CZ291770B6

CZ291770B6 - Způsob čištění biologicky aktivního erytropoetinu

Info

Publication number: CZ291770B6
Application number: CZ19973256A
Authority: CZ
Inventors: Dino Zanette; Edoardo Giacomo Sarubbi; Adolfo Soffientini; Ermenegildo Restelli; Armando Grigoletto
Original assignee: Aventis Bulk S.P.A.
Priority date: 1995-04-14
Filing date: 1996-04-09
Publication date: 2003-05-14
Also published as: NZ307173A; DE69609061T2; CN1181759A; KR100442076B1; EA199700314A1; MX9707527A; NO974524L; EP0820468A1; AU5645796A; CA2216130A1; DE69609061D1; GR3034294T3; TW421652B; AU693693B2; WO1996032413A1; AR001622A1; ATE194144T1; CZ325697A3; IL117849A; CA2216130C

Abstract

Zp sob iÜt n biologicky aktivn ho erytropoetinu, p°i n m se a) zfiltrovan ivn prost°ed s obsahem erytropoetinu, upraven na pH 7,5 a 9,0 uvede do styku s chromatografickou matric s dihydroxyboronylov²mi skupinami, p°edem uvedenou do rovnov n ho stavu s prvn m ekvilibra n m pufrem, kter²m je vodn² pufr s koncentrac 25 a 100 mM, s iontovou silou 2 a 20 mS/cm.sup.2.n. a pH v rozmez 7,5 a 9,0, b) matrice se promyje prvn m elu n m pufrem, kter²m je vodn² pufr o pH 7,5 a 11, obsahuj c slou eninu s 1-hydroxy, 2-aminoskupinami v koncentraci 20 a 200 mM a 10 a 100 mM slou eniny s n zkou molekulovou hmotnost , obsahuj c 1,2-cis-diolov skupiny, elu t se uvede do styku s aniontom ni ovou matric s obsahem kvart rn ch amoniov²ch funk n ch skupin v rovnov n m stavu s druh²m ekvilibra n m pufrem, kter²m je vodn² pufr o pH 7,5 a 11,0 obsahuj c 0,01 a 0,1 % hmotnostn ch sm edla a c) matrice se promyje druh²m ekvilibra n m pufrem o pH 7,5 a 11,0 v p° tomnosti 0,01 % a 0,1 % hmotnostn ch sm edla a erytropoetin se odd l .\

Description

I

Způsob čištění biologicky aktivního erytropoetinu

Oblast techniky

Vynález se týká jednoduchého a účinného způsobu pro izolaci biologicky účinného erytropoetinu z biologických tekutin, které tuto látku obsahují.

Dosavadní stav techniky

Příprava erytropoetinu z různých zdrojů včetně buněk, které byly získány genetickým inženýrstvím, byla popsána v různých evropských patentových spisech, například EP 148 605, EP 205 564, EP 209 539, EP 267 678, EP 649 464 a EP 672 160.

Pod pojmem „erytropoetin“ se v popisu vynálezu rozumí přírodně se vyskytující erytropoetin, který je možno získat například z lidské moči nebo polypeptidu, jejichž řetězec aminokyselin včetně glykosylace je zdvojen ve srovnání s přírodně se vyskytujícím erytropoetinem. Uvedené látky podporují in vivo buňky kostní dřeně ke zvýšené produkci retikulocytů a červených krvinek. Zahrnut je také eiytropoetin, který je možno získat z kultury savčích buněk aktivací endogenního genu nebo genů pro erytropoetin, tak jak bylo popsáno například v mezinárodní patentové přihlášce, zveřejněné pod číslem WO 93/09 222 (podána jako PC-T/US 92/09627) nebo v mezinárodní patentové přihlášce, zveřejněné pod číslem WO 94/12 650 s prioritou z US přihlášky č. 07/985 586.

Způsob podle vynálezu je zvláště vhodný pro izolaci erytropoetinu ze živného prostředí, v němž jsou pěstovány kultury buněk, produkujících erytropoetin.

Pod pojmem „živné prostředí“ se rozumí jakákoliv kapalina, získaná syntetickým způsobem, například živné prostředí pro pěstování savčích buněk, zvláště takových, které byly podrobeny genetické transformaci.

Živné prostředí se v tomto případě oddělí od vypěstovaných buněk a buněčné drti filtrací nebo ultrafiltrací obvyklým způsobem. Z tohoto důvodu znamená „zfíltrované živné prostředí“ prostředí, oddělené od buněk a buněčné drti filtrací nebo ultrafiltrací.

„Produkční buňky“ jsou s výhodou stabilizované nebo nestabilizované buněčné linie eukaryotického původu nebo s výhodou buněčné linie savců, které jsou při pěstování ve vhodném prostředí schopné produkovat požadovaný erytropoetin v izolovatelném množství. Jako příklady takových buněk je možno uvést fibroblasty, keratinocyty, epiteliální buňky, například z mléčné žlázy nebo ze střev, endoteliální buňky, buňky glie, nervové buňky, krevní buňky, například lymfocyty nebo buňky kostní dřeně, svalové buňky a mimoto také prekurzory všech těchto somatických buněčných typů. Jak již bylo uvedeno, jde s výhodou o buněčný materiál savčího původu, například může jít o myši, krysy, králíky, kočky, psy, vepře, skot, ptáky, ovce, kozy, koně, opice nebo člověka. Nejvýhodnější je materiál z primátů a člověka. Pod pojmem „produkční buňky“ se rozumí také primární, sekundární nebo imortalizované buňky obratlovců, zvláště savců, nejvýhodněji primátů nebo člověka po transfekci exogenním genetickým materiálem, který přímo nebo nepřímo u buněk vyvolává produkci izolovatelného množství erytropoetinu, tak jak bylo popsáno v mezinárodních patentových přihláškách č. WO 93/09 222 nebo WO 94/12 650.

Příklady imortalizovaných lidských buněčných linií, které je možno použít k produkci erytropoetinu jsou obecně známé a dostupné. Jde například o HeLa buňky a jejich deriváty, například ATCC CCL 2, 2.1 a 2.2, o buňky karcinomu mléčné žlázy MCF-7, například ATCC HTB 22, o leukemické buňky K.-562, například ATCC CCL 234, buňky karcinomu KB, například ATCC CCL 17, buňky karcinomu vaječníku 2780AD, popsané v publikaci Van del Blick A. M. a další,

-1 CZ 291770 B6

Cancer Res., 48, 5927 až 5932, 1988, buňky Ráji, ATCC CC1 86, buňky Jurkat, ATCC TIB 152, buňky Namalwa, ATCC CRL 1432, buňky HL-60, ATCC CCL 240, buňky WiDr, ATCC CCL 218, buňky HT1080, ATCC CCL 1219, buňky Daudi, ATCC CCL 213, buňky RPMI 8226, ATCC CCL 155, buňky Daudi, ATCC CCL 213, buňky RPMI 8226, ATCC CCL 155, buňky U5 937, ATCC CRL 1593, buňky Bowesova melanomu, ATCC CRL 9607, podlinie WI-38VA13 buněk 2RS, ATCC CCL 75.1 a buňky MOLT-4, ATCC CRL 1582. Je také možno použít sekundární kmeny lidských fibroblastů, například WI-38, ATCC CCL 75 a MRC-5, ATCC CCL 171.

Jak již bylo uvedeno, způsobem podle vynálezu je možno izolovat požadovaný erytropoetin z jakéhokoliv živného prostředí uvedených kultur.

Široká aplikace technologií genetického inženýrství pro přípravu biologicky aktivních bílkovin ve velkém měřítku podstatně zvýšila vyhlídky získat tyto látky v množství, které odpovídá 15 poptávce. V některých případech je však izolace těchto látek z živného prostředí obtížná, pracná a nákladná. Jde zvláště o případy, kdy bílkovina je vysoce glykosylována, jak již bylo svrchu uvedeno. V těchto oblastech stále přetrvává potřeba jednoduchých a účinných izolačních postupů, které by byly použitelné pro výrobu uvedených látek ve velkém měřítku.

V případě, že se v popisu vynálezu uvádí specifická účinnost erytropoetinu, jde o účinnost, stanovenou metodou ELISA, například pomocí zkušebního balíčku pro stanovení lidského erytropoetinu (R and D systems, lne.). Obsah bílkovin ve vzorku se měří zkouškou BCA na bílkoviny. Tyto zkoušky budou dále uvedeny podrobněji v odstavcích, týkajících se analytických postupů.

Vynález si klade za úkol navrhnout izolační postupy, zvláště vhodný chromatografícký postup, který by využíval jednoduchých materiálů, například matrice s dihydroxyboronylovými skupinami. Tento chromatografícký stupeň je účinný a snadno proveditelný a je tedy možno jej zařadit jako první nebo některý následující stupeň vícestupňového postupu. V případě zařazení jako 30 první stupeň se tato chromatografie s výhodou kombinuje s chromatografií na iontoměniči, jak bude dále podrobněji popsáno. Uvedený vícestupňový postup může zahrnovat mimoto jakýkoliv počet dalších chromatografických stupňů, při nichž je možno použít chromatografií na iontoměniči, chromatografií s oddělením izolovaných látek podle molekulové hmotnosti, hydrofobní interakci a afinitní chromatografické postupy.

V případě, že se dihydroxyboronylová chromatografie provádí jako některý z mezistupňů vícestupňového postupu, provádí se tento postup s výhodou tak, že se částečně čištěný materiál, který obsahuje erytropoetin, nanese na chromatografickou matrici, kterou je matrice s dihydroxyboronylovými skupinami. Částečně čištěný materiál se rovněž uvede do rovnovážného stavu 40 v tomtéž pufru jako matrice před nanesením na tuto matrici. Tento pufr bude dále označován jako „první ekvilibrační pufr“ a bude podrobněji popsán. Tento postup je pro čištění erytropoetinu zvláště vhodný.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří způsob čištění biologicky aktivního erytropoetinu, kteiý spočívá v tom, že se

a) zfiltrované živné prostředí s obsahem erytropoetinu, upravené na pH 7,5 až 9,0 uvede do styku s chromatografickou matrici s dihydroxyboronylovými skupinami, předem uvedenou do rovnovážného stavu s první ekvilibračním pufrem, kterým je vodný pufr s koncentrací 25 až 100 mM, s iontovou silou 2 až 20 mS/cm² a pH v rozmezí 7,5 až 9,0,

-2CZ 291770 B6

b) matrice se promyje prvním elučním pufrem, kterým je vodný pufr o pH 7,5 až 11, obsahující sloučeninu s 1-hydroxy, 2-aminoskupinami v koncentraci 20 až 200 mM a 10 až 100 mM sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností, obsahující 1,2-cis-diolové skupiny, eluát se uvede do styku s aniontoměničovou matricí s obsahem kvartémích amoniových funkčních skupin v rovnovážném stavu s druhým ekvilibračním pufrem, kterým je vodný pufr o pH 7,5 až 11,0 obsahující 0,01 až 0,1 % hmotnostních smáčedla a

c) matrice se promyje druhým ekvilibračním pufrem o pH 7,5 až 11,0 v přítomnosti 0,01 % až 0,1 % hmotnostních smáčedla a erytropoetin se oddělí.

Svrchu uvedeným způsobem je možno dosáhnout vysokého stupně čištění erytropoetinu ze živného prostředí, takže je tento postup možno účinně použít jako první stupeň vícestupňového postupu.

Podle výhodného provedení způsobu podle vynálezu je možno postupovat tak, že se živné prostředí, které obsahuje erytropoetin, který má být izolován, podrobí postupu, který spočívá v tom, že se po eluci ve stupni c) před oddělením erytropoetinu

d) provede ultrafiltrace při použití membrány, oddělující látky od molekulové hmotnosti 5000 až 25 000,

e) popřípadě se provede diaflltrace k výměně prvního elučního pufru za pufr, vhodný pro následující stupeň a

f) provede se filtrace na gelu při použití pryskyřice oddělující materiály s molekulovou hmotností 5000 až 250 000, jako je dextranakrylamid nebo celulóza.

Podle dalšího výhodného provedení se postupuje tak, že se po stupni a)

- matrice promyje prvním ekvilibračním pufrem a pak tamtéž pufrem s obsahem 10 až 100 mM sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností, obsahující 1,2-cis-diolové skupiny, a po stupni b) se

- matrice promyje druhým ekvilibračním pufrem a pak tímtéž pufrem, obsahujícím až 50 mM soli, zvyšující iontovou sílu pufru, jako chloridu sodného, přičemž

- druhý eluční pufr dále obsahuje 150 až 350 mM soli, zvyšující iontovou sílu pufru, jako chloridu sodného.

Pod pojmem „chromatografická matrice s obsahem dihydroxyboronylových skupin“ se rozumí jakákoliv známá chromatografícká matrice, která nese boritanovou funkci, v níž je atom boru stabilně vázán na uhlíkový řetězec, v němž proximální uhlíkový atom má dostatečnou hustotu volných elektronů k tomu, aby zůstal vázán na atom boru za různých podmínek použití. S výhodou je tento proximální uhlíkový, tvořící součást benzenového kruhu, popřípadě substituovaného. Zvláště výhodné jsou pro použití k provádění způsobu podle vynálezu tak zvané fenylboritanové pryskyřice. Jako příklad těchto pryskyřic je možno uvést pryskyřice, uvedené v US patentových spisech č. 4 562 251, 4 778 888 a 4 269 605. Z těchto látek jsou v současné době nejvýhodnější matrice zagarózy s fenylboritanovými skupinami. Tyto matrice se běžně dodávají například od Amicon lne nebo Grace lne. pod obchodními názvy MATREX GEL, jde například o typy MATREX GEL PBA-10. PBA-30 a PBA-60. V případě, že je tento stupeň zařazen jako první stupeň postupu, prováděného ve více stupních, je nejvýhodnějším materiálem pro toto použití

-3CZ 291770 B6 agaróza s fenylboritanovými skupinami, dodávaná pod názvem MATREX GEL PBA-60, v níž je kyselina m-aminofenylboritá kovalentně vázána na agarózu s velikostí částic v rozmezí 50 až 150 mikrometrů při částicích kulovitého tvaru, obsaženo je 60 až 100 mikroM kyseliny borité/ml gelu. Pro další stupně čištění jsou však výhodnější jiné agarózové matrice s obsahem fenylborita5 nových skupin, například MATREX GEL PBA-30, v níž je kyselina m-aminofenylboritá kovalentně vázána na agarózu, jejíž kulovité částice mají průměr 50 až 150 mikrometrů, množství kyseliny je 30 až 50 mikroM kyseliny borité/ml gelu.

V současné době je nejvhodnější použití těchto chromatografíckých matricí při chromatografií, ίο prováděné na sloupci, i když použití těchto materiálů v jiných systémech není zcela vyloučeno.

Při použití při chromatografií na sloupci se chromatografická matrice se svrchu uvedenými funkčními skupinami s výhodou užívá při teplotě místnosti, zvláště výhodně při teplotě 5 až 25 °C a zejména 10 až 20 °C, nej výhodnější teplota je 15 °C.

Svrchu uvedený „první ekvilibrační pufr“ se s výhodou volí ze skupiny glycin, fosfáty, trialkylamoniumhydrogenuhličitan a kyselina 4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazinethansulfonová, HEPES, v uvedené koncentraci, iontové síle a pH. Zvláště výhodná koncentrace pro tento první ekvilibrační pufr je koncentrace přibližně 50 mM, zvláště výhodná hodnota pH je přibližně 8,5 20 a výhodná vodivost přibližně 2,5 mS/cm². Tyto výhodné podmínky je možno použít jak v případě, že je uvedený postup zařazen jako první stupeň nebo jako kterýkoliv další stupeň postupu, prováděného ve více stupních.

Svrchu uvedená „nízkomolekulámí sloučenina s obsahem 1,2-cis-diolových skupin“ může být 25 jakákoliv známá nízkomolekulámí sloučenina, která obsahuje uvedené skupiny, to znamená, že obsahuje nejméně dvě hydroxyskupiny na sousedních atomech uhlíku tak, aby mohla vzniknout přibližně rovinná konfigurace. Reprezentativními příklady těchto látek, které jsou běžně známé, mohou být polyoly s krátkým otevřeným řetězcem, například sorbitol, mannitol, adonitol, arabitol, glycerol, arythritol a cis-inositol a také monosacharidy s uzavřeným řetězcem, jako 30 ribóza a manóza, velmi výhodný je sorbitol. Zvláště výhodné je použití nízkomolekulámí látky s obsahem 1,2-cis-diolových skupin v koncentraci přibližně 50 mM v případě, že běží o první stupeň čištění, kdežto v případě použití tohoto postupu v některém následujícím stupni je výhodná koncentrace této látky 20 až 100 mM, nej výhodnější je koncentrace 100 mM.

Svrchu uvedená „sloučenina, obsahující l-hydroxy-2-aminoskupiny“, která tvoří hlavní složku prvního elučního pufru, může být jakákoliv sloučenina, která obsahuje uvedené funkční skupiny a může vytvořit vodný pufr se svrchu uvedeným rozmezím pH. Jako příklad takových sloučenin je možno uvést 2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol, který je uváděn také jako tris nebo tris(hydroxymethyl)aminoethan, dále bis(hydroxymethyl)aminoethan, N-(2-hydroxy-l,l-bis/40 hydroxymethylethyl/)glycin, uváděný také jako tricin a N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycin, uváděný také jako bicin. Tyto látky se s výhodou užívají v koncentraci 20 až 100 mM, přičemž v případě prvního stupně čištění se obvykle užívá koncentrace 50 mM. První eluční pufr se s výhodou upravuje na pH přibližně 8,5.

V případě použití v některém z následujících stupňů čištění je výhodné koncentrační rozmezí 20 až 150 mM, nejvýhodnější je koncentrace 100 mM. Také pro toto použití je v současné době výhodnou sloučeninou tris.

Výhodné podmínky eluce v případě použití chromatografie na matrici, obsahující fenyl50 boritanové skupiny jako druhého chromatografíckého stupně zahrnují použití elučního pufru, obsahujícího 100 mM tris a 100 mM sorbitolu.

S výhodou obsahují „druhý ekvilibrační pufr“ a „druhý eluční pufr“ svrchu uvedenou sloučeninu s obsahem 1-hydroxy, 2-aminoskupin jako svou hlavní složku. V těchto případech je výhodná 55 koncentrace uvedené látky 20 až 200 mM.

-4CZ 291770 B6

Pod pojmem „chaotropní činidlo“ se rozumí činidlo, které napomáhá přeměně bílkovinného materiálu na vhodnou sůl a tím i solubilizaci tohoto materiálu ve vodném prostředí, obecně v důsledku svých disociačních vlastností.

Jako příklady chaotropních činidel je možno uvést močovinu a její deriváty a také guanidin.

V případě použití chaotropního činidla se toto činidlo užívá v koncentračním rozmezí 2 až 8 M, s výhodou 4 až 6 M.

Akceptorem kyanátových skupin může být jakákoliv známá sloučenina, která je schopna rychle vázat ionty CNO“, které se mohou vytvořit při hydrolýze močoviny. Výhodným akceptorem kyanátových skupin je glycin. V případě jeho použití při provádění způsobu podle vynálezu se glycin s výhodou užívá v koncentraci 2 až 40 mM, zvláště 20 mM.

Pod pojmem „smáčedlo“ se rozumí jakákoliv známá látka, která snižuje povrchové napětí, to znamená síly, působící na povrchu kapalin s tendencí zmenšit jejich povrch. Výhodnými příklady smáčedel mohou být zvláště polyoxyethylensorbitanové deriváty mastných kyselin, známé pod obchodním názvem Tween, velmi výhodnou látkou pro toto použití je zejména Tween 20, to znamená polyoxyethylensorbitanmonolaurát. V případě svého použití se smáčedlo užije v koncentraci 0,01 až 0,1 %, s výhodou 0,01 % hmotnostních.

Svrchu uvedená aniontoměničová matrice, obsahující kvartémí amoniové funkční skupiny, může být jakákoliv běžně dodávaná matrice tohoto typu. Výhodné pro toto použití jsou matrice na bázi agarózy nebo celulózy, například na bázi mikrokrystalické celulózy nebo zesítěné agarózy. Zvláště výhodné jsou také ty matrice, které obsahují diethylaminoethylové, triethylaminomethylové nebo trimethylaminomethylové funkční skupiny.

Zvláště výhodnou aniontoměničovou matricí je zesítěná agaróza s trimethylaminomethylovými skupinami, která se běžně dodává například pod názvem Q-Sepharose (Pharmacia AB). Chromatografie s použitím takové matrice se s výhodou provádí na sloupci při teplotě místnosti.

V případě, že se do promývacího nebo elučního pufru přidává sůl, tak jak bylo svrchu uvedeno, je účelem tohoto přidání zvýšení iontové síly pufru, jak se to běžně provádí. K uvedenému účelu je proto možno použít kteroukoliv z běžně užívaných solí. Jednou z nejčastěji používaných solí je v tomto případě chlorid sodný.

Ultrafiltrační stupeň je možno uskutečnit běžným způsobem při použití systému s tangenciálním průtokem nebo systému, tvořeného komorou s míchaným obsahem. Použitou membránou je s výhodou polysulfonová membrána nebo membrána z regenerované celulózy, může jít o běžně dodávané typy membrán, například od Millipore lne. nebo Amicon lne. K provádění způsobu podle vynálezu jsou vhodné zvláště takové membrány, jimiž je možno oddělit sloučeniny od molekulové hmotnosti 10 000.

Ultrafiltrát se pak popřípadě podrobí diafíltraci, opět známým způsobem a s výhodou v tomtéž pufru, který se pak užije pro následnou filtraci na gelu. Jako pufr pro tuto filtraci na gelu je například možno použít vodný pufr o pH v rozmezí 6 až 8. Svrchu uvedená sůl je v tomto pufru přítomná s výhodou v rozmezí 100 až 200 mM a zvláště v množství 100 mM, pH se pohybuje v rozmezí 7,4 až 7,5.

K provádění tohoto stupně způsobu podle vynálezu je možno použít běžné matrice pro filtraci na gelu. Jako příklady těchto matric je možno uvést polydextrany, zesítěné působením akrylamidů, například hydrofilní gely s vysokou mechanickou pevností, připravené kovalentním zesítěním allyldextranu působením Ν,Ν'-methylenbisakrylamidu, použít je možno také gely na bázi zesítěné celulózy. Zesítěné dextranakrylamidové gely jsou běžně dodávány a jsou známé například pod obchodním názvem Sephacryl (Pharmacia AB). Výhodným gelem tohoto typu je

-5CZ 291770 B6

Sephacryl S-200 HR s průměrem částic 25 až 75 mikrometrů, jehož zesítění je řízeno tak, aby byly odděleny globulámí bílkoviny s molekulovou hmotností v rozmezí 5000 až 250 000.

Jako příklad zesítěných gelů na bázi celulózy je možno uvést běžně dodávané porézní gely ze zesítěné celulózy, například GLC 300 s průměrem částic v rozmezí 44 až 125 mikrometrů nebo GLC 1000 se středním průměrem částic 53 až 125 mikrometrů (Amicon, lne.).

Způsob podle vynálezu je zvláště vhodný k provádění ve velkém měřítku vzhledem k tomu, že je tvořen řadou postupů, které je snadno možno za sebou zařadit bez obvyklých nevýhod těchto stupňů.

Mimoto se při provádění způsobu podle vynálezu používá pouze vodných rozpouštědel, což přináší další výhodu, jak bude každému odborníku zcela zřejmé.

Mimoto je tímto způsobem možno postupovat od prvního chromatografíckého stupně, to znamená od stupně, prováděného na matrici s dihydroboritanovými skupinami do druhého chromatografíckého stupně s použitím aniontoměničové matrice přímým přenesením eluátu z prvního stupně do druhého stupně bez nutnosti výměny nebo úpravy rozpouštědla.

Tato skutečnost může usnadnit celý postup, avšak mimoto přispívá ke zvýšení celkového výtěžku.

Způsobem podle vynálezu je tedy možno izolovat produkt typu erytropoetinu s průměrnou specifickou účinností 145 000 až 175 000 jednotek ELISA/mg, přičemž se vychází ze zfíltrovaného živného prostředí s průměrnou specifickou účinností 500 až 2000 jednotek ELISA/mg.

Kombinace prvního a druhého chromatografíckého stupně mimoto dovoluje 60 až lOOnásobné čištění tohoto materiálu, přičemž pro úplný postup, provedený ve všech stupních je celkový faktor čištění výsledné látky 110 až 150.

V případě erytropoetinu je produkt, získaný na konci způsobu podle vynálezu, možno izolovat jako pevnou látku po odstranění solí a po lyoftlizaci běžným způsobem, nebo je možno uskutečnit v získaném roztoku výměnu rozpouštědla, například diafíltrací k získání roztoku, vhodného pro výrobu farmaceutických prostředků, například podle patentového spisu EP 430 200.

Praktické provedení vynálezu bude vysvětleno následujícími příklady, které však nemají v žádném případě sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Chromatografie na matrici s fenylboritanovými skupinami jako první stupeň čištění erytropoetinu

Supematant z kultury buněk, produkujících lidský erytropoetin, získaný například způsobem podle příkladu 21 mezinárodní patentové přihlášky WO 93/09 222 nebo podle mezinárodní patentové přihlášky WO 94/12 650 a obsahující přibližně 20 mg erytropoetinu se zfiltruje při použití běžně dodávaného prostředku, obsahujícího membránu s průměrem otvorů 1,2 a 0,5 mikrometrů (Opticap, Millipore lne.). Pak se materiál podrobí ultrafiltraci na běžně dodávaném prostředku, obsahujícím membránu z regenerované celulózy S1Y30 (Amicon lne.) a oddělující sloučeniny s molekulovou hmotností 30 000, pak se provádí diafiltrace při použití vody a 0,05M HEPES o pH 8,5, vodivost 2,5 mS/cm². Ultrafiltrát se nanese na chromatografický sloupec s obsahem nabobtnané agarózy s fenylboritanovými skupinami, užije se 120 ml agarózy

-6CZ 291770 B6

I

PBA 60 (Amicon lne.) v rovnovážném stavu s 0,05 M HEPES o pH 8,5 s obsahem 0,1 % Tween 20 (pufr A), sloupec se udržuje na teplotě 10 až 15 °C chlazením vodou. Rychlost průtoku se nastaví na 2 až 4 objemy sloupce, CV, za hodinu. Po promytí pufrem A až do stabilizace základní čáry podle optické hustoty OD při 280 nm se sloupec dále promývá při použití 0,05 M HEPES o pH 8,5 s obsahem 0,01 % Tween 20 a 0,05 M sorbitolu (pufr B). Eluce se provádí při použití 0,02 M glycinu a 0,01 % Tween 20 (pufr C) a materiál, který se vymývá v hlavním vrcholu při sledování OD při 280 nm izoluje, tento materiál má přibližně 4 až 5násobný objem sloupce, získá se ve výtěžku 70 až 80 % a produkt je v něm čištěn přibližně dvacetkrát. Materiál se pak přímo nanese na sloupec zesítěné agarózy s trimethylaminomethylovými skupinami jako aniontoměničové pryskyřice, užije se 25 ml nabobtnané pryskyřice Q-Sepharose FF, (Pharmacia AB) v rovnovážném stavu s 0,22 M tris o pH 8,5 s obsahem 0,01 % Tween 20 (pufr D). Po promytí pufrem D při stálé tychlosti průtoku až do stabilizace základní čáry se pak sloupec promývá tímtéž pufrem, který navíc obsahuje 0,05 M chloridu sodného (pufr E), k eluci se užije 0,02 M tris o pH 8,5 s obsahem 0,01 % Tween 20 a 0,15 M chloridu sodného (pufr F). Materiál z oblasti vrcholu při sledování OD při 280 nm se izoluje, výtěžek je přibližně 80 %. Materiál se pak koncentruje ultrafiltrací při použití komory s míchaným obsahem a membránou, schopnou oddělit sloučeniny od molekulové hmotnosti 10 000 (YM10, Amicon).

Koncentrovaný roztok se nanese na sloupec, obsahující gel zesítěného dextranu s akrylamidem Sephacryl S 200 (Pharmacia AB), v rovnovážném stavu 0,02 M Tris o pH 7,4 s obsahem 0,15 M NaCl (pufr G), sloupec se vymývá týmž pufrem. Odebírají se jednotlivé frakce, frakce s obsahem erytropoetinu (detekce zkouška ELISA) se spojí a koncentrují ultrafiltrací svrchu uvedeným způsobem.

Příklad 2

Chromatografie na materiálu s fenylboritanovými skupinami jako jeden z dalších stupňů při čištění erytropoetinu

Roztok částečně čištěného lidského erytropoetinu, získaného z produkčních buněk způsobem podle příkladu 21 mezinárodní patentové přihlášky WO 93/09 222 nebo podle WO 94/12 650 a obsahujícího přibližně 20 mg erytropoetinu se podrobí diafiltraci nebo dialýze proti vodě a 0,05 M HEPES o pH 8,5 s 0,15 M NaCl při vodivosti 18 mS/cm². Pak se materiál nanese na chromatografický sloupec agarózy s fenylboritanovými skupinami, užije se 120 ml nabobtnané pryskyřice PBA 30 (Amicon lne.) v rovnovážném stavu v 0,05 M HEPES o pH 8,5 s obsahem 0,15 M NaCl (pufr A'), sloupec se udržuje na teplotě 10 až 15 °C chlazením vodou. Rychlost průtoku se upraví na 2 až 4 objemy sloupce CV za hodinu. Sloupec se promývá pufrem A' až do stabilizace základní čáry při optické hustotě OD při 280 nm. K eluci se užije 0,10 M Tris o pH 8,5 s obsahem 0,1 M sorbitolu (pufr B'), materiál, který tvoří obsah vrcholu při OD při 280 nm se oddělí, objem tohoto materiálu je přibližně 4 až 5 CV, výtěžek je přibližně 90 %.

Analytické postupy

ELISA

Specifická účinnost erytropoetinu, získaného způsobem podle vynálezu se měří metodou ELISA pro lidský eiytropoetin EPO. Postup je známý a zkušební balíček se běžně dodává pod obchodním názvem QUANTIKINE IVD (R and D Systems).

Analýza bílkovin

Zkoušky na bílkovinu se provádějí při použití zkušebního balíčku BCA protein Assay (Pierce Chemical Co.). Jde o postup, který kombinuje biuretovou reakci (redukce bílkovin pomocí

-7CZ 291770 B6

Cu²⁺ na Cu^l+ v alkalickém prostředí) s vysoce specifickou reakcí kyseliny bicinchonové BCA na Cu^,+.

Specifická účinnost

Specifickou účinnost jednotlivých vzorkuje možno vypočítat podle následující rovnice:

Specifická účinnost = počet jednotek erytropoetinu při zkoušce ELISA/mg bílkoviny při BCA.

Čištěný erytropoetin má specifickou účinnost přibližně 200 000 jednotek ELISA/mg bílkoviny při BCA. Specifická účinnost, zjištěná při zkoušce ELISA je pouze nepřímo spojena se skutečnou biologickou účinností erytropoetinu. Z tohoto důvodu se obvykle provádí ke stanovení specifické účinnosti in vivo biologická zkouška, která je v oboru dobře známa a kníž se užívají polycytemické myši, které prodělaly období sníženého zásobení kyslíkem. Tímto způsobem je možno zjistit specifickou účinnost vzorku a vyjádřit ji v mezinárodních jednotkách/mg bílkoviny, jak je v oboru běžné.

Analýza HPLC

Zařízení: Systém Waters 616 LC, opatřený detektorem PDA model 996.

Sloupec: Vydac pro bílkoviny, C₄, 3 mikrometry, 4,6 x 250 mm.

Mobilní fáze: A) 0,1% vodná kyselina trifluoroctová a acetonitril 95 : 5, B) 0,1% vodná kyselina trifluoroctová a acetonitril 5 : 95.

Gradient: min (%B): 5 (5), 50 (95).

Rychlost průtoku: 1 ml/min.

Analýza SDS-PAGE

Analýza SDS-PAGE se provádí na Phas Systém (Pharmacia AB), denzitometrická měření se provádějí na průtokovém denzitometru Flying spot CS-9301 PC (Shimadzu Co), podle návodu výrobce běžným způsobem.

Analytické údaje a výsledky

Při hodnocení produktu, získaného z řady zkoušek se specifická účinnost erytropoetinu v supernatantu buněčné kultury pohybovala v rozmezí 500 až 2000 jednotek ELISA/mg. Specifická účinnost erytropoetinu po prvním chromatografickém stupni se pohybovala v rozmezí 35 000 až 95 000 jednotek ELISA/mg. Specifická účinnost erytropoetinu na konci čištění podle příkladu 1 se pohybovala průměrně v rozmezí 145 000 až 175 000 jednotek ELISA/mg.

Podle výsledků analýzy HPLC a podle SDS-PAGE tak, jak bylo svrchu uvedeno, je možno prokázat, že erytropoetin tvořil na konci postupu více než 92 % plochy pod křivkou AUC.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob čištění biologicky aktivního erytropoetinu, vyznačující se tím, že se

a) zfiltrované živné prostředí s obsahem erytropoetinu, upravené na pH 7,5 až 9,0, uvede do styku s chromatografickou matricí s dihydroxyboronylovými skupinami, předem uvedenou do rovnovážného stavu s prvním ekvilibračním pufrem, kterým je vodný pufr s koncentrací 25 až 100 mM, s iontovou sílou 2 až 20 mS/cm² a pH v rozmezí 7,5 až 9,0,

b) matrice se promyje prvním elučním pufrem, kterým je vodný pufr o pH 7,5 až 11, obsahující sloučeninu s l-hydroxy-2-aminoskupinami v koncentraci 20 až 200 mM a 10 až 100 mM sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností, obsahující 1,2-cis-diolové skupiny, eluát se uvede do styku s aniontoměničovou matricí s obsahem kvartémích amoniových funkčních skupin v rovnovážném stavu s druhým ekvilibračním pufrem, kterým je vodný pufr o pH 7,5 až 11,0, obsahující 0,01 až 0,1 % hmotnostních smáčedla a

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se po eluci ve stupni c) před oddělením erytropoetinu

e) popřípadě se provede diafiltrace k výměně prvního elučního pufru za pufr, vhodný pro následující stupeň a

f) provede se filtrace na gelu při použití pryskyřice, oddělující materiály s molekulovou hmotností 5000 až 250 000, jako je dextranakrylamid nebo celulóza.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, v y z n a č u j í c í se t í m , že se po stupni a) matrice promyje prvním ekvilibračním pufrem a pak tímtéž pufrem s obsahem 10 až 100 mM sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností, obsahující 1,2-cis-diolové skupiny, a po stupni b) se

4. Způsob podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že se ultrafiltrace ve stupni d) provádí při použití membrány, oddělující sloučeniny s molekulovou hmotností 5000 až 10 000.

5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že se eluce ve stupni b) provádí v přítomnosti 2 až 8 M chaotropního činidla, 2 až 40 M akceptoru kyanátových skupin a 0,02 až 0,1 % hmotnostních smáčedla.

-9CZ 291770 B6

6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že se jako chromatografický materiál s dihydroxyboronylovými skupinami použije agaróza s fenylboritanovými skupinami.

5

7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že se první ekvilibračni pufr voli ze skupiny glycin, fosfát, trialkylamoniumhydrogenuhličitan a kyselina 4(2-hydroxyethyl)-l-piperazinethansulfonová.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se jako první ekvilibračni pufr ío užije kyselina 4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazinethansulfonová v koncentraci 0,05 M.

9. Způsob podle některého z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, žepH prvního ekvilibračního pufru má hodnotu 8,5.

15

10. Způsob podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že se sloučenina s nízkou molekulovou hmotností s obsahem 1,2-cis-diolových skupin volí ze skupiny polyolů s nízkou molekulovou hmotností a přímým řetězcem, jako jsou sorbitol, mannitol, adonitol, arabitol, glycerol, erythritol a cis-inositol a z monosacharidů s uzavřeným řetězcem, jako jsou ribóza a manóza.

11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím., že se jako sloučenina snízkou molekulovou hmotností s obsahem 1,2-cis-diolových skupin užije sorbitol.

12. Způsob podle nároku 10 nebo 11,vyznačující se tím, že se sloučenina s nízkou 25 molekulovou hmotností s obsahem 1,2-cis-diolových skupin užije v koncentraci 0,05 M.

13. Způsob podle některého z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že druhý ekvilibrační pufr obsahuje sloučeninu s obsahem l-hydroxy-2-aminoskupin v koncentraci 0,02 až 0,2 M.

14. Způsob podle některého z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že druhý eluční pufr obsahuje sloučeninu s obsahem 1-hydroxy, 2-aminoskupin v koncentraci 0,05 M.

15. Způsob podle některého z nároků 1 až 14, v y z n a č u j i c í se t í m, že se sloučenina

35 s obsahem l-hydroxy-2-aminoskupin volí ze skupiny, zahrnující 2-amino-2-hydroxymethyl1,3-propandiol, bis(hydroxymethyl)aminoethan, N-/2-hydroxy-l,l-bis(hydroxymethylethyl)/glycin a N,N-bis(-2-hydroxyethyl)glycin.

16. Způsob podle některého z nároků 5ažl 5, vyznačující se tím, že se chaotropní 40 činidlo volí z močoviny, derivátu močoviny a guanidinu.

17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že se jako chaotropní činidlo užije 6 M močovina.

45

18. Způsob podle některého z nároků 5 až 17,vyznačující se tím, že se jako akceptor kyanátových skupin užije glycin.

19. Způsob podle některého z nároků 1 až 18, vyznačující se tím, že se aniontoměničová pryskyřice, nesoucí kvartémí amoniové funkční skupiny, volí ze skupiny, zahrnující 50 mikrokrystalickou celulózu nebo zesítěnou agarózovou matrici, nesoucí diethylaminoethylové, triethylaminomethylové nebo trimethylaminomethylové funkční skupiny.

-10CZ 291770 B6

I

20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se t í m, že se jako aniontoměničová matrice užije trimethylaminomethylagaróza.

5 21. Způsob podle některého z nároků 2 až 20, v y z n a č u j í c í se tím, že se k filtraci na gelu užije zesítěný dextranakrylamidový gel s řízenou velikostí otvorů.