CN1181759A - 纯化诸如促红细胞生成素的糖蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从一种生物流体中回收具有生物活性的糖蛋白的简单而有效的方法。它包括一个硼酸苯酯色谱步骤而且特别适合于促红细胞生成素的纯化。

Description

纯化诸如促红细胞生成素的糖蛋白的方法
本发明涉及一种从含生物活性糖蛋白的生物流体中回收该糖蛋白的简单而有效的方法。
更具体地，本发明的方法适用于回收被高度糖基化了的蛋白质，即在其分子量中糖含量高于大约30％的糖蛋白和糖肽。
根据本发明的方法，可被方便地纯化的糖蛋白的一个特殊和优选的例子是促红细胞生成素。
从包括用基因工程方法处理的细胞的各种来源中制备促红细胞生成素已见于很多欧洲专利申请或专利，例如EP-148605，EP-205564，EP-209539，EP-267678，EP-649464和EP-672160。
这里所使用的名词“促红细胞生成素”或“促红细胞生成素产品”意图包括：天然产生的促红细胞生成素；从尿中提取的人类促红细胞生成素；以及具有天然产生的促红细胞生成素的氨基酸序列和充足的糖基复制能力的多肽，它具有在体内使骨髓细胞增加生产网织红细胞和红细胞的生物特性；还包括在向哺乳动物细胞中导入一个完整的促红细胞生成素编码基因后从哺乳动物细胞培养液中获得的促红细胞生成素，或者将内源促红细胞生成素基因激活后从哺乳动物细胞培养液中获得的促红细胞生成素，其中包括“基因被激活的”促红细胞生成素，它被描述于例如国际专利申请公开号WO 93/09222中，其提交号为PCT/US92/09627，也指定美国；或被描述于WO 94/12650，它要求USs.n.07/985,586的优先权，以上内容被并入本文作参考。
本发明的方法特别适合于回收存在于促红细胞生成素生产细胞培养液中的促红细胞生成素。
这里所使用的名词“培养液”优选地是指任何人工来源的液体，例如哺乳动物细胞-尤其是经过基因转化的哺乳动物细胞-的细胞培养液。
优选地，本申请中的“培养液”是指按照本领域的常规方法，通过过滤或超滤从细胞和细胞碎片中分离的培养液。另外，本公开中的名词“过滤的培养液”是指按照本领域的常规方法，通过过滤或超滤从细胞和细胞碎片中分离的培养液。
“生产细胞”优选是稳定化的或非稳定化的真核细胞系或哺乳动物来源的细胞系，通过在合适培养基中的培养，它能够以可回收的量生产所需要的糖蛋白。这些细胞中有代表性的例子包括：纤维细胞、角化细胞、上皮细胞(例如乳房上皮细胞、肠上皮细胞)、内皮细胞、胶质细胞、神经细胞、血形成因子(例如淋巴细胞、骨髓细胞)、肌细胞和这些体细胞的前体。上述这些细胞优选是来自哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、牛、鸟类、绵羊、山羊、马、猴、人)，最优选是来自灵长目动物和人类。特别地，“生产细胞”还包括来自脊椎动物-尤其是哺乳动物-的被转染了的原代、继代和无限增殖化的细胞，最优选是来自灵长目动物或人类的用外源性基因物质转染了的细胞，这些外源性基因物质能直接或间接地导致细胞产生可回收量的促红细胞生成素，它们被描述于诸如上述的国际专利申请公开号WO 93/09222或WO 94/12650中。
用于生产促红细胞生成素的无限增殖化的人类细胞系的例子是广为人知的和容易得到的，它们包括下述细胞，但又不仅限于这些细胞：海拉细胞和海拉细胞的衍生物(例如ATCC CCL2、2.1和2.2)、MCF-7乳癌细胞(例如ATCC HTB 22)、K-562血癌细胞(例如ATCC CCL 234)、KB癌细胞(例如ATCC CCL17)、2780 AD卵巢癌细胞，Van del Blick，A.M.et al.，Cacer Res，48：5927-5932(1988)、Raji细胞(ATCC CCL 86)、Jurkat细胞(ATCC TIB 152)、Namalwa细胞(ATCC CRL 1432)、HL-60细胞(ATCC CCL 240)、WiDr细胞(ATCC CCL 218)、HT 1080细胞(ATCC CCL 1219)、Daudi细胞(ATCC CCL213)、RPMI 8226细胞(ATCC CCL 155)、U-937细胞(ATCC CRL 1593)、Bowes Melanoma细胞(ATCC CRL9607)、WI-38VA13 subline 2RS细胞(ATCC CCL 75.1)以及MOLT-4细胞(ATCC CRL 1582)。继代人类纤维细胞系，例如WI-38(ATCC CCL 75)和MRC-5(ATCC CCL 171)也可被使用。
如上所述，本发明的方法适合于从任何上述的培养液和生产细胞中回收所需要的糖蛋白。
基因工程技术在大规模生产具有生物活性的蛋白质方面的广泛应用极大地增加了大量获取它们的可能性，以满足对它们的大量需求。然而在很多情况下，从培养液中将它们回收是困难的、麻烦的和昂贵的。当蛋白质象上面提到的那样是高度糖基化的时，情况尤其如此。正是由于这些原因，在本领域中对适合于大规模生产的简便和有效的回收方法的需求还继续存在。
当在本说明书中涉及到促红细胞生成素的比活时，所使用的测定方法为ELISA方法(例如本申请中提到的方法：人类促红细胞生成素ELISA方法，R&D系统，Inc.)，而样品中的蛋白质含量是通过BCA蛋白质分析测定的。在下面的标题为“分析方法”的内容中，对上述分析方法进行了更为详细的报道。
本发明的一个目的是在全部的纯化方法中提供一种合适的色谱分离步骤，它使用含有二羟硼基的色谱介质。由于该色谱步骤的有效性和通用性，它可以是多级步骤中的第一步或后继的步骤。如果第一步为色谱步骤，二羟硼基色谱优选与一个离子交换色谱步骤相耦合，在下面对其作更为详细的描述；如果色谱步骤为后继的步骤，它可以在多级步骤中的任一阶段使用。
这一多级步骤可适当地包括附加的许多色谱分离步骤，其中包括离子交换、筛析、疏水作用和亲和色谱分离步骤。
如果在多级步骤中色谱分离步骤是后继的步骤，在二羟硼基色谱中，优选将一种半纯化的物质加到预先平衡的含有二羟硼基的色谱介质之上。在被加到介质上之前，半纯化的物质也要用介质平衡缓冲液进行平衡。这种平衡缓冲液在这里被表示为“第一平衡缓冲液”，在下面有对其更为详细的定义。这一处理步骤特别适合于纯化促红细胞生成素。
本发明的一个目的是一种纯化方法，它包括：a)将含有待分离糖蛋白的过滤后的培养液与预先平衡的含有二羟硼基的色谱介质相接触，b)用第一洗脱缓冲液进行洗脱，并使该洗出液直接与含有季铵功能基团的阴离子交换介质相接触，c)用第二洗脱缓冲液将糖蛋白洗脱。
对本公开作了全面的阅读后就会明白，这些处理步骤可以对含在培养基中的糖蛋白进行几倍的纯化，因而它们在多级方法中被作为第一步纯化步骤而被有效地应用。
根据本发明的方法的一个优选的实施方案，对含有待分离糖蛋白的培养液进行如下步骤，其中包括：a)使过滤后的培养液与含有二羟硼基的色谱介质相接触，b)用第一洗脱缓冲液进行洗脱，并使该洗出液直接与含有季铵功能基团的阴离子交换介质相接触，c)用第二洗脱缓冲液洗脱，d)在截断分子量为5,000-30,000 D的膜上超滤，e)可选的渗滤步骤以将缓冲液转换为适合于下一步操作的那一种，以及f)在分离范围为5,000至250,000 D的分离树脂上进行凝胶过滤。
根据另一个优选的实施方案，本发明的方法包括：a)使pH被调节至7.5-9.0的过滤后的培养液与用第一平衡缓冲液平衡的含有二羟硼基的色谱介质相接触，上述平衡缓冲液是一种浓度为25-100mM的缓冲水溶液，其离子强度在2和20mS/cm2之间，pH在7.5和9.0之间。b)随后用第一平衡缓冲液冲洗，然后再用含有10至100mM的包含1，2-cys-二醇的低分子量物质的第一平衡缓冲液冲洗，c)用第一洗脱缓冲液洗脱，该缓冲液是一种pH在7.5和11.0之间的缓冲水溶液，它含有具有1-羟基、2-氨基的浓度为20-200mM的化合物，其中可能含有2至8M的离液剂，2-40mM的氰酸盐受体以及0.01％至0.1％(w/w)的表面活性剂，d)使洗出液与在第二平衡缓冲液中平衡的含有季铵功能基团的阴离子交换介质相接触，该第二平衡缓冲液是一种pH在7.5和11.0之间、含有0.01％至0.1％(w/w)的表面活性剂的缓冲水溶液，e)随后用第二平衡缓冲液以及含有附加的达50mM的盐的同样的缓冲液进行冲洗，f)用第二洗脱缓冲液洗脱，该缓冲液pH在7.5和11.0之间，含有0.01％至0.1％(w/w)的表面活性剂和150至350mM的盐，g)在截断分子量为5,000-30,000 D的膜上超滤，h)可选的渗滤步骤以将缓冲液转换为适合于下一步凝胶过滤的合适的缓冲液，以及i)在分离范围为5,000至250,000 D的分离树脂上进行凝胶过滤。
“含有二羟硼基的色谱介质”是指任何已知的含有硼酸化功能的色谱介质，其中硼原子与碳原子链牢固相连，最近的碳原子提供了足够的自由电子密度以维持在不同的使用条件下与硼原子的连接。最优选地，这个最近的碳原子是一个芳香族的碳原子，例如属于可能被取代的苯环的碳原子。在本发明的应用中特别优选的是所谓硼酸苯酯树脂。在美国专利4,562,251、4,778,888和4,269,605中对这些树脂的例子进行了报导，其内容被并入本文作参考。其中硼酸苯酯琼脂糖介质在目前是最优选的。目前这些介质可商购，例如从Amicon Inc或Grace Inc.，其商品名为MATREX GEL，它包括MATREX GEL PBA-10、PBA-30和PBA-60。目前最优选的用于第一步纯化步骤的硼酸苯酯琼脂糖是所出售的MATREX GEL PBA-60，其中m-氨基苯硼酸与琼脂糖共价结合，它是一种直径为50-150μm的球状珠，比例为60-100μM含硼酸/ml凝胶。然而对于后继的纯化步骤，诸如MATREX GEL PBA-30的硼酸苯酯琼脂糖介质是优选的，其中m-氨基苯硼酸与琼脂糖共价结合，它是一种直径为50-150μm的球状珠，比例为30-50μM含硼酸/ml凝胶。
目前这些色谱介质最优选是在柱色谱系统中使用，即使间歇式或其它的系统并不被完全排除在外。
当用在柱色谱系统中时，含有二羟硼基的色谱介质优选在室温下使用，优选为5至25℃，更优选为10至20℃，最优选的温度大约为15℃。
上述的“第一平衡缓冲液”优选地选自在指定浓度范围、离子强度和pH下的甘氨酸、磷酸、三烷基碳酸氢铵和4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)。这种第一平衡缓冲液的一个特别优选的浓度是大约50mM，特别优选的pH值大约是8.5，优选的电导率大约是2.5mS/cm2。无论在第一步还是在后继的纯化步骤中这些条件都是优选的。
上述的“含有1，2-cys-二醇的低分子量的物质”是任何已知的含有1，2-cys-二醇功能基团的低分子量化合物，即在相邻的碳原子上至少有两个羟基，它们可以维持或表现出一种平面或准平面构型。在任何情况下本技术领域所熟知的这些物质的具有代表性的例子是小分子开链多元醇，例如山梨醇、甘露醇、核糖醇、阿拉伯糖醇、甘油、赤藓醇和顺式-环己六醇，以及闭链单糖，例如核糖和甘露糖，目前山梨醇是最优选的。在第一个纯化步骤中，含有1，2-cys-二醇的低分子量物质特别优选在大约50mM的浓度下使用，而在后继的纯化步骤中，200-100mM的浓度在目前是优选的，100mM则是最优选的。
上述“具有1-羟基、2-氨基的化合物”是所谓的“第一洗脱缓冲液”的主要成分，它包括任何具有上述功能基团而且能够在上述的pH范围内形成一种缓冲水溶液的物质。这类物质的具有代表性的例子是：2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇，它也被称作TRIS或三(羟甲基)氨基乙烷；双(羟甲基)氨基乙烷；N-[2-羟基-1，1-双(羟甲基乙基)]甘氨酸，它也被称作tricine；以及N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸，它也被称作bicine。在第一个纯化步骤中，它们优选的使用浓度为大约20-100mM，而目前最优选的浓度约为50mM。优选地，将第一洗脱缓冲液的pH调节至大约8.5。
如果用于后继的纯化步骤，优选的浓度范围为20-150mM，而100mM是最优选的。而且在这一应用中TRIS是目前优选的。
当硼酸苯酯色谱被作为第二个色谱分离步骤时，优选的洗脱条件涉及洗脱缓冲液，它包括100mM的TRIS和100mM的山梨醇。
优选地，“第二平衡缓冲液”和“第二洗脱缓冲液”以上述所定义的含有1-羟基、2-氨基的化合物作为其主要成分。在这种情况下，其优选的浓度是在20和200mM之间。
“离液剂”是一种有助于蛋白质物质盐溶的试剂，因而能够在培养基水溶液中使蛋白质增溶，主要是由于其解离特性。
离液剂的具有代表性的例子是脲及其衍生物和胍。如果有离液剂存在，其使用浓度在2至8M之间，大约4-6M是优选的。
氰酸盐受体是任何已知的能与脲水解中所形成的CNO-离子很容易地结合的物质。甘氨酸是一种优选的氰酸盐受体。当将甘氨酸用于本发明的方法中时，它优选的使用浓度为2至40mM，最优选是大约20mM。
这里所使用的名词“表面活性剂”是指任何已知的能够降低表面张力-即作用在液体表面以使其表面积减少的力-的物质。优选的表面活性剂的例子是脂肪酸的聚氧乙烯山梨糖醇衍生物，它被称为“Tween”。目前“Tween 20”(即聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸酯)是优选的。如果有表面活性剂存在，其优选的使用浓度为大约0.01-0.1％(w/w)，目前最优选的是大约0.01％。
上述的含有季铵功能基团的阴离子交换介质是任何已知的具有上述功能基团的商品阴离子交换介质。优选用于本发明的方法中的是基于琼脂糖或纤维素的介质，例如纤维素微晶或交联的琼脂糖。含有二乙氨乙基、三乙氨甲基或三甲氨甲基功能基团的介质也是特别优选的。
一种特别优选的阴离子交换介质是三甲氨甲基交联的琼脂糖，它可商购，例如Q-Sepharose(Pharmacia AB)。使用这些介质的色谱步骤最优选是以柱色谱形式在室温下进行。
当按照上面的报道将一种盐加入冲洗或洗脱缓冲液中时，其目的是增加缓冲液的离子强度，这是本领域的一般作法。本技术领域一般使用的任何盐类都可被用于本发明方法的这一目的，NaCl是其中最为常用和便于使用的一种。
超滤步骤按照本技术领域的一般作法进行，使用切向流系统或搅拌槽系统。该膜优选是一种聚砜膜或再生纤维素膜，可从例如Millipore Inc.或Amicon Inc.购买其各种型号的商品。目前优选用于本发明方法的膜的截断分子量是10,000。
然后将超滤液按照本技术领域已知的方法进行渗滤，优选是在用于下一步凝胶过滤的同种缓冲液中进行。这种凝胶过滤缓冲液是一种pH为6至8的缓冲水溶液。在该缓冲液中盐的优选浓度是100至200mM，在更优选的条件下，盐浓度为100mM，pH为大约7.4-7.5。
传统的凝胶过滤介质可在这一处理步骤中很方便地使用。这些介质的有代表性的例子是用丙烯酰胺交联的聚葡聚糖，例如用N，N′-亚甲基双丙烯酰胺共价交联烯丙基葡聚糖而制备的具有高机械强度的复合亲水凝胶以及交联的纤维素凝胶。可作为商品购得的交联的葡聚糖-丙烯酰胺的商品名是SEPHACRYL，可从Pharmacia AB购得。一种优选的SEPHACRYL凝胶是SEPHACRYL S-200 HR，其球径为25-75μm，其交联度被控制在对球形蛋白质的分离范围为5,000-250,000 D。
交联的纤维素凝胶的例子是下述交联的多孔纤维素凝胶商品，例如GLC 300(平均粒径为44-125μm)或GLC1,000(平均粒径为53-125μm)，可从Amicon Inc购得。
本发明的方法特别适合于大规模的生产，因为它所包含的一系列步骤很容易被放大而且其中任何一步都没有大的缺点。
而且它只使用含水溶剂，这代表了一个更大的优点，因为本领域的技术人员认为这是有利的。
另外，它允许通过将洗出液直接从第一步转移到第二步而从它的第一个色谱步骤(即使用二羟硼基介质的那一步)转换到它的第二个色谱步骤(即使用阴离子交换介质的那一步)，这其中不需要任何的溶剂转换或调节。
除了使全部的操作更为容易外，本发明方法的这一特点还有助于提高回收率。
本发明的方法实际上能够从一种平均比活为500-2,000ELISA单位/mg的过滤后的细胞培养液中回收促红细胞生成素产品，其平均比活为145,000-175,000 ELISA单位/mg。
另外，组合的第一和第二步色谱分离步骤能够将初使的培养液纯化60-100倍，而整个方法的纯化因子为110-150倍。
对于促红细胞生成素来说，在本发明的最后步骤所回收的糖蛋白产品在按照本技术领域的一般方法除去盐和冻干后，可以以固体的形式被分离，或者通过诸如渗滤的方法对所获得的溶液进行溶剂置换以得到适合医药用途的溶液，例如描述于EP 430 200中的方法，其内容被并入本文作参考。
下述实施例只是说明性的，并不能视为限制本发明的范围。
实施例1
在促红细胞生成素纯化中作为第一个纯化步骤的苯基硼酸盐色谱
将按照WO 93/09222的实施例21或WO 94/12650中的描述获得的含有大约20mg促红细胞生成素的人促红细胞生成素生产细胞的培养物上清液在一个混合膜过滤器(1.2和0.5μm；Opticap，Millipore Inc)中过滤，然后在一个30,000D的再生纤维素螺旋过滤器SIY30(Amicon Inc)中超滤，再用水和0.05M的、pH8.5、电导率2.5mS/cm2的HEPES进行渗滤。将超滤液装入硼酸苯酯琼脂糖色谱柱(120ml膨胀的树脂；PBA 60，AmicoInc)中，该柱用含有0.01％Tween 20、pH8.5的0.05M的HEPES(缓冲液A)平衡，用水冷使其维持在大约10-15℃。将流速设置为大约2-4柱体积(CV)/小时。在用缓冲液A冲洗直至基线稳定后[280nm下的光密度值(OD)]，用含有0.01％Tween 20和0.05M山梨醇、pH8.5的0.05M的HEPES(缓冲液B)继续冲洗。用含有6M脲、0.02M甘氨酸和0.01％Tween 20、pH8.5的0.02M的TRIS(缓冲液C)进行洗脱，收集峰值(280nM时的OD)时的洗出液(大约4-5CV；产率70-80％，纯化因子大约为20倍)并将其直接装入三甲氨甲基交联的琼脂糖阴离子交换树脂(25ml膨胀的树脂；Q-Sepharose FF，Pharmacia AB)中，该树脂用含有0.01％Tween 20、pH8.5的0.02M TRIS(缓冲液D)平衡过。用缓冲液D以恒定的流速冲洗直至基线稳定后，再用还含有0.05M NaCl的缓冲液D(缓冲液E)冲洗，用含有0.01％Tween 20和0.15M NaCl、pH8.5的0.02M TRIS(缓冲液F)进行洗脱。收集峰值(OD 280nm)时的洗出液(回收率大约80％)，在一个膜的截流分子量为10,000D的搅拌槽(YM 10，Amico)中超滤浓缩。
将浓缩的溶液装入交联的葡聚糖-丙烯酰胺凝胶过滤柱(Sephacryl S 200；Pharmacia AB)中，该柱用含有0.15M NaCl、pH 7.4的0.02M TRIS(缓冲液G)平衡过，用同样的缓冲液进行洗脱。收集分离组分，其中含有促红细胞生成素产品(ELISA分析)的组分被收集后用上述的超滤方法浓缩。
实施例2在促红细胞生成素纯化中作为后继的纯化步骤的硼酸苯酯色谱
将含有大约20mg促红细胞生成素的半纯化的人促红细胞生成素溶液(来自按照WO 93/09222的实施例21或WO 94/12650中的描述而获得的生产细胞)用水和含有0.15M NaCl、pH8.5、电导率大约18mS/cm2的0.05M HEPES渗滤或透析，然后装入硼酸苯酯琼脂糖色谱柱(120ml膨胀的树脂；PBA 30，AmiconInc)中，该柱用含有0.15M NaCl、pH8.5的0.05M HEPES(缓冲液A′)平衡过，用水冷使其温度保持在大约10-15℃。将流速设置为大约2-4柱体积(CV)/小时。用缓冲液A′冲洗直至基线稳定[280nm下的光密度值(OD)]。用含有0.1M山梨醇、pH8.5的0.10M TRIS(缓冲液B′)进行洗脱，收集峰值(280nm下的OD)时的洗出液(大约4-5CV；产率为大约90％)。
分析方法ELISA：
根据上述本发明的方法获得的促红细胞生成素产品的比活可用Human EPO ELISA方法测定，该方法是已知的且商品名为QUANTIKINE IVD(R&D SYSTEMS Inc)。蛋白质分析：
蛋白质分析使用BCA Protein Assay Reagent方法(PierceChemical Co)，该法将双缩脲反应(在碱性溶液中将Cu2+蛋白质还原为Cu1+)与用于Cu1+的双辛可宁酸(BCA)的高度特异性反应结合了起来。比活：
样品的比活用下述公式计算：比活＝ELISA法测定的促红细胞生成素的总单位/用BCA分析测定的总蛋白质mg数。促红细胞生成素的纯化后的制剂的比活为大约200,000ELISA单位/mg用BCA分析测定的蛋白质。使用ELISA法确定的促红细胞生成素的比活与促红细胞生成素的实际生物活性只有间接的联系。通常用于测定体内比活的检测方法为本领域的技术人员所熟知的对缺氧性红细胞增多的小鼠的生物分析(如本领域的技术人员所知，该检测方法可以以IU/mg为单位测定比活)。HPLC分析：设备：Waters 616 LC System，装备有996型PDA检测器分离柱：Vydac protein C4，3μm，4.6×250mm流动相：A)0.1％的三氟乙酸水溶液∶乙腈，95∶5，B)0.1％的三氟乙酸水溶液∶乙腈，5∶95梯度：分钟(％B)：5(5)，50(95)流率：1ml/minSDS-PAGE分析：
SDS-PAGE分析在一台Phast System，Pharmacia AB上进行，密度的测定使用一台Flying Spot扫描密度测定仪(CS-9301PC，Shimadzu Co)，上述测定都是根据厂商的说明和本领域的一般知识进行的。
分析数据和结果
收集若干次测试的数据后，所得的结果如下：细胞上清液中的促红细胞生成素产品的比活范围为500-2,000 ELISA单位/mg；在经过第一个色谱步骤后所回收的促红细胞生成素产品的比活为大约35,000-95,000 ELISA单位/mg；在经过描述于实施例1中的最后步骤后所回收的促红细胞生成素产品的平均比活为大约145,000-175,000 ELISA单位/mg。
根据上述方法进行的HPLC分析和SDS-PAGE分析显示，在本方法的最后所回收的促红细胞生成素产品有一个主要的峰，它占了曲线下92％以上的面积(AUC)。

Claims (20)

1.一种用于纯化促红细胞生成素的方法，它包括下述步骤：a)将含有促红细胞生成素的半纯化的物质加到用第一平衡缓冲液预平衡的二羟硼基色谱介质上，b)用平衡缓冲液冲洗，c)用一种pH在7.5和11之间的缓冲水溶液洗脱，该缓冲水溶液含有具有1-羟基-2-氨基的化合物以及含有1，2-cys-二醇的低分子量物质。
2.一种用于纯化促红细胞生成素的方法，它包括：a)使含有待分离的具有生物活性的糖蛋白的过滤后的培养液与用第一平衡缓冲液预平衡的含有二羟硼基的色谱介质相接触，b)用第一洗脱缓冲液洗脱，并使该洗出液直接与含有季铵功能基团的阴离子交换介质相接触，c)用第二洗脱缓冲液洗脱糖蛋白并收集之。
3.一种用于纯化促红细胞生成素的方法，它包括：a)使含有待分离的糖蛋白的过滤后的培养液与用第一平衡缓冲液预平衡的含有二羟硼基的色谱载体相接触，b)用第一洗脱缓冲液洗脱，c)使该洗出液直接与含有季铵功能基团的阴离子交换介质相接触，d)用第二洗脱缓冲液洗脱，e)在截断分子量为5,000-25,000 D的膜上超滤，f)可选的渗滤步骤以将缓冲液转换为适合于下一步操作的那一种，以及g)在分离范围为5,000至250,000 D的分离树脂上进行凝胶过滤。
4.一种用于纯化促红细胞生成素的方法，它包括：a)使pH被调节至7.5-9.0的过滤后的培养液与用第一平衡缓冲液平衡的含有二羟硼基的色谱载体相接触，上述平衡缓冲液是一种浓度为25-100mM的缓冲水溶液，其离子强度在2和20mS/cm2之间，pH在7.5和9.0之间，b)随后用第一平衡缓冲液冲洗，然后再用含有10至100mM的包含1，2-cys-二醇的低分子量物质的第一平衡缓冲液冲洗，c)用第一洗脱缓冲液洗脱，该缓冲液是一种pH在7.5和11.0之间的缓冲水溶液，它含有具有1-羟基、2-氨基的浓度为20-200mM的化合物，其中可能含有2至8M的离液剂，2-40mM的氰酸盐受体以及0.02％至0.1％(w/w)的表面活性剂，d)使洗出液与在第二平衡缓冲液中平衡的含有季铵功能基团的阴离子交换介质相接触，第二平衡缓冲液是一种pH在7.5和11.0之间、含有0.01％至0.1％(w/w)的表面活性剂的缓冲水溶液，e)随后用第二平衡缓冲液以及含有附加的达50mM的盐的同样的缓冲液进行冲洗，f)用第二洗脱缓冲液洗脱，该缓冲液pH在7.5和11.0之间，含有0.01％至0.1％(w/w)的表面活性剂和150至350mM的盐，g)在截断分子量为5,000-30,000 D的膜上超滤，h)可选的渗滤步骤以将缓冲液转换为适合于下一步凝胶过滤的缓冲液，以及i)在分离范围为5,000至250,000 D的分离树脂上进行凝胶过滤。
5.根据权利要求1、2、3或4中的任一项的方法，其中含有二羟硼基的色谱载体是硼酸苯酯琼脂糖。
6.根据权利要求1、2、3或4中的任一项的方法，其中第一平衡缓冲液选自甘氨酸、磷酸盐、三烷基碳酸氢铵和4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸。
7.根据权利要求6的方法，其中第一平衡缓冲液是浓度大约为0.05M的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸。
8.根据权利要求1至7中的任一项的方法，其中第一平衡缓冲液的pH大约为8.5。
9.根据权利要求1或4至8中的任一项的方法，其中含有1，2-cys-二醇的低分子量物质选自小分子开链多元醇，例如山梨醇、甘露醇、核糖醇、阿拉伯糖醇、甘油、赤藓醇和顺式-环己六醇，以及闭链单糖，例如核糖和甘露糖。
10.根据权利要求9的方法，其中含有1，2-cys-二醇的低分子量物质是山梨醇。
11.根据权利要求9或10的方法，其中含有1，2-cys-二醇的低分子量物质的浓度大约为0.05M。
12.根据权利要求1或4至11中的任一项的方法，其中第二平衡缓冲液含有一种具有1-羟基、2-氨基的化合物，其浓度为0.02-0.2M。
13.根据权利要求1或4至11中的任一项的方法，其中第二洗脱缓冲液含有一种具有1-羟基、2-氨基的化合物，其浓度为0.05M。
14.根据权利要求4至13中的任一项的方法，其中具有1-羟基、2-氨基的化合物选自2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇、双(羟甲基)氨基乙烷、N-[2-羟基-1，1-双(羟甲基乙基)]甘氨酸以及N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸。
15.根据权利要求4至14中的任一项的方法，其中离液剂选自脲及其衍生物和胍。
16.根据权利要求15的方法，其中离液剂是6M的脲。
17.根据权利要求4至16中的任一项的方法，其中氰酸盐受体是甘氨酸。
18.根据权利要求3至17中的任一项的方法，其中含有季铵功能基团的阴离子交换介质选自纤维素微晶或含有二乙氨乙基、三乙氨甲基或三甲氨甲基功能基团的交联的琼脂糖介质。
19.根据权利要求18的方法，其中阴离子交换介质是三甲氨甲基琼脂糖。
20.根据权利要求3至19中的任一项的方法，其中凝胶过滤在控制孔径的交联的葡聚糖-丙烯酰胺凝胶介质上进行。
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