DE69022297T2

DE69022297T2 - DNS und ihre Verwendung.

Info

Publication number: DE69022297T2
Application number: DE69022297T
Authority: DE
Inventors: Akira Arimura; Ciharu Kimura; Chieko Kitada; Haruo Onda
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Tulane University
Priority date: 1989-06-20
Filing date: 1990-06-19
Publication date: 1996-02-22
Anticipated expiration: 2010-06-20
Also published as: EP0404034A3; ATE127844T1; EP0404034A2; EP0404034B1; CA2019363A1; US5326860A; DE69022297D1; CA2019363C; US5198542A

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues bioaktives Peptid, das von Gehirnhypothalami oder Hoden abgeleitet ist, eine DNA, die ein DNA-Segment enthält, das für das Peptid codiert, eine Transformante, die die DNA trägt, und ein Verfahren zur Herstellung bes obigen Peptids unter Verwendung der Transformante.
Verschiedene Hormone sind bekannt, die von Gehirnhypothalami und Hypophysen sekretiert werden. Beispiele dafür sind Thyreotropin- freisetzendes Hormon, luteinisierendes-Hormon-freisetzendes Hormon, Somatostatin, adrenocorticotropes Hormon, Wachstumshormon und Prolactin. Deren Wirkung ist gut untersucht worden. Einer der Erfinder untersuchte eine bestimmte neue bioaktive Substanz hypothalamischen Ursprungs, eine andere als diese Hormone, auf der Basis von Adenylat-Cyclase-Aktivität und fand daraufhin ein Peptid, das aus 38 Aminosäureresten besteht und bis dahin noch nicht beschrieben worden war. Seine Struktur wurde bestimmt, und das Peptid wurde "PACAP38" genannt.
Die Erfinder reichten Anmeldungen für Patente (Japanische Patentanmeldungen Nr. 1-155791/1990 und 1-284771/1990) über cDNA von Schaf-PACAP38 sowie eine Anmeldung für ein Patent (Japanische Patentanmeldung Nr. 1-259924/1990) über die partielle Struktur von cDNA von Human-PACAP38 ein. Es wurde auch gefunden, daß die Aminosäureseauenz des reifen Teils von Schaf-PACAP38 dieselbe ist wie die von Human-PACAP38 und das einige Aminosäuren von deren Vorstufen substituiert waren.
Obwohl jedoch die Existenz der PACAP38-Peptide wie oben beschrieben bestätigt wurde, ist es schwierig, die Peptide und ihre Vorstufen aus Hypothalami oder dergleichen zu isolieren und zu reinigen, da sehr komplizierte Operationen erforderlich sind und die gewünschten Peptide nur in kleinen Mengen erhalten werden. Es ist daher wünschenswert, ein Verfahren bereitzustellen, um die Peptide leicht und in großen Mengen zu erhalten.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die Erfinder untersuchten Massenherstellungstechniken zur Herstellung der PACAP38-Peptide. Als Ergebnis gelang es den Erfindern, eine cDNA, die für ein PACAP38-Peptid codiert, aus einer cDNA-Bibliothek zu isolieren, die aus einer Messenger-RNA aus Rattenhirn hergestellt wurde, und ihre Nucleotidsequenz bei Ratten sowie beim Schaf und beim Menschen zu bestimmen. Wir fanden, daß die Aminosäuresequenzen dieser drei Arten reifer PACAP38-Proteine dieselben sind, und dies ermöglichte es, die PACAP38-Peptide unter Verwendung gentechnischer Verfahren in großen Mengen zu erhalten, was zur vorliegenden Erfindung führte.
Die Aminosäuresequenz des reifen PACAP38-Proteins wird durch die Formel (1) dargestellt: [Formel 1]
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden bereitgestellt (1) eine DNA, die ein DNA-Segment enthält, das für ein Hypophysen- Adenylat-Cyclase-aktivierendes Polypeptid mit 38 Resten (PACAP38) codiert, bei der es sich um eine DNA handelt, die ein DNA-Segment enthält, das für ein Polypeptid codiert, das der folgenden Formel entspricht:
(2) ein Precursor-Protein für PACAP38; (3) eine Transformante, die eine DNA enthält, die ein DNA-Segment enthält, das für PACAP38 codiert; sowie (4) ein Verfahren zur Herstellung von reifem PACAP38, das das Kultivieren der oben in (3) beschriebenen Transformante, das Erzeugen und Anreichern eines Proteins in einem Kulturprodukt und das Gewinnen des resultierenden Proteins umfaßt.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine vereinfachte Restriktionsenzyinkarte der cDNA, die für einen Teil eines Schaf-PACAP38 codiert;
Fig. 2 zeigt eine Nucleotidsequenz der cDNA, die für einen Teil eines Schaf-PACAP38-Precursors codiert, und die abgeleitete Aminosäuresequenz dieses Teils des Schaf-PACAP38-Precursors;
Fig. 3 ist eine vereinfachte Restriktionsenzymkarte der cDNA, die für einen Teil eines Human-PACAP38-Precursors codiert;
Fig. 4 zeigt eine Nucleotidsequenz der cDNA, die für einen Teil eines Human-PACAP38-Precursors codiert, und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Human-PACAP38-Precursors;
Fig. 5 ist eine vereinfachte Restriktionsenzymkarte der cDNA, die für einen Teil eines Ratten-PACAP38-Precursors codiert; und
Fig. 6 zeigt eine Nucleotidsequenz der cDNA, die für einen Teil eines Ratten-PACAP38-Precursors codiert, und die abgeleitete Aminosäuresequenz dieses Ratten-PACAP38-Precursors.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

In der vorliegenden Erfindung beinhalten die DNAs, die die für Schaf-PACAP38 codierenden DNA-Segmente enthalten, eine DNA, die eine Nucleotidsequenz enthält, die im wesentlichen der Formel (2) oder (3) entspricht, sowie eine DNA, die im wesentlichen einem Teil davon entspricht. Vorzugsweise wird die DNA durch Formel (2) oder (3) oder einen Teil davon dargestellt. [Formel (2)] [Formel (3)]
Zu den Precursorn von Schaf-PACAP38 gehört ein Precursor, der im wesentlichen Formel (8) oder Formel (9) entspricht. Vorzugsweise wird der Precursor durch Formel (8) oder Formel (9) dargestellt. [Formel (8)] [Formel (9)]
In der vorliegenden Erfindung beinhalten die DNAs, die die für Human-PACAP38 codierenden DNA-Segmente enthalten, eine DNA, die eine Nucleotidsequenz enthält, die im wesentlichen Formel (4) oder Formel (5) entspricht, sowie eine DNA, die im wesentlichen einem Teil davon entspricht. Vorzugsweise wird die DNA durch Formel (4) oder (5) oder einen Teil davon dargestellt. [Formel (4)] [Formel (5)]
Zu den Precursorn von Human-PACAP38 gehört ein Precursor, der im wesentlichen Formel (10) oder Formel (11) entspricht. Vorzugsweise wird der Precursor durch Formel (10) oder (11) dargestellt. [Formel (10)] [Formel (11)]
In der vorliegenden Erfindung beinhalten die DNAs, die die für Ratten-PACAP38 codierenden DNA-Segmente enthalten, eine DNA, die eine Nucleotidsequenz enthält, die im wesentlichen Formel (6) oder Formel (7) entspricht, sowie eine DNA, die im wesentlichen einem Teil davon entspricht. Vorzugsweise wird die DNA durch Formel (6) oder (7) oder einen Teil davon dargestellt. [Formel (6)] [Formel (7)]
Zu den Precursorn von Ratten-PACAP38 gehört ein Precursor, der im wesentlichen Formel (12) oder Formel (13) entspricht. Vorzugsweise wird der Precursor durch Formel (12) oder (13) dargestellt. [Formel (12)] [Formel (13)]
Es gibt einen Teil, der Schaf-, Human- und Ratten-PACAP38- Precursorn gemeinsam ist und in Formel (1') dargestellt wird: [Formel 1']
Der Ausdruck "entspricht im wesentlichen" läßt Raum für konservative Additionen, Deletionen und/oder Substitutionen.
In der vorliegenden Erfindung kann ein Expressionsvektor, der eine DNA aufweist, die die Nucleotidsequenz enthält, die für das Precursor-Protein von PACAP38 oder für reifes PACAP38 codiert, zum Beispiel nach dem folgenden Verfahren hergestellt werden:
(i) Messenger-RNA (mRNA) wird aus PACAP38-erzeugenden Zellen isoliert;
(ii) aus der mRNA wird einzelsträngige komplementäre DNA (cDNA) synthetisiert, dann erfolgt die Synthese von doppelsträngiger DNA;
(iii) die komplementäre DNA wird in einen Phagen oder ein Plasmid eingeführt;
(iv) ein Wirt wird mit dem so erhaltenen rekombinanten Phagen oder Plasmid transformiert;
(v) nach der Kultivierung der so erhaltenen Transformante wird das Plasmid oder der Phage, das bzw. der die gewünschte DNA enthält, mit einem geeigneten Verfahren, wie Hybridisierung mit einer DNA-Sonde, die für einen Teil von PACAP38 codiert, oder Immunoassay unter Verwendung eines Anti-PACAP38-Antikörpers, aus der Transformante isoliert;
(vi) die gewünschte klonierte DNA wird aus der rekombinanten DNA herausgeschnitten; und
(vii) die klonierte DNA oder ein Teil davon wird stromabwärts von einem Promotor in dem Expressionsvektor ligasiert.
Die für PACAP38 codierende mRNA kann aus verschiedenen PACAP38- erzeugenden Zellen erhalten werden, wie Schaf-Hypothalami, Human- Hypothalami und -Hoden oder Ratten-Hypothalami und -Hoden.
Zu den Verfahren zur Herstellung von RNA aus den PACAP38- erzeugenden Zellen gehört das Guanidin-Thiocyanat-Verfahren [J.M. Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294 (1979)].
Indem man die so erhaltene mRNA als Matrize verwendet, wird mit Hilfe von Reverser Transcriptase cDNA synthetisiert, zum Beispiel nach dem Verfahren von H. Okayama et al. [Molecular and Cellular Biology 2, 161 (1982); ibid. 3, 280 (1983)]. Die so erhaltene cDNA wird in das Plasmid eingeführt.
Zu den Plasmiden, in die die cDNA eingeführt werden kann, gehören zum Beispiel pBR322 [Gene 2, 95 (1977)], pBR325 [Gene 4, 121 (1978)], pUC12 [Gene 19, 259 (1982)] und pUC13 [Gene 19, 259 (1982)], die jeweils von Escherichia coli abgeleitet sind, sowie pUB110, der von Bacillus subtilis abgeleitet ist [Biochemical and Biophysical Research Communication 112, 678 (1983)]. Es kann jedoch jedes andere Plasmid verwendet werden, solange es in dem Wirt replizierbar und kultivierbar ist. Zu den Phagenvektoren, in die die cDNA eingeführt wird, gehören zum Beispiel λgt11 [R. Young und R. Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 1194 (1983)]. Es kann jedoch jeder andere Phagenvektor verwendet werden, solange er in dem Wirt replizierbar ist.
Zu den Verfahren zur Einführung der cDNA in das Plasmid gehört zum Beispiel das in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Laboratory, S. 239 (1982), beschriebene Verfahren. Zu den Verfahren zur Einführung der cDNA in den Phagenvektor gehört zum Beispiel das Verfahren von T.V. Hyunh et al. [DNA Cloning, A Practical Approach 1, 49 (1985)].
Das so erhaltene Plasmid wird in die geeigneten Wirtszellen, wie Escherichia und Bacillus, eingeführt.
Beispiele für die oben beschriebene Escherichia sind Escherichia coli K12DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 60, 160 (1968)], M103 [Nucleic Acids Research 9 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biologv 41, 459 (1969)] und C600 [Genetics 39 440 (1954)].
Beispiele für den oben beschriebenen Bacillus sind Bacillus subtilis MI114 [Gene 24, 255 (1983)] und 207-21 [Journal of Biochemistry 95, 87 (1984)].
Zu den Verfahren zum Transformieren des Wirts mit dem Plasmid gehören zum Beispiel das Calciumchlorid-Verfahren und das Calciumchlorid/Rubidiumchlorid-Verfahren, das in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 249 (1982), beschrieben ist.
Wenn der Phagenvektor verwendet wird, kann der Phagenvektor zum Beispiel unter Verwendung des in-vitro-Verpackungsverfahrens in vermehrte Escherichia coli transduziert werden.
Schaf-, Ratten- und Human-cDNA-Bibliotheken, die Schaf-, Ratten- bzw. Human-PACAP38-cDNAs enthalten, können alle nach den oben beschriebenen Verfahren und ähnlichen erhalten werden.
Zu den Verfahren zum Klonieren jeder PACAP38-cDNA aus jeder der cDNA-Bibliotheken gehören zum Beispiel das Verfahren von Hyunh et al. unter Verwendung des Phagenvektors λgt11 und eines Anti- PACAP38-Antikörpers [DNA Cloning, A Practical Approach, S. 49 (1985)] sowie das Kolonie-Hybridisierungs- oder Plaque-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung eines Oligonucleotids, das auf der Basis der Aminosäureseouenz von PACAP38 als Sonde chemisch synthetisiert wird [T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)].
Die so klonierte PACAP38-cDNA wird, falls notwendig, zum Beispiel in pBR322, pUC12, pUC13, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 oder dergleichen subkloniert, um die Schaf-PACAP38-cDNA zu erhalten.
Die Nucleotidsequenz der so erhaltenen DNA wird zum Beispiel nach dem Maxam-Gilbert-Verfahren [A.M. Maxam und W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 560 (1977)] oder dem Didesoxy- Verfahren [J. Messing et al., Nucleic Acids Research 9, 309 (1981)] bestimmt, und die Existenz der PACAP38-cDNA wird durch Vergleich mit der bekannten Aminosäuresequenz bestätigt.
Wie oben beschrieben, wird eine DNA erhalten (Schaf-PACAP38-cDNA) [Formel (2)], die für einen Teil des Precursorproteins von PACAP38 codiert.
Die Restriktionsenzymfragmentkarte der in Beispiel 1, das im folgenden beschrieben ist, erhaltenen DNA, die für einen Teil des Precursorproteins von Schaf-PACAP38 codiert, ist in Fig. 1 gezeigt. Die nach dem Didesoxy-Verfahren bestimmte Nucleotidsequenz der cDNA und die aus dieser Nucleotidsequenz ermittelte Aminosäuresequenz sind in Fig. 2 gezeigt.
Die wie oben beschrieben klonierte DNA, die für einen Teil des Precursorproteins von Schaf-PACAP38 codiert, kann je nach der beabsichtigten Verwendung verwendet werden, wie sie ist, oder, falls gewünscht, durch Digestion mit einem Restriktionsenzym herausgeschnitten werden.
Der Bereich, der exprimiert werden soll, wird aus der klonierten DNA herausgeschnitten und stromabwärts des Promotors in einen für die Expression geeigneten Träger (Vektor) ligasiert, wodurch der Expressionsvektor erhalten werden kann.
Die DNA weist am 5'-Terminus ATG als Translations-Startcodon auf und kann am 3'-Terminus TAA, TGA oder TAG als Translations-Stopcodon aufweisen. Dieses Translations-Startcodon und die Translations-Stopcodons können unter Verwendung eines geeigneten synthetischen DNA-Adapters hinzugefügt werden. Um die DNA zu exprimieren, wird der Promotor weiterhin so ligasiert, das er sich stromaufwärts davon befindet.
Zu den Vektoren gehören die obigen von Escherichia coli abgeleiteten Plasmide, wie pBR322, pBR325, pUC12 und pUC13, die von Bacillus subtilis abgeleiteten Plasmide, wie pUB110, pTP5 und pC194, von Hefe abgeleitete Plasmide, wie pSH19 und pSH19, Bakteriophagen, wie der Phage λ, sowie Tierviren, wie Retroviren und Vacciniaviren.
Als der in der vorliegenden Erfindung verwendete Promotor kann jeder Promotor verwendet werden, solange er für die Expression in der für die Genexpression verwendeten Wirtszelle geeignet ist.
Wenn es sich bei der für die Transformation verwendeten Wirtszelle um Escherichia handelt, wird vorzugsweise ein trp-Promotor, ein lac-Promotor, ein reca-Promotor, ein λPL-Promotor, ein lpp- Promotor oder dergleichen verwendet. Wenn es sich bei der Wirtszelle um Bacillus handelt, wird vorzugsweise ein SPO1-Promotor, ein SPO2-Promotor, ein penp-Promotor oder dergleichen verwendet. Wenn es sich bei der Wirtszelle um Hefe handelt, wird vorzugsweise ein PHO5-Promotor, ein PGK-Promotor, ein GAP-Promotor, ein ADH-Promotor oder dergleichen verwendet. Vorzugsweise handelt es sich insbesondere bei der Wirtszelle um Escherichia und bei dem Promotor um den trp-Promotor oder den λPL-Promotor.
Wenn der Wirt eine Tierzelle ist, kann ein von SV40 abgeleiteter Promotor, ein Retrovirus-Promotor, ein Metallothionein-Promotor, ein Hitzeschock-Promotor oder dergleichen verwendet werden.
Die Verwendung eines Enhancers ist ebenfalls wirkungsvoll für die Expression.
Unter Verwendung eines so aufgebauten Vektors, der die DNA enthält, die für das Precursor-Protein von PACAP38 oder das reife Peptid PACAP38 codiert, wird die Transformante hergestellt.
Beispiele für Wirtszellen sind Escherichia, Bacillus, Hefe und Tierzellen.
Spezifische Beispiele für Escherichia und Bacillus sind die oben beschriebenen Stämme.
Beispiele für die oben beschriebene Hefe sind Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R&supmin;, NA87-11a und DKD-5D.
Beispiele für die Tierzellen sind Affenzellen COS-7, Vero, chinesische Hamsterzellen (CHO), Maus-L-Zellen und Human-FL- Zellen.
Die oben beschriebene Transformation von Escherichia erfolgt zum Beispiel nach dem in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 2110 (1972), Gene 17, 107 (1982) oder dergleichen beschriebenen Verfahren.
Die Transformation von Bacillus erfolgt zum Beispiel nach dem in Molecular & General Genetics 168, 111 (1979) oder dergleichen beschriebenen Verfahren.
Die Transformation der Hefe wird zum Beispiel nach dem in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 1929 (1978) beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die Transformation von Tierzellen wird zum Beispiel nach dem in Virology 52, 456 (1973) beschriebenen Verfahren durchgeführt.
So wird die Transformante erhalten, die mit dem Expressionsvektor transformiert ist, der die DNA enthält, die für einen Teil des Precursor-Proteins von PACAP38 oder das reife Peptid (PACAP38) codiert.
Wenn die Wirtszelle Escherichia oder Bacillus ist, eignet sich für die Kultivierung der Transformante besonders ein flüssiges Medium als Kulturmedium. Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen und weitere, die für das Wachstum der Transformanten notwendig sind, sind darin enthalten. Zu den Kohlenstoffquellen gehören zum Beispiel Glucose, Dextrin, lösliche Stärke und Saccharose. Zu den Stickstoffquellen gehören anorganische oder organische Stoffe, wie Ammoniumsalze, Nitrate, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakte, Sojabohnenschrot und Kartoffelextraktlösung. Zu den anorganischen Verbindungen gehören zum Beispiel Calciumchlorid, Natriumdihydrogen phosphat und Magnesiumchlorid. Weiterhin können Hefe, Vitamine, Wachstumsfaktoren usw. hinzugefügt werden.
Der pH-Wert des Mediums beträgt vorzugsweise etwa 5 bis 8.
Als Medium für die Kultur von Escherichia wird vorzugsweise zum Beispiel M9-Medium verwendet, das Glucose und Casamino Acids enthält (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972). Damit der Promotor effizient wirkt, kann, falls erforderlich, ein Wirkstoff wie 3-Indolylacrylsäure hinzugefügt werden.
Wenn die Wirtszelle Escherichia ist, wird die Kultur gewöhnlich etwa 3 bis 24 Stunden bei etwa 15 bis 43ºC durchgeführt, wobei belüftet oder gerührt wird, falls notwendig.
Wenn die Wirtszelle Bacillus ist, wird die Kultur gewöhnlich etwa 6 bis 24 Stunden bei etwa 30 bis 40ºC durchgeführt, wobei belüftet oder gerührt wird, falls notwendig.
Wenn die Hefetransformanten kultiviert werden, wird zum Beispiel Burkholder-Minimalmedium [K.L. Bostian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 77 4505 (1980) als Medium verwendet. Der pH-Wert des Mediums wird vorzugsweise auf etwa 5 bis 8 eingestellt. Die Kultur wird gewöhnlich etwa 24 bis 72 Stunden bei etwa 20 bis 35ºC durchgeführt, wobei belüftet oder gerührt wird, falls notwendig.
Wenn die Tierzelltransformanten kultiviert werden, kann als Medium zum Beispiel MEM-Medium, das etwa 5 bis 20% Kälberfetusserum enthält [Science, 122, 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI1640-Medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967] und 199-Medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] verwendet werden. Der pH-Wert beträgt vorzugsweise etwa 6 bis 8. Die Kultur wird gewöhnlich etwa 15 bis 60 Stunden bei etwa 30 bis 40ºC durchgeführt, wobei belüftet oder gerührt wird, falls notwendig.
Ein Teil des Precursor-Proteins von PACAP38 oder des reifen Peptids (PACAP38) kann aus der oben beschriebenen Kultur zum Beispiel nach dem folgenden Verfahren isoliert und gereinigt werden.
Wenn ein Teil des Precursor-Proteins von PACAP38 oder des reifen Peptids (PACAP38) aus dem kultivierten Zellen extrahiert wird, werden die Zellen nach der Kultur nach einem bekannten Verfahren gewonnen. Dann werden die gewonnenen Zellen in einer geeigneten Pufferlösung suspendiert und durch Ultraschallbehandlung, Lysozym und/oder Frieren/Tauen zerstört. Danach erhält man eine rohe extrahierte Lösung eines Teils des Precursor-Proteins von Schaf- PACAP38 oder des reifen Peptids durch Zentrifugation oder Filtration. Der Puffer kann ein Protein-Denaturierungsmittel, wie Harnstoff oder Guanidin-Hydrochlorid, oder ein Tensid, wie Triton X-100, enthalten.
Wenn ein Teil des Precursor-Proteins von PACAP38 oder des reifen Peptids in die Kulturlösung ausgeschieden wird, wird der Überstand hach Beendigung der Kultur nach einem an sich bekannten Verfahren von den Zellen abgetrennt und dann aufgefangen. Die Abtrennung und Reinigung eines Teils des Precursor-Proteins von Schaf-PACAP38 oder des reifen Peptids, das in dem so erhaltenen Überstand oder der extrahierten Lösung enthalten ist, kann durch eine geeignete Kombination an sich bekannter Trenn- und Reinigungsverfahren erfolgen. Zu diesen bekannten Trenn- und Reinigungsverfahren gehören Verfahren, die auf Löslichkeit beruhen, wie Salzfällung und Lösungsmittelfällung, Verfahren, die hauptsächlich auf einem Unterschied im Molekulargewicht beruhen, wie Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, Verfahren, die auf einem Unterschied in der elektrischen Ladung beruhen, wie Ionenaustausch-Säulenchromatographie, Verfahren, die auf spezifischer Affinität beruhen, wie Affinitätschromatographie, Verfahren, die auf einem Unterschied in der Hydrophobie beruhen, wie Reverse-Phase-HPLC, und Verfahren, die auf einem Unterschied im isoelektrischen Punkt beruhen, wie Elektrophorese mit isoelektrischer Fokussierung.
Die Aktivität eines so gebildeten Teils des PACAP38-Precursor- Proteins oder des reifen Peptids kann durch ein Enzym-Immunoassay unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers gemessen werden. Wenn die Produkte die gefäßverengende Wirkung haben, kann die Aktivität als Index gemessen werden.
Die mit der DNA der vorliegenden Erfindung transfizierten oder transformierten Zellen können eine große Menge des Precursor- Proteins van PACAP38 oder des PACAP38-Peptids erzeugen. Die DNA der vorliegenden Erfindung wird daher auf Versuchstiere angewandt, um ihre Wirkung, insbesondere Gehirnfunktionen, insbesondere Gehirnfunktionen aufgrund von Hormonen, zu verstehen. Weiterhin liefert die so erhaltene Information Informationen, die dazu dienen, Gehirnfunktionen des Menschen aufzuklären.
Weiterhin hat PACAP38 die Wirkung, cAMP zu erhöhen. Somit können dadurch Informationen über das Wachstum und die Erhaltung von Gehirnnerven der Ratte und des Menschen erhalten werden, und PACAP38 kann auch als Therapeutikum für verschiedene Neuropathien verwendet werden.
Oben wurde das Klonieren der für Schaf-, Human- und Ratten- PACAP38 codierenden cDNAs, die Herstellung von Expressionsvektoren von Teilen der PACAP38-Precursor und reifen Peptide des Schafs, des Menschen und der Ratte, die Herstellung entsprechender Transformanten, die Herstellung von Teilen von PACAP38- Precursor-Proteinen und reifen Peptiden unter Verwendung der Transformanten und ihre Anwendbarkeit im Einzelnen beschrieben.
Wenn Nucleotide, Aminosäuren usw. in der Beschreibung und den Zeichnungen durch Abkürzungen bezeichnet sind, werden die Abkürzungen verwendet, die von der IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature angenommen wurden oder die in der Technik gewöhnlich verwendet werden. Zum Beispiel werden die folgenden Abkürzungen verwendet. Wenn bei den Aminosäuren ein optisches Isomer vorliegen kann, ist die L-Form dargestellt, wenn nichts anderes angegeben ist.
DNA : Desoxyribonucleinsäure
cDNA : komplementäre Desoxyribonucleinsäure
A : Adenin
T : Thymin
G : Guanin
C : Cytosin
BNA : Ribonucleinsäure
mRNA : Messenger-Ribonucleinsäure
dATP : Desoxyadenosintriphosphat
dTTP : Desoxythyraidintriphosphat
dGTP : Desoxyguanosintriphosphat
dCTP Desoxycytidintriphosphat
ATP : Adenosintriphosphat
EDTA : Ethylendiamintetraessigsäure
SDS : Natriumdodecylsulfat
BHA : Benzhydrylamin
Cl-Z : 2-Chlorbenzyloxycarbonyl
Br-Z : 2-Brombenzyloxycarbonyl
Bzl : Benzyl
OBzl : Benzylester
HOBT : 1-Benzotriazol
DCC : N,N'-Dichlorhexylcarbodiimid
Gly oder G: Glycin
Ala oder A: Alanin
Val oder V: Valin
Leu oder L: Leucin
Ile oder I: Isoleucin
Ser oder S: Serin
Thr oder T: Threonin
Cys oder C: Cystein
Met oder M: Methionin
Glu oder E: Glutaminsäure
Asp oder D: Asparaginsäure
Lys oder K: Lysin
Arg oder R: Arginin
His oder H: Histidin
Phe oder F: Phenylalanin
Tyr oder V: Tyrosin
Trp oder W: Tryptophan
Pro oder P: Prolin
Asn oder N: Asparagin
Gln oder Q: Glutamin
Ein Teil der Aminosäuresequenz der PACAP38-Precursor-Proteine oder der reifen Proteine der vorliegenden Erfindung kann modifiziert sein, solange dies die biologischen Eigenschaften nicht beeinträchtigt, und zwar kann eine Addition, Eliminierung oder Substitution mit einer anderen Aminosäure vorliegen.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Bezugsbeispiele und Beispiele ausführlicher beschrieben. Selbstverständlich sollen diese Bezugsbeispiele und Beispiele den Umfang der Erfindung nicht einschränken.
Die in dem unten beschriebenen Beispiel 2 erhaltene Transformante Escherichia coli DH5α/pOH3BP7 wurde am 19. Juni 1989 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan (FRL) unter der Zugriffsnummer FERM BP-2484 hinterlegt. Dieser Mikroorganismus wurde auch am 15. Juni 1989 beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO) unter der Zugriffsnummer IFO 14884 hinterlegt.
Die in dem unten beschriebenen Beispiel 3 erhaltene Transformante Escherichia coli DH5α/pHT38P8 wurde am 28. September 1989 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan (FRL) unter der Zugriffsnummer FERM BP-2622 hinterlegt. Dieser Mikroorganismus wurde auch am 28. September 1989 beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO) unter der Zugriffsnummer IFO 14953 hinterlegt.
Die in dem unten beschriebenen Beispiel 4 erhaltene Transformante Escherichia coli JM109/pRB38P21 wurde am 19. Februar 1990 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan (FRL) unter der Zugriffsnummer FERM BP-2762 hinterlegt.

Bezugsbeispiel 1

Die Aminosäuresequenz von Schaf-PACAP38 war mit der von Human- PACAP38 identisch. Wenn man aus Schaf-Hypothalami gereinigtes PACAP38 (Nat.38p) und synthetisiertes PACAP38 (Syn.38p) in vitro auf Ratten-Pituicyten einwirken ließ, wurde eine Erhöhung der Adenylat-Cyclase-Aktivität beobachtet. Die minimale wirksame Menge betrug 10&supmin;¹² M, und es wurde gezeigt, daß die Aktivität mit zunehmender Konzentration zunahm.
Weiterhin wurde eine ähnliche Aktivität auch für synthetisiertes 27-NH&sub2; beobachtet [die Aminosäuren in den Positionen 132 bis 158 in Fig. 2, Position 1 bis 27 des reifen PACAP38, Syn.27p-NH&sub2; in der folgenden Tabelle. Die Sequenz ist in Formel (1") gezeigt.]. [Formel 1"]
Dagegen konnte die entsprechende Aktivität für ein synthetisiertes Schweine-VIP (vasoaktives intestinales Polypeptid) nicht beobachtet werden. Adenylat-Cyclase-Stimulierungstest in Ratten-Pituicyten-Kultur Kontrolle (Blindprobe)

Bezugsbeispiel 2

Man ließ die in Bezugsbeispiel 1 verwendeten Stoffe in gleicher Weise auf Ratten-Pituicyten einwirken. Als Ergebnis wurde dabei die freisetzende Wirkung in bezug auf Prolactin (PRL), ACTH und GH bestätigt.

Beispiel 1

Herstellung einer DNA-Sonde, die für einen Teil von Schaf-PACAP38 codiert
Eine Messenger-RNA-Sequenz wurde aus der Aminosäuresequenz abgeleitet, die sich aus den Resten 1 bis 27 von Schaf-PACAP38,
zusammensetzt, und eine DNA-Sonde mit der folgenden Sequenz wurde chemisch synthetisiert.
Der 5'-Terminus dieser DNA-Sonde wurde unter Verwendung von T4-Polynucleotid-Kinase mit ³²P phosphoryliert. Die phosphorylierte DNA-Sonde wurde zur Durchmusterung der cDNA-Bibliothek verwendet.

Beispiel 2

Isolierung von Schaf-PACAP38-Precursor-cDNA und Bestimmung ihrer Nucleotidsequenz
Escherichia coli Y1090 wurde mit der obigen Schaf-Hypothalamus- cDNA-Bibliothek (Clontech Laboratories, Inc.) infiziert und als Platte ausgestrichen, um zu bewirken, daß Phagenplaques erscheinen. Ein Teil der DNA aus den Plaques wurde nach dem Verfahren von W. Benton und R. Davis [Science 196, 180-182 (1977)] auf einen Nitrocellulosefilm übertragen und mit der in Beispiel 1 mit ³²P markierten DNA-Sonde hybridisiert. Die Hybridisierung wurde bei 60ºC in Abwesenheit von Formaldehyd durchgeführt. 5 Klone, die auf die Hybridisierung positiv reagierten, wurden alle isoliert. Dann wurde ein cDNA-Teil von λOH38P7, bei dem es sich um einen der oben beschriebenen Klone handelte, mit EcoRI herausgeschnitten und wieder in die EcoRI-Stelle des Plasmids pUC18 einkloniert, wobei das Plasmid pOH38P7 hergestellt wurde. Durch Transformieren von Escherichia coli DH5α mit diesem Plasmid wurde die Transformante Escherichia coli DH5α/pOH38P7 erhalten. Der in diesem Plasmid eingeschlossene cDNA-Teil hatte 1,8 kbp, und die vereinfachte Restriktionsenzymkarte davon ist in Fig. 1 gezeigt. In der Figur zeigt einen Codebereich für reifes Schaf-PACAP38. Die Nucleotidsequenz dieses cDNA-Teils wurde nach dem Verfahren von Sanger bestimmt [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467 (1977)]. Diese Nucleotidsequenz und ein Teil der daraus abgeleiteten Aminosäuresequenz des Schaf-PACAP38-Precursors sind in Fig. 2 gezeigt. Der von umgebene Bereich zeigt den Teil des reifen Peptids von Schaf-PACAP38.

Beispiel 3

Isolierung von Human-PACAP38-Precursor-cDNA und Bestimmung ihrer Nucleotidsequenz

Escherichia coli Y1090 wurde mit der obigen Hoden-cDNA-Bibliothek (Clontech Laboratories, Inc.) infiziert und als Platte ausgestrichen, um zu bewirken, daß Phagenplaques erscheinen. Ein Teil der DNA aus den Plaques wurde nach dem Verfahren von W. Benton und R. Davis [Science 196, 180-182 (1977)] auf einen Nitrocellulosefilm übertragen und mit der in Beispiel 1 mit ³²P markierten DNA-Sonde hybridisiert. Die Hybridisierung wurde bei 60ºC in Abwesenheit von Formaldehyd durchgeführt. 5 Klone, die auf die Hybridisierung positiv reagierten, wurden alle isoliert. Dann wurde ein cDNA-Teil von HT38P8, bei dem es sich um einen der oben beschriebenen Klone handelte, mit EcoRI herausgeschnitten und wieder in die EcoRI-Stelle des Plasmids pUC18 einkloniert, wobei das Plasmid pHT38P8 hergestellt wurde. Durch Transformieren von Escherichia coli DH5α mit diesem Plasmid wurde die Transformante Escherichia coli DH5α/pHT38P8 erhalten. Der in diesem Plasmid eingeschlossene cDNA-Teil hatte 2,3 kbp, und die vereinfachte Restriktionsenzymkarte davon ist in Fig. 3 gezeigt. In der Figur zeigt einen Codebereich für reifes Human-PACAP38. Die Nucleotidsequenz dieses cDNA-Teils wurde nach dem Verfahren von Sanger bestimmt [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467 (1977)]. Diese Nucleotidsequenz und ein Teil der daraus abgeleiteten Amindsäuresequenz des Human-PACAP38-Precursors sind in Fig. 4 gezeigt. Der von umgebene Bereich zeigt den Teil des reifen Peptids von Human-PACAP38.

Beispiel 4

Isolierung von Ratten-PACAP38-Precursor-cDNA und Bestimmung ihrer Nucleotidsequenz

Escherichia coli Y1090 wurde mit der obigen Hoden-cDNA-Bibliothek (Clontech Laboratories, Inc.) infiziert und als Platte ausgestrichen, um zu bewirken, daß Phagenplaques erscheinen. Ein Teil der DNA aus den Plaques wurde nach dem Verfahren von W. Benton und R. Davis [Science 196, 180-182 (1977)] auf einen Nitrocellulosefilm übertragen und mit der in Beispiel 1 mit ³²P markierten DNA-Sonde hybridisiert. Die Hybridisierung wurde bei 60ºC in Abwesenheit von Formaldehyd durchgeführt. 4 Klone, die auf die Hybridisierung positiv reagierten, wurden alle isoliert. Dann wurde ein cDNA-Teil von RB38P68, bei dem es sich um einen der oben beschriebenen Klone handelte, mit EcoRI herausgeschnitten und wieder in die EcoRI-Stelle des Plasmids pUC18 einkloniert, wobei das Plasmid pRB38P21 hergestellt wurde. Durch Transformieren von Escherichia coli JM109 mit diesem Plasmid wurde die Transformante Escherichia coli JM109/pRB38P21 erhalten. Der in diesem Plasmid eingeschlossene cDNA-Teil hatte 1,2 kbp, und die vereinfachte Restriktionsenzymkarte davon ist in Fig. 5 gezeigt. In der Figur zeigt einen Codebereich für reifes Ratten- PACAP38. Die Nucleotidsequenz dieses cDNA-Teils wurde nach dem Verfahren von Sanger bestimmt [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467 (1977)]. Diese Nucleotidsequenz und ein Teil der daraus abgeleiteten Aminosäuresequenz des Ratten-PACAP38-Precursors sind in Fig. 6 gezeigt. Der von umgebene Bereich zeigt den Teil des reifen Peptids von Ratten-PACAP38.

Beispiel 5

Synthese von PACAP38-NH&sub2;

PACAP38-NH&sub2; wurde synthetisiert, wobei man 1,04 g (0,5 mmol) eines kommerziell erhältlichen p-Methyl-BHA-Harzes (Applied Biosystems Inc.) und einen Peptidsynthesizer (Model 430A, Applied Biosystems Inc.) verwendete.
Eine Ausgangsaminosäure, Boc-Lys(Cl-Z) wurde mit HOBt/DCC aktiviert und dann an das Harz kondensiert. Danach wurde die Boc-Gruppe an dem Harz mit 50% Trifluoressigsäure/Methylenchlorid behandelt, um die Schutzgruppe von der Aminogruppe zu entfernen. An diese freie Aminogruppe wurden nacheinander die folgenden geschützten, mit HOBT/DCC aktivierten Aminosäuren gemäß der Aminosäuresequenz von PACAP38 kondensiert:
Nach Beendigung der Reaktionen wurden die restlichen Aminogruppen mit Essigsäureanhydrid acetyliert, wobei man 2,42 g eines Harzes mit geschütztem PACAP38-NH&sub2; erhielt.
0,51 g des resultierenden Harzes mit geschütztem PACAP38-NH&sub2; wurden bei 0ºC 60 Minuten in Gegenwart von 0,6 g p-Kresol mit 5 ml Fluorwasserstoff behandelt, danach wurde überschüssiger Fluorwasserstoff durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde zweimal mit 5 ml Ethylether gewaschen und dann mit 6 ml 50%iger wäßriger Essigsäure extrahiert. Das unlösliche Material wurde durch Filtration entfernt und mit 5 ml 50%iger wäßriger Essigsäure gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden kombiniert, und die kombinierte Lösung wurde auf 2 bis 3 ml konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde auf eine Säule mit Sephadex LH-20 (2 x 90 cm) aufgetragen und mit 50%iger Essigsäure eluiert. Die Hauptfraktionen wurden gesammelt, anschließend wurde [das Lösungsmittel] durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt. Dann wurde der Rückstand in 100 ml 0,1%iger wäßriger Trifluoressigsäure gelöst. Die resultierende Lösung wurde auf eine Säule mit dem Harz YMC-ODS AM120 S-50 (1,6 x 7 cm) aufgetragen und mit einem linearen Gradienten von 0,1%iger wäßriger Trifluoressigsäure und 50%igem Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt, eluiert.
Die Hauptfraktionen wurden miteinander kombiniert und danach lyophilisiert. So wurden 60 mg eines weißen Pulvers erhalten. Dieses Pulver wurde in 20 ml 0,05 M wäßrigem Ammoniumacetat gelöst. Die resultierende Lösung wurde auf eine Säule mit CM-Cellulofine-Barz (1 x 6 cm) aufgetragen und mit einem linearen Gradienten von 0,05 M bis 1 M Ammoniumacetat eluiert. Die Hauptfraktionen wurden miteinander kombiniert. Die kombinierte Lösung wurde wiederum auf eine YMC-ODS-Säule (2,6 x 7 cm) aufgetragen und mit einem linearen Gradienten von 0%igem bis 40%igem wäßrigem Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt, eluiert. Die Fraktionen mit 28% bis 30% Acetonitril wurden gesammelt und anschließend lyophilisiert. So wurden 21,6 mg eines weißen Pulvers erhalten.

Anal. der Aminosäuren:

Asp 2.90(3), Thr 0.84(1), Ser 2.10(3), Glu 2.21(2), Gly 2.00(2), Ala 3.29(3), Val 3.19(3), Met 1.01(1), Ile 0.87(1), Leu 2.19(2), Tyr 3.93(4), Phe 0.92(1), Lys 7.18(7), Bis 0.96(1), Arg 4.19(4)
(M + H)&spplus; durch Massenspektrometrie (SIMS): 4530
HPLC-Elutionszeit: 19,6 Minuten

Säulenbedingungen

Säule: YMC-ODS (AM-301, S-5 120A)
Eluent: A (0,1%ige wäßrige Trifluoressigsäure)
B (Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt)
50 Minuten Elution mit linearem Gradienten vom Eluenten A zum Eluenten B
Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/Minute

Beispiel 6

Synthese von PACAP27-NH&sub2;

PACAP27-NH&sub2; wurde synthetisiert, wobei man 1,04 g (0,5 mmol) eines kommerziell erhältlichen p-Methyl-BHA-Harzes (Applied Biosystems Inc.) und einen Peptidsynthesizer (Model 430A, Applied Biosystems Inc.) verwendete.
Eine Ausgangsaminosäure, Boc-Leu, wurde mit HOBt/DCC aktiviert und dann an das Harz kondensiert. Danach wurde die Boc-Gruppe an dem Harz mit 50% Trifluoressigsäure/Methylenchlorid behandelt, um die Schutzgruppe von der Aminogruppe zu entfernen. An diese freie Aminogruppe wurden nacheinander die folgenden geschützten, mit HOBt/DCC aktivierten Aminosäuren gemäß der Aminosäuresequenz von PACAP38 (1-27) kondensiert:
Nach Beendigung der Reaktionen wurden die restlichen Aminogruppen mit Essigsäureanhydrid acetyliert, wobei man 2,31 g eines Harzes mit geschütztem PACAP27-NH&sub2; erhielt.
0,50 g des resultierenden Harzes mit geschütztem PACAP27-NH&sub2; wurden bei 0ºC 60 Minuten in Gegenwart von 0,6 g p-Kresol mit 5 ml Fluorwasserstoff behandelt, danach wurde überschüssiger Fluorwasserstoff durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde zweimal mit 5 ml Ethylether gewaschen und dann mit 6 ml 50%iger wäßriger Essigsäure extrahiert. Das unlösliche Material wurde durch Filtration entfernt und mit 5 ml 50%iger wäßriger Essigsäure gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden kombiniert, und die kombinierte Lösung wurde auf 2 bis 3 ml konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde auf eine Säule mit Sephadex LH-20 (2 x 90 cm) aufgetragen und mit 50%iger Essigsäure eluiert. Die Hauptfraktionen wurden gesammelt, anschließend wurde lyophilisiert, wobei man 129 mg eines weißen Pulvers erhielt. Dieses Pulver wurde in 5 ml 0,1%iger wäßriger Trifluoressigsäure gelöst. Die resultierende Lösung wurde auf eine Säule mit TSK-Gel (ODS-120T) (21,5 x 300 mm) aufgetragen und mit 27%igem Acetonitril, das 0,1% wäßrige Trifluoressigsäure enthielt, eluiert. Die Hauptfraktionen wurden gesammelt und anschließend lyophilisiert. So wurden 17,2 mg eines weißen Pulvers erhalten.

Anal. der Aminosäuren:

Asp 1.99(2), Thr 0.98(1), Ser 2.76(3), Glu 1.25(1), Gly 1.05(1), Ala 3.0 (3), Val 1.56(2), Met 0.78(1), Ile 0.72(1), Leu 1.88(2), Tyr 2.22(3), Phe 0.75(1), Lys 2.73(3), Bis 1.51(1), Arg 1.94(2)
(M + H)&spplus; durch Massenspektrometrie (SIMS): 3145
HPLC-Elutionszeit: 21,2 Minuten

Säulenbedingungen

Beispiel 7

Unter Verwendung männlicher Wistar-Ratten mit einem Körpergewicht von 350 g unter Nembutal-Anästhesie wurde die hypotonische Wirkung gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Dosierung (nmol/kg) Verbindung Einheit: mm Hg

Claims

1. DNA, die ein DNA-Segment enthält, das für ein Hypophysen- Adenylat-Cyclase-aktivierendes Polypeptid mit 38 Resten (PACAP38) codiert, bei der es sich um eine DNA handelt, die ein DNA-Segment enthält, das für ein Polypeptid codiert, das der folgenden Formel entspricht:

2. DNA gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem für PACAP38 codierenden DNA-Segment um ein DNA-Segment handelt, das für Schaf-PACAP38 codiert, wobei das DNA-Segment eine Nucleotidsequenz enthält, die der folgenden Formel oder einem Teil davon entspricht und Adenylat-Cyclase aktivieren kann:

3. DNA gemäß Anspruch 2, wobei es sich bei dem für PACAP38 codierenden DNA-Segment um ein DNA-Segment handelt, das für Schaf-PACAP38 codiert, wobei das DNA-Segment eine Nucleotidsequenz enthält, die der folgenden Formel entspricht und Adenylat-Cyclase aktivieren kann:

4. DNA gemäß Anspruch 2, wobei es sich bei dem für PACAP38 codierenden DNA-Segment um ein DNA-Segment handelt, das für Schaf-PACAP38 codiert, wobei das DNA-Segment eine Nucleotidsequenz enthält, die der folgenden Formel entspricht und Adenylat-Cyclase aktivieren kann:

5. DNA gemäß Anspruch 2, wobei das für Schaf-PACAP38 codierende DNA-Segment eine Nucleotidsequenz enthält, die der folgenden Formel oder einem Teil davon entspricht und Adenylat-Cyclase aktivieren kann:

6. DNA gemäß Anspruch 5, wobei das für Schaf-PACAP38 codierende DNA-Segment eine Nucleotidsequenz enthält, die der folgenden Formel entspricht und Adenylat-Cyclase aktivieren kann:

7. DNA gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem für PACAP38 codierenden DNA-Segment um ein DNA-Segment handelt, das für Human-PACAP38 codiert, wobei das DNA-Segment eine Nucleotidsequenz enthält, die der folgenden Formel oder einem Teil davon entspricht und Adeknylat-Cyclase aktivieren kann:

8. DNA gemäß Anspruch 7, wobei es sich bei dem für PACAP38 codierenden DNA-Segment um ein DNA-Segment handelt, das für Human-PACAP38 codiert, wobei das DNA-Segment eine Nucleotidsequenz enthält, die der folgenden Formel entspricht und Adenylat-cyclase aktivieren kann:

9. DNA gemäß Anspruch 7, wobei es sich bei dem für PACAP38 codierenden DNA-Segment um ein DNA-Segment handelt, das für Human-PACAP38 codiert, wobei das DNA-Segment eine Nucleotidsequenz enthält, die der folgenden Formel oder einem Teil davon entspricht und Adenylat-Cyclase aktivieren kann:

10. DNA gemäß Anspruch 7, wobei das für Human-PACAP38 codierende DNA-Segment eine Nucleotidsequenz enthält, die der folgenden Formel oder einem Teil davon entspricht und Adenylat-Cyclase aktivieren kann:

11. DNA gemäß Anspruch 10, wobei das für Human-PACAP38 codierende DNA-Segment eine Nucleotidsequenz enthält, die der folgenden Formel entspricht und Adenylat-Cyclase aktivieren kann:

12. DNA gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem für PACAP38 codierenden DNA-Segment um ein DNA-Segment handelt, das für Ratten-PACAP38 codiert, wobei das DNA-Segmenteine Nucleotidsequenz enthält, die der folgenden Formeloder einem Teil davon entspricht und Adenylat-Cyclaseaktivieren kann:

13. DNA gemäß Anspruch 12, wobei es sich bei dem für PACAP38 codierenden DNA-Segment um ein DNA-Segment handelt, das für Ratten-PACAP38 codiert, wobei das DNA-Segment eine Nucleotidsequenz enthält, die der folgenden Formel entspricht und Adenylat-Cyclase aktivieren kann:

14. DNA gemäß Anspruch 12, wobei es sich bei dem für PACAP38 codierenden DNA-Segment um ein DNA-Segment handelt, das für Ratten-PACAP38 codiert, wobei das DNA-Segment eine Nucleotidsequenz enthält, die der folgenden Formel entspricht und Adenylat-Cyclase aktivieren kann:

15. DNA gemäß Anspruch 12, wobei das für Ratten-PACAP38 codierende DNA-Segment eine Nucleotidsequenz enthält, die der folgenden Formel oder einem Teil davon entspricht und Adenylat-Cyclase aktivieren kann:

16. DNA gemäß Anspruch 15, wobei das für Ratten-PACAP38 codierende DNA-Segment eine Nucleotidsequenz enthält, die der folgenden Formel entspricht und Adenylat-Cyclase aktivieren kann:

17. Precursor-Protein für ein Hypophysen-Adenylat-Cyclase- aktivierendes Polypeptid mit 38 Resten (PACAP38), das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die der folgenden Formel entspricht:

18. Precursor-Protein für ein Hypophysen-Adenylat-Cyclase- aktivierendes Polypeptid mit 38 Resten (PACAP38) des Schafes, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die der folgenden Formel entspricht:

19. Precursor-Protein für ein Hypophysen-Adenylat-Cyclase- aktivierendes Polypeptid mit 38 Resten (PACAP38) des Schafes, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, dieder folgenden Formel entspricht:

20. Precursor-Protein für ein Hypophysen-Adenylat-Cyclase- aktivierendes Polypeptid mit 38 Resten (PACAP38) des Menschen, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die der folgenden Formel entspricht:

21. Precursor-Protein für ein Hypophysen-Adenylat-Cyclase- aktivierendes Polypeptid mit 38 Resten (PACAP38) des Menschen, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, dieder folgenden Formel entspricht:

22. Precursor-Protein für ein Hypophysen-Adenylat-Cyclase- aktivierendes Polypeptid mit 38 Resten (PACAP38) der Ratte, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die der folgenden Formel entspricht:

23. Precursor-Protein für ein Hypophysen-Adenylat-Cyclase- aktivierendes Polypeptid mit 38 Resten (PACAP38) der Ratte, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die der folgenden Formel entspricht:

24. Transformante, die eine DNA enthält, die ein DNA-Segment enthält, das für ein Hypophysen-Adenylat-Cyclase-aktivierendes Polypeptid mit 38 Resten (PACAP38) codiert, bei dem es sich um ein DNA-Segment handelt, das für ein Polypeptid codiert, das der folgenden Formel entspricht:

25. Verfahren zur Herstellung eines reifen Proteins eines Hypophysen-Adenylat-Cyclase-aktivierenden Polypeptids mit 38 Resten (PACAP38), bei dem es sich um ein Polypeptid handelt, das der folgenden Formel entspricht:

wobei das Verfahren das Kultivieren der Transformante gemäß Anspruch 24 umfaßt.

26. Transformante, die die DNA gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6 enthält.

27. Transformante gemäß Anspruch 26, bei der es sich um E. coli DH5α/pOH38P7 (FERM BP-2484) handelt.

28. Verfahren zur Herstellung eines reifen Proteins eines Hypophysen-Adenylat-Cyclase-aktivierenden Polypeptids mit 38 Resten (PACAP38), bei dem es sich um ein Polypeptid handelt, das der folgenden Formel entspricht:

wobei das Verfahren das Kultivieren der Transformante gemäß Anspruch 26, das Erzeugen und Anreichern des reifen PACAP38-Proteins in einer Kultur und das Gewinnen des Proteins umfaßt.

29. Transformante, die die DNA gemäß einem der Ansprüche 7 bis 11 trägt.

30. Transformante gemäß Anspruch 29, bei der es sich um E. coli DH5α/pHT38P8 (FERM BP-2622) handelt.

31. Verfahren zur Herstellung eines reifen Proteins eines Hypophysen-Adenylat-Cyclase-aktivierenden Polypeptids mit 38 Resten (PACAP38), bei dem es sich um ein Polypeptid handelt, das der folgenden Formel entspricht:

wobei das Verfahren das Kultivieren der Transformante gemäß Anspruch 29, das Erzeugen und Anreichern des reifen PACAP38-Proteins in einer Kultur und das Gewinnen des Proteins umfaßt.

32. Transformante, die die DNA gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16 trägt.

33. Transformante gemäß Anspruch 32, bei der es sich um E. coli JM109/pRB38P21 (FERM BP-2762) handelt.

34. Verfahren zur Herstellung eines reifen Proteins eines Hypophysen-Adenylat-Cyclase-aktivierenden Polypeptids mit 38 Resten (PACAP38), bei dem es sich um ein Polypeptid handelt, das der folgenden Formel entspricht:

wobei das Verfahren das Kultivieren der Transformante gemäß Anspruch 32, das Erzeugen und Anreichern des reifen PACAP38-Proteins in einer Kultur und das Gewinnen des Proteins umfaßt.