DE69935855T2 - Ortsspezifische proteinmodifizierung durch mutagenese - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Modifizierung von Proteinen. Insbesondere schließt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Koppeln von Polyethylenglykol mit Proteinen in einer Art und Weise ein, die die Vorteile, die mit Polyethylenglykol-verknüpften Proteinen verbunden sind, bietet, während eine gewünschte Proteinbioaktivität erhalten bleibt.
  • Beschreibung des zugehörigen Stands der Technik
  • Verfahren und Reagenzien für die chemische Modifizierung von Proteinen sind über Jahrzehnte umfangreich eingesetzt worden. Traditionell wurden proteinchemische Modifikationen durchgeführt, um ihre funktionalen Eigenschaften und strukturellen Merkmale zu untersuchen. Mit dem Aufkommen der rekombinanten DNA-Techniken und dem Interesse an Proteintherapeutika haben Wissenschaftler Proteine chemisch modifiziert, um ihre klinische Leistung zu verbessern. Insbesondere haben Verfahren zur Verknüpfung von Proteinen mit Polyethylenglykol innerhalb der pharmazeutischen und biochemischen Gemeinschaften eine weitverbreitete Verwendung erfahren, was das Ergebnis vielfältiger verbesserter pharmakologischer und biologischer Eigenschaften ist, die mit Proteinen zusammenhängen, die mit Polyethylenglykol verknüpft sind. Zum Beispiel sind mit Polyethylenglykol verknüpfte Proteine dafür bekannt, eine deutlich gesteigerte Plasmahalbwertszeit aufzuweisen, und haben somit die klinische Verwendbarkeit erheblich verbessert. Zusätzlich weisen Polyethylenglykol-verknüpfte Proteine im Allgemeinen eine verringerte Antigenität und Immunogenität auf, wodurch sie weniger dazu neigen, lebensbedrohende Anaphylaxien zu verursachen.
  • Ein anderer Vorteil, der mit Polyethylenglykol-verknüpften Proteinen verbunden ist, ist der der Wasserlöslichkeit, die als Ergebnis der hohen Wasserlöslichkeit des Polyethylenglykols gesteigert ist. Die erhöhte Wasserlöslichkeit kann die Proteinformulierungseigenschaften bei physiologischen pH-Werten verbessern und kann die Komplikationen verringern, die mit der Zusammenlagerung von gering löslichen Proteinen verbunden sind.
  • Darüber hinaus haben Polyethylenglykol-verknüpfte Proteine Verwendung bei bioindustriellen Anwendungen, wie beispielsweise Enzym-basierten Reaktionen, bei denen die Reaktionsumgebung für die Enzymaktivität nicht optimal ist, gefunden. Beispielsweise zeigen einige Polyethylenglykol-verknüpften Enzyme eine breitere optimale pH-Aktivität und eine verringerte optimale Aktivierungstemperatur. Darüber hinaus sind Enzyme, die eine verringerte Aktivität in vielen organischen Lösungsmitteln haben, erfolgreich mit Polyethylenglykol in einem Ausmaß verknüpft worden, das sie nützlich für das Katalysieren von Reaktionen in organischen Lösungsmitteln macht. Zum Beispiel ist Polyethylenglykol mit Meerrettichperoxidase verknüpft worden, die dadurch löslich und aktiv in Chloroform und Toluol wird (Urrotigoity et al., Biocatalysis, 2:145–149, 1989).
  • Polyethylenglykol-verknüpfte Proteine variieren in dem Ausmaß, in dem die Plasmazirkulations-Halbwertszeit gesteigert wird, die Immunogenität verringert wird, die Wasserlöslichkeit erhöht wird und die Enzymaktivität verbessert wird. Die Faktoren, die für diese Variationen verantwortlich sind, sind vielfältig und schließen das Ausmaß ein, mit dem das Protein mit Polyethylenglykol substituiert ist, die chemischen Reaktionen, die verwendet werden, um das Polyethylenglykol mit dem Protein zu verknüpfen und die Orte der Polyethylenglykolstellen in dem Protein.
  • Die am meisten gebräuchlichen Verfahren für die Anheftung von Polyethylenglykol an Proteine schließen die Aktivierung mindestens einer der Hydroxylgruppen des Polyethylenglykols mit einer funktionellen Gruppe ein, die empfänglich für einen nukleophilen Angriff durch ein Stickstoff von Aminogruppen des Proteins ist. Diese Verfahren führen im Allgemeinen zum Verlust der biologischen Aktivität als Folge der nicht-spezifischen Anheftung des Polyethylenglykols.
  • Alternative Ansätze zur Verknüpfung von Proteinen mit Polyethylenglykol schließen die Kontrolle der Verknüpfungsreaktionspartner und Bedingungen ein, so dass die Verknüpfungsstelle auf den N-Terminus beschränkt ist (Kinstler et al., Pharm Res. 13:996, 1996); die Anheftung von Polyethylenglykol an Protein-Kohlenhydrat funktionelle Gruppen (Urrotigoity et al., Biocatalysis, 2:145, 1989); die Anheftung von Polyethylenglykol an Proteincysteinreste (Goodson et al., Biotechnology 8:343, 1990); die Anheftung von Polyethylenglykol während der Festphasen- und Flüssigphasen-Peptidsynthese (Felix, ACS Symbposiom Serien 680 ch 16, 1997) und die selektive Ersetzung von Proteinargininresten mit Lysinresten, die eine Polyethylenglykolanheftungsstelle zur Verfügung stellen (Hersfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:7185, 1991). Während dies die Kontrolle der Reaktionsstelle zu einem gewissen Grad ermöglicht, gibt es einen anhaltenden Bedarf für verbesserte Verfahren zur Bereitstellung Polyethylenglykol-verknüpfter Proteine. Insbesondere würde es wünschenswert sein, Verfahren zur Verknüpfung mit Proteinen mit Polyethylenglykol bereitzustellen, die zu modifizierten Proteinen führen, die eine verbesserte Bioaktivität oder einen geringeren Verlust der Bioaktivität haben, während die Vorteile der Polyethylenglykolverknüpfung erhalten bleiben, einschließlich einer deutlich verringerten Immunogenität, gesteigerten Löslichkeit und verlän gerten Zirkulations-Halbwertszeiten Eigenschaft der modifizierten Proteine.
  • Pettit, Dean K. et al. (Polymer reprints, 1997, Band 38(1), 574–575) beschreiben ein Verfahren zur Pegylierung von Proteinen durch Binden der Proteine über einen Antikörper an eine Affinitätssäule.
  • WO 89/05824 beschreibt ein Verfahren zur Pegylierung von Proteinen, bei dem Lysinreste eines Polypeptids durch Depletion oder Substitution modifiziert werden und/oder eine andere Aminosäure in dem Polypeptid durch Lysin ersetzt wird, welches dann mit einem Polyalkylenglykol verknüpft wird.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein lösliches, mutiertes TNFR-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 6 ausgewählt wurde, und DNA-Sequenzen, die dieses kodieren, zur Verfügung.
  • Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren Verfahren zur Verknüpfung eines Proteins mit Polyethylenglykol zur Verfügung, wobei das Verfahren Schritte umfasst, bei denen man
    • ein lösliches, mutiertes TNFR-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 6 ausgewählt wurde, erzeugt; und
    • dieses Protein mit Polyethylenglykol unter Bedingungen umsetzt, die ausreichen, um Polyethylenglykol mit dem Protein zu verknüpfen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt Lysinreste innerhalb der extrazellulären Domäne des p75 TNF-Rezeptors, welche Polyethylenglykolverknüpfungsstellen sind und Lysinreste, die Kontakt mit TNFα herstellen.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung basieren auf der Erkenntnis, dass durch Entfernen einer oder mehrerer ausgewählter Aminosäurereste, die fähig zur Reaktion mit Polyethylenglykolstellen sind, und durch nachfolgende Verknüpfung des Proteins mit Polyethylenglykol, das erhaltene Polyethylenglykol-modifizierte Protein keine signifikante Reduzierung der gewünschten Aktivität zeigt. In einer Ausführungsform ist der ausgewählte Aminosäurerest ein Lysinrest, der, wenn er mit Polyethylenglykol reagiert, die Fähigkeit des resultierenden verknüpften Proteins stört, an seinen Bindungspartner, Substrat oder Rezeptor zu binden. Es wird angenommen, dass die ausgewählten Aminosäurereste mit Bindungsstellen in Verbindung stehen und, wenn sie modifiziert werden, die strukturellen Elemente des verknüpften Proteins, die die Proteinkonformation und Funktion festlegen, stören. Durch das Entfernen des ausgewählten Aminosäurerests, modifiziert das Polyethylenglykol das Protein an der Stelle des ausgewählten Aminosäurerests während einer nachfolgenden Polyethylenglykolmodifizierungsreaktion nicht. Vorzugsweise wird der entfernte Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest ersetzt, der nicht mit Polyethylenglykol unter den Reaktionsbedingungen reaktiv ist, um die Anzahl der Aminosäurereste zu bewahren und die optimale Proteinkonformation zu erhalten. Beispielsweise kann Lysin entfernt werden und durch einen Argininrest ersetzt werden. Arginin hat die selbe Struktur wie Lysin mit Ausnahme der Polyethylenglykolreaktiven ε-NH2-Funktionalität des Lysins, die in Arginin fehlt.
  • Aminosäurereste, die mit Polyethylenglykol unter Bedingungen, die im Stand der Technik bekannt sind, reaktiv sind, schließen solche ein, die Reste haben, die nukleophile Teile aufweisen, die für die Reaktion mit Polyethylenglykol oder einem aktivierten Polyethylenglykol zur Verfügung stehen. Zum Beispiel ist Lysin durch sein ε-NH2 mit Polyethylenglykol reaktiv; Asparaginsäure und Glutaminsäure sind durch ihre COOH (Carboxyl) Funktionalitäten mit Polyethylenglykol reaktiv; Serin und Threonin sind durch ihre OH (Hydroxy) Stellen potentiell reaktiv; und Cystein mit verfügbaren SH (Sulfhydryl) Gruppen könnte ebenfalls mit Polyethylenglykol reagieren. Die Bedingungen, die für die Reaktionen zwischen Polyethylenglykol oder aktivierten Polyethylenglykolen und spezifischen Aminosäureresten in Proteinen geeignet sind, sind bekannt und die Fachleute sind mit der Kenntnis solcher Reaktionen ausgestattet. Es ist im Stand der Technik bekannt, dass Lysinreste mit aktiviertem Polyethylenglykol unter günstigen Reaktionsbedingungen reagieren und das mit minimalen Nebenreaktionen. Somit sind in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung Lysinreste typischerweise der als Ziel verwendete Rest und die Reaktionsbedingungen werden so kontrolliert, dass die Reaktion zwischen Polyethylenglykol und Lysin maximiert wird.
  • Nach dem Exprimieren, Sammeln und Aufreinigen der konstruierten Proteine, die durch die mutierte DNA kodiert werden, können die exprimierten Proteine mit Polyethylenglykol zur Reaktion gebracht werden, um ein verknüpftes Protein zu bilden. Danach kann das verknüpfte Protein auf funktionale Aktivität und andere Eigenschaften, wie beispielsweise Immunogenität, physiologische Clearance und Löslichkeit getestet werden. Die Polyethylenglykol-verknüpften Proteine, die die gewünschte Ak tivität und günstigste Clearance-, Löslichkeits- und Immunogenitätseigenschaften haben, enthalten ebenfalls die gewünschten ausgewählten Lysinreste, d.h. die Reste, die entfernt und ersetzt wurden, bevor das Protein mit Polyethylenglykol zur Reaktion gebracht wird.
  • Proteine können durch jede einer Vielzahl von herkömmlichen Techniken erzeugt werden. Eine gewünschte DNA-Sequenz kann unter Verwendung von Techniken, die per se bekannt sind, chemisch synthetisiert werden. DNA-Fragmente können ebenfalls durch Restriktionsendonukleaseverdau einer Volllängen klonierten DNA-Sequenz hergestellt werden und durch Elektrophorese auf Agarosegelen isoliert werden. Verknüpfer, die Restriktionsendonukleasespaltungsstelle(n) enthalten, können eingesetzt werden, um das gewünschte DNA-Fragment in einen Expressionsvektor einzusetzen, oder das Fragment kann an Spaltungsstellen, die natürlicherweise darin enthalten sind, verdaut werden.
  • Ebenso stellt die vorliegende Erfindung Methoden zur Verhinderung der multimeren Assoziierung von Proteinen zur Verfügung. Beispielsweise kann Polyethylenglykol selektiv an Stellen verknüpft werden, die sich an oder in der Umgebung von multimeren Assoziierungsgrenzflächen befinden, wobei die Bindung des Proteins an seinen natürlichen Partner ("cognate") durch "Stellen-geschützte" Polyethylenglykolverknüpfung, wie hier gelehrt, erhalten bleibt, wodurch die Rezeptormultimerisierung verhindert wird.
  • Nach der Erzeugung eines Proteins der Erfindung wird das Protein mit Polyethylenglykol verknüpft. Reagenzien und Arbeitsschritte zur Bildung von Polyethylenglykolproteinkonjugaten sind im Stand der Technik per se bekannt und allgemein für die Durchführung der vorliegenden Erfindung anwendbar. Typischerweise schließen diese Arbeitsschritte als Erstes das Be reitstellen eines aktivierten Polyethylenglykols, in dem eine oder beide Hydroxylgruppen in einem Polyethylenglykol aktiviert sind, und die Umsetzung des aktivierten Polyethylenglykols mit aktiven Stellen in einem Protein, das für die Polyethylenglykolverknüpfung ausgewählt wurde, ein. Wie oben bereits ausgeführt wurde, basieren die am häufigsten eingesetzten Verfahren zur Verknüpfung eines Proteins mit Polyethylenglykol auf einer nukleophilen Reaktion zwischen Proteinaminostellen (dem ε-Aminstickstoff eines Lysins oder dem α-aminoterminalen Amin) und einem aktivierten Hydroxyl des Polyethylenglykols. Da Sulfhydrylgruppen ebenfalls Nukleophile sind, sind Cysteinsulfhydrylgruppen, die nicht Teil einer Disulfidbrücke sind, ebenfalls mögliche Reaktionsstellen in dem Protein. Die allgemeinen Prinzipien der Polyethylenglykolverknüpfung mit Proteinen und übliche aktivierende Reagenzien werden von Delgado et al. in „The Uses and Properties of PEG-Linked Proteins" aus Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9(3,4):249–304 (1992) und der ACS Symposium Serie 680 Herausgeber y Harris et al., Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications 1997, die beide hier als Referenz aufgenommen werden, beschrieben.
  • Aktivierte Formen von Polyethylenglykol und Monomethoxypolyethylenglykol sind kommerziell erhältlich und können in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Vor allem Shearwater Polymers, Inc. of Huntsville, AL stellt eine Anzahl von Polyethylenglykolpolymeren und Polyethylenglykolderivaten zur Verfügung. Der Shearwater Polymers, Inc. Katalog (Shearwater Polymers, Inc. Catalog Functionalized Biocompatible Polymers for Research, 1997–1998, der hier durch Referenz aufgenommen wird) beschreibt eine breite Vielzahl von aktivierten Polyethylenglykolen, die für die Verknüpfung mit Proteinen in einem breiten Bereich von Reaktionsbedingungen geeignet sind, und macht diese verfügbar. Dieser Katalog stellt zusätzlich bevorzugte Reaktionsbedingungen für ihre derivati sierten Polyethylenglykolreagenzien bereit. Die Fachleute, die auf die zahlreichen Reagenzien, die für die Verknüpfung von Proteinen mit Polyethylenglykol geeignet sind, aufmerksam gemacht worden sind, werden die Vielfalt der Reagenzauswahlen im Hinblick auf die Natur des ausgewählten Proteins, die Natur der reaktiven Aminogruppen oder Sulfhydrylgruppen des Proteins und der endgültigen Verwendung des verknüpften Proteins zu schätzen wissen. Zum Beispiel kann ein Succinimidylsuccinataktiviertes Polyethylenglykol (SS-PEG) bei der Verknüpfungsreaktion verwendet werden, um verknüpfte Proteine bereitzustellen, die eine verbesserte Löslichkeit, Aktivitätsmerkmale und Liefereigenschaften aufweisen, aber nicht notwendigerweise eine gesteigerte klinische Clearance Zeit zeigen. Die Esterverknüpfung mit dem Protein ist weniger stabil und wird in vivo hydrolysieren, wodurch das Polyethylenglykol von dem Protein freigesetzt wird. Aktivierte Polyethylenglykole sind verfügbar, die bevorzugter mit Aminogruppen im Vergleich zu Sulfhydrylgruppen reagieren und umgekehrt. Üblicherweise ausgewählte aktivierte Polyethylenglykole umfassen Succiniminidylcarbonataktivierte Polyethylenglykole, Succinimidylsuccinataktiviertes Polyethylenglykol und Succimidylpropionsäurepolyethylenglykole.
  • Als eine Alternative zur Auswahl kommerziell verfügbarer aktivierter Polyethylenglykole kann ein interessierendes Polyethylenglykol durch Verwendung von Reagenzien aktiviert werden, die mit Hydroxylfunktionalitäten reagieren, um eine Stelle zu bilden, die mit einer Stelle eines interessierenden Proteins reaktiv ist. Typischerweise ist die reaktive Stelle des Proteins eine Aminogruppe, aber es kann ebenfalls ein Sulfhydryl oder Hydroxyl sein, und das aktivierte Polyethylenglykol ist typischerweise ein aktiver Ester oder Imidazol (siehe Seiten 274–285 ibid.). Vorzugsweise ist nur eine Hydroxylfunktionalität des Polyethylenglykols aktiviert, was dadurch erreicht werden kann, dass ein Monomethoxypolyethylenglykol in der Ak tivierungsreaktion eingesetzt wird. Verfahren, bei denen zwei Hydroxyle aktiviert sind, liegen jedoch ebenfalls innerhalb des Anwendungsbereichs der vorliegenden Erfindung. Abhängig von der Natur der aktivierenden Gruppe und des nukleophilen Angriffs, kann der aktivierende Teil nach der nukleophilen Reaktion in das Protein eingebaut werden oder auch nicht.
  • Das Polyethylenglykol kann jedes Molekulargewicht aufweisen, aber ist vorzugsweise in dem Bereich von ungefähr 500 bis ungefähr 100 000 und mehr bevorzugt im Bereich von 2000 bis 20 000. Die Kriterien für die Auswahl eines speziellen Polyethylenglykolmolekulargewichts beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf das Molekulargewicht des Proteins, das für die Modifizierung ausgewählt wurde, die Ladung des Proteins, den Typ des Proteins und die Anzahl und der Ort der möglichen Stellen für die Verknüpfung. Immunologische und Plasmahalbwertszeit Eigenschaften der Proteine, die mit molekularen Polyethylenglykolen verschiedenen Molekulargewichts verknüpft werden, werden in Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9 249, 1992 und der ACS Symposium Serie 680, Harris et al., Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications 1997 diskutiert. Wie im Stand der Technik bekannt ist, gilt im Allgemeinen, dass je größer die Menge des Polyethylenglykols, die mit dem Protein verknüpft ist, desto länger die Plasmahalbwertszeit und desto größer die Proteinlöslichkeit. Da der Molekulargewichtsgrenzwert ("cut-off") für die glomeruläre Filtration bei ungefähr 70 kDa liegt, erfahren Proteine, die Molekulargewichte von weniger als 70 kDa haben, eine verlängerte Plasmahalbwertszeit. Für Proteine, die größer als 70 kDa sind, werden die Effekte des Polyethylenglykols und seines Molekulargewichts mit dem Clearance-Mechanismus variieren.
  • Allgemein führt die Verwendung eines Polyethylenglykols, das ein hohes Molekulargewicht hat, in den Verfahren der vor liegenden Erfindung zu verknüpften Proteinen, die mehr Polyethylenglykol pro Molekül des Proteins enthalten, als wenn Polyethylenglykol verwendet wird, das ein geringeres Molekulargewicht hat. Somit ist das Molekulargewicht des Polyethylenglykols vorzugsweise bis zu 20 000, wenn eine große Menge des Polyethylenglykols pro Proteinmolekül gewünscht ist. Polyethylenglykole mit kleinerem Molekulargewicht können jedoch aufgrund ihrer größeren Beweglichkeit in Lösung an mehr Stellen des Proteins verknüpfen, als ein höhermolekulares Protein. Somit kann es bevorzugt sein, ein Polyethylenglykol zu verwenden, das ein geringeres Molekulargewicht hat, wenn ein Protein eine Anzahl von gewünschten Verknüpfungsstellen aufweist, um sicherzustellen, dass eine optimale Anzahl der Stellen verknüpft wird. Dies kann ein besonders wünschenswerter Ansatz sein, wenn sich die potientiellen Verknüpfungsstellen oder Reaktionsstelle in dem Protein in enger Nachbarschaft zueinander befinden. Eine andere Überlegung, die bei der Auswahl eines Polyethylenglykolmolekulargewichts gemacht wird, ist, dass selbst wenn Proteine, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung behandelt werden, geschützte Stellen haben, Polyethylenglykole mit größerem Molekulargewicht so groß sein können, dass, wenn sie einmal verknüpft sind, ihre molekulare Größe dazu führt, ihren räumlichen oder sterischen Einfluss auszuweiten, so dass Bindungs- oder Rezeptorstellen eine verringerte Zugänglichkeit haben. Es liegt innerhalb des Wissens der Fachleute, ein optimales Polyethylenglykolmolekulargewicht für jedes ausgewählte Protein und die durch die Polyethylenglykolverknüpfung gewünschten Vorteile zu bestimmen.
  • Während die oben beschriebenen Polyethylenglykolverknüpfungsverfahren solche sind, bei denen das Ergebnis ein Polyethylenglykol ist, das über eine kovalente Bindung mit einem Protein verknüpft ist, liegt es ebenfalls im Bereich der vorliegenden Erfindung, Verfahren einzuschließen, bei denen die Verknüpfung über eine anders geartete Verbindung erfolgt. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung können Proteine durch Verknüpfung mit einem Polyethylenglykol unter Verwendung einer Auswahl verschiedener Kopplungs- oder Verknüpfungsmechanismen modifiziert werden. Zum Beispiel kann ein Protein, das für die Verknüpfung ausgewählt wurde, an einer Aminogruppe oder einer anderen geeigneten reaktiven Funktionalität mit einem polyA-Oligonukleotid derivatisiert werden und dann mit einem Polyethylenglykol, das mit einem polyT-Oligonukleotid derivatisiert ist, verknüpft werden. Ein anderer Ansatz schließt die Derivatisierung des Proteins mit einer Funktionalität ein, die einen bekannten spezifischen Bindungspartner aufweist und das Protein anschließend mit dem Polyethylenglykol verknüpft wird, welches mit dem Bindungspartner für die Funktionalität derivatisiert worden ist. Zum Beispiel kann ein Protein mit Biotin und das Polyethylenglykol mit Streptavidin oder Avidin (oder umgekehrt) derivatisiert werden. Dies führt zur spezifischen Bindung des Polyethylenglykols an solche Proteinstellen, die Biotin aufweisen. Eine Anzahl an Reagenzien zur Modifizierung von Proteinen für die Zwecke der Einfügung bestimmter Funktionalitäten sind kommerziell erhältlich. Zum Beispiel identifiziert und bietet der Pierce ImmunoTechnology Katalog Zugang zu einer Vielfalt an Reagenzien, die mit Proteinmodifikation im Zusammenhang stehen. Unter diesen befindet sich Traut's Reagenz und SATA (Pierce ImmunoTechnology Katalog, Band I, Seite E-14), welche aktive Gruppen an N-terminalen Aminen und Lysinaminofunktionalitäten einfügen können. Diese aktiven Gruppen bieten Stellen für das weitere Einfügen von Funktionalitäten zur spezifischeren Umsetzung mit Polyethylenglykol. Die Fachleute werden ebenfalls erkennen, dass ionische Interaktionen zwischen Polyethylenglykol und einem interessierenden Protein möglich sind. Zum Beispiel kann eine Verbindung zwischen einem ionischen Teil in dem Protein und seinem Gegenion in dem Polyethylenglykol verwendet werden, wenn die Verbindung ausreichend stark ist, um unter physiologischen Bedingungen verbunden zu bleiben.
  • Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, die zuvor modifizierte Proteine verwenden können, schließen solche Verfahren ein, bei denen das für die Verknüpfung ausgewählte Protein zu wenige potentielle Polyethylenglykolverknüpfungsstellen oder keine potentiellen Polyethylenglykolverknüpfungsstellen außerhalb der geschützten Aminosäureregion hat. Durch Modifizieren des ausgewählten Proteins, um Amino- und Sulfhydrylstellen in das Protein einzufügen, kann ausreichend Polyethylenglykol mit dem ausgewählten Protein verknüpft werden, um die gewünschten Vorteile zu erhalten. Die Modifizierung des ausgewählten Proteins kann durch Verwendung genetischer Konstruktionsmethoden oder chemischer Modifikation erreicht werden. Wie oben erwähnt wurde, sind Verfahren und Reagenzien für das Modifizieren von Proteinen, um eine große Vielfalt von gewünschten Ergebnissen zu erhalten, im Stand der Technik gut bekannt. Insbesondere stellt Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, 1993, das hiermit durch Referenz aufgenommen wird, Informationen bezüglich der Verknüpfungsreagenzien und Verfahrensbedingungen bereit.
  • Während Polyethylenglykol ein bevorzugtes Proteinverknüpfungsreagenz ist, sind eine Vielzahl zusätzlicher Polymermodifizierer verwendet worden, um Proteine zu modifizieren. Diese umfassen modifizierte Polyethylenglykole, verzweigte Polyethylenglykole, kreuzverknüpfte Polyethylenglykole.
  • Proteine, die gemäß den hier beschriebenen Verfahren modifiziert wurden, weisen Vorteile auf, die im Zusammenhang mit der Polyethylenglykolverknüpfung stehen, ohne den erwarteten signifikanten Verlust bei der Aktivität. Durch bloße Anwendung bekannter Testverfahren, um die Aktivität nach der Verknüpfung zu ermitteln, können die Vorteile für Proteine, die gemäß der vorliegenden Erfindung verknüpft wurden, gezeigt werden. Aktivitätstests sind spezifisch für das Protein und sollten gemäß dem interessierenden Protein ausgewählt werden. Viele Proteine haben mehr als eine Stelle, die mit einer oder mehr Aktivitäten in Zusammenhang stehen. Die Wahl der Aktivität für die Messung für solche Proteine hängt von der interessierenden Aktivität und der Stelle ab, die spezifisch für die Aminosäureentfernung und nachfolgende Verknüpfungsreaktion ausgewählt wurde. Zusätzlich zu der Auswertung von Polyethylenglykolverknüpften Proteinen auf ihre Aktivität, können sie auf das Ausmaß der Polyethylenglykolsubstitution, des Molekulargewichts, und die Stellen der Verknüpfung analysiert werden. Die Techniken für die Durchführung dieser analytischen Verfahren sind gut bekannt und einige werden bezüglich Polyethylenglykol-verknüpfter Proteine in Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9(3:4):285–291, 1992, beschrieben. Die Beispiele 4 bis 6 beschreiben beispielhafte Verfahren zur Charakterisierung Polyethylenglykol-verknüpfter Proteine.
  • Zusätzlich zur Bereitstellung von Verbindungen, die verbesserte Bioaktivitätseigenschaften aufweisen, stellen die Verfahren der vorliegenden Erfindung ein Polyethylenglykolverknüpftes Molekülprodukt zur Verfügung, das homogener ist und in höheren Ausbeuten vorliegt. Da die Verknüpfung nicht an Aminosäureresten stattfinden wird, die kritisch für die Bioaktivität des Moleküls sind, muss das Reaktionsprodukt nicht durch Ausschluss vielzähliger unerwünschter Produktfraktionen aufgereinigt werden. Da die Polyethylenglykolreaktion bis zum Abschluss durchgeführt werden kann und alle zur Verfügung stehenden Polyethylenglykolstellen vollständig umgesetzt werden können, ist das Endprodukt homogener als die Produkte des Standes der Technik, die unter Bedingungen hergestellt werden, welche die Reaktion an bestimmten Stellen bevorzugen.
  • Die folgenden Beispiele werden dargestellt, um eine detailliertere Beschreibung bestimmter Ausführungsformen der vorlie genden Erfindung zu geben und sind nicht dahingehend auszulegen, dass sie den Bereich der Erfindung beschränken.
  • BEISPIEL 1
  • Auswahl einer Proteinmodifizierungsstelle
  • Im folgenden wird ein Verfahren zur Identifizierung von Aminosäureresten des p75 TNF-Rezeptors zur Entfernung und Ersetzung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung beschrieben. Da die zu erwartenden Reaktionsbedingungen zur Modifizierung von Polyethylenglykol solche waren, die die Modifizierung der ε-Aminogruppe der Lysinreste und des N-terminalen Amins bevorzugen, waren die identifizierten Aminosäuren Lysinreste, die den Kontakt zwischen dem TNF-Rezeptor und dem Liganden in dem TNF-Rezeptor-Ligandenkomplex herstellen.
  • Der p75 TNF-Rezeptor stammt aus einer Familie strukturell homologer Rezeptoren, welche den p55 TNF-Rezeptor einschließt. TNFα und TNFβ (TNF-Liganden) konkurrieren um die Bindung an die p55 und p75 TNF-Rezeptoren. Die Röntgenkristallstruktur des Komplexes, die durch die extrazelluläre Domäne des humanen p55 TNF-Rezeptors und TNFβ gebildet wird, ist bestimmt worden (Banner et al. Cell 73:431, 1993, hiermit durch Referenz aufgenommen). Diese kristallographische Arbeit bestätigte, dass der Komplex des p55 TNF-Rezeptors und TNFβ drei p55 TNF-Rezeptormoleküle aufweist, die symmetrisch an ein TNFβ-Trimer gebunden sind. Die Studien zeigten weiter, dass der Rezeptor in einer Furche zwischen zwei benachbarten TNFβ-Untereinheiten bindet. Vorteilhafterweise stellt die Kristallstruktur des Komplexes ein Modell für die TNF-Rezeptorstruktur und Aktivierung zur Verfügung und kann verwendet werden, um Aminosäuredomänen innerhalb des Liganden und des Rezeptors zu identifizieren, die den Kontakt für den Komplex herstellen.
  • Ein Sequenzabgleich der p55 TNF-Rezeptoraminosäuresequenz und der p75 TNF-Rezeptoraminosäuresequenz zeigt, dass p75 TNF-Rezeptorreste K34, K42, K47, K108, K120 und K140 nah mit den p55 TNF-Rezeptorresten K32, Y40, G45, S108, L119 und T138 abgeglichen werden. (Siehe Banner et al. Cell 73:431, 1993). Basierend auf dieser Information des Sequenzabgleichs und einer molekularen Modellierung, die die räumlichen Positionen der Lysinreste des p75 TNF-Rezeptors darstellt, kann erkannt werden, dass zwei Lysinreste des p75-Rezeptors den Kontakt zwischen dem p75-Rezeptor und dem Liganden herstellen. Diese Lysinreste sind K108 und K120 (das Lysin an Position 108 und das Lysin an Position 120). 1 stellt eine Aminosäuresequenz der extrazellulären Domäne des p75 TNF-Rezeptors (ohne die Signalsequenz) zur Verfügung und zeigt die Lysinreste, die Polyethylenglykol-Verknüpfungsstellen sind und die Lysinreste, die den Kontakt mit TNFα herstellen. Somit wurden die Lysinreste an den Positionen 108 und 120 für die Entfernung und Ersetzung in Übereinstimmung mit dieser Erfindung ausgewählt.
  • BEISPIEL 2
  • Erzeugung von Wildtyp p75 TNF-Rezeptor und mutiertem p75 TNF-Rezeptor
  • Im Folgenden werden Verfahren zur Herstellung eines Wildtyp löslichen p75 TNF-Rezeptormoleküls (extrazelluläre Domäne des p75 TNF-Rezeptors) und drei mutierter, löslicher TNF-Rezeptormoleküle beschrieben. Der Wildtyp lösliche p75 TNF-Rezeptor hat die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen, die in SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 beschrieben sind. Die Wildtyp- und mutierten TNF-Rezeptormoleküle, die in den folgenden Experimenten verwendet wurden, waren die extrazellulären Domänen ohne die Signalpeptide.
  • Der lösliche p75 TNF-Rezeptor in der Form eines kovalent dimerisierten Fusionskonstrukts zweier extrazellulärer, Liganden-bindender Teile des humanen p75 TNF-Rezeptors, die durch einen IgG1Fc-Rest (TNFR:Fc) aneinander fusioniert wurden (hohler et al. J. Immunol. 151:1548–1561, 1993), wurde durch Exprimieren des Proteins in CHO-Zellen unter Verwendung des Dihydrofolatreduktase selektierbaren, vervielfältigbaren Markers erzeugt. Suspensionszellen wurden zentrifugiert und in serumfreiem Medium in einem kontrollierten Bioreaktor resuspendiert. Das Produkt wurde nach 7 Tagen gesammelt und das TNFR:Fc-Molekül wurde unter Verwendung einer Protein A-Affinitätschromatographie gefolgt von einem Ionenaustauschchromatographie-Schritt aufgereinigt.
  • Für jedes der drei mutierten, löslichen TNF-Rezeptormoleküle wurde ein spezifisches Lysin, K, entfernt und ein Arginin, R, wurde an derselben Position eingebaut. Genauer gesagt wurde das Lysin an Position 108 und/oder das Lysin an Position 120 individuell mutiert, so dass zwei einzelne Mutanten (K108R oder K120R) und eine Doppelmutante (K108R, K120R) erzeugt wurden, bei denen das K an Position 108 und/oder Position 120 durch ein R an derselben Position ersetzt wurde. SEQ ID NO: 1 stellt die Nukleotidsequenz der K108R-Mutante zur Verfügung und SEQ ID NO: 2 beschreibt die Aminosäuresequenz, die von SEQ ID NO: 1 kodiert wird. SEQ ID NO: 3 stellt die Nukleotidsequenz für die K120R-Mutante zur Verfügung und SEQ ID NO: 4 beschreibt die Aminosäuresequenzen, die von SEQ ID NO: 3 kodiert werden. SEQ ID NO: 5 stellt die Nukleotidsequenz für die K108R,K120R-Mutante zur Verfügung und SEQ ID NO: 6 beschreibt die Aminosäuresequenzen, die von SEQ ID NO: 5 kodiert werden.
  • Kurz gesagt wurden die Mutanten unter Verwendung von stellengerichteter Mutagenese von K108 und/oder K120 in dem humanen p75 TNF-Rezeptor unter Verwendung von PCR-Mutagenese des Sfr1-Not1-Fragments des hTNF-Rezeptors und Fc-Fusionsproteins (hTNFR:Fc) erzeugt. Die mutierten TNF-Rezeptorfragmente wurden im Leseraster mit einem humanen Fc-Fragment in dem Säugetierexpressionsvektor sf Haveo409 ligiert. Mehrere der erzeugten Klone wurden sequenziert, um zu bestätigen, dass die gewünschten Nukleinsäureaustausche in die Mutein-Nukleotidsequenzen eingebaut wurden.
  • Genauer gesagt wurde PCR-Mutagenese verwendet, um mutierte 430 Bp Sal/Sfr1-Fragmente zu erzeugen. Die PCR-Mutageneseverfahren verwendeten Wildtyp TNFR cDNA (SEQ ID NO: 7), die als Vorlage für die PCR-Reaktionen verwendet wurde. Die Oligonukleotidsequenzen, die in den PCR-Reaktionen verwendet wurden, um die drei mutierten Sall-Srf1-DNA-Fragmente zu erzeugen, waren wie folgt:
    Für die TNF-Rezeptor (K108R)-Mutante enthielt das 3'-Oligonukleotid eine A zu G Ersetzung an Position 389 und eine Srf1-Stelle an dem 3'-Ende. Für die TNF-Rezeptor (K120R)-Mutante enthielt das 3'-Oligonukleotid eine A zu G Ersetzung an Position 425 und eine Srf1-Stelle an dem 3'-Ende. Für die TNF-Rezeptor (K108R, K120R)-Mutante enthielt das Oligonukleotid eine A zu G Ersetzung an Position 389 und 425 und eine Srf1-Stelle an dem 3'-Ende. Das 5'-Oligonukleotid, das verwendet wurde, um mutierte PCR DNA-Fragmente zu erzeugen, hatte keine Nukleotidänderungen in den TNFR-kodierenden Nukleotiden und enthielt die 5' Sal1-Stelle.
  • Für die PCR-Reaktionen wurden das Boehringer Mannheim "Expand High Fidelity" PCR-Kit und Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Das PCR-Zyklus-Protokoll umfasste die folgenden Bedingungen: 94 °C für 2 Minuten; 94 °C für 30 Sekunden; 50 °C für 15 Sekunden; 72 °C für 1 Minute. 25 Reaktionszyklen.
  • Die DNA-Fragmente, die in den PCR-Reaktionen erzeugt wurden, wurden auf einem 1 Agarosegel aufgetrennt und die 430 Bp TNFR-Fragmente wurden unter Verwendung des „GeneClean"-Reagenzes von BIO101 isoliert. Die isolierten Fragmente wurden einem Restriktionsverdau mit Sal1 und Srf1 von NEB in "Universal Restriction Buffer" von Stratagene unterzogen. Die DNA wurde dann unter Verwendung des „GeneClean"-Reagenzes von BIO101 gereinigt.
  • Jedes der mutierten Sal1/Srf1 DNA 430-Fragmente, die oben erzeugt wurden (und dem 5'-Ende des TNF-Rezeptors entsprechen) wurden individuell mit dem 1065 Bp Srf1/Not1 DNA-Fragment, das dem 3'-TNF-Rezeptor entspricht und der humanen Fc cDNA und dem 7730 Bp Sal1/Not1 pDC409-Expression ligiert. 20 ng des pDC409-Vektors wurden für jede Ligationsreaktion verwendet und die TNF-Rezeptorfragmente waren in einer dreifach höheren molaren Konzentration vorhanden. Die Ligationsreaktion wurde in Boehringer Mannheim Ligationsmix mit 500 Einheiten des Ligaseenzyms bei Raumtemperatur für 3 Stunden durchgeführt.
  • Die Ligationsreaktionsmischungen wurden dialysiert und 1/10 der Reaktionsmischung wurde in E. coli DH10B-Zellen elektroporiert. 10 Kolonien jeder Konstruktion wurden in flüssiger Kultur angezogen und die Expressionsvektorkonstrukte wurden unter Verwendung von Restriktionsenzymanalyse bestätigt. Das TNF-Rezeptor-cDNA-Insert in einem Konstrukt von jeder der 3 Mutanten wurde durch Nukleotidsequenzierung analysiert, um die gewünschten Nukleotidmutationen zu bestätigen.
  • Die drei mutierten Fusions-cDNA-Konstrukte wurden in CV1/EBNA-Zellen transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden bei 37 °C für 7 Tage kultiviert und anschließend wurden konditionierte Medien dieser Zellen gewonnen und auf TNFR:Fc-Expression unter Verwendung eines Fc-ELISA-Assays untersucht. Die konditionierten Medien wurden ebenfalls auf TNF- Rezeptorbioaktivität unter Verwendung eines A375-Zellwachstumsbioassays, der auf der Messung der Inhibierung der TNF-Aktivität basiert, untersucht. Die 3 TNFR:Fc-Mutanten und das TNFR:Fc-Wildtypkonstrukt zeigten gleiche Expressionsniveaus der Rezeptormoleküle.
  • Um die mutierten TNF-Rezeptorproteine zu sammeln und aufzureinigen, wurden Überstände der transfizierten CV1/EBNA-Zellen 7 Tage nach der Transfektion gesammelt und durch Zentrifugation und Filtration durch einen 0,45 μm-Filter geklärt. Die Aufreinigung des gesammelten und filtrierten Wildtypproteins und der mutierten Proteine wurde unter Verwendung einer Protein-A-Affinitätschromatographie durchgeführt. Eine Protein-A-Sepharosesäule wurde verwendet, um den FC-Teil des Fusionsproteins einzufangen. Einmal gebunden wurde das Protein mit 3 Säulenvolumen einer 25 mM TRIS/140 mM NaCl-Lösung bei pH 7,4 gewaschen und mit 3 Säulenvolumen einer 50 mM Natriumacetat/100 mM NaCl-Lösung bei pH 4,0 eluiert. Jedes eluierte Fusionsprotein wurde gegen 20 mM Na2HPO4 bei pH 7,4 dialysiert und auf ungefähr 1 mg/ml verdünnt. Die gesammelten Endprodukte waren aufgereinigte, lösliche p75 TNFR:Fc-Mutanten, wie oben beschrieben. SEQ ID NO: 1 stellt die Nukleotidsequenz für die K108R-Mutante zur Verfügung und SEQ ID NO: 2 beschreibt die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 1 kodiert wird. SEQ ID NO: 3 stellt die Nukleotidsequenz für die K120R-Mutante zur Verfügung und SEQ ID NO: 4 beschreibt die Aminosäuresequenzen, die durch SEQ ID NO: 3 kodiert werden. SEQ ID NO: 5 stellt die Nukleotidsequenz für die K108R,K120R-Mutante zur Verfügung und SEQ ID NO: 6 beschreibt die Aminosäuresequenzen, die durch SEQ ID NO: 5 kodiert werden.
  • BEISPIEL 3
  • Verknüpfung der Wildtyp und mutierten p75 TNF:Fc-Rezeptoren mit Polyethylenglykol
  • Im Folgenden wird ein Verfahren für die Herstellung Polyethylenglykol-verknüpfter Wildtyp-TNFR:Fc-Moleküle und Polyethylenglykol-verknüpfter mutierter TNFR:Fc-Moleküle beschrieben. Für jede Polyethylenglykolverknüpfungsreaktion wurde eine Menge von einhundert Mikrogramm (100 μg) des Wildtyp TNFR:Fc oder mutierten TNFR:Fc, hergestellt in Beispiel 2, in 400 μl 50 mM Na2HPO4 bei pH 8,5 aufgelöst und erlaubt mit SPA-PEG 5000 bei verschiedenen molaren Verhältnissen von Polyethylenglykol zu Protein (berechnet als Anzahl der Lysinreste in TNFR:Fc) über Nacht bei 4 °C zu reagieren. Die molaren Verhältnisse von Protein zu Lysinresten waren 1:1 und 10:1. SPA-PEG ist ein 5000 MW Succinimidylcarbonat-aktiviertes Monomethoxypolyethylenglykol, das von Shearwater Polymers, Birmingham, AL, bezogen wurde. Den Protein- und Polyethylenglykollösungen wurden erlaubt, über Nacht bei 2 bis 8 °C zu reagieren.
  • Jedes der Polyethylenglykol-verknüpften TNFR:Fc-Moleküle wurde durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von SPA-Sepharose Fast Flow Harz (Pharmacia), das mit 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4 äquilibriert wurde, aufgereinigt. Polyethylenglykol-verknüpftes TNFR:Fc hat unter diesen Bedingungen an das Harz gebunden. Nicht-reagiertes Polyethylenglykol und Reaktionsnebenprodukte wurden mit 5 Säulenvolumen des Äquilibrierungspuffers von der Säule gespült. Das Polyethylenglykolverknüpfte TNFR:Fc wurde mit 5 Säulenvolumen 20 mM Natriumphosphat, 200 mM NaCl, pH 7,4 von der Säule eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden vereinigt und auf ungefähr 1 bis 5 mg/ml konzentriert.
  • Im Folgenden wird die Bezeichnung beschrieben, die jedem der TNFR:Fc-Moleküle, die mit Polyethylenglykol (PEG) durch das oben beschriebene Verfahren verknüpft wurden, gegeben wurde:
    • 1. PEG-TNFR:Fc(K108R,K120R)
    • 2. PEG-TNFR:Fc(K108R);
    • 3. PEG-TNFR:Fc(K120R);
    • 4. PEG-TNFR:Fc.
  • BEISPIEL 4
  • Charakterisierung des verknüpften TNFR:Fc
  • Im Folgenden wird die Charakterisierung der Polyethylenglykol-verknüpften Wildtyp und Polyethylenglykol-verknüpften mutierten TNFR:Fc-Moleküle, die in Beispiel 3 hergestellt wurden, und eine Kontrollcharakterisierung von unverknüpftem Wildtyp und mutierten TNFR:Fc-Molekülen, die in Beispiel 2 hergestellt wurden, beschrieben. Die Charakterisierungsanalysen schlossen SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, Größenausschlusschromatographie, ELISA und in vitro-Bioassay Tests ein.
  • SDS-PAGE-Gradientengele von 4 bis 20 Acrylamid (Novex, San Diego) wurden mit jeweils 1 μg Polyethylenglykolverknüpften mutierten TNFR:Fc-Molekülen und Polyethylenglykolverknüpften Wildtyp-TNFR:Fc gefahren. Die Gele wurden mit Novex-Schnellfärbung („Novex fast stain") gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt. Die Gradientengele zeigten, dass das Ausmaß der Polyethylenglykolverknüpfung für jedes der Polyethylenglykol-verknüpften mutierten TNFR:Fc-Moleküle und Polyethylenglykol-verknüpften Wildtyp-TNFR:Fc-Moleküle gleich war.
  • Eine Größenausschlusschromatographie wurde für jedes der Moleküle, die, wie in Beispiel 3 beschrieben wurde, mit Polyethylenglykol verknüpft waren, durchgeführt. Die Größenausschlusscharakterisierung wurde unter Verwendung eines Waters HPLC-Systems von Millipore Corp., Milford, MA durchgeführt, das mit einer 300 × 8 mm SEC-400 Biosilsäule von BioRad ausgestattet war. Die Probeninjektionsmengen waren 50 bis 100 μg und die mobile Phase war Phosphat-gepufferte Saline bei 1 ml/min. Die Ergebnisse bestätigten, dass die Polyethylenglykol-verknüpften Mutanten und die Polyethylenglykol-verknüpften Wildtyp-TNFR:Fc eine erhebliche Steigerung der Gesamtgröße aufwiesen. Genauer gesagt waren die Polyethylenglykolverknüpften Moleküle zwei- bis dreimal größer als die unverknüpften Moleküle, abhängig von dem Verhältnis des Polyethylenglykols zu Lysin, das in der Verknüpfungsreaktion verwendet wurde.
  • Die Polyethylenglykol-verknüpften mutierten TNFR:Fc-Moleküle, die Polyethylenglykol-verknüpften Wildtyp-TNFR:Fc-Moleküle und unverknüpfte Formen des TNFR:Fc wurden einem ELISA-Test unterzogen, welcher die Beschichtung von 96 Mulden-Mikrotiterplatten mit anti-IgG1-Fc monoklonalen Antikörpern umfaßte, wobei die Polyethylenglykol-modifizierten Moleküle auf die Mikrotiterplatten aufgebracht wurden und ihnen erlaubt wurde, an die anti-IgG1-Fc Antikörper zu binden. Ein sekundärer polyklonaler anti-TNFR Antikörper wurde verwendet, um die Menge der Polyethylenglykol-verknüpften Moleküle und die Menge des unverknüpften TNFR:Fc, die an die Platte gebunden hatten, nachzuweisen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten, dass die Polyethylenglykol-verknüpften mutierten TNFR:Fc und Polyethylenglykol-verknüpften Wildtyp-TNFR:Fc die Bindung mit den anti-IgG1-Fc und/oder anti-TNFR Antikörpern verringerten oder eliminierten. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Polyethylenglykolverknüpfung die Epitope abschirmt, die bei der Antikörperbindung aktiv sind.
  • BEISPIEL 5
  • Pharmakokinetiken der Wildtyp und mutierten TNFR:Fc-Moleküle
  • Im Folgenden werden Experimente beschrieben, die entwickelt wurden, um die Pharmakokinetiken der Wildtyp TNFR:Fc mit dem mutierten Polyethylenglykol-verknüpften TNFR:Fc Molekül K108R, K120R (das Lysin an Position 108 und 120 war durch Arginin ersetzt worden) zu vergleichen. Das mutierte Molekül ist mit einem Polyethylenglykol:Lysin Verhältnis von 10:1 verknüpft worden.
  • Gruppen von zwei 10–12 Wochen alten weiblichen Balb/c Mäusen wurden 10 μg des Wildtyp TNFR:Fc oder verknüpften mutierten TNFR:Fc in einem Gesamtvolumen von 100 μl intravenös injiziert. Nach der Injektion wurden die Mäuse getötet und Blutproben wurden nach 5 Minuten, 1 Stunde, 8 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden über eine Herzpunktion gesammelt. Plasmaproben wurden durch einen A375-Bioassay untersucht. Die Eliminierungs-Halbwertszeiten, t½, der Polyethylenglykolverknüpften Mutante und dem Wildtyp TNFR:Fc wurden bestimmt. Die Halbwertszeitwerte sind als t½ +/– S.E. dargestellt, wobei S.E. den Standardfehler bei der Anpassung der logarithmischen linearen Gerade an die Datenpunkte anzeigt. Der t½ des Wildtyp-TNFR:Fc wurde mit 16,5 +/– 1,0 Stunden bestimmt und der der Polyethylenglykol Mutante wurde mit 36,5 +/– 8,5 Stunden bestimmt.
  • Die Ergebnisse der oben angegeben Experimente zeigen, dass ein Polyethylenglykol-verknüpfter TNF-Rezeptor, der in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, eine signifikant erhöhte Zirkulations-Halbwertszeit verglichen mit einem TNF-Rezeptor, der nicht mit Polyethylenglykol verknüpft ist, aufweist.
  • BEISPIEL 6
  • Bioaktivität des Polyethylenglykol-verknüpften Wildtyp-TNFR:Fc und Polyethylenglykol-verknüpften mutierten TNFR:Fc
  • Die Bioaktivitäten der Polyethylenglykol-verknüpften TNFR:Fc-Moleküle, die in Beispiel 3 hergestellt wurden, wurden durch in vitro A375-Bioassays gemessen. Dieser Assay wird allgemein in Onozaki et al. J. Immunology 135:3962 (1985) und Nakai et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 154:1189 (1988) beschrieben. Der Bioassay basiert auf der inhibitorischen Antwort der A375 humanen malignen Melanom adhärenten Zelllinie auf TNFα. Lösliches TNFR:Fc kann die inhibitorische Aktivität des TNFα in einer Dosis-abhängigen Art spezifisch neutralisieren. Um den Bioassay durchzuführen, wurde eine 375-Zelllinie (ATCC CRL 1872) unter Verwendung einer Trypsin-EDTA-Lösung geerntet, um die Zellmonoschicht aus den Behältern zu entfernen. Die geernteten Zellen wurden mit einem Assaymedium aus Dulbeccos' modifiziertem Eagles Medium mit zugesetztem fötalem Rinderserum, nicht-essentiellen Aminosäuren und Natriumpyruvat (alles von GIBCO bezogen) gewaschen.
  • 96-Schalen Platten wurden mit seriellen Verdünnungen der Arbeitslösungen der Polyethylenglykol-verknüpften mutierten TNFR:Fc, die in Beispiel 3 beschrieben sind, vorbereitet. Dann wurden gleiche Mengen von TNFα (R & D System, Katalog Nr. #210-CA TF) in dem oben beschriebenen Assaymedium in die Schalen der 96 Schalenplatten gegeben, gefolgt von der Zugabe eines gleichen Volumens von ungefähr 4 × 105 geernteter Zellsuspension zu jeder Schale.
  • Die Platten wurden in einer Feuchtigkeitskammer bei 37 °C und 10 % CO2 platziert und den Zellen wurde erlaubt, für 72 Stunden zu inkubieren. Danach wurden die Platten aus der Kammer entnommen und die Zellen wurden mit PBS-Lösung gewaschen, geblottet und mit Ethylalkohol fixiert. Lebensfähige Zellen wurden durch Färbung der fixierten Zellen mit 0,1 % wässriger Kristallviolettlösung sichtbar gemacht. Nachdem die Platten mit Wasser gewaschen wurden und die Zellen geblottet wurden, wurde 2 % Natriumdeoxycholatlösung zu jeder Schale zu gegeben und die Schalen jeder Platte wurden auf die optische Dichte bei 570 nm auf einem Plattenleser unter Verwendung der Delta Soft Mikroplattenanalyse-Software ausgelesen. Standard-Bioaktivitätseinheiten wurden jeder Probe zugewiesen und so angepasst, dass die Konzentration des TNFR:Fc in den Schalen berücksichtigt wurde. Den Schalen, die Null-Proben enthielten, wurde eine Bioaktivität von Null zugewiesen.
  • Die Ergebnisse der A375 Bioassays zeigten die folgende Reihenfolge der Aktivität der Polyethylenglykol-verknüpften Moleküle.
    PEG-TNFR:Fc(K108R,K120R) > PEG-TNFR:Fc(K108R) » PEG-TNFR:Fc-(K120R) = PEG-TNFR:Fc (PEG ⇒ Polyethylenglykol-verknüpft)
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die Polyethylenglykolverknüpften TNFR:Fc-Moleküle eine signifikante biologische Aktivität, wie durch die in vitro-Verfahren bestimmt wurde, behalten. Da das TNFR:Fc Mutein PEG-TNFR:Fc(K108R), in dem das Lysin an Position 108 zu einem Arginin mutiert war, eine sehr viel größere Aktivität behält als das Mutein, in dem das Lysin an 120 zu Arginin mutiert ist, wird angenommen, dass das Polyethylenglykol, das an K108 verknüpft ist, die TNF-Bindung behindert. Wenn dieser Rest zu R108 mutiert ist, wird die Polyethylenverknüpfung an der 108-Position verhindert und verringert die TNF-Bindungsaktivität nicht signifikant.
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00270001
  • Figure 00280001
  • Figure 00290001
  • Figure 00300001
  • Figure 00310001
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  • Figure 00330001
  • Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Figure 00360001

Claims (6)

  1. Lösliches, mutiertes TNFR-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 6 ausgewählt wurde.
  2. DNA-Sequenz, die für ein mutiertes, lösliches TNFR-Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 6 ausgewählt wurde.
  3. Lösliches, mutiertes TNFR-Polypeptid gemäß Anspruch 1, wobei das Polypeptid mit Polyethylenglykol verknüpft ist.
  4. Verfahren zur Verknüpfung eines Proteins mit Polyethylenglykol, wobei das Verfahren Schritte umfasst, bei denen man ein modifiziertes p75TNFR gemäß Anspruch 1 erzeugt; und das Protein mit Polyethylenglykol unter Bedingungen umsetzt, die ausreichen, um Polyethylenglykol mit dem Protein zu verknüpfen.
  5. Verfahren zur Verknüpfung eines Proteins mit Polyethylenglykol gemäß Anspruch 4, bei dem man ein Polypeptid erzeugt, das die SEQ ID NO: 2 umfasst.
  6. Verfahren zur Verknüpfung eines Proteins mit Polyethylenglykol gemäß Anspruch 4, bei dem man ein Polypeptid erzeugt, das die SEQ ID NO: 6 umfasst.
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