続いての精製工程においては２０〜１００ｍＭの濃度が現在好ましく、１００ｍＭが最も好適なものである。
該「第一の溶離用緩衝液」の主な構成成分である上記の「１−ヒドロキシ、２−アミノ基を有する化合物」は、かかる官能基を有し、かつ上記のｐＨ範囲内の水性緩衝液を生成し得る任意の化合物である。任意のかかる化合物の代表例には次のものがある：ＴＲＩＳまたはトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタンとしても知られている２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール；ビス（ヒドロキシメチル）アミノエタン；トリシンとしても知られているＮ−［２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチルエチル）］グリシン；及びビシンとしても知られているＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン。これらのものは好ましくは約２０〜１００ｍＭの濃度で使用され、第一の精製工程の場合は約５０ｍＭが現在最も好ましい。好ましくは、第一の溶離用緩衝液は約８．５のｐＨ値に調整される。続いての精製工程としての用途に対し、好適な濃度範囲は２０〜１５０ｍＭであり、１００ｍＭが最も好ましい。またこの用途のためには、ＴＲＩＳが現在好適なものである。
フェニルボロネートクロマトグラフィーを第二のクロマトグラフィー工程として用いる場合の好適な溶離条件はＴＲＩＳ １００ｍＭ及びソルビトール１００ｍＭを含む溶離用緩衝液を含む。
好ましくは、「第二の平衡用緩衝液」及び「第二の溶離用緩衝液」は、その主成分として１−ヒドロキシ、２−アミノ基を有する上記定義の化合物を有する。この場合、その好適な濃度は２０乃至２００ｍＭ間である。
「カオトロピック剤」（“chaotropic agent”）は、一般にその解離特性のために、タンパク性物質の塩溶及びすなわちその水性媒質中での可溶化を好適にする試薬である。
カオトロピック剤の代表例は尿素及びその誘導体並びにグアニジンである。カオトロピック剤は、存在する場合、２乃至８Ｍ間の濃度で用い、約４〜６Ｍが好ましい。
シアネート受容体は尿素の加水分解の結果として生成し得るＣＮＯ-イオンを容易に結合し得る任意の既知の物質である。シアネート受容体としてグリシンが好ましい。本発明の工程におけるその用途に対し、グリシンは好ましくは２〜４０ｍＭ、最も好ましくは約２０ｍＭの濃度で用いられる。
本明細書で用いる「界面活性剤」なる用語は、表面張力、即ちその表面積を減少させる液体の表面で作用する力を減少させる任意の既知の物質をいう。界面活性剤の好適な例には「Ｔｗｅｅｎ」として知られている脂肪酸のポリオキシエチレンソルビタン誘導体があり、「Ｔｗｅｅｎ ２０」（即ち、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）が現在好ましい。現在、界面活性剤は、存在する場合、好ましくは約０．０１〜０．１％（ｗ／ｗ）の濃度で用いられ、約０．０１％が現在最も好ましい。
第四級アンモニウム官能基を担持する上記の陰イオン交換体マトリックスは、該官能基を有する任意の既知の、そして市販の陰イオン交換体マトリックスである。本発明の方法に用いるために好ましいものは、アガロースまたはセルロースベースのマトリックス、例えば微結晶性セルロースまたは交差結合されたアガロースである。また、殊に好適なものはジエチルアミノエチル、トリエチルアミノメチルまたはトリメチルアミノメチル官能基を担持するマトリックスである。
殊に好適な陰イオン交換体マトリックスは、例えばQ-Sepharose(Pharmacia AB)として市販されるトリメチルアミノメチル交差結合されたアガロースである。これらのマトリックスを含むクロマトグラフィー工程は最も好ましくは室温で行われるカラムクロマトグラフィーとして行われる。
上記のように塩を洗浄用または溶離用緩衝液に加える場合、このものは当該分野で通常のように緩衝液のイオン強度を増大させるために加えられる。当該分野で通常用いられる任意の塩がこの目的のために本発明の方法に用いることができ、ＮａＣｌが最も頻繁にかつ便利に用いられるものである。
限外濾過工程は当該分野で通常のように接線流システム(tangential flow system)または撹拌セルシステムを用いて行われる。好ましくは、膜は例えばMillipore Inc.またはAmicon Inc.から市販されているタイプのポリスルホン膜または再生セルロース膜である。本発明の方法に現在用いるために好ましいものは１０，０００のカットオフを有するものである。
次に、限外濾過した濾液を場合によりそれ自体当該分野で既知の方法により次のゲル濾過工程に用いるものと好ましくは同様の緩衝液中で透析する。このゲル濾過緩衝液は６乃至８間のｐＨ値を有する水性緩衝液である。塩は好ましくはこの緩衝液中で１００〜２００ｍＭで存在し、そしてより好ましくは塩は１００ｍＭであり、かつｐＨ値は約７．４〜７．５である。
通常のゲル濾過マトリックスを便利にはこの工程段階で使用し得る。これらのマトリックスの代表例は、アクリルアミドで交差結合されたポリデキストラン例えばアリルデキストランをＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド及び交差結合されたセルロースゲルで共有結合的に交差結合させることにより製造される高機械的強度の複合体親水性ゲルである。市販の交差結合されたデキストラン−アクリルアミドはSEPHACRYLなる商標名で既知であり、そしてPharmacia ABから入手できる。好適なSEPHACRYLゲルは２５〜７５μｍのビーズサイズを有し、かつその交差結合をこのものが球形のタンパク質に対して５，０００〜２５０，０００Ｄの分画範囲を有するように制御されたSEPHACRYL S-200 HRである。
交差結合されたセルロースゲルの例には、市販の交差結合された多孔性セルロースゲル例えばAmicon Inc.から入手できるＧＬＣ ３００（平均粒径４４〜１２５μｍ）またはＧＬＣ １，０００（平均粒径５３〜１２５μｍ）である。
本発明の方法は殊に既知のものがもつ大きな欠点なしに容易にスケールアップすることができる一連の工程からなるために、大規模製造に向いている。
更に、本発明の方法は水性溶媒のみが用いられ、そしてこのことは当該分野に精通せる者により認められるようにさらなる利点を表す。
加えて、本発明の方法は何ら溶媒の交換または調整を必要とせずに第一の工程からの溶離液を第二の工程に直接移すことにより、その第一のクロマトグラフィー工程（即ちジヒドロボロニルマトリックスを用いるもの）からその第二のクロマトグラフィー工程（即ち陰イオン交換体マトリックスを用いるもの）に通すことが可能となる。
全体的な操作が容易になることに加え、本発明の方法のこの特徴は回収率を改善することに寄与する。
本発明の工程は事実５００〜２，０００ ＥＬＩＳＡ単位／ｍｇの平均特異活性を有する濾過された細胞液から出発して１４５，０００〜１７５，０００ ＥＬＩＳＡの平均特異活性を有するエリトロポエチン生成物の回収を可能にする。
更に、第一及び第二のクロマトグラフィー工程の組合わせは、完全な工程のに対する１１０〜１５０倍の全体的な精製ファクターで、初期培養液の６０〜１００倍の精製を可能にする。
エリトロポエチンの場合におけるように、本発明の工程の終了時に回収される糖タンパク質は塩除去及び当該分野で通常の凍結乾燥後に固体として単離し得るか、または得られる溶液を例えば透析により溶媒交換し、例えば引用をもって本明細書の一部をなすＥＰ−４３０，２００に記載される製薬学的調製物に適する溶液にし得る。
次の実施例は説明のためのみのものであり、そして本発明の範囲を限定するためのものではない。
実施例１
エリトロポエチン精製における第一の精製工程としてのフェニルボロネートクロマトグラフィー
約２０ｍｇのエリトロポエチンを含むＷＯ ９３／０９２２２の実施例２１またはＷＯ ９４／１２６５０に記載により得られたヒトエリトロポエチン生成細胞の培養液の上澄を混合膜カートリッジ（１．２及び０．５μｍ；Opticap、Millipore Inc.）上で濾過し、次に３０，０００Ｄ再生セルローススパイラルカートリッジＳ１Ｙ３０（Amicon Inc.）上で限外濾過し、そして水及び０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．５、伝導度２．５ｍＳ／ｃｍ2で透析した。限外濾過液を０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．５（緩衝液Ａ）で平衡化したフェニルボロネートアガロースクロマトグラフィー用カラム（１２０ｍｌ膨潤樹脂；ＰＢＡ ６０、Amicon Inc.）上に担持させ、そして水冷により約１０〜１５℃で保持した。流速を約２〜４カラム容量（ＣＶ）／時間に設定した。ベースラインが安定するまで［２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）］緩衝液Ａで洗浄した後、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０及び０．０５Ｍソルビトールを含む０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．５（緩衝液Ｂ）を用いて洗浄を続けた。６Ｍ尿素、０．０２Ｍグリシン及び０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む０．０２Ｍ ＴＲＩＳ ｐＨ８．５（緩衝液Ｃ）を用いて溶出を行い、溶出したピーク（２８０ｎｍでのＯＤ）を捕集し（約４〜５ＣＶ；収率７０〜８０％、精製ファクター約２０倍）、そして０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む０．０２Ｍ ＴＲＩＳ ｐＨ８．５（緩衝液Ｄ）で平衡化したトリメチルアミノメチル交差結合されたアガロース陰イオン交換樹脂（２５ｍｌ膨潤樹脂；Q-Sepharose FF、Pharmacia AB）上に直接担持させた。ベースラインが安定するまで緩衝液Ｄ、及び次にまた０．０５Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｄ（緩衝液Ｅ）を用いて一定流速で洗浄した後、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０及び０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０２Ｍ ＴＲＩＳ ｐＨ８．５（緩衝液Ｆ）を用いて溶出を行った。ピークを捕集し（回収約８０％）、そして１０，０００Ｄカットオフの膜（YM10、Amicon）を有する撹拌されたセルを用いる限外濾過により濃縮した。
濃縮された溶液を０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０２Ｍ ＴＲＩＳ ｐＨ７．４（緩衝液Ｇ）で平衡化した交差結合されたデキストラン−アクリルアミドゲル濾過カラム（Sephacryl S200;Pharmacia AB）上に担持させ、そして同じ緩衝液で溶出させた。フラクションを捕集し、エリトロポエチン生成物を含むもの（ＥＬＩＳＡアッセイ法）をプールし、そして上記のように限外濾過により濃縮した。
実施例２
エリトロポエチン精製における続いての精製工程としてのフェニルボロネートクロマトグラフィー
約２０ｍｇのエリトロポエチンを含む半精製されたヒトエリトロポエチン（ＷＯ ９３／０９２２２の実施例２１またはＷＯ ９４／１２６５０に記載のように得られた生成細胞からのもの）の溶液を水及び０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．５、並びに０．１５Ｍ ＮａＣｌ、伝導度約１８ｍＳ／ｃｍ2を用いて透過濾過または透析し、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．５（緩衝液Ａ’）で平衡化したフェニルボロネートアガロースクロマトグラフィー用カラム（１２０ｍｌ膨潤樹脂；ＰＢＡ ６０、Amicon社）上に担持させ、そして水冷により約１０〜１５℃に保持した。流速を約２〜４カラム容量（ＣＶ）／時間に設定した。ベースラインが安定するまで［２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）］緩衝液Ａ’で洗浄した。０．１Ｍソルビトールを含む０．１０Ｍ ＴＲＩＳ ｐＨ８．５（緩衝液Ｂ’）を用いて溶出を行い、溶出したピーク（２８０ｎｍでのＯＤ）を捕集した（約４〜５ＣＶ；収率約９０％）。
分析方法：
ＥＬＩＳＡ：
上記の方法により得られたエリトロポエチン生成物の特異的活性はQUANTIKINE IVD(R&D SYSTEMS Inc.）として既知でかつ市販されているヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡ法により測定した。
タンパク質アッセイ法：
タンパク質アッセイ法はビュレット反応（アルカリ性媒質中でのＣｕ2+からＣｕ1+へのタンパク質還元）をＣｕ1+に対するビシンコニン酸（ＢＣＡ）の高度に特異的な反応を組み合わせた方法であるＢＣＡタンパク質アッセイ試薬方法（Pierce Chemical Co）により行った。
特異的活性：
試料に対する特異的活性は次式により計算される：特異的活性＝ＥＬＩＳＡによるエリトロポエチンの全単位／ＢＣＡアッセイ法によるタンパク質の全ｍｇ。エリトロポエチンの精製した調製物はＢＣＡアッセイ法により約２００，０００ＥＬＩＳＡ単位／ｍｇタンパク質の特異的活性を有していた。エリトロポエチンの単位を定量するためにＥＬＩＳＡを用いる特異的活性はエリトロポエチンの実際の生物学的活性に間接的にのみ関連する。生体内の特異的活性を測定するために一般的に行われる試験は当該分野に精通せる者により既知であるエクスハイポキシック多血球血症（exhypoxic polycythemic）マウスバイオアッセイ法（例えばアッセイ法により当該分野に精通せる者により既知であるようにＩＵ／ｍｇとして特異的活性を測定し得る）である。
ＨＰＬＣ分析：
装置：ＰＤＡ検出器モデル９９６を備えたＷａｔｅｒｓ ６１６ ＬＣシステム
カラム：Ｖｙｄａｃ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ4、３μｍ、４．６×２５０ｍｍ
移動相：Ａ）０．１％水性トリフルオロ酢酸：アセトニトリル、９５：５、Ｂ）０．１％水性トリフルオロ酢酸：アセトニトリル、５：９５ グラジエント：分（％Ｂ）：５（５）、５０（９５）
流速：１ｍｌ／分
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は製造者の指示及び当該分野の通常の知識に従ってＰｈａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ上で行い、そして濃度測定はＦｌｙｉｎｇ Ｓｐｏｔ走査型デンシトメータＣＳ−９３０１ ＰＣ、島津製作所を用いて行った。
分析データ及び結果：
数回の実験から捕集したデータから、細胞上澄のエリトロポエチンの特異的活性は５００〜２，０００ＥＬＩＳＡ単位／ｍｇの範囲内であり；第一のクロマトグラフィー工程後に回収されたエリトロポエチンの特異的活性は約３５，０００〜９５，０００ＥＬＩＳＡ単位／ｍｇであり；実施例１に記載された工程の終了時に回収されたエリトロポエチン生成物の特異的活性は平均して約１４５，０００〜１７５，０００ＥＬＩＳＡ単位／ｍｇであった。
上記の方法により行われたＨＰＬＣ並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は工程の終了時に回収されたエリトロポエチン生成物が９２％より多い曲線下面積（ＡＵＣ）を表す主なピークを有することを示した。
Claims (19)
- ａ）エリトロポエチンを含む濾過された培養液を、グリシン、リン酸塩、炭酸水素トリアルキルアンモニウム及び４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジノエタンスルホン酸から選ばれる第一の平衡用緩衝液で予備平衡させたジヒドロキシボロニル担持クロマトグラフィー用マトリックスに適用し、
ｂ）第一の平衡用緩衝液で洗浄し、そして
ｃ）１−ヒドロキシ、２−アミノ基を有する化合物ならびに小さい開鎖状ポリオール及び閉鎖状単糖類から選ばれる物質を含む１，２−シス−ジオールを含む７．５〜１１間のｐＨ値を有する水性緩衝液で溶出させる
工程を含んでなるエリトロポエチンの精製方法。 - ａ）エリトロポエチンを含む濾過された培養液を、グリシン、リン酸塩、炭酸水素トリアルキルアンモニウム及び４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジノエタンスルホン酸から選ばれる第一の平衡用緩衝液で予備平衡させたジヒドロキシボロニル担持クロマトグラフィー用マトリックスと接触させ、
ｂ）１−ヒドロキシ、２−アミノ基を有する化合物を主たる成分として含有する第一の溶離用緩衝液で溶出させ、そしてこの溶離液を第四級アンモニウム官能基を担持する陰イオン交換マトリックスと直接接触させ、
ｃ）エリトロポエチンを１−ヒドロキシ、２−アミノ基を有する化合物を主たる成分として含有する第二の溶離用緩衝液で溶出させ、そしてそれを捕集する
ことを含んでなるエリトロポエチンの精製方法。 - ａ）エリトロポエチンを含む濾過された培養液を、グリシン、リン酸塩、炭酸水素トリアルキルアンモニウム及び４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジノエタンスルホン酸から選ばれる第一の平衡用緩衝液で予備平衡させたジヒドロキシボロニル担持クロマトグラフィー用マトリックスと接触させ、
ｂ）１−ヒドロキシ、２−アミノ基を有する化合物を主たる成分として含有する第一の溶離用緩衝液で溶出させ、
ｃ）この溶離液を第四級アンモニウム官能基を担持する陰イオン交換マトリックスと直接接触させ、
ｄ）１−ヒドロキシ、２−アミノ基を有する化合物を主たる成分として含有する第二の溶離用緩衝液で溶出させ、
ｅ）５，０００〜２５，０００Ｄカットオフ膜上で限外濾過し、
ｆ）場合により緩衝液を次の工程に適するものと交換するために透析し、そして
ｇ）５，０００〜２５０，０００Ｄ間の分離範囲を有する分離樹脂上でゲル濾過する
ことを含んでなるエリトロポエチンの精製方法。 - ａ）ｐＨ７．５〜９．０に調整した濾過された培養液を２〜２０ｍＳ／ｃｍ2間のイオン強度及び７．５〜９．０間のｐＨ値を有する２５〜１００ｍＭの濃度の水性緩衝液である第一の平衡用緩衝液で平衡させたジヒドロキシボロニル担持クロマトグラフィー用マトリックスと接触させ、
ｂ）第一の平衡用緩衝液及び次いで小さい開鎖状ポリオール及び閉鎖状単糖類から選ばれる物質を含む１０〜１００ｍＭの１，２−シス−ジオールを含む第一の平衡用緩衝液で順次洗浄し、
ｃ）可能であれば２〜８Ｍのカオトロピック剤、２〜４０ｍＭのシアネート受容体、及び０．０２〜０．１％（ｗ／ｗ）の界面活性剤の存在下にて、２０〜２００ｍＭの濃度で１−ヒドロキシ、２−アミノ基を有する化合物を含む７．５〜１１．０間のｐＨ値を有する水性緩衝液である第一の溶離用緩衝液で溶出させ、
ｄ）この溶離液を７．５〜１１．０間のｐＨ値及び０．０１〜０．１％（ｗ／ｗ）の界面活性剤を有する水性緩衝液である第二の溶離用緩衝液中で平衡された第四級アンモニウム官能基を担持する陰イオン交換マトリクスと接触させ、
ｅ）第二の平衡用緩衝液及び５０ｍＭまでの塩を更に含む同じ緩衝液で順次洗浄し、
ｆ）０．０１〜０．１％（ｗ／ｗ）の界面活性剤及び１５０〜３５０ｍＭの塩の存在下にて１−ヒドロキシ、２−アミノ基を有する化合物を主たる成分として含有し且つ７．５〜１１．０間のｐＨ値を有する第二の溶離用緩衝液で溶出させ、
ｇ）５，０００〜３０，０００Ｄカットオフ膜上で限外濾過し、
ｈ）場合により緩衝液を次のゲル濾過工程に適するものと交換するために透析し、そして
ｉ）５，０００〜２５０，０００Ｄ間の分離範囲を有する分離樹脂上でゲル濾過する
ことを含んでなるエリトロポエチンの精製方法。 - ジヒドロキシボロニル担持クロマトグラフィー用マトリックスがフェニルボロネートアガロースである請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の方法。
- 第一の平衡用緩衝液が約０．０５Ｍの濃度の４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジノエタンスルホン酸である請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の方法。
- 第一の平衡用緩衝液のｐＨ値が約８．５である請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の方法。
- 小さい開鎖状ポリオールがソルビトール、マンニトール、アドニトール、アラビトール、グリセリン、エリトリトール及びシス−イノシトールから選ばれ、そして閉鎖状単糖類がリボース及びマンノースから選ばれる請求の範囲第１または４〜７項のいずれかに記載の方法。
- 小さい開鎖状ポリオール及び閉鎖状単糖類から選ばれる物質を含む１，２−シス−ジオールがソルビトールである請求の範囲第１または４項に記載の方法。
- 小さい開鎖状ポリオール及び閉鎖状単糖類から選ばれる物質を含む１，２−シス−ジオールが約０．０５Ｍの濃度で存在する請求の範囲第１または４項記載の方法。
- 第二の平衡用緩衝液が０．０２〜０．２Ｍの濃度で１−ヒドロキシ、２−アミノ基を有する化合物を含む請求の範囲第１または４〜１０項のいずれかに記載の方法。
- 第二の平衡用緩衝液が０．０５Ｍの濃度で１−ヒドロキシ、２−アミノ基を有する化合物を含む請求の範囲第１または４〜１０項のいずれかに記載の方法。
- １−ヒドロキシ、２−アミノ基を有する化合物が２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、ビス（ヒドロキシメチル）アミノエタン、Ｎ−［２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチルエチル）］グリシン及びＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシンから選ばれる請求の範囲第４〜１２項のいずれかに記載の方法。
- カオトロピック剤が尿素及びその誘導体ならびにグアニジンから選ばれる請求の範囲第４〜１３項のいずれかに記載の方法。
- カオトロピック剤が６Ｍ尿素である請求の範囲第１４項記載の方法。
- シアネート受容体がグリシンである請求の範囲第４〜１５項のいずれかに記載の方法。
- 第四級アンモニウム官能基を担持する陰イオン交換マトリックスがジエチルアミノエチル、トリエチルアミノメチルまたはトリメチルアミノメチル官能基を担持する微結晶性セルロースまたは交差結合されたアガロースから選ばれる請求の範囲第３〜１６項のいずれかに記載の方法。
- 陰イオン交換マトリックスがトリメチルアミノメチルアガロースである請求の範囲第１７項記載の方法。
- ゲル濾過を細孔を制御した交差結合されたデキストラン−アクリルアミドゲルマトリックスを用いて行う請求の範囲第３〜１８項のいずれかに記載の方法。
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