DE69733950T2 - Methode zur reinigung eines erythrpoietinbindenden proteins - Google Patents

Methode zur reinigung eines erythrpoietinbindenden proteins Download PDF

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Der hämatologische Prozess, der zur Herstellung und Reifung von roten Blutzellen führt, befindet sich unter der Kontrolle von Erythropoietin (EPO)(zusammenfassend beschrieben in Krantz, S. B. (1991) Erythropoietin. Blood 77, 419–434), einem Glykoproteinhormon, das hauptsächlich in der Niere synthetisiert wird. Käuflich erhältliches menschliches EPO wird über rekombinante DNA-Techniken produziert und ist als rekombinantes menschliches EPO (rhEPO) bekannt. rhEPO weist eine molekulare Masse von ungefähr 36.000 Dalton auf, wie durch SDS-PAGE bestimmt. Die molekulare Masse des Proteinrückgrats ist 18.398 Dalton, was anzeigt, dass das gesamte Molekül stark glykosyliert ist. Die Kohlenwasserstoffreste sind für die in vivo biologische Aktivität wichtig.
  • Im Unterschied zu vielen anderen Wachstumsfaktoren hat die Spezifität von EPO für Erythroidzellen zu seiner Entwicklung als ein sicheres und effizientes therapeutisches Protein geführt. Die medizinischen Vorteile von EPO wurden bei der Behandlung von Anämie gut etabliert, die mit chronischem Nierenversagen, Krebschemotherapie und autologer Vor-Spende von Blut zusammenhängt. Aufgrund der chronischen Natur der EPO-Therapie wäre es wünschenswert, ein oral verabreichtes Molekül der „2. Generation" zu haben.
  • Ein Verständnis der strukturellen Basis der Interaktion von EPO mit seinem Rezeptor würde bei der Entwicklung von neuen Wirkstoffen, wie zum Beispiel eines oralen Anämiewirkstoffs helfen. Herkömmliche Verfahren der Wirkstoffauffindung werden durch rationale Design-Ansätze ergänzt, die versuchen, die Information über die strukturelle Basis von Rezeptor-Liganden Interaktionen zu verwenden, um molekulare Modelle zu entwickeln. Diese Modelle werden im Umkehrschluss dazu verwendet, um so Moleküle mit therapeutischem Potential aufzubauen. Die zwei Ansätze sind komplementär und beruhen auf der Möglichkeit, Information über die 3-dimensionale Struktur des therapeutischen Ziels zu erhalten. Die Möglichkeit, EPO und seinen Rezeptor herzustellen und den Effekt von strukturellen Veränderungen auf die Proteinfunktion zu ermitteln, stellt ein Mittel zum Testen von hypothetischen molekularen Modellen zur Verfügung und trägt zur Etablierung einer Struktur-Aktivitäts-Verwandtschaftsdatenbank für Wirkstoffaufbau bei.
  • Der biologische Effekt von EPO scheint teilweise durch die Interaktion mit einem Zellmembran-gebundenen Rezeptor vermittelt zu werden, der bereits kloniert wurde (Jones, S. S., D'Andrea, A. D., Haines, L. L., and Wong, G. G. (1990), Human erythropoietin receptor: Cloning, expression, and biological characterization, Blood 76, 31–35; Noguchi, C. T., Kyung, S. B., Chin, K., Wada, Y., Schecter, A. N. and Hankins, W. D. (1991) Cloning of the human erythropoietin receptor gene, Blood 78, 2548–2556; Maouche, L., Tournamile C., Hattab, C., Boffa, G., Carton J.-P. and Chretein, S. (1991) Cloning of the gene encoding the human erythropoietin receptor. Blood 78, 2557–2563). Augenblicklich besteht beträchtliches Interesse an der physikalischen Natur der Assoziierung von EPO mit dem EPO-Rezeptor (EPOR) und eine aufkommende Technik zur Analyse dieses Typs von Interaktion ist die Erzeugung von löslichen Rezeptoren, die auch als Hormon-bindende Proteine bezeichnet werden (Langer, J. A. (1990) Soluble ligand-binding fragments of polypeptide receptors in basic and applied research, Pharmaceutical Technology 14, 46–66). Dieses Verfahren schließt die genetische Erzeugung von geeigneten Expressionsvektoren ein, die für die extrazelluläre Domäne des Rezeptors kodieren und die anschließende Produktion und Reinigung des Proteins. Sobald in aktiver Form erhalten, sind diese löslichen Rezeptorfragmente in zahlreichen Testformaten brauchbar und weisen eine verbesserte Brauchbarkeit in biophysikalischen Studien, wie zum Beispiel NMR oder Röntgenkristallographie auf, da sie unter Bedingungen verwendet werden können, die frei von den Detergenzien sind, die dazu erforderlich sind, um membrangebundene Rezeptoren löslich zu machen. Einige Rezeptorfragmente dieses Typs, einschließlich IL-1 und IL-4 fungieren dabei, die biologischen Effekte des Hormons zu neutralisieren und scheinen therapeutisches Potential aufzuweisen (Maliszewski, C. R. and Fanslow, W. C. (1990) Soluble receptors for IL-1 and IL-4: Biological activity and therapeutic potential, Trends in Biotech 8, 324–329).
  • Frühere Berichte erläutern die Entwicklung von Systemen für die Produktion und Reinigung von menschlichen und Maus-EPO-bindenden Protein (EBP), wobei die Proteinexpression in eukaryontischen Zellen und Bakterien verwendet wurde, jedoch mit mäßigen Ausbeuten (Harris, K. W., Mitchell, R. A., and Winkleman, J. C. (1992) Ligand Binding Properties of the Human Erythropoietin Receptor Extracellular Domain Expressed in E. coli. J. Biol. Chem. 267, 15205–15209; Yet, M.-G and Jones, S. S. (1993) The Extracytoplasmic Domain of the Erythropoietin Receptor Forms a Monomeric Complex with Erythropoietin. Blood 82, 1713–1719; Nagao, N., Masuda, S., Abe, S., Ueda, M. and Sasaki, R. (1992) Production and ligand- binding characteristics of a soluble form of the murine erythropoietin receptor, Biochem. Biophys. Res. Comm. 188, 888–897).
  • Der Mechanismus der EPO-Rezeptoraktivierung wurde als auf der Dimerisierung von zwei EPO-Rezeptormolekülen beruhend vorgeschlagen, was zu anschließenden Schritten der Signaltransduktion führt (Watowich, S. S., Yohimura, A., Longmore, G. D., Hilton, D. J., Yoshimura, and Lodish, H. F., Homodimerization and constitutive activation of the erythropoietin receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences 89, 2140–2144 (1992)). Während der lösliche EPO-Rezeptor (Johnson, D. L., Middleton, S. A., Mc Mahon, F., Barbone, F., Kroon, D., Tsao, E., Lee, W. H., Mulcahy, L. S. and Jolliffe, L. K., Refolding, Purification and Characterization of Human Erythropoietin Binding Protein Produced in Escherichia coli, Protein Expression and Purification 7 104–113 (1996)) im Hinblick auf die Strukturbestimmung und die Einfachheit der Herstellung Vorteile aufweist, stellt er jedoch wahrscheinlicher weise kein vor-gebildetes Templat für die Rezeptordimerisierung dar. Bei der Suche nach Peptiden oder kleinen Molekülen, die möglicherweise an den EPO-Rezeptor binden und diesen aktivieren, ist ein solches vor-gebildetes Dimerisierungstemplat ein hochwertvolles Werkzeug für die Entdeckung, den Nachweis und die Beschreibung von Molekülen mit solcher Aktivität. Die Verwendung von Rezeptor-Ig Fusionsmolekülen stellt solche Template zur Verfügung und stellt in Abhängigkeit von dem Testformat Informationen über die Fähigkeit eines gegebenen Moleküls oder Verbindung zur Verfügung, um nichtproduktive sowie produktive Dimerisierungskomplexe nachzuweisen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Ein neues Verfahren zur Herstellung von hochreinem menschlichem EPO-bindenden Protein (EBP) aus Fermentationen von rekombinanten Wirtszellen wird hier beschrieben. Das beschriebene Verfahren der folgenden Erfindung stellt ein hochreines nicht-glykosyliertes EBP zur Verfügung, das die EPO-Rezeptor biologische Eigenschaft von EPO (Liganden) Bindung beibehält. Das hochreine EBP ist auch in einer großen Vielzahl von Wirkstoffauffindungstechniken brauchbar, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, den Aufbau, die Entdeckung und Herstellung von Ligandenmimetika, den Aufbau, die Entdeckung und Produktion von Inhibitoren der Ligandenbindung, den Aufbau, die Entdeckung und Herstellung von Agonisten, Antagonisten und anderen Modulatoren der Ligandenbindung und Herstellung von Kristallstrukturen, die die präzise Charakterisierung der EBP-Liganden Interaktionsstelle(n) ermöglichen. Die präzise Charakterisierung der EBP-Liganden Interaktionsstelle(n) ist auch für den Aufbau, die Entdeckung und die Herstellung von Ligandenmimetika, den Aufbau, die Entdeckung und die Herstellung von Inhibitoren der Ligandenbindung und den Aufbau, die Entdeckung und Herstellung von Agonisten, Antagonisten und anderen Modulatoren der Ligandenbindung brauchbar.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1. Der für die Expression von EBP in E. coli verwendete Plasmidvektor wird gezeigt.
  • 2 Panels A und B. Reduzierende (Panel A) und nicht-reduzierende (Panel B) 10–20% SDS-PAGE von Proben aus EBP-Expressionen und -Reinigungsstudien werden gezeigt.
  • 3, Panels A, B, C und D: Die Demonstration des Nachweises der „aktiven" Form von EBP wird gezeigt.
  • 4, Panels A, B, C und D: Die Demonstration von EBP-Reinheit und Aktivität nach Reinigung durch HIC und präparative Größen-Ausschlusschromatographie wird gezeigt.
  • 5, Panels A und B: Bestimmung von EPO-EBP-Komplex-Stöchiometrie durch C-4-Umkehrphasen HPLC wird gezeigt.
  • 6, Panels A und B: Equilibrium-EPO-Bindung an immobilisiertes EBP und Massenspektrumanalyse wird gezeigt.
  • 7, Panels A und B: Kompetition von EBP für die [125J] EPO-Bindung an zellassoziierte native EPO-Rezeptoren wird gezeigt.
  • 8, Panels A und B: Kreuzvernetzung von EBP-Proteinen, die durch verschiedene Peptidliganden dimerisiert wurden, wird durch SDS-Page unter nicht-reduzierenden Bedingungen (Panel A) und reduzierenden Bedingungen (Panel B) gezeigt.
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Erythropoietin-bindendem Protein (EBP) aus mikrobiellen Fermentationen. Das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung gereinigte EBP ist auch als ein Therapeutikum brauchbar, da es an Erythropoietin bindet, was das Erythropoietin für die Interaktion mit dem zellassoziierten Rezeptor nicht verfügbar macht.
  • Der Ausdruck EBP, wie hier verwendet, betrifft eine Form des EPO-Rezeptors, dem ein wesentlicher Teil der Membranankerdomäne und der cytoplasmatischen Domäne fehlt, der jedoch die Liganden-bindende Domäne und die Fähigkeit, Erythropoietin zu binden, beibehält. Der Ausdruck EBP-Ig, wie hier verwendet, betrifft ein rekombinant produziertes Fusionsprotein, umfassend eine Immunglobulin schwere Kette einschließlich der Gelenk-Region und EBP, eine Form des EPO-Rezeptors, dem ein wesentlicher Teil der Membranverankerungsdomäne und der cytoplasmatischen Domäne fehlt, die jedoch die Liganden-bindende Domäne und die Fähigkeit, Erythropoietin zu binden, beibehält. Der Ausdruck EPO-Mimetikum, wie hier verwendet, betrifft eine Verbindung, die an den EPO-Rezeptor bindet und zu anschließenden Schritten der EPO-Rezeptor-vermittelten Signaltransduktion führt.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist zur Verwendung mit mikrobiellen Fermentationen im Allgemeinen geeignet. Es ist dem Fachmann im Stand der Technik leicht ersichtlich, dass eine große Vielzahl von mikrobiellen Zellen zur Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Pilzzellen einschließlich Hefe und bakterielle Zellen, einschließlich E. coli. Eine bevorzugte mikrobielle Fermentation ist eine bakterielle Fermentation von Zellen, die das Plasmid enthalten, die für das EBP oder ein EBP-Fusionsprotein, das isoliert und gereinigt werden soll, kodieren. Eine bevorzugte bakterielle Fermentation ist eine Fermentation von E. coli, die das EBP oder ein EBP-Fusionsprotein, das isoliert und gereinigt werden soll, exprimieren. Es ist dem Fachmann im Stand der Technik leicht ersichtlich, dass bakterielle Fermentationen anders als E. coli-Fermentationen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Die mikrobielle Fermentation kann in jedem Flüssigmedium angezogen werden, das zum Wachstum der verwendeten Bakterien geeignet ist.
  • Das EBP, das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert und gereinigt werden soll, kann auch von jeder geeigneten EBP-kodierenden DNA-Sequenz exprimiert werden. Die EBP-kodierende DNA-Sequenz kann von einer DNA abgeleitet sein, die für einen EPO-Rezeptor kodiert, der selber von einer Zellinie oder einem Zelltyp abgeleitet ist, der einen EPO-Rezeptor exprimiert. Die EBP-kodierende DNA-Sequenz kann auf einer Vielzahl von Plasmiden enthalten sein, die eine hohe Kopienzahl pro Zelle oder eine niedrige Kopienzahl pro Zelle aufweisen können. Die Plasmide können auch in im wesentlichen jeglicher Größe vorliegen. Es ist dem Fachmann im Stand der Technik leicht ersichtlich, dass im wesentlichen jedes Plasmid, das die EBP-kodierende Sequenz enthält, das zur Expression des EBP in den rekombinanten Wirtszellen führt, im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
  • Die klonierte EBP-kodierende DNA, die durch die hier beschriebenen Verfahren erhalten wird, kann durch molekulares Klonieren in einen Expressionsvektor, der einen geeigneten Promotor und andere geeignete transkriptions-regulatorische Elemente enthält, rekombinant exprimiert werden und in prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen transferiert werden, um rekombinantes Protein herzustellen. Techniken für solche Manipulationen sind vollständig in Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Gold Spring Harbor Laboratory, Cold spring Harbor, New York, 1989) beschrieben und sind im Stand der Technik gut bekannt.
  • Expressionsvektoren sind hier definiert als DNA-Sequenzen, die für die Transkription von klonierten Kopien von Genen und die Translation von deren mRNAs in einem geeigneten Wirt erforderlich sind. Solche Vektoren können dazu verwendet werden, um eukaryontische Gene in einer Vielzahl von Wirten zu exprimieren, zum Beispiel Bakterien einschließlich E. coli, blaugrünen Algen, Pflanzenzellen, Insektenzellen, Pilzzellen einschließlich Hefezellen, und Tierzellen.
  • Spezifisch aufgebaute Vektoren ermöglichen das Hin- und Hertransferieren von DNA zwischen Wirten, wie zum Beispiel Bakterien-Hefe oder Bakterien-Tierzellen oder Bakterien-Pilzzellen oder Bakterien-Invertebraten Zellen. Ein geeignet aufgebauter Expressionsvektor sollte enthalten: einen Replikationsursprung für die autonome Replikation in Wirtszellen, selektierbare Marker, eine begrenzte Zahl von brauchbaren Restriktionsenzymstellen, ein Potential für hohe Kopienzahl und aktive Promotoren. Ein Promotor wird als eine DNA-Sequenz definiert, die die RNA-Polymerase steuert, an die DNA zu binden und die RNA-Synthese zu initiieren. Ein starker Promotor ist ein solcher, der eine Initiation von mRNA bei einer hohen Frequenz verursacht. Expressionsvektoren können einschließen, sind jedoch nicht begrenzt auf, Klonierungsvektoren, modifizierte Klonierungsvektoren, spezifisch aufgebaute Plasmide oder Viren.
  • Eine Vielzahl von bakteriellen Expressionsvektoren kann verwendet werden, um rekombinantes EBP in Bakterienzellen zu exprimieren.
  • Käuflich erhältliche bakterielle Expressionsvektoren, die für die rekombinante EBP-Expression geeignet sein können, schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, pET-Vektoren (Novagen), pRSET, pTrcHis und pTrxFus-Vektoren (Invotrogen), pQE-Vektoren (Qiagen), pFLAG-Vektoren (Eastman Kodak, International Biotechnologies Inc.), pPROEXTm–1 (Life Technologies, Inc.), pKK-Vektoren (Clonetech), pPL-Lambda (Pharmacia), und pCal-Vektoren (Stratagene).
  • Eine Vielzahl von Pilzzellexpressionsvektoren kann dazu verwendet werden, um rekombinantes EBP in Pilzzellen, wie zum Beispiel Hefe, zu exprimieren. Käuflich erhältliche Pilzzellexpressionsvektoren, die für die rekombinante EBP-Expression geeignet sein können, schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, pYES2 (Invitrogen), Pichia Expressionsvektoren (Invitrogen) und pYEUra3 (Clonetech).
  • Eine Vielzahl von Insektenzellexpressionsvektoren kann dazu verwendet werden, um rekombinantes EBP in Insektenzellen zu exprimieren. Käuflich erhältliche Insektenzellenexpressionsvektoren, die für die rekombinante Expression von EBP geeignet sein können, schließen ein, sind jedoch nicht begrenz auf, pBlueBacII (Invitrogen), pFastBac1 (Life Technologies, Inc.), pBacPAK-Vektoren (Clonetech) und pAc-Vektoren (Pharmingen).
  • Eine Vielzahl von Säugerexpressionsvektoren kann dazu verwendet werden, um rekombinantes EBP in Säugerzellen zu exprimieren. Käuflich erhältliche Säugerexpressionsvektoren, die zur Expression von rekombinantem EBP geeignet sein können, schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, pMAMneo (Clonetech), pcDNA3 (Invitrogen), pMclneo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12)(ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), IZD35 (ATCC 375565) und pee12 (Celltech). Zellinien, die von Säugerspezies abgeleitet sind, die zur Expression geeignet sein können und die käuflich erhältlich sind schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171), L-Zellen HEK-293 (ATCC CRL1573) und NS0 (ECACC85110503).
  • Die DNA, die für EBP kodiert, kann zur Expression in einer rekombinanten Wirtszelle in einen Expressionsvektor kloniert werden. Rekombinante Wirtszellen können prokaryontische oder eukaryontische sein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Bakterien, wie zum Beispiel E. coli, Pilzzellen wie zum Beispiel Hefe, Insektenzellen, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Drosophila und Seidenraupen-abgeleitete Zellinien und Säugerzellen und -Zellinien.
  • Der Expressionsvektor kann in die Wirtszellen über jede einer Vielzahl von Techniken, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Transformation, Transfektion, Protoplastenfusion, Lipofektion und Elektroporation eingeführt werden. Die Expressionsvektor-enthaltenen Zellen werden klonal vervielfältigt und individuell analysiert, um zu bestimmen, ob sie EBP-Protein produzieren. Die Identifizierung von EBP-exprimierenden Wirtszellklonen kann durch mehrere Mittel erfolgen, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, immunologische Reaktivität mit anti-EBP und die Anwesenheit von Wirtszell-assoziierter EBP-Aktivität. Ähnlich kann die Identifizierung von EBP-Fusionsprotein-exprimierenden Wirtszellklonen durch mehrere Mittel durchgeführt werden, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, immunologische Aktivität mit anti-EBP-Antikörpern und die Anwesenheit von Wirtszell-assoziierter EBP-Aktivität, sowie immunologischer Reaktivität mit Antikörpern, die für den nicht-EBP-Teil des Fusionsproteins spezifisch sind und andere Wirtszell-assoziierte Aletivitäten des nicht-EBP-Teils des Fusionsproteins.
  • Da der genetische Code degeneriert ist, kann mehr als ein Kodon verwendet werden, um für eine bestimme Aminosäure zu kodieren, und daher kann die Aminosäuresequenz durch jedes eines Sets von ähnlichen DNA-Oligonukleotiden kodiert werden. Nur ein Mitglied des Sets wird mit der EBP-Sequenz identisch sein, wird jedoch in der Lage sein, an EBP-DNA sogar in der Anwesenheit von DNA-Oligonukleotiden mit Fehlpaarungen unter geeigneten Bedingungen zu hybridisieren. Unter veränderten Bedingungen können die fehlgepaarten DNA-Oligonukleotide möglicherweise immer noch an die EBP-DNA hybridisieren, um eine Identifizierung und Isolierung von EBP-kodierender DNA zu ermöglichen.
  • Es ist bekannt, dass es eine wesentliche Menge von Redundanz in den verschiedenen Kodons gibt, die für spezifische Aminosäuren kodieren. Daher ist das Verfahren dieser Erfindung auch auf diejenigen EBP-kodierenden DNA-Sequenzen gerichtet, die alternative Kodons enthalten, die für die eventuelle Translation der identischen Aminosäure kodieren. Für die Zwe cke dieser Beschreibung wird eine Sequenz, die eines oder mehrere ersetzte Kodons trägt, als eine degenerierte Variation definiert. Auch eingeschlossen sind Mutationen, entweder in der DNA-Sequenz oder dem translatierten Protein, die die letztendlichen physikalischen Eigenschaften des exprimierten Proteins nicht wesentlich verändern. Zum Beispiel kann die Substitution von Valin für Leucin, Arginin für Lysin oder Asparagin für Glutamin keine Veränderung in der Funktionalität des Polypeptids hervorrufen. Zusätzlich kann die Veränderung von natürlich auftretenden Glykosylierungsstellen durch stellengerichtete Mutagenese unter der Verwendung von im Stand der Technik gut bekannten Techniken zur Produktion eines Proteins führen, das an einer bestimmten Stelle nicht länger glykosyliert ist. Es ist dem Fachmann im Stand der Technik leicht ersichtlich, dass ein auf solche Weise modifiziertes EBP eine EBP-Variante dieser Erfindung ist.
  • Es ist bekannt, dass DNA-Sequenzen, die für ein Peptid kodieren, so verändert werden können, um für ein Peptid zu kodieren, das Eigenschaften aufweist, die unterschiedlich sind als die des natürlich auftretenden Peptids. Verfahren zur Veränderung der DNA-Sequenzen schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, stellengerichtete Mutagenese. Beispiele von veränderten Eigenschaften schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, Veränderungen in der Affinität eines Enzyms für ein Substrat oder eines Rezeptors für einen Liganden.
  • Wie hier verwendet ist ein „funktionelles Derivat" von EBP ein Protein, das eine biologische Aktivität besitzt (entweder funktionell oder strukturell), die im wesentlichen ähnlich zu der EBP biologischen Aktivität der EPO-Bindung ist. Der Ausdruck „funktionelle Derivate" ist als die „Fragmente", „Varianten", „degenerierten Varianten", „Analoga" und „Homologe" oder „chemischen Derivate" von EBP einschließend gedacht. Der Ausdruck „Fragment" bedeutet, dass er sich auf jegliches Polypeptid Subset von EBP bezieht. Der Ausdruck „Variante" bedeutet, dass er sich auf ein Molekül bezieht, das im wesentlichen ähnlich in Struktur und Funktion zu entweder dem gesamten EBP-Molekül oder einem Fragment davon ist. Ein Molekül ist „im wesentlichen ähnlich" zu EBP, wenn beide Moleküle im wesentlichen ähnliche Strukturen aufweisen oder wenn beide Moleküle ähnliche biologische Aktivitäten aufweisen. Daher, wenn die Moleküle im wesentlichen ähnliche Aktivität besitzen, werden sie als Varianten betrachtet, auch wenn die Struktur von einem der Moleküle nicht in dem anderen gefunden wird oder sogar, wenn die zwei Aminosäuresequenzen nicht identisch sind. Der Ausdruck „Analogon" betrifft ein Molekül, das in seiner Funktion im wesentlichen ähnlich zu entweder dem gesamten EBP-Molekül oder einem Fragment davon ist.
  • Durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung gereinigtes EBP ist in einer großen Vielzahl von Wirkstoffentdeckungstechniken brauchbar, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, den Aufbau, die Entdeckung und Herstellung von Ligandenmimetika, den Aufbau, die Entdeckung und Herstellung von Inhibitoren der Ligandenbindung, den Aufbau, die Entdeckung und die Herstellung von Agonisten, Antagonisten und anderen Modulatoren der Ligandenbindung und die Produktion von Kristallstrukturen, die die präzise Charakterisierung der EBP-Ligandinteraktionsstelle(n) ermöglichen. Verbindungen, die EPO-Mimetika sind, können DNA, RNA, Peptide, Proteine oder nicht-proteinöse organische Moleküle sein.
  • Pharmazeutisch brauchbare Zusammensetzungen, die EBP enthalten, können gemäß bekannten Verfahren formuliert werden, wie zum Beispiel durch das Mischen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. Beispiele von solchen Trägern und Verfahren der Formulierung können in Remington's Pharmaceutical Sciences gefunden werden. Um eine pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzung zu bilden, die für die effektive Verabreichung geeignet ist, werden solche Zusammensetzungen eine effektive Menge des Peptids oder Proteins, der DNA, der RNA oder des Modulators enthalten.
  • Im Anschluss an die Expression von EBP in einer rekombinanten Wirtszelle kann EBP zurückerhalten werden, um EBP in aktiver Form zur Verfügung zu stellen. Mikrobielle Zellen, die das EBP-Expressionsplasmid enthalten, werden aus dem Fermentationsmedium geerntet, um eine Zellpaste oder Schlämme zur Verfügung zu stellen. Jedes herkömmliche Mittel, um Zellen aus einem Flüssigmedium zu ernten, ist geeignet, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Zentrifugation oder Mikrofiltration.
  • Die geernteten Zellen werden in einem geeigneten Lysepuffer lysiert. Die unlöslichen Proteine werden von den löslichen Proteinen durch herkömmliche Verfahren abgetrennt, die im Stand der Technik bekannt sind, wie zum Beispiel Zentrifugation und Mikrofiltration. Das EBP kann in einem oder beiden der löslichen und unlöslichen Proteinfraktionen des Zelllysats vorhanden sein.
  • Das in dem unten beschriebenen System hergestellte EBP akkumuliert als ein unlösliches Protein, das dann aufgereinigt wird und zurückgefaltet wird, um eine aktive Form des Proteins zu erhalten. Es ist dem Fachmann im Stand der Technik leicht ersichtlich, dass eine große Vielzahl von Expressionsvektoren und Wirtszellen in dem vorliegenden Verfahren verwendet werden können und dass das zu exprimierende EBP verändert werden kann, um eine Signalsequenz zu enthalten oder nicht zu enthalten. Zusätzlich kann das Reinigungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um EBP aus einem Gemisch von exprimierten EBPs, umfassend EBP mit und ohne eine Signalsequenz, zu reinigen.
  • Die unlösliche Proteinfraktion wird gesammelt und in einem geeigneten Solubilisierungspuffer löslich gemacht. Die löslich gemachten Proteine werden nochmals von den unlöslichen Proteinen wie oben beschrieben abgetrennt und die lösliche EBP-Proteinfraktion wird gesammelt. Das löslich gemachte EBP wird durch Inkubation für eine geeignete Zeitdauer in einem geeigneten Zurückhaltungspuffer durch herkömmliche im Stand der Technik bekannte Verfahren zurückgefaltet. Das zurückgefaltete EBP wird dann hydrophober Interaktionschromatographie unter der Verwendung einer geeigneten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix unterzogen. Beispiele von geeigneten hydrophoben Interaktionschromatographiematrices schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, Alkyl- oder aromatisch substituierte Silica oder Polymer-basierte Harze, wie zum Beispiel Oktyl-Sepharose, Butyl-Sepharose, Phenyl-Sepharose (Pharmacia); Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pently-, Hexyl-, Octyl-, Decyl-, Dodecyl-, Phenylbutylamine- oder Phenyl-substituierte perlenförmige Agarose (Supleco); oder Phenyl- oder Butyl-Toyopearl, wobei Phenyl-Toyopearl 650 M bevorzugt ist. Die Proteine werden unter der Verwendung eines geeigneten Elutionspuffers von der hydrophoben Interaktionssäule eluiert. Die Fraktionen, die aktives EBP enthalten, wie durch die hier beschriebenen Verfahren bestimmt, werden gesammelt. Das aktive EBP wird vorherrschend in dem ersten Hauptproteinpeak gefunden, der von der Säule eluiert wird. Diese Säulenfraktionen, die das aktive EBP enthalten, werden vereinigt und einer High-Performance Größenausschlusschromatographie (HP-SEC) unter der Verwendung einer geeigneten HP-SEC-Matrix unterzogen. Geeignete HP-SEC-Matrices schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, poröse Silika und Polymergelfiltrationmedien, einschließlich Sephacryl, Sepharose, Superdex und Sephadex größendefinierte Harze; Toyopearl HW, Progel TSK (Supelco), wobei Bio-Sil SEC-250 (BioRad) oder TosoHaas G3000SW bevorzugt ist. Die Fraktionen von der HP-SEC-Säule, die die EBP-Aktivität enthalten werden vereinigt und stellen extrem reines EBP dar, das EPO bindet. Dieses extrem reine EBP ist für die hier beschriebenen Verwendungen geeignet. Es ist dem Fachmann leicht ersichtlich, dass ein Variieren des Spiegels an EBP-Reinheit ein EBP zur Verfügung stellen wird, das für die hier beschriebenen Verwendungen brauchbar sein kann.
  • Die anfängliche Aufreinigung von EBP aus dem Zurückfaltungsmix kann auch unter der Verwendung von anionischer Austauschchromatographie erzielt werden. Die Anwendung eines Gradienten von ansteigender Salzkonzentration in einem geeigneten Puffer führt zur Elution eines zweiten hauptsächlichen Absorptionspeaks an Proteinen, wobei der erste Hauptpeak aktives EBP enthält. Geeigneten Anionenaustauschmedien schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, substituierte Polymer oder nicht-poröse Harze mit DEAE oder QAE funktionellen Modifikationen, einschließlich TSK-5w-DEAE, DEAE Sepharose, QAE Sepharose oder DEAE Sepharose, wobei DEAE Sepharose FastFlow bevorzugt ist. Auf diese Weise aufgereinigtes aktives EBP kann durch High-Performance Größenausschlusschromatographie (HP-SEC) weiter gereinigt werden.
  • Die Aufreinigung von EBP, das in E. coli unter der Verwendung des hier beschriebenen Verfahrens hergestellt wurde hat ein langlebiges, jedoch transientes Proteinfaltungsintermediat ergeben, das sich letztendlich in die aktive Form des Proteins entspannt. Aus 24-Stunden Zurückfaltungsgemischen gereinigtes aktives Protein scheint in Liganden-Bindungsbestimmungen mit dem identisch zu sein, das für 7 Tage zurückgefaltet wurde, was den Schluss unterstützt, dass nur eine einzelne aktive Form des Proteins, unabhängig von der Zurückhaltungsdauer, durch diese Verfahren gereinigt wurde. HP-SEC Studien haben gezeigt, dass das Intermediat ein größeres hydrodynamisches Volumen aufzuweisen scheint, als die aktive Form des Proteins, mit einer Retentionszeit, die einem Protein mit einer ungefähr zweimal größeren Masse als der aktiven Form des Proteins entspricht. Dies kann die Teilnahme eines Dimer-gefaltenten Intermediats oder eines Intermediats anzeigen, in dem nur eine der zwei vorhergesagten Domänen des Proteins gefaltet ist, was zu einem erhöhten hydrodynamischen Volumen führt.
  • Die hier beschriebene lösliche Ligandenbindungsdomäne neutralisiert die proliferativen Eigenschaften des EPO, wie es bei der Dosis-anhängigen Neutralisation einer EPO-responsiven Zellinie festgestellt wurde. Ein Molekül mit der Fähigkeit EPO zu neutralisieren, z.B. das EBP, das durch den Prozess der vorliegenden Erfindung aufgereinigt wurde, kann Verwendung in der Behandlung EPO-responsiver, proliferativer Störungen, wie Erythro-Leukämie und Polyzythämie finden. EBP kann auch für die in vivo Neutralisation von EPO eingesetzt werden.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erlaubt die Herstellung von aktivem, unglykosyliertem EBP, potentiell einsetzbar für eine Vielfalt von Verwendbarkeiten, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, die Entwicklung und Entdeckung von Medikamenten, als ein Therapeutikum, und für Strukturuntersuchungen durch NMR und Kristallographie. Die Herstellung des Proteins in Bakterien erlaubt die einfache Einfügung von stabilen Kohlenstoff- und Stickstoffisotopen, erforderlich für heteronukleare NMR-Studien, und limitiert damit den möglicherweise erschwerenden Faktor der Heterogenität, der durch die Glykosylierung des aus Säugetierzelllinien hergestellten Proteins hineingebracht wird. Insbesondere stellt das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Reinigung von EBP ein Protein her, das genügend rein für das Kristallwachstum ist, wodurch kristallographische Studien möglich sind.
  • Zusätzlich kann rekombinantes EBP von anderen zellulären Proteinen durch den Einsatz einer mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern hergestellten Immunaffinitätssäule getrennt werden.
  • Die folgenden Beispiele werden zur Verdeutlichung der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt.
  • Beispiel 1
  • Konstruktion des EBP bakteriellen Expressionsvektors
  • Um die Expression zum periplasmatischen Raum zu dirigieren, wurde die pelB-Signalsequenz (Lei, S-P., Lin, H-C., Wang, S. S., Callaway, J., and Wilcox, G. (1987), Characterization of the Erwina carotovora pelB gene and its product pectate lysate, J. Bact. 164, 4376-12; Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., & Dubendorff, J. W. (1990) Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 185: 60–89) an den N-Terminus des reifen hEPOR (Jones, S. S., D'Andrea, A. D., Haines, L. L., and Wong, G. G. (1990). Human erythropoietin receptor: Cloning, expression, and biological charcterozation, Blood 76, 31–35) durch überlappende Extensions-PCR (Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., and Pease, L. R. (1989) Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension, Gene 77, 61–68) fusioniert. Zwei separate DNA-Fragmente, eines für die pelB-Signalsequenz kodierend, und ein anderes für die Aminosäuren 1–225 der extrazellulären Domäne des reifen hEPOR kodierend, wurden durch PCR erzeugt. Die endständigen 16 Nukleotide des pelB PCR-Fragments wurden identisch zu den ersten 16 Nukleotiden des EBP-PCR-Fragmentes gestaltet, so dass die beiden Fragmente als Matrizen für die überlappende Extensions-PCR benutzt werden konnten. Die 5' und 3' Primer, die für die überlappende Extensions-PCR genutzt wurden, waren so angelegt, um jeweils Nde I und BamH I Restriktionsstellen für die nachfolgende Klonierung in das bakterielle Expressionsplasmid einzuführen. Zusätzlich brachte der 3' Primer ein Stoppcodon an die Stelle der Aminosäure 226 des reifen hEPOR ein. Das pelB-EBP-PCR-Fragment wurde in die Nde I und BamH I-Stellen des T7-Promoter-Expressionsvektors pET11a (Novagen, Inc., Madison, WI) ligiert und seine Sequenz durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Für die bakterielle Expression wurde das resultierende Konstrukt, genannt pSAM3 (1), in den E. coli-Stamm BL21 (DE3)pLysS, der die T7 RNA-Polymerase auf dem Chromosom unter Kontrolle des IPTG-induzierbaren Lac-Promotors (Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., & Dubendorff, J. W. (1990) Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 185: 60–89) trägt, transformiert. EBP wird von dem T7-Promotor unter Regulation des Lac-Operators exprimiert. Die Gene, die für den Lac-Repressor (lacI) und für die Ampicillinresistenz (bla) kodieren, sind auch auf dem Plasmid vorhanden. Üblicherweise wurden die Kulturen zu einer OD600 von 0,6 bis 0,9 in M9ZB-Medium (Studier, F. W. et al., (1990), siehe oben), das 100 μg/mL Ampicillin und 25 μm/ml Chloramphenicol enthält, angezogen, wobei zu dieser Zeit die Proteinexpression mit einer Endkonzentration von 1 mM IPTG induziert wurde. Nach einer weiteren zwei- bis dreistündigen Inkubation wurden die Zellen geerntet und das EBP wurde isoliert und wie hier beschrieben aufgereinigt.
  • Fermentation.
  • Parentaler E. coli-Stamm BL21(DE3) pLysS (Studier et al., siehe oben), transformiert mit dem Plasmid pSAM3 (genannt SM4), wurde in M9ZB amp/cap Medium [M9ZB amp/cap Medium pro Liter: 10 g N-Z-Amin A, 100 ml 10X M9 Minimalsalze (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO.), 5 g NaCl, 1 mM MgSO4, 2% D-Glukose, 100 mg Ampicillin und 25 mg Chloramphenicol] als eine 8%-ige Glyzerinstammlösung einer OD600 = 1,0 Kultur gehalten. Hohe Dichte-Fermentation wurde in einem CF-3000-Fermenter (Chemap Inc., South Plainfield, NJ) durchgeführt, ausgerüstet mit einem 10 Liter Rührtank. Angereichertes M9ZB Medium, pro Liter 20 g N-Z-Amin A, 5 g NaCl, 10 g M9 Minimalsalze, 0,12 g MgSO4, 0,2 g Glucose, 100 mg Ampicillin und 25 mg Chloramphenicol enthaltend, wurde hergestellt, durch eine 0,22 μm Milli-Pak 40 (Millipore Corp.) Vorrichtung gefiltert und in den Fermenter gepumpt. Nach Equilibrierung des Mediums auf 37°C und 20% gelösten Sauerstoff bei pH 6,8 wurde der Fermenter mit 50 ml der transformierten E. coli Glyzerinkultur (siehe oben) beimpft. Vor In duktion wurde der pH mittels Glukosezugabe (400 g Glukose auf 1 Liter des angereicherten M9ZB Mediums) gehalten. Sobald ein OD600-Wert von 25,0 erreicht wurde, wurde die Überexpression des Proteins durch Zugabe von IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mM induziert und der pH durch Zugabe von HCl auf 6,1 reduziert. Die Induktionsphase konnte über Nacht fortschreiten. Der OD600-Wert bei Ernte war 36, und 445 g der Zellpaste wurde durch Zentrifugation gewonnen. Der finale pH von 6,1 verlangsamt deutlich die Verdoppelungszeit, und der final pH, der benötigt, wird um die Zellwachstumsrate zu begrenzen, ist abhängig von einer verläßlichen pH-Kontrolle und der Probenkalibrierung.
  • Der konstruierte Expressionsvektor enthält die anfänglichen 225 N-terminalen Reste des reifen humanen Erythropoietin Rezeptors und enthält eine pelB-Signalsequenz, die, wie erwartet wurde, das exprimierte Protein zum periplasmatischen Raum von E. coli dirigieren sollte, um lösliches richtig gefaltetes EBP zu erhalten. Westernblot Analysen der löslichen periplasmatischen Proteinpräparationen und des Wachstumsmediums zeigten, dass in diesen Präparationen nach Induktion niedrige Proteinmengen vorhanden waren. Gekochte Kulturextrakte, analysiert durch SDS-PAGE, zeigten zwei intensive Proteinbanden, die in induzierten Kulturen vorhanden waren, die in Kulturen fehlten, die unter identischen Bedingungen mit Ausnahme der Induktion unter IPTG gewachsen waren. Das scheinbare Molekulargewicht der kleineren Spezies wurde auf 27 kDa abgeschätzt, während die langsamer wandernde Spezies ungefähr 1,5 kDa größer erschien. Gewinnung von unlöslichem Protein auf dem analytischen Maßstab führte zu Proteinpräparationen, die hauptsächlich diese zwei Spezies beinhalteten. Die Nterminale Sequenzanalyse dieses Proteins nach Solubilisierung, Zurückfaltung und Pufferaustausch zu PBS, zeigte zwei Proteinsequenzen an: Eine, die mit den ersten sechs Aminosäuren korrespondiert, die man für die reife, N-terminale Sequenz des EPO-Rezeptors erwartet und eine zweite, die die ersten sechs Aminosäuren der N-terminalen pelB-Signalsequenz ausmacht. Diese Daten zusammengenommen zeigen, dass das Expressionssystem zur Produktion von zwei Proteinformen führt, beide unlöslich und vermutlich in Einschlusskörpern lokalisiert, eine, die zum EBP korrespondiert mit einem richtig prozessierten Amino-Terminus und eine, die die kodierende pelB-Signalsequenz beibehält. Eine Signalsequenz scheint für die Produktion des EBP in diesem Expressionssystem erforderlich zu sein, da eine Version des Plasmid pSAM3 ohne die pelB-Signalsequenz im E. coli-Stamm BL21 (DE3) pLysS nicht exprimiert wurde. Andere Plasmidkonstrukte oder andere E. coli-Stämme könnten konstruiert werden, die die Anwesenheit einer Signalsequenz für eine Produktion des EBP in hohem Spiegel nicht benötigen. Auch ein alternatives Konstrukt, in der die ompT-Signalsequenz be nutzt wurde, konnte beobachtet werden, das beträchtliche Mengen von überexprimiertem unlöslichen EBP generierte.
  • Zusätzliche Fermentationen wurden mit verschiedenen Verteilungen der Signalsequenz „An" und der Signalsequenz „Aus"-Form des EBPs durchgeführt. Anfänglich kontrollierte Fermentationsstudien zeigten induzierte Kulturen mit einer größeren Menge des prozessierten EBP, die einen niedrigeren End-pH hatten. Anschließend wurde ein experimentelles Protokoll für die Produktion von vollständig prozessiertem EBP entwickelt. Der Endfermentationsprozess weist ein sorgfältig kontrolliertes Sauerstoffniveau auf und eine regulierte Reduktion des pHs der Kultur nach Induktion der Proteinexpression. Dies resultierte in der Expression einer Proteinspezies mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von ungefähr 27 kDa nach SDS-PAGE-Analyse (2, Tafel A, Reihe B versus Reihe C). Tafel A (reduzierte) Proben waren wie folgt: A. Pharmacia LMWM; B. vor Induktion; C. nach Induktion; D. zurückgefaltetes Gemisch; E. HIC Pool; F. HP-SEC Pool (2,5 μg); G. HP-SEC Pool (5,0 μg). Tafel B (nicht reduzierte) Proben waren folgende: A. Pharmacia LMWM; B. zurückgefaltetes Gemisch; C. HIC Pool; D. HP-SEC Pool (2,5 μg); E. HP-SEC Pool (5,0 μg).
  • Fermentation unter weniger strenger Kontrolle kann auch genutzt werden, um EBP zu gewinnen, das als ein Gemisch von „Signalsequenz an" und „Signalsequenz prozessiertem" Material, wie oben beschrieben, erscheint. Unlösliches EBP, das von diesen Fermentationen gewonnen wurde, kann auch nach den Methoden, die hier beschrieben werden zurückgefaltet und aufgereinigt werden, um aktives Protein mit einem richtig prozessierten Aminoterminus zu erhalten. Das Zurückfalten und die Aufreinigung resultiert in der Abtrennung der Proteinform, die die unprozessierte Signalsequenz enthält.
  • Beispiel 2
  • Proteingewinnung und Proteinzurückfaltung.
  • In Anbetracht des hohen Niveaus der Expression von unlöslichem Protein haben wir Bedingungen für die Gewinnung und das Zurückfalten der Einschlusskörper gesucht, um aktives Protein zu erhalten. Die Bedingungen wurden basierend auf einer Anzahl von Faktoren entwickelt, die in der Zurückfaltung von rekombinanten Proteinen berücksichtigt werden (Marston, F.A.O (1986) The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli. Biochemical Journal 240, 1–12; Light, A. (1985) Protein solubility, protein modifi cattions and protein folding, BioTechniques 3, 298–306; Schein, C. H. (1990), Solubility as a function of protein structure and solvent components, Bio/Technology 8, 308–317). Die Zentrifugation erschien für die Gewinnung der Einschlusskörper geeignet zu sein, die bei einer Konzentration von 3,5 M Harnstoff optimal gelöst vorgefunden wurden. Diese Konzentration des Harnstoffs löste über 90% des EBPs effektiv, aber ließ verschiedene kontaminierende Proteine in der unlöslichen Fraktion. Frühere Experimente über Zurückfaltungsbedingungen haben darauf hingewiesen, dass der Prozess durch High-Performance Größenanschluß-Chromatographie (HP-SEC) nachvollzogen werden kann. Die Benutzung der HP-SEC basierte auf der Beobachtung, dass, wenn sich die Route der Proteinzurückfaltung zu entweder einem korrekt gefalteten aktiven Produkt oder zu verschiedenen Typen von Proteinaggregaten hin bewegen würde, dann die Benutzung einer analytischen Technik, die auf der Basis des molekularen Volumens unterscheidet, die Effizienz eines Zurückfaltungsprotokolls allein vorhersagen sollte. Daher wurde der Proteinzurückfaltungsprozess durch High-Performance Größenausschluß-Chromatographie (HP-SEC) auf einem Waters 625 HPLC-System, ausgerüstet mit einem Waters 991 Detektor, beobachtet. Trennungen wurden bei umgebender Temperatur auf einer BioSil SEC-250 (7,8 × 300 mm)(BioRad)-Säule oder einer G-3000 SWXL (7,8 × 300 mm)-Säule (Supelco, Bellfonte, PA), die vergleichbare Auflösung liefert, durchgeführt. Die analytische Säule war in 10 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 150 mM NaCl äquilibriert, bei einer Flußrate von 1 ml/min. und wurde bei 220 nm überwacht. Die aktive Form des Proteins wurde durch Peak Shift-Analyse detektiert, durch Beifügung von 10 μg des gereinigten rekombinanten humanen EPO (1,7 mg/ml, spezifische Aktivität 120 Einheiten/μg) zu einem 100 μl Aliquot aus der Bulk-Zurückfaltungslösung, gefolgt von einer HP-SEC-Analyse. Dieses Chromatogramm wurde dann mit der chromatographischen Auflösung eines 100 μl Aliquots das Bulk-Zurückfaltungsgemisch verglichen, die in der Abwesenheit des E-POs durchgeführt wurde.
  • Ein Teil der Zellpaste (74,3 g) der obigen kontrollierten Fermentation wurde in 0,3 l des EBP-Lysispuffers lysiert (10 mM TRIS-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl), die 51 mg Phenylmethylsulfonylfluorid enthält sowie 600 mg Eiweißlysozym (Calbiochem), 1 mM MgCl2, und 12.500 Einheiten von Benzonase (EM Science) und, alles zusammen, EBP Lysispuffer genannt wird. Dieses Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden mit gelegentlichem Schütteln inkubiert. Das resultierende Lysat wurde bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde durch Anwendung einer einminütigen Beschallungsphase nach Hinzufügung von 0,3 l des TE-Puffers (TE-Puffer: 10 mM TRIS- HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 3% NP-40 [Proteingrad, Calbiochem]) gelöst. Die resultierende Suspension wurde bei 8000 × g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die unlöslichen Proteine wurden mit 0,3 l Wasser gewaschen. Der Pellet wurde resuspendiert durch Beschallung (20 Sekunden). Unlösliches Protein wurde durch Zentrifugation (12.000 × g, 15 Minuten, 4°C) gewonnen. Das Nassgewicht des gewonnenen Proteins war ungefähr 3,5 g, nach Abguss des Waschüberstands.
  • Das unlösliche Proteinpellet wurde in 9 ml des Lösungspuffers pro Gramm Protein resuspendiert (Lösungspuffer: 0,1 M TRIS-HCl, pH 8,5, 3,5 M Harnstoff, 10 mM Lysin, 10 mM Dithiothreitol) und wurde bei 12.000 g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Lysin wurde zugegeben, um als Radikalfänger von aminreaktiven Cyanaten zu dienen, die möglicherweise im Harnstoff vorhanden sind (Marston, F. A. O. and Hartley, D. L. (1990) Solubilization of protein aggregates, Methods Enzymol. 182, 264–276). An diesem Punkt kann der gewonnene Überstand als ein günstiger Stoppunkt bei 4°C über Nacht inkubiert werden oder kann bis zu der Zurückfaltungsstufe weitergeführt werden. Die OD280 des gelösten Proteins wurde gegenüber dem Lösungspuffer bestimmt (21,7 A. U./ml), und 30 ml des gelösten Proteins wurde im Zurückfaltungspuffer auf 1020 ml verdünnt (Zurückfaltungspuffer: 0,05 M TRIS-HCl, pH 8,5, 3 mM EDTA, 10 mM Lysin, 2 mM reduziertes Glutathion, 0,2 mM oxidiertes Glutathion) und bei 4°C gelagert. End-OD280 des zurückgefalteten Gemisches war 0,64.
  • Eine qualitative Abschätzung der Liganden-Bindungsaktivität war mittels Durchführung zweier HP-SEC-Experimente mit dem Zurückfaltungsgemisch möglich, das eine mit zugefügtem Liganden, das andere ohne (3). Unlösliches EBP wurde wie hier beschrieben in Lösung gebracht und bei 4°C für 6 Tage inkubiert (3, Tafel A und B). Wie in 3, Tafel A zu sehen ist, wenn das Zurückfaltungsgemisch alleine auf eine analytische SEC-Säule injiziert wurde, konnte ein Absorptionspeak ungefähr bei 9,5 Minuten beobachtet werden, der einem Standard-kalibrierten Molekulargewicht von ungefähr 25.000 Dalton entspricht. Dieser Wert ist in guter Übereinstimmung mit der vorhergesagten Molekularmasse 24,724 des EBP. Nach Zugabe von 8,5 μg EPO zu dem Gemisch und nachfolgender chromatographischer Auflösung konnte ein EPO-EBP-Komplexpeak beobachtet werden bei ungefähr 8,1 Minuten und ein EPO Peak bei ungefähr 8,5 Minuten (3, Tafel B, über das Experiment gezeigt in 3, Tafel A überlagert). Der Absorptionspeak bei ungefähr 9,5 Minuten ist fast vollständig abgebaut, was das Vorhandensein einer EBP-Form beweist, die mit EPO interagieren kann, um eine Spezies mit einer größeren offensichtlichen Lösungsphasen-Molekularmasse zu schaffen. Nur der 9,5 Minuten-Peak scheint mit EPO zu interagieren, ein Hinweis auf eine einzelne aktive Spezies. Die Peaks, die nach 10 Minuten eluieren, haben eine kalibrierte Molekularmasse von weniger als 3.000 Dalton. 3, Tafel C zeigt eine signifikante Menge an richtig zurückgefaltetem Protein, das unmittelbar nach Verdünnung der 3,5 M Harnstoff-Denaturierungslösung zu 0,1 M Harnstoff beobachtet wird, wie durch den Peak bei 9,5 Minuten Elutionszeit gezeigt (Peak 2). Nach 24 Stunden Inkubation bei 4°C wird ein Zuwachs beobachtet, sowohl in der 9,5 Minuten (Peak 2) aktiven Proteinform, als auch in der Spezies, die bei 8,2 Minuten (Peak 1) eluiert, wie in 3, Tafel D gezeigt ist. Das Auftreten dieser Formen erscheint auf Kosten von höheren Molekulargewichtsproteinformen, mit Zurückbehaltungszeiten von 6–8 Minuten und von unlöslichem Protein in dem Zurückfaltungsgemisch. Wie in 3, Tafel A gezeigt, zerfällt die 8,2 Minuten Proteinform graduell und die Absorbierung erscheint in dem aktiven Proteinpeak. Diese Experimente produzieren klare Verschiebungen eines Proteins des Mr = 25.000 nach Zugabe von EPO zu einem Aliquot des Zurückfaltungsgemisches (3, Tafel A und B). Nur der Mr = 25.000 Peak scheint sich nach Zugabe von EPO zu verschieben, ein Hinweis für das Vorhandensein einer einzeln aktiven Spezies unter diesen Analysebedingungen. Die HP-SEC-Studie des Zurückfaltungsgemisches über einen Zeitlauf resultierte in der Beobachtung, dass eine Spezies von Mr = 52.000 langsam in eine aktive Mr = 25.000 Spezies überführt wird (3, Tafel C, Peaks 1 und 2 verglichen mit 3, Tafel A [nach 6 Tagen der Zurückfaltungszeit]). Die Zurückfaltungslösung blieb leicht wolkig zurück, und es wurde vermutet, dass das unlösliche Protein, Ursache der trüben Lösung, langsam in der Lösung aufgenommen wurde, was zu einer zusätzlichen aktiven und inaktiven Proteinspezies über die anfänglichen 24 Stunden der Zurückfaltung führte (3, Tafel C und D). Diese metastabile Spezies wurde als langlebig beobachtet, und schien nicht mit einer Disulfid-gebundenen Spezies verwandt zu sein, weil über den Ablauf der übermäßig langen Zurückfaltungsprozedur die nicht-reduzierenden SDS-PAGE-Experimente keine Unterschiede mit der Zeit nachweisen konnten. Diese Studie deutete darauf hin, dass die wiederholte Inkubation bei 4°C in der Anhäufung von zusätzlichem aktiven Produkt resultierte, auf Kosten des inaktiven Materials, bezeichnet als Peak Nr. 1 (3, Tafel A), und dadurch wurde der Zurückfaltungsprozess typischerweise für 5 bis 7 Tage durchgeführt (3, Tafel C vs. Tafel A). Das Protein mit einer analytischen HP-SEC-Elutionszeit von 8,2 Minuten (3, Peak 1) wurde durch präparative HP-SEC isoliert und durch SDS-PAGE analysiert. Sowohl unter reduzierenden als auch unter nicht reduzierenden Bedingungen erschien das Protein monomer zu sein. Da dieser Peak letztlich relativ zu dem 9,5 Minuten-Peak (3, Peak 2) abnimmt, nach mehreren Tagen Zurückfaltungszeit (3, Tafel A), wird vorgeschlagen, dass diese Spezies ein Zurückfaltungsintermediat repräsentiert.
  • Beispiel 3
  • Proteinaufreinigung.
  • Nach sechs Tagen Zurückfaltungszeit wurde das endgültige Zurückfaltungsgemisch auf 37°C aufgewärmt und auf 1 M (NH4)2SO4 durch Zufügung von 3,5 molarem (NH4)2SO4, in 20 mM TRIS-HCl, pH 7,5 und zusätzlich 20 mM TRIS-HCl, pH 7,5 eingestellt. Das endgültig angepasste Volumen des 1 M (NH4)2SO4-Zurückfaltungsgemisches war 1,5 Liter. Analytische HP-SEC-Analyse dieser Lösung machte deutlich, dass zum Teil die höhermolekularen Formen des Zurückfaltungsgemisches aus der Lösung präzipitiert wurden. Nach Filtrieren durch einen 0,45 μm Filter wurde diese Lösung auf eine Säule (5 cm × 16 cm) der Phenyl-Toyopearl TSK 650 M (Supelco) bei einer Flussrate von 8 ml/min bei Raumtemperatur aufgetragen. Die Säule war vorher mit 1 M (NH4)2SO4/20 mM TRIS-HCl, pH 7,5 (Puffer A) äquilibriert worden. Nach Abschluss der Säulenbeladung wurde die Absorption (280 nm) des Säulenelements auf die Basislinie zurückgeführt durch Waschen mit Puffer A. Das an die Säule gebundene Protein wurde mit einem 2000 ml linearen Gradienten von 20 mM TRIS-HCl, pH 7,5 (Puffer B) eluiert, beginnend mit 100% Puffer A, gefolgt von 1000 ml Puffer B. Eine Flussrate von 8 ml/Min. wurde im Verlauf des Experimentes aufrecht erhalten. Fraktionen von 2 Minuten Laufzeit wurden gesammelt. Zwei größere Absorptionspeaks wurden eluiert, einer bei ungefähr 80% Puffer B und ein anderer nach ungefähr 200 ml 100% Puffer B 4A. Analytische HP-SEC der Säulenfraktionen (100 μl) zeigten, dass der erste Absorptionspeak das aktive Protein enthielt, und Fraktionen 85 bis 102 wurden vereinigt und durch Ultrafiltration konzentriert (Amicon YM-10 Membran). Das zurückerhaltene Material wurde durch einen 0,45 μm Filter vor dem nächsten Chromatographieschritt gefiltert.
  • Der zurückerhaltene Pool (22 ml, 60 mg Protein) wurde einer HP-SEC auf einer Bio-Sil SEC-250-Säule (21,5 × 600 mm, BioRad) unterworfen, ausgerüstet mit einer BioSil-Vorsäule (7,5 × 21,5 mm), äquilibriert mit PBS, pH 7,5 bei 4 ml/Min. Injektionen von 4,5 ml wurden vorgenommen, und der gesamte Pool wurde in 5 chromatographische Experimente zerlegt. Einminütige Fraktionen wurden gesammelt und die aktiven Fraktionen von jedem Lauf (Fraktionen 40–42) wurden vereinigt und durch Ultrafiltration in Centriprep 10-Vorrichtungen konzentriert (Amicon)[4B]. Der zurückerhaltene Pool (23 ml, 2,04 mg/ml, 46 mg) wurde auf Aktivität mittels HP-SEC EPO-Bindungsanalyse (siehe unten) und auf Reinheit durch nicht reduzierende und reduzierende SDS-PAGE-Analyse (siehe 2) analysiert. SDS-PAGE-Gele (10–20% Gradienten SDS-PAGE-Platten, 84 × 70 × 1,0 mm, Integrated Separation Systems, Natick, MA) wurden mit Coomasie Brilliant Blau R-250 gefärbt.
  • Bei analytischer HP-SEC erscheint dieses Protein als eine einzelne Spezies mit einer Elutionszeit von 9,5 Minuten ohne Spuren von Hochmolekulargewichtsaggregaten (4, Tafel C). Wenn ein Überschuss von EPO vor der chromatographischen Auflösung zugemischt wird, wird das bei 9,5 Minuten beobachtete EBP zu einem Komplex mit einer Zurückhaltungszeit von ungefähr 8,2 Minuten umgewandelt (4, Tafel D, übergelegt mit Experiment gezeigt in 4, Tafel C). Wenn EPO auf einem Niveau unter dem Überschuss dazugegeben wird, beobachtet man den kompletten Abbau des EPO-Peaks bei 8,5 Minuten, während der Komplex-Peal bei ungefähr 8,2 Minuten übrig bleibt. Eine finale EBP-Ausbeute von etwa 0,6 mg aktivem Protein pro Gramm des Nasszellgewichtes wurde beobachtet, mit 33% Gesamtausbeute vom Zurückfaltungsstadium hin zum offensichtlich homogenen Protein. Tabelle 1 zeigt das Resultat der Aufreinigung von zurückgefaltetem EBP aus E. coli.
    Figure 00210001
    Anmerkung: Ausgehend von 74,3 Gramm der Zellen (Nassgewicht).
    • 1 – berechnet von der SEC-Peakfläche, basierend auf % des aktiven Proteins
  • Beispiel 4
  • Herstellung des EPO-EBP-Komplexes und Stöchiometriebestimmung.
  • Die Stöchiometrie von EBP und EPO in dem Bindungskomplex wurde weiter untersucht durch Isolierung des EPO-EBP-Komplexes mit HP-SEC und durch die Bestimmung des Pro teinanteils innerhalb dieses Gemischs mittels C-4 Umkehrphasen-Chromatographie, wie unten beschrieben. Eine Standardkurve der Detektor Antwort für EPO und EBP (5, Tafel A) wurde erzeugt, die eine lineare Detektor Antwort zeigte, mit einem geringen Grad an Wiederholungsfehlern (1,0 S. D.) über drei unterschiedliche analytische Läufe, bei jeder Menge des Analyten, wie durch die Fehlerbalken angezeigt. 5, Tafel B beinhaltet die Resultate der Analyse zweier unterschiedlicher Abfüllchargen des EPO-EBP-Komplexes, aufgereinigt durch HP-SEC vor C-4-Analyse. Diese Daten, zusammen mit den hier beschriebenen HP-SEC-Daten, zeigen ein 1:1-Verhältnis des EPO-EBP-Komplexes.
  • Der Komplex wurde wie folgt erhalten. Eine Lösung, die 5 mg EPO und 12 mg EBP (EBP-Überschuss) beinhaltet, wurde einer präparativen HP-SEC unterworfen mit der Methode, die oben beschrieben wurde. Der erste eluierte Proteinpeak (EPO-EBP-Komplex) wurde gesammelt und einer Analyse durch C-4-Reverse-Phase HPLC unterworfen. In Kürze: eine 4,6 × 250 mm Säule (YMC-PACK, C4-AP, 300A) wurde mit Wasser/Acetonitril (80%/20%), die 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) enthält, äquilibriert und ein Aliquot des EPO-EBP-Komplexes wurde mit einer Flussrate von 1 ml/min injiziert. Nach fünfminütigem Waschen wurde ein linearer Gradient von 20–100% Acetonitril, der 0,1% TFA enthält, über 20 Minuten aufgetragen und das Experiment bei 220 nm überwacht. Unter diesen Bedingungen eluieren EBP und EPO entsprechend bei 14,1 und 15,1 Minuten, mit Basislinie-Auflösung. Von jedem Protein wurde eine Standardkurve angelegt, die zeigte, dass die Detektorantwort linear war, über einen Bereich von 50 zu 500 pmol. Die Peakfläche jedes Proteins in dem Komplex wurde mit der Standardkurve verglichen, um das Verhältnis von EPO und EBP in dem Komplex zu bestimmen.
  • Beispiel 5
  • Aminosäureanalyse und N-terminale und Peptidfragment-Aminosäuresequenzananyse.
  • Aminosäureanalyse einer Lösung des aufgereinigten EBPs wurde mit Hilfe von Standardtechniken durchgeführt, auf einem 420H Hydrolysierer (Applied Biosystems, Foster City, CA), und der Aminosäuregehalt wurde mittels eines internen Standards abgeschätzt. Diese Daten wurden benutzt, um einen molaren Extinktionskoeffizienten von 57.500 für EBP bei 280 nm (2,3 Absorptionseinheiten/mg) abzuschätzen, basierend auf der Absorption der Proteinlösung, die für die Aminosäureanalyse benutzt wurde. Dieser Wert wurde anschließend benutzt, um die EBP-Konzentrationen abzuschätzen. Ein berechneter Extinktionskoeffizient (Gill, S. C and von Hippel, P. H. (1989) Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal. Biochem. 182, 319–326) von 42.760 wurde ursprünglich eingesetzt, aber anschließend in Bindungs-Titratonsexperimenten als ungenau angesehen.
  • Die aminoterminale Sequenz des EBP wurde auf einem 2090E-integrierten Mikro-Sequenzsystem (Porton Instruments, Fullerton, CA) unter Verwendung der Standard-Gasphase Edman-Abbau Chemie bestimmt. Wiederholte Ausbeuten waren größer als 85%.
  • Zur Peptidkartierung wurden ungefähr 50 μg des EBP in PBS zu 300 μl des 0,05 M TRIS-Puffers pH 8,5 hinzugegeben. Zu dieser Lösung wurden 2 μl von 1 mg/ml TPCK-Trypsin (Worthington, Freehold, NJ) in Wasser hinzugefügt und das Gemisch wurde bei 37°C für 16 Stunden inkubiert. Der Verdau wurde mit 25 μl Trifluoressigsäure abgelöscht und das Gemisch durch einen 0,45 μm Membranfilter filtriert. Der Extrakt wurde über HPLC analysiert auf einer Dynamax C-18 5 Micron 300A Säule (Rainin Instrument Co., Woburn, MA), mit einem Gradienten von 0 bis 42% Acetronitril/0,1% TFA über 50 Min eluiert, gefolgt bei 42–70% desselben Puffers über 10 Min. bei 1,0 ml/Min. Fraktionen des Materials, die mit 250 nm Absorbtionspeaks eluierten, wurden gesammelt und das Lösungsmittel in einer Speedvac verdampft. Die Peptide wurden wie oben sequenziert.
  • Um die Bindungskapazität des zurückerhaltene Materials zu bestimmen und um die Identität und die Strukturintegrität des Proteins zu bestimmen, wurden verschiedene zusätzliche Studien unternommen. Diese beinhalteten die N-terminale Sequenzanalyse, die TOF Massenspektrometrie und Assayausführungen, entwickelt um die Liganden-Bindungskapazität des EBP zu bestimmen. Die N-terminale Sequenzanalyse wies nur die erwartete N-terminale Sequenz für zehn Zyklen nach (s. oben), um die Identität des Proteins zu bestätigen. Sequenzanalyse von verschiedenen internen tryptischen Peptiden bestätigte auch die erwartete lineare Sequenz des Proteins und ein prinzipielles Disulfid-Bindungsmuster von 1-2, 3-4.
  • Beispiel 6
  • Massenspektrometrie
  • Um die Masse des gewonnenen Proteins zu bestätigen, wurde Matrix-assistierte Laser-Desorptionsionisierungs TOF Massenspektrometrie auf einem Laser MAT Instrument (Finnigan-MAT, San Jose, CA) durchgeführt unter Benutzung einer Sinapinsäurematrix und einem internen Rinder-Kohlensäureanhydrase Massenstandard. 6, Tafel B stellt das MALDI/TOF Massenspektrum des EBP dar, welches das molekulare Ion (MH+) bei 24.732 Daltons zeigt. Der Massenschwerpunkt des Kohlensäureanhydrase-Ions (CA+) wurde benutzt, um das Instrument zu kalibrieren. Zwei geladene Ionen des EBP (MH2++) und der Kohlensäureanhydrase (CA++) sind auch im Spektrum offenkundig. Der molekulare Massenschwerpunkt von 24.732 für EBP vergleicht sich gut mit der ausgerechneten durchschnittlichen Masse von 24.724 und unterstützt beides, die Identität und die ordnungsgemäße carboxyterminale Verkürzung des Proteins.
  • Beispiel 7
  • Herstellung von EBP-Perlen und Bestimmung der Gleichgewichtsbindungskonstante (Scatchard Analyse).
  • EPB, nach der obigen Methode hergestellt, enthält eine freie Sulfhydrylgruppe, die modifiziert werden kann, ohne die Bindung der Lösungsphase des Liganden zu beeinflussen. Um EBP für die Gleichgewichtsbindungsanalyse zu immobilisieren, wurde diese Beobachtung auf die kovalente Anhaftung des EPBs an Agaroseperlen erweitert. Die Jodacetyl-Aktivierungschemie der Sulfolink Perlen (Pierce Chemical Co, Rockford, IL) ist spezifisch für freie Thiole und garantiert, dass die Bindung nicht einfach reversibel ist. EBP-Sulfolink Perlen wurden wie folgt hergestellt: Eine Sulfolink Gelsuspension (10 ml) wurde mit Kopplungspuffer (40 ml: 50 mM TRIS, pH 8,3, 5 mM EDTA) gemischt, und dem Gel wurde es erlaubt, sich abzusetzen. Der Überstand wurde entfernt und das zu bindende EBP (0,3–1 mg/ml in Kopplungspuffer) wurde direkt zu den gewaschenen Perlen gegeben. Das Gemisch wurde schonend 30 Min. bei Raumtemperatur geschüttelt und den Perlen wurde erlaubt, sich über eine Stunde bei Raumtemperatur abzusetzen. Der Überstand wurde entfernt und aufbewahrt und die Perlen wurden zwei Mal mit 20 ml des Kopplungspuffers gewaschen. Die Waschlösungen wurden auch aufbewahrt. Die Perlen wurden dann mit 20 ml 0,5 M Cystein für 30 Min. bei Raumtemperatur behandelt, um ungebundene Stellen zu blockieren. Zum Schluss wurden die Perlen mit 50 ml 1 M NaCl gewaschen, dann mit 30 ml PBS, in 20 ml PBS resuspendiert und bei 4°C aufbewahrt. Die Menge des EPB, die kovalent an die Perlen gebunden war, wurde bestimmt durch Vergleich der OD280 der ursprünglichen EPB Lösung zu Gesamt OD280, die in dem Reaktionsüberstand und in den zwei 20 ml Waschlösungen gewonnen worden war. Üblicherweise bleibt 40 bis 60% des applizierten EPB mit den Perlen assoziiert.
  • Die Bindungstests wurden durch Zugabe von EPB Perlen (50 μl) zu den einzelnen Reaktionsröhrchen gestartet. Die Gesamtbindung wurde in Röhrchen gemessen, die 0,3 bis 30 nM [125I] EPO enthielten (NEN Research Products, Boston MA, 100 μCl/μg). Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung wurde nicht markiertes EPO in einem Spiegel von 1000fachem Überschuss zur korrespondierenden [125J] EPO Konzentration hinzugefügt. Jedes Reaktionsvolumen wurde auf 500 μl mit Bindungspuffer (PBS/0,2% BSA) gebracht. Die Perlen wurden für 5 Stunden (ein Zeitraum, der experimentell als angemessen zur Etablierung des Gleichgewichts bestimmt worden war) bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln inkubiert. Nach 5 Stunden wurde jedes Reaktionsgemisch durch eine 1 ml Pipettenspitze, gestopft mit Glaswolle, passiert. Die Röhrchen wurden mit 1 ml Waschpuffer (PBS/5% BSA) gewaschen, und dieses Volumen sowie zwei zusätzliche 1 ml Waschlösungen wurden durch die Pipettenspitze passiert und für die Bestimmung der freien EPO-Konzentration gesammelt. Nicht-spezifische Bindung wurde aus dem Überschuss-kalten EPO-Experiment für jede Konzentration der Radiomarkierung bestimmt und von der Gesamtbindung abgezogen, um die spezifische Bindung auszurechnen. 6, Tafel A repräsentiert die Gleichgewichtsbindungsdaten, und die Einfügung ist die lineare Transformation (Scatchard) des Datensatzes in Tafel A und zeigt eine Kd von 5 nM ± 2 an.
  • Beispiel 8
  • Kompetitive Erythropoietin Rezeptor Bindungsanalyse.
  • Ein gesamter zellbasierter Bindungstest wurde durch Zugabe von zunehmender Menge aufgereinigtem EPB zu einer konstanten Menge von [125J] markiertem EPO und EPOR tragenden Zellen durchgeführt. Unspezifische Bindung wurde durch Zugabe eines Überschusses von EPO (1 μM) bestimmt und vor der Datenanalyse abgezogen. Die geschätzten IC50 und Ki von 5 Tests wurden als jeweils 1,7 ± 1 nM und 0,94 f 0,5 nM bestimmt. Kompetition des EPB um die [125I] EPO-Bindung mit intakten Zelloberflächen EPO-Rezeptoren erbrachten eine IC50 von ca. 1,7 nM ± 1 (7, Tafel A). Kurz gesagt wurde das Experiment wie folgt durchgeführt. TF-1-Zellen (Kitamura T., Tange T., Teraswa, T., Chiba, S., Kuwaki, T. Miyagawa, K., Piao, Y.-F., Miyazono, K., Urabe, A. und Takaku, F. (1989) Establishment and characterization of a unique human cell line that proliferates dependently on GM-CSF, IL-3 or Erythropoietin. J. Cell Physiol. 140, 323–334) wurden in RPMI 1640, 10% fötalem Kälberserum, 1% L-Glutamin, 1% Penicillin, 0,1% Streptomycin und 1 Einheit/ml des IL-3 (Genzyme, Cambridge, MA) gehalten. [125I] EPO wurde von NEN Research Products bezogen, wie oben er wähnt. Kompetitive Bindungsstudien wurden mit Hilfe eines einstufigen Rezeptorbindungstestverfahrens durchgeführt. Kutz wurde Medium, das Mid-Logphase TF-1 Zellen beinhaltete zentrifugiert und das Zellpellet in Bindungspuffer (RPMI 1640, 0,2% BSA, 0,02% Natriumazid) bei 4 × 107 Zellen/ml resuspendiert. Um die Bindung des EPO zu den intakten Zellen zu untersuchen, mit oder ohne Kompetition von EBP, wurden 4 × 106 Zellen, [125I] EPO (üblicherweise 80 pM) und EBP gemischt und innerhalb eines Endvolumens von 150 μl, im Duplikat, aufgenommen. Die Inkubationen wurden in 1,5 ml Polypropylenröhrchen bei 10°C über Nacht durchgeführt. Am Ende der Inkubationsperiode wurden 120 μl Aliquots des Bindungsgemisches auf ein 300 μl Kissen von 10%iger Saccharose in Sarstedt RIA Röhrchen geschichtet. Die Zellen wurden in einer Microfuge für 1 Min. pelletiert, und die Röhrchen wurden sofort in ein Trockeneisbad platziert, zum schnellen Einfrieren der Inhalte. Zellen und gebundener Ligand wurden durch Wegschneiden des Bodens des Röhrchens gesammelt und in 12 × 75 mm Teströhrchen zur Quantifizierung der Radioaktivität in einem Gammazähler transferiert. London-2 (London Software, Chagrin Fall, OH) wurde für die Datenreduktion angewendet.
  • Beispiel 9
  • Zellteilungs-Neutralisierungstest.
  • Die Zellinie FDC-P1/ER, eine EPO-abhängige Linie, die den Maus EPO-Rezeptor exprimiert, wurde angezogen und aufbewahrt, wie vorher beschrieben (Carroll, M. P., Spivak, J. L., Mc-Mahon, M., Weich, N., Rapp, U. R. und May, W. S. 1991. Erythropoietin induces Raf-1 activation and Raf-1 is required for exythropoietin-mediated proliferation. J. Biol. Chem. 266, 14964–14969). Die Zellen wurden in RPMI 1640 Medium (Gibco) aufbewahrt, das 10% Hitze-inaktiviertes fötales Kälberserum und 10 Einheiten/ml des rekombinanten humanen EPO enthält. Zur Inhibierung des Proliferationstests wurden FDC-P1/ER-Zellen bis zur stationären Phase gewachsen, zentrifugiert, mit RPMI 1640 Medium (kein EPO) gewaschen und in Medium ohne EPO über Nacht ausplattiert. Tests wurden in 96 Well U-Form Boden-Zellkulturplatten mit jedem Testpunkt in dreifachen Ansätzen angesetzt. Jedes Well enthielt 4 × 104 Zellen, 0,5 Einheit/ml EPO und verschiedene Mengen an EBP (in Medium) in einem Endvolumen von 0,2 ml. Die Platten wurden bei 37°C für ca. 48 Stunden inkubiert, und die Zellen wurden danach mit 1 μCi/Well des [3H]Thymidin (20 Ci/mmol, Dupont-NEN) für sechs Stunden bei 37°C gepulst. Zellen wurden auf Glasfaserfiltern mit Hilfe eines Tomtec Zellharvesters geerntet. Die Filter wurden mit einem Szintillationsmittel gezählt unter Benut zung eines LKB Betaplatten 1205 Szintillationszählers. Die hier beschriebene lösliche Liganden-Bindungsdomäne neutralisierte die proliferativen Eigenschaften des EPO wie anhand der dosisabhängigen Neutralisierung der proliferativen Antwort des EPO in der EPO-responsiven Zelllinie FDC-P1/ER festgestellt wurde. 7, Tafel B zeigt: Inhibierung der EPO-abhängigen zellulären Proliferation durch EBP. Der IC50 wurde als 5 nM ± 1 abgeschätzt.
  • Zusammengenommen beweisen die hier gezeigten Beispiele, dass das zurückgefaltete EBP, das in der hier beschriebenen Art hergestellt wurde, hoch aktiv ist, und mit der Gleichgewichtsbindungskonstante des EBP, das in CHO-Zellen von 1 nM hergestellt wird (Yet, M.-G und Jones, S. S. (1993) The Extracytoplasmic Domain of the Erythropoietin Receptor Forms a Monomeric Complex with Erythropoietin. Blood 82, 1713–1719) und mit der kleinen Menge des richtig gefalteten bakteriell exprimierten EBP-GST Fusionsproteins von einem alternativen bakteriellen Expressionssystem (Harris, K. W., Mitchell, R. A., und Winkleman, J. c. (1992) Ligand Binding Properties of the Human Erythropoietin Receptor Extracellular Domain Expressed in E. coli J. Biol. Chem., 267, 15205–15209) gut korreliert, hat jedoch Vorteile, die hohe Reinheit einschließen, es ist kein Fusionsprotein, es ist nicht glykosyliert und es wird mit hoher Ausbeute hergestellt und aufgereinigt.
  • Beispiel 10
  • Peptidsynthese.
  • Allgemein wurden alle der hier beschriebenen zyklischen EPO-mimetischen Peptide mit Hilfe der Merrifield Festphasen-Peptidsynthesemethode auf den Applied Biosystems Modellen 430A und 431A Peptidsynthesizern synthetisiert. Geschützte BOC (t-Butoxycarbonyl) Aminosäurederivate wurden nach Säureentschützungs-(50% Trifluoressigsäure/50% Dichlormethan) und Neutralisierungsschritten (5% Diisopropylethylamin/N-Methylpyrrolidin) als Hydroxyl-benzotriazolester gekoppelt. Die Säureabbau-, Neutralisierungs- und Kopplungsschritte wurden so lange wiederholt, bis das Volllängen-Peptidharz erhalten war. Das vollständige Harz-gebundene Peptid wurde mit 50% TFA behandelt, um das freie N-terminale Peptidharz zu erhalten. Die Seitenketten-schützenden Gruppen wurden entfernt und das Peptid wurde von dem Harz durch Behandlung mit flüssigem HF-Anisol (10 Volumen%) für 90 Min. bei –6°C gespalten. Das freie Peptid wurde dann mit kaltem Ethyläther gefällt. Zusätzliche Äther-Waschschritte wurden angewendet, um restliche Radikalfänger (Anisol) zu entfernen. Das trockene Peptidharz wurde dann in 50% HOAc extrahiert, mit Wasser verdünnt und lyophilisiert. Die Cysteine wurden oxidiert, indem das rohe Peptid in 0,1% TFA/Acetonitril suspendiert wurde, gefolgt von einer Verdünnung mit Wasser auf eine Peptidkonzentration von 1 mg/ml, was in einer klaren Lösung resultierte (üblicherweise 30 bis 50% AcN/Wasser). Festes Ammoniumhydrogencarbonat wurde zu der Peptidlösung hinzugefügt, bis ein pH von ca. 8,0 erreicht war. Kaliumeisen(III)cyanid (0,1 M) wurde tropfenweise zu der gerührten Peptidlösung hinzugefügt, bis eine leicht gelbe Lösung bestehen blieb. Die Peptidlösung wurde mit Hilfe analytischer Reverse Phase HPLC auf die Bildung von oxidierten Produkt kontrolliert. Die zyklischen Peptide eluierten üblicherweise hinter dem reduzierten Startmaterial auf einer Vydac C18 Säule. Vor der Aufreinigung wurde ein Bio-Rad AG 2-X8 Anionenaustauschgranulat (Chloridform) zu der gelben Peptidlösung hinzugefügt, um oxidierendes Agens (Eisen) zu entfernen. Das Anionenaustauschgranulat wurde durch Filtration entfernt und mit einem Volumen Wasser entsprechend dem Volumen der Peptidlösung gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden auf eine präparative HPLC-Säule (Vydac C18) aufgetragen und das Targetpeptid wurde bei einer Reinheit von 90 bis 95% isoliert, mittels eines Wasseracetonitrilgradienten mit 0,1% TFA. Wenn maßgebliches lineares Peptid auch während der Chromatographie erhalten wurde (üblicherweise eluierte das reduzierte Peptid nahe bei dem erwünschten zyklischen Peptid) wurde der Oxidationsschritt mit Kalium-Eisen (III) Zyanid wiederholt, um die Gesamtausbeute des reduzierten Targetpeptids zu maximieren. Die von der präparativen Chromatographie gesammelten Fraktionen, welche hochreines erwünschtes Peptid enthielten, wurden zusammengefasst und lyophilisiert. Das Endprodukt jeder Synthese wurde durch analytische HPLC auf Reinheit (gewöhnlich > 95%), durch Ionenspray-Massenspektroskopie auf Molekulargewicht und durch Aminosäureanalyse auf Peptidzusammensetzung charakterisiert. Alle zyklischen Peptidpräparationen waren negativ für freie Sulfhydrylgruppen unter Verwendung von Ellman's Reagenz. Die Peptide, die für die hier beschriebenen Studien benutzt wurden, sind in Tabelle 2 zu sehen. Tabelle 2 EPO-mimetische Peptide und Derivate
    Figure 00280001
    Figure 00290001
    • * alle Peptide sind über eine intramolekularen Disulfidbindung zyklisch und am C-Terminus amidiert
  • Kompetitive Bindungstests der Peptide wurden wie hier beschrieben durchgeführt. Die einzelnen Peptide wurden in DMSO aufgelöst, um eine Stammlösung von 1 mM herzustellen. Alle Reaktionsröhrchen (in Duplikaten) enthielten 50 μl EBP Perlen, 0,5 nM [125J] EPO (NEN Research Products, Boston, 100 μCi/μg) und 0–500 μM Peptid, insgesamt in 500 μl Bindungspuffer (PBS/0,2% BSA). Die Endkonzentration von DMSO wurde in allen Peptidteströhrchen auf 2,5% eingestellt, ein Wert ohne nachweisbaren Effekt, da eine Prüfung der Sensitivität des Tests auf DMSO bewies, dass Konzentrationen von bis zu 25% DMSO (V/V) keinen schädlichen Effekt auf die Bindung hatten. Nicht-spezifische Bindung wurde in jedem einzelnen Test durch Einbeziehung der Röhrchen gemessen, die einen großen Überschuss von unmarkiertem EPO (1000 nM) enthielten. Anfängliche Testpunkte mit nicht-hinzugefügtem Peptid wurden für jeden Test aufgenommen, um die Gesamtbindung zu bestimmen. Bindungsgemische wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit schonendem Schütteln inkubiert. Die Kügelchen wurden dann mit Hilfe von Mikrosäulen (Isolab, Inc.) gesammelt und mit 3 ml Waschpuffer (PBS/5% BSA) gewaschen. Die Säulen, die die gewaschenen Kügelchen enthielten, wurden in 12 × 75 mm Glasröhrchen platziert und die Menge der gebundenen Radioaktivität in einem Gammazähler bestimmt. Die Menge von gebundenem [125J] EPO wurde im Prozent der Kontrollbindung (gesamt = 100%) angegeben und gegen die Peptidkonzentration, nach Korrektur auf unspezifische Bindung, aufgetragen. Die IC50 wurde als die Konzentration des Analyten definiert, die die Bindung von [125J] EPO an die EBP Perlen um 50% reduziert.
  • Beispiel 11
  • EPO-abhängige Zellteilungstests.
  • Zellinie FCD-P1/hER, eine EPO-abhängige Linie, die den nativen humanen EPO-Rezeptor exprimiert, wurde benutzt, um die EPO-mimetische Aktivität von Peptidkandidaten zu bestimmen. Die Zelllinie weist eine EPO-abhängige, zelluläre Proliferation auf, und der Test wurde wie folgt durchgeführt. Die Zellen wurden in RPMI 1640 Medium (Gibco/BRL) gehal ten, das 10% Hitze-inaktiviertes fötales Kälberserum und 10 Einheiten/ml des rekombinanten humanen EPO enthält. Für den zellulären Proliferationstest wurden die Zellen zur stationären Phase gewachsen, zentrifugiert, mit RPMI 1640 Medium (kein EPO) gewaschen und in nicht-EPO enthaltendem Medium 24 Stunden plattiert.
  • Nach 24 Stunden wurden die Zellen gezählt, als 800.000 Zellen/ml resuspendiert, und in 40.000 Zellen/Well aufgeteilt. Stammlösungen der entsprechenden Peptide (10 mM in DMSO) wurden hergestellt und, in dreifache Ansätze aufgeteilt, einer Endkonzentration von 1 × 10–10 M bis 1 × 10–5 M und auf ein Endvolumen von 0,2 ml angepasst. DMSO End-Konzentrationen von 0,1% (V/V, maximal) oder weniger zeigten keine zelluläre Toxizität oder stimulatorischen Effekte. Eine Standard EPO Dosis-Antwortkurve wurde mit jeder Testreihe hergestellt. Nach einer Inkubation von 42 Stunden bei 37°C (ungefähr 2 Zellverdoppelungen) wurde 1 μCi/Welt des [3H] Thymidin hinzugefügt und die Inkubation für 6 Stunden fortgeführt, danach wurden die Zellen geerntet und gezählt, um den [3H] Thymidineinbau als ein Maß der Zellteilung zu bestimmen. Die Resultate wurden als die Menge des Peptides dargestellt, die benötigt wird, um eine Hälfte der maximalen Aktivität mit rekombinanten EPO zu gewinnen, und sind in Tabelle 3 gezeigt.
  • Beispiel 12
  • Dimerisierung des EBP durch EPO-mimetische Peptide.
  • Peptidvermittelte Rezeptordimerisierung wurde für die Studie unter Benutzung des nicht wasserlöslichen homo-bifunktionellen Sulfhydryl-reaktivem Kreuzvernetzungsreagenz DPDPB (1,4-Di-(2'-pyridyldithio)propionamido]butan, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) stabilisiert. EPB (22 μM) wurde in Anwesenheit oder Abwesenheit des DPDPB (1,1 mM), 400 μM Peptidligand, 75 μl PBS, pH 7,5 inkubiert, mit allen Reaktionen und Kontrollen, eine Endkonzentration von 4,4% DMSO und 0,007% TFA enthaltend. Diese Proben wurden für 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und für 12 Stunden bei 4°C vor Analyse unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen durch SDS-PAGE (10 bis 20% Gradientengele, Integrated Separations Systems, Natick, MA) gelagert.

Claims (4)

  1. Verfahren zur Reinigung von Erythropoietin bindendem Protein aus Mikroben-Zellfermentationen, umfassend: a) Ernten von mikrobiellen Zellen aus einer Fermentation; b) Hinzufügen einer ausreichenden Menge eines Lysepuffers zu den geernteten mikrobiellen Zellen, um ein Roh-Lysat herzustellen; c) Sammeln von unlöslichen Proteinen aus dem Roh-Lysat; d) Lösen der unlöslichen Proteine in einem Lösungspuffer; e) Zurückfalten der gelösten Proteine von Schritt d) in einem geeigneten Zurückfaltungspuffer, wobei ein zurückgefaltetes Protein hergestellt wird; f) Binden des zurückgefalteten Proteins aus Schritt e) mit einer hydrophoben Interaktions-Chromatographie-Matrix; g) Eluieren und Sammeln von aktivem Erythropoietin bindendem Protein von der hydrophoben Interaktions-Chromatographie-Matrix; h) in Kontakt bringen des aktiven Erythropoeitin bindenden Proteins aus Schritt g) mit einer Größenausschluß Chromatographie-Matrix; i) Eluieren und Sammeln des aktiven Erythropoietin bindenden Proteins von der Größenausschluß-Chromatographie-Matrix von Schritt h), wobei ein reines Erythropoietin bindendes Protein hergestellt wird; j) gegebenenfalls, Konzentrieren und/oder Diafiltrieren des Produkts von Schritt i) in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger; und k) gegebenenfalls, Sterilisieren des Proteinprodukts.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lyselösung von Schritt b) 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, enthaltend 51 mg von Phenylmethylsulfonylfluorid, 600 mg Eiweiß-Lysozym, 1 mM MgCl2 und 12500 Einheiten Benzonase® ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die hydrophobe Interaktions-Chromatographie-Matrix Phenyl-Toyoperl 650 M ist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, wobei die Größenausschluß-Chromatographie-Matrix eine High-Performance Größenausschluß-Chromatographie-Matrix wie z.B. Bio-Sil SEC-25 oder TosoHaas G3000 SW ist.
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