CN114173874A - 含pacap肽或pacap的稳定化肽的神经营养性角膜炎的预防或治疗用组合物 - Google Patents

含pacap肽或pacap的稳定化肽的神经营养性角膜炎的预防或治疗用组合物 Download PDF

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Abstract

本发明以提供神经营养性角膜炎的预防或治疗用组合物作为目的。本发明人发现PACAP肽在神经营养性角膜炎模型中，发挥角膜损伤的抑制效果，以及在培养神经细胞模型中促进神经轴索延伸。再者，提供通过将PACAP的序列中的3位及/或8位的天冬氨酸的羧基用四唑取代，稳定性显著地亢进，含PACAP肽或稳定化的PACAP肽的神经营养性角膜炎的预防或治疗用组合物、以及神经轴索延伸促进剂。

Description

含PACAP肽或PACAP的稳定化肽的神经营养性角膜炎的预防或 治疗用组合物
【技术领域】
本发明涉及含具有PACAP的生理活性的稳定化肽的神经营养性角膜炎的预防或治疗用组合物。
【背景技术】
角膜的知觉通过眨眼反射及流泪反射而对于预防损伤而言重要，被角膜神经支配。一方面，角膜神经不仅介导知觉，对于角膜上皮，经从角膜神经终末释放的神经传递物质或神经生长因子的分泌，对角膜上皮细胞增殖产生影响。角膜神经受损伤，则知晓角膜上皮细胞的代谢发生改变，损害增殖性，引起营养障碍性溃疡。神经营养性角膜炎或神经麻痹性角膜症是以三叉神经的损伤作为原因的变性角膜疾病，引起角膜上皮的损伤。在最重症型中有带来角膜的溃疡－融解－穿孔时，损害患者的目视确认能力。称为如角膜的疱疹一样的病毒感染、眼外伤、角膜手术、再者糖尿病的全身症状等，各种各样的临床症状可成为神经营养性角膜炎的原因。特别是，疱疹的感染有占神经营养性角膜炎的27％的报告。神经营养性角膜炎尽管很早就知晓其存在，但尚未开发其有效的治疗方法。
随神经科学的发展，发现了各种神经保护因子，期待作为神经障碍的预防或治疗药的开发。发现了减少引起神经变性的自由基或兴奋性氨基酸的药剂或可保护及/或修复神经细胞的药剂(例如神经营养因子或免疫抑制剂等的免疫亲和素配体等)具有神经保护作用的同时，发现了垂体腺苷酸环化酶活化多肽(PACAP)、CD44或人脑羧基肽酶B(HBCPB)等的生物体内蛋白质具有神经保护作用(专利文献1及2)。
垂体腺苷酸环化酶活化多肽(PACAP)是从绵羊下丘脑提取物发现的神经肽。PACAP可在垂体前叶细胞中具有刺激cAMP形成的活性。作为PACAP，存在由38个氨基酸残基构成的PACAP38和由27个氨基酸残基构成的PACAP27，两者均具有同等的作用(非专利文献1及2)。PACAP属于血管活性肠多肽(VIP)/胰泌素/胰高血糖素超家族，人PACAP27的序列与血管活性肠多肽(VIP)具有68％的相同性。PACAP和VIP与PAC1受体(PAC1R)、VPAC1受体(VPAC1R)及VPAC2受体(VPAC2R)结合，在对于这些受体的亲和性的点不同。PAC1R对于PACAP具有高的选择性地结合，对于PACAP的亲和性与对于VIP的亲和性比较高1000倍以上。一方面，VPAC1R及VPAC2R一同，对于PACAP和VIP具有同程度的亲和性。知晓PACAP具有多样的生理作用，具有作为神经保护物质、免疫抑制因子、血管扩张因子、外分泌线段泌促进因子(专利文献3)、神经突起形成促进因子(专利文献4)的生理作用。
利用PACAP所具有的多样的生理活性而进行药品的开发。但是知晓，如PACAP一样的比较短的肽多在水溶液中不稳定，另外，起因于缺乏蛋白酶抗性而在生物体内的半衰期短的问题。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1：特表2014-510101号公报
专利文献2：特开2012-232952号公报
专利文献3：特开2009-269818号公报
专利文献4：国际公开第2005/102375号
【非专利文献】
非专利文献1：S.Bourgault(2009)Current Medicinal Chemistry 16,4462-4480
非专利文献2：Louise Dickson(2009)Pharmacology&Therapeutics,12,294-316
非专利文献3：Alessandro Lambiase(2012)Investigative Ophthalmology&Visual Science,vol.53,No.13,p.8280-8287
【发明的概要】
【发明要解决的课题】
本发明旨在提供神经营养性角膜炎的预防或治疗用组合物。
【用于解决课题的手段】
本发明人发现，PACAP肽或其稳定化肽在神经营养性角膜炎模型中发挥角膜损伤的抑制效果，以及在培养神经细胞模型中促进神经轴索延伸，从而完成本发明。再者，作为发现稳定化肽，通过将存在于PACAP肽中的天冬氨酸的羧基取代为四唑，可大幅地提高在水溶液中的稳定性。
从而，本发明涉及以下技术方案：
[1-1]神经营养性角膜炎的预防或治疗用医药组合物，其含由以下的序列所表示的序列、或者其稳定化序列构成的肽：
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVLGKR YKQRVKNK(SEQ ID NO:1)、或者
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVL(SEQ ID NO:2)。
[1-2]用于在神经营养性角膜炎的预防或治疗中使用的肽，其为由以下的序列所表示的序列、或者其稳定化序列构成的肽：
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVLGKR YKQRVKNK(SEQ ID NO:1)、或者
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVL(SEQ ID NO:2)。
[1-3]神经营养性角膜炎的预防或治疗方法，包括向需要神经营养性角膜炎的治疗或预防的对象施用由以下的序列所表示的序列、或者其稳定化序列构成的肽：
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVLGKR YKQRVKNK(SEQ ID NO:1)、或者
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVL(SEQ ID NO:2)。
[1-4]由以下的序列所表示的序列、或者其稳定化序列构成的肽用于制造神经营养性角膜炎的治疗用的医药的用途：
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVLGKR YKQRVKNK(SEQ ID NO:1)、或者
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVL(SEQ ID NO:2)。
[2]由上述稳定化序列构成的肽是在SEQ ID NO:1或2的序列中，3位及/或8位的天冬氨酸残基的羧基被取代为四唑的序列、或者所述序列的一部分发生改变的序列，其中在上述稳定化序列是所述序列的一部分发生改变的序列时，由稳定化序列构成的肽具有向PAC1R、VPAC1R及VPACR2的结合性的，项目1-1所述的预防或治疗用组合物、项目1-2所述的肽、项目1-3所述的方法、或者项目1-4所述的使用。
[3]由上述稳定化序列构成的肽是由下述的式所表示的序列中3位及/或8位的天冬氨酸残基的羧基被取代为四唑的序列或其改变序列构成的肽：
H-X1-D-G-I-F-T-D-X2-Y-X3-R-Y-R-X4-X5-X6-A-X7-X8-X9-Y-L-A-A-V-X10(SEQ IDNO:3)
(式中，X1是中性氨基酸、X2是中性氨基酸、X3是中性氨基酸、X4是碱性氨基酸、X5是中性氨基酸或egTz、X6是非极性氨基酸、X7是非极性氨基酸、X8是碱性氨基酸、X9是碱性氨基酸、X10是中性氨基酸)，
上述肽具有向PAC1R、VPAC1R及VPACR2的结合性，上述改变序列是在SEQ ID NO:3的序列中缺失或附加1或多个氨基酸的序列的，含上述肽的，项目1-1或项目2所述的预防或治疗用组合物、项目1-2或项目2所述的肽、项目1-3或项目2所述的方法、或者项目1-4或项目2所述的使用。
[4]X1、X2、及X3中的中性氨基酸是丙氨酸或丝氨酸的，项目1-1所述的预防或治疗用组合物、项目3所述的预防或治疗用组合物、肽、方法、或者使用。
[5]X4、X8、及X9中的碱性氨基酸是赖氨酸或精氨酸的，项目3或4所述的预防或治疗用组合物、肽、方法、或者使用。
[6]X5是谷氨酰胺、丙氨酸、或者，egTz的，项目3～项目5之任一项所述的预防或治疗用组合物、肽、方法、或者使用。
[7]再者X6是甲硫氨酸、正亮氨酸、丙氨酸或亮氨酸的，项目3～6之任一项所述的预防或治疗用组合物、肽、方法、或者使用。
[8]X7是缬氨酸或丙氨酸的，项目3～项目7之任一项所述的预防或治疗用组合物、肽、方法、或者使用。
[9]X10是亮氨酸或丙氨酸的，项目3～8之任一项所述的预防或治疗用组合物、肽、方法、或者使用。
[10]SEQ ID NO:3的3位及8位的天冬氨酸的羧基被取代为四唑的，项目3～9之任一项所述的预防或治疗用组合物、肽、方法、或者使用。
[11]在上述肽中，N末端被乙酰基化或甲磺酰化的，项目3～10之任一项所述的预防或治疗用组合物、肽、方法、或者使用。
[12]在上述肽中，N末端被乙酰基化的，项目3～11之任一项所述的预防或治疗用组合物、肽、方法、或者使用。
[13]1或2个氨基酸缺失的，项目3～12之任一项所述的预防或治疗用组合物、肽、方法、或者使用。
[14]项目3～项目13之任一项所述的预防或治疗用组合物、肽、方法、或者使用，其中向上述肽的C末端附加选自以下的序列的1种序列：
GKRYKQRVKNK(SEQ ID NO:37)；
GKRYKQRVKN(SEQ ID NO:38)；
GKRYKQRVK(SEQ ID NO:39)；
GKRYKQRV(SEQ ID NO:40)；
GKRYKQR(SEQ ID NO:41)；
GKRYKQ(SEQ ID NO:42)；
GKRYK(SEQ ID NO:43)；
GKRY(SEQ ID NO:44)；
GKR；
GRR；
GK；
GR；及
G。
[15-1]神经轴索延伸促进剂，其含由以下的序列所表示的序列、或者其稳定化序列构成的肽：
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVLGKR YKQRVKNK(SEQ ID NO:1)、或者
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVL(SEQ ID NO:2)。
[15-2]促进神经轴索延伸的方法，其包括向需要神经轴索延伸的促进的对象施用由以下的序列所表示的序列、或者其稳定化序列构成的肽：
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVLGKR YKQRVKNK(SEQ ID NO:1)、或者
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVL(SEQ ID NO:2)。
[15-3]由以下的序列所表示的序列、或者其稳定化序列构成的肽用于制造神经轴索延伸促进剂的用途：
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVLGKR YKQRVKNK(SEQ ID NO:1)、或者
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVL(SEQ ID NO:2)。
[15-4]用于经神经轴索延伸促进而在神经营养性角膜炎、神经损伤治疗用或神经再生治疗中使用的，由以下的序列所表示的序列、或者其稳定化序列构成的肽：
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVLGKR YKQRVKNK(SEQ ID NO:1)、或者
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVL(SEQ ID NO:2)。
[16]上述肽使三叉神经的轴索延伸的，项目15-1所述的神经轴索延伸促进剂、项目15-2所述的方法、项目15-3所述的使用、或者项目15-4所述的肽。
[17-1]含项目15-1或16所述的神经轴索延伸促进剂的，神经损伤治疗用或神经再生用组合物。
[17-2]由项目15-2或16所述的方法治疗神经损伤，或使神经再生的方法。
[17-3]项目[15-3]所述的用途，其中上述神经轴索延伸促进剂用于神经损伤治疗用或神经再生用。
[18]促进在体外或体内的神经轴索延伸的方法，适用由以下的序列所表示的序列、或者其稳定化序列构成的肽：
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVLGKR YKQRVKNK(SEQ ID NO:1)、或者
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVL(SEQ ID NO:2)。
[19]包括用添加上述肽的培养基培养神经细胞的，项目[18]所述的促进在体外的神经轴索延伸的方法。
【发明的效果】
根据本发明，可将PACAP或稳定化的PACAP用于神经营养性角膜炎的预防或治疗用途、或者神经轴索延伸促进用途。
【附图的简单的说明】
图1显示高表达PAC1R的细胞株中的由各肽(肽1、2、6～9)的cAMP诱导作用。
图2显示高表达VPAC1R的细胞株中的由各肽(肽1、2、6～9)的cAMP诱导作用。
图3显示神经营养性角膜炎模型大鼠中的由各肽(肽1及肽9)的泪液分泌促进作用。
图4显示神经营养性角膜炎模型大鼠中的由各肽(肽1及肽9)的角膜点状表层炎(SPK)的评分的变化。
图5显示由各肽的培养三叉神经中的轴索延伸的促进作用。
【具体实施方式】
本发明涉及含PACAP肽或稳定化PACAP肽的神经营养性角膜炎的治疗或预防用医药组合物。在本发明的别的实施方式中，本发明涉及含PACAP肽或稳定化PACAP肽的神经轴索延伸促进剂。再者，在别的实施方式中，本发明涉及包括适用PACAP肽或稳定化PACAP肽的，促进在体外或体内的神经轴索延伸的方法。稳定化PACAP肽是指以维持PACAP的生理活性的同时，提高稳定性的方式氨基酸发生改变的肽。具体而言稳定化PACAP肽涉及由PACAP肽的氨基酸序列中3位及/或8位的天冬氨酸残基的羧基被取代为四唑的序列或其序列的一部分发生改变的序列构成的肽。根据本发明的稳定化PACAP肽与PACAP比较具有向PAC1R、VPAC1R、及/或VPAC2R的同程度的结合性。同程度的结合性只要是肽向各自的受体的EC50值与PACAP比较为10倍以内即可，优选5倍以内、更优选为3倍以内。PACAP也可为由38的残基构成的PACAP38、或者由27残基构成的PACAP27之任一者。PACAP38及PACAP27具有下述的序列：
【化1】
PACAP38：HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVLGKR YKQRVKNK(SEQ ID NO:1)
PACAP27：HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVL(SEQ ID NO:2)
在本发明中，序列的一部分发生改变的序列是指对于原来的序列取代、缺失、附加1或多个氨基酸的序列。更优选地，序列的一部分发生改变的序列是指对于原来的序列取代、缺失、或者附加1或数个氨基酸的序列。
氨基酸的取代只要是不变更由序列的一部分发生改变的序列构成的肽向PAC1R、VPAC1R、及/或VPAC2R的结合性，就可在任意的场所发生。在由序列的一部分发生改变的序列构成的肽中，从维持结合性的观点来看，可在PACAP27的，2位、9位、11位、15位～17位、19位～21位、及27位的位置发生氨基酸取代。在特别优选的实施方式中，在下述的序列中X1～X10所示的位置的氨基酸可被取代：
H-X1-D-G-I-F-T-D-X2-Y-X3-R-Y-R-X4-X5-X6-A-X7-X8-X9-Y-L-A-A-V-X10(SEQ IDNO:3)。
氨基酸取代可为1或多个氨基酸被取代，从维持活性的观点来看，可1～10的任意的数、例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或者10个氨基酸被取代。就是在其中，特别优选1～4个氨基酸的取代，更优选3个氨基酸被取代，再更优选2个氨基酸被取代，特别优选1个氨基酸被取代。
氨基酸的缺失只要是不变更由序列的一部分发生改变的序列构成的肽向PAC1R、VPAC1R、及/或VPAC2R的结合性，就可在任意的场所发生。缺失的氨基酸的数选自1～10的任意的数、例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或者10。从不改变结合性的观点来看，特别优选1或2个氨基酸的缺失。氨基酸的缺失可为从原来的序列的N末端侧或C末端侧缺失，也可为从序列的内部缺失。PACAP27和PACAP38由于各自具有同等的向PAC1R、VPAC1R、及/或VPAC2R的结合性，即使是缺失存在于PACAP38的C末端侧的氨基酸，也被认为对于结合性影响少。
氨基酸的附加只要是不变更由序列的一部分发生改变的序列构成的肽向PAC1R、VPAC1R、及/或VPAC2R的结合性，就可在任意的场所发生。附加的氨基酸的数选自1～10的任意的数、例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或者10。氨基酸可附加在原来的序列的N末端侧或C末端侧，也可附加在序列的内部。PACAP27和PACAP38由于各自具有同等的向PAC1R、VPAC1R、及/或VPAC2R的结合性，即使是在PACAP27的C末端附加任意的氨基酸，也被认为对于结合性影响少。
本发明的1的实施方式涉及由下述的式的序列中3位及/或8位的天冬氨酸残基的羧基被取代为四唑的序列、或者其改变序列构成的肽：
H-X1-D-G-I-F-T-D-X2-Y-X3-R-Y-R-X4-X5-X6-A-X7-X8-X9-Y-L-A-A-V-X10(SEQ IDNO:3)
(式中，X1是中性氨基酸、X2是中性氨基酸、X3是中性氨基酸、X4是碱性氨基酸、X5是中性氨基酸或egTz、X6是非极性氨基酸、X7是非极性氨基酸、X8是碱性氨基酸、X9是碱性氨基酸、X10是非极性氨基酸)，
具有向PAC1R、VPAC1R、及/或VPAC2R的结合性的肽。
X1～X10所表示的氨基酸可被具有相同的属性的氨基酸保守取代。作为一例，保存的取代是指下述的组之内的氨基酸的取代：
1.非极性氨基酸：Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro、Nle、Ala
2.中性氨基酸：Ala、Ser、Thr、Tyr、Cys、Asn、Gln、Gly
3.碱性氨基酸：Lys、Arg、His
4.酸性氨基酸：Asp、Glu
X1、X2、及X3中的中性氨基酸是Ala、Ser、Thr、Tyr、Cys、Asn、Gln、或者Gly，更优选为Ala或Ser。
X4、X8、及X9中的碱性氨基酸是Lys、Arg、或者His，更优选为Lys或Arg。
X5中的中性氨基酸是Ala、Ser、Thr、Tyr、Cys、Asn、Gln、或者Gly，更优选为Ala、或者Gln。X5也可为谷氨酰胺的酰胺进一步取代为四唑的氨基酸(egTz)。
X6中的非极性氨基酸是Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro、Nle、或者Ala，更优选为Met、Nle、Leu、或者Ala。
X7中的非极性氨基酸是Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro、Nle、或者Ala，更优选为Val、或者Ala。
X10非极性氨基酸是Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro、Nle、或者Ala，更优选为Leu或Ala。
在本发明中，改变序列是指对于原来的序列取代、缺失、附加1或多个氨基酸的序列。更优选地，改变序列是指对于原来的序列取代、缺失、或者附加1或数个氨基酸的序列。
在SEQ ID NO:3的序列中，3位及/或8位的天冬氨酸残基的羧基被取代为四唑的序列的改变序列是指，优选为，对于SEQ ID NO:3所表示的氨基酸序列缺失或附加1或多个氨基酸的序列。更优选地，可对于SEQ ID NO:3所表示的氨基酸序列缺失1或2个氨基酸，可对于SEQ ID NO:3所表示的氨基酸序列附加下述的C末端附加序列。
不旨在受理论束缚，PACAP27和PACAP38由于各自具有同等的向PAC1R、VPAC1R、及/或VPAC2R的结合性，在PACAP27中向C末端侧的氨基酸附加不影响向PAC1R的结合性。从而，在本发明涉及PACAP27或其稳定化肽时，可还含C末端附加序列，也可不存在C末端附加序列。C末端附加序列是指由1～11个任意的氨基酸构成的序列。C末端附加序列优选与PACAP38的28位～38位的氨基酸相对应。从而，作为C末端序列可举出下述的序列：
GKRYKQRVKNK(SEQ ID NO:37)；
GKRYKQRVKN(SEQ ID NO:38)；
GKRYKQRVK(SEQ ID NO:39)；
GKRYKQRV(SEQ ID NO:40)；
GKRYKQR(SEQ ID NO:41)；
GKRYKQ(SEQ ID NO:42)；
GKRYK(SEQ ID NO:43)；
GKRY(SEQ ID NO:44)
GKR；
GRR；
GK；
GR；及
G。
本发明涉及的肽只要是不失对于PAC1R、VPAC1R、及/或VPAC2R的结合性，就可使用D体或L体的氨基酸，或也可使用外消旋体的氨基酸。另外，同样地本发明涉及的肽可由如2-氨基异酪酸或L-2-氨基酪酸一样的非天然氨基酸构成，含N末端的氨基、C末端的羧基或氨基酸侧链的官能团被任意地修饰的衍生物。作为修饰的例，可举出向氨基附加保护基(例如，酰基化(甲酰基化、乙酰基化等)、甲磺酰化、脲化、氨基甲氧化、Boc化、Fmoc化)、羧基的酯化(乙基化等)等。另外，可通常在生物体内发生的修饰、例如磷酸化、酰胺化、甲基化、酯化、乙酰基化等之外，也可含在合成过程中发生，或者使纯化变得容易的修饰、例如生物素化。另外，也可以延长肽的生物体内半衰期的目的进行PEG化等的修饰。特别是，从提高稳定性的观点来看，N末端的氨基酸的游离氨基可被保护基(例如酰基)保护。例如，N末端的氨基酸的游离氨基可被乙酰基化或甲磺酰化。在由PACAP的3位及/或8位的天冬氨酸残基的羧基被取代为四唑的序列构成的肽中，通过N末端被乙酰基化或甲磺酰化，稳定性进一步提升。C末端可为羧基(-COOH)、羧酸盐(-COO-)、酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)的任何，还可附加糖链(参照例如，WO2017/027848)。
在本发明的具体性的实施方式中，本发明涉及具有下述表1所示的序列的肽3～34、或者其改变序列：
【表1】
肽名 N末端 序列 C末端
肽1 H- HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：2) NH<sub>2</sub>
肽2 Ac- HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：4) NH<sub>2</sub>
肽3 H- HSTzGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：5) NH<sub>2</sub>
肽4 H- HSDGIFTTzSY SRYRKQMAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：6) NH<sub>2</sub>
肽5 H- HSTzGIFTTzSY SRYRKQMAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：7) NH<sub>2</sub>
肽6 H- HSTzGIFTTzSY SRYRKQNIAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：8) NH<sub>2</sub>
肽7 H- HSTzGIFTTzSY SRYRKQLAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：9) NH<sub>2</sub>
肽8 Ac- HSTzGIFTTzSY SRYRKQNIAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：10) NH<sub>2</sub>
肽9 Ac- HSTzGIFTTzSY SRYRKQLAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：11) NH<sub>2</sub>
肽10 Ac- HSTzGIFTTzSY SRYRKQMAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：12) NH<sub>2</sub>
肽11 Ms- HSTzGIFTTzSY SRYRKQNIAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：13) NH<sub>2</sub>
肽12 Ms- HSTzGIFTTzSY SRYRKQLAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：14) NH<sub>2</sub>
肽13 Ac- HSTzGIFTTzSY SRYRKegTzLAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：15) NH<sub>2</sub>
肽14 Ac- HSTzGIFTTzSY SRYRKQLAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：16) NH<sub>2</sub>
肽15 Ac- HSTzGIFTTzAY SRYRKQLAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：17) NH<sub>2</sub>
肽16 Ac- HSTzGIFTTzSY ARYRKQLAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：18) NH<sub>2</sub>
肽17 Ac- HSTzGIFTTzSY SRYRKALAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：19) NH<sub>2</sub>
肽18 Ac- HSTzGIFTTzSY SRYRKQAAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：20) NH<sub>2</sub>
肽19 Ac- HSTzGIFTTzSY SRYRKQLAAK KYLAAVL(SEQ ID NO：21) NH<sub>2</sub>
肽20 Ac- HSTzGIFTTzSY SRYRKQLAVK KYLAAVA(SEQ ID NO：22) NH<sub>2</sub>
肽21 Ac- HSTzGIFTTzSY SRYRRQLAVR RYLAAVL(SEQ ID NO：23) NH<sub>2</sub>
肽22 Ac- HSTzGIFTTzSY SRYRRQLAVR RYLAAVLGRR(SEQ ID NO：24) NH<sub>2</sub>
肽23 Ac- HSTzAIFTTzSY SRYRKQLAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：25) NH<sub>2</sub>
肽24 Ac- HSTzGIFTTzAY SRYRKQLAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：26) NH<sub>2</sub>
肽25 Ac- HSTzGIFTTzSY SRYRKQAAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：27) NH<sub>2</sub>
肽26 Ac- HSTzGIFTTzAY SRYRKALAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：28) NH<sub>2</sub>
肽27 Ac- HSTzGIFTTzAY SRYRKQAAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：29) NH<sub>2</sub>
肽28 Ac- HSTzGIFTTzSY SRYRKAAAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：30) NH<sub>2</sub>
肽29 Ms- HSTzGIFTTzAY SRYRKQLAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：31) NH<sub>2</sub>
肽30 Ms- HSTzAIFTTzSY SRYRKQLAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：32) NH<sub>2</sub>
肽31 Ms- HSTzAIFTTzSY SRYRKQAAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：33) NH<sub>2</sub>
肽32 Ac- HSTzAIFTTzSY SRYRKQAAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：34) NH<sub>2</sub>
肽33 Ac- HATzAIFTTzSY SRYRKQAAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：35) NH<sub>2</sub>
肽34 Ac- HSTzGIFTTzSY SRYRKAAAVK KYLAAVL(SEQ ID NO：36) NH<sub>2</sub>
天冬氨酸的羧基被取代为四唑的氨基酸具有下述的结构：
【化2】
Figure BDA0003350947390000081
另外，在本说明书中，作为序列中的表述，作为使用“Tz”的。
再者，谷氨酰胺的酰胺被取代为四唑的氨基酸具有下述的结构：
【化3】
Figure BDA0003350947390000082
另外，在本说明书中，作为序列中的表述，作为使用“egTz”的。
本发明涉及的肽可由任意的制造方法制造。例如，可通过使用Boc法或Fmoc法等进行固相合成或液相合成来制造。另外，在别法中，可通过将编码本发明的肽的核酸由基因导入法导入到宿主细胞，由宿主细胞合成来制造。在此时，通过以肽的末端附加聚组氨酸标签等的标签肽的方式设计，可使表达后纯化变得容易。
本发明涉及的肽含医药上容许的盐。作为医药上容许的盐，可举出与无机酸的盐(例如，盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)、与有机酸的盐(例如，甲磺酸盐、苯磺酸盐、p-甲苯磺酸盐、蚁酸盐、醋酸盐、三氟醋酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐等)、或者与碱的盐(例如，铵盐、甲基吡啶鎓盐、乙酰基吡啶鎓盐等)。本发明涉及的肽也含水合物、或者溶剂和物。
N末端被甲磺酰化的组氨酸可由反应式1所示的方法或基于其的方法制造。
【化4】反应式1
Figure BDA0003350947390000083
式中，Trt表示三苯甲基、Me表示甲基。
在反应式1的方法中，通过在碱存在下，使通式化合物(I)所表示的化合物与甲磺酰氯反应来制造化合物(II)，接下来，可在甲醇中，将化合物(II)由使用碱的水解制造化合物(III)。
在化合物(II)的制造中，碱相对于化合物(I)使用0.2～5当量、优选1～3当量。使用的碱可举出三乙基胺、N,N-二异丙基乙基胺、吡啶、4-二甲基氨基吡啶，优选可举三乙基胺。甲磺酰氯使用0.1～5当量、优选1～2当量。溶剂只要是不影响反应，就不特别限定，例如，可举出四氢呋喃、二氯甲烷、甲苯等，优选可举二氯甲烷。反应温度通常是1℃～30℃、优选为15℃～25℃，反应时间通常是0.5小时～12小时、优选为0.5小时～2小时。
在化合物(III)的制造中，碱相对于化合物(II)使用0.1～10当量、优选1～3当量。作为碱，可举氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾，优选可举氢氧化钾。溶剂可举出有机溶剂(例如，甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、1、4-二噁烷及四氢呋喃)和水的混合溶剂，优选可举与甲醇及水的混合溶剂。反应时间因使用的试剂或溶剂而不同，通常0.5小时～12小时、优选为0.5小时～3小时。反应温度因使用的试剂或溶剂而不同，通常0℃～100℃、优选为60℃～100℃。
根据本发明的肽通过结合于PAC1R、VPAC1R、及/或VPAC2R，可与PACAP发挥同样的生理活性。不旨在受理论束缚，神经营养性角膜炎的预防或治疗用途可为经结合于这些受体的作用。更具体性地，根据本发明的肽可抑制由神经营养性角膜炎引起的泪液量的减少，另外抑制角膜点状表层炎。再者，根据本发明的肽促进神经的轴索延伸。可由根据本发明的肽的轴索延伸促进作用治疗三叉神经的损伤或使三叉神经再生。本发明涉及的肽可经这些作用治疗或预防神经营养性角膜炎。另外，根据本发明的肽可在体内或体外促进神经的轴索延伸。在体外促进轴索延伸时，在含根据本发明的肽的培养基中培养神经细胞。神经细胞的培养方法可由本技术领域公知的任意的方法进行，可使用本技术领域广泛知晓的神经细胞培养基。
本发明涉及含治疗有效量的上述的肽的神经营养性角膜炎的治疗或预防用医药组合物。本发明的医药组合物通过对于患者而施用，可由PACAP的生理作用治疗神经营养性角膜炎，或通过对于有患这样的疾病的可能性的患者施用，可预防神经营养性角膜炎。另外，“治疗”是指患障碍或疾病时防止它们的状态的恶化，迟滞进程，维持它们的状态现状、减轻或消退，“预防”是指在其发病前防止障碍或疾病的发病。患神经营养性角膜炎的可能性的有的患者可举出例如患角膜的如疱疹一样的病毒感染、眼外伤、角膜手术、再者糖尿病等的患者。
根据本发明的肽、或含所述肽的医药组合物可对应于治疗对象疾病而非经口施用或经口施用。作为经口施用，可举出舌下、口腔内、内服施用。作为非经口施用，可通过例如，静脉内、动脉内、皮下、局部、腹腔内、肌肉内、经鼻、经皮、经粘膜、髓膜内、经直肠、肌肉内、脑内、髓膜内、蛛网膜下、硬膜内、硬膜外、点眼、点耳、点鼻、眼内的通路施用。作为眼内通路，进一步具体性地，可举出结膜下、眼球肌膜囊下、玻璃体内的通路。含根据本发明的肽的医药组合物可对应于其施用通路而作为适宜剂形，例如点眼剂、注射剂、粉末剂、输液制剂、颗粒剂、锭剂、栓剂等任何，在非经口施用的观点，优选点眼剂、注射剂、输液制剂、用时调制用的粉末剂等。作为眼内施用用的制剂，可举出例如玻璃体内注射剂、结膜下注射剂、及眼球肌膜囊下注射剂。另外，这些制剂也可含有制药上容许的各种辅助剂、即，载体或其他助剂、例如，稳定剂、防腐剂、无痛化剂、乳化剂等的添加剂。另外，也可与具有神经保护效果、炎症抑制效果或外分泌线段泌效果的别的药剂组合使用。
在本说明书中言及的全部文献其整体通过引用整合到本说明书中。
接下来说明的本发明的实施例仅旨在例示，不限定本发明的技术性范围。本发明的技术性范围仅由专利权利要求的记载限定。可以不脱离本发明的宗旨作为条件，进行本发明的变更、例如，本发明的构成要件的追加、删除及取代。
【实施例】
【实施例1：肽合成1】
Ms-His(Trt)-OMe的合成
【化5】
Figure BDA0003350947390000091
向N-im-三苯甲基-L-组氨酸甲基酯盐酸盐(2.02g，4.5mmol)的二氯甲烷溶液(40mL)加溶解于N,N-二异丙基乙基胺(1.0mL，5.7mmol)和二氯甲烷(2.0mL)的甲磺酰氯化物(314.7mg，2.7mmol)，25℃2小时于分钟反应40，再者，加溶解于二氯甲烷(1.0mL)的甲磺酰氯化物(174.7mg，1.5mmol)，25℃反应1小时。其后，加饱和碳酸氢钠水溶液而使反应停止，由醋酸乙酯提取，将得到的有机层用10％柠檬酸水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液及饱和生理盐水清洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压馏去溶剂。由于反应未完全地进行，向得到的残渣加二氯甲烷(15mL)，接下来，加三乙基胺(1.0mL，7.2mmol)及甲磺酰氯化物(326.8mg，2.9mmol)的二氯甲烷溶液(1.0mL)，在室温下搅拌1小时。其后，加饱和碳酸氢钠水溶液而使反应停止，由醋酸乙酯提取，将得到的有机层用10％柠檬酸水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液及饱和生理盐水清洗，将有机层用无水硫酸钠干燥，减压馏去溶剂，得到淡黄色的固体(2.35g，＞100％)。得到的固体不进一步纯化而在以下的反应中使用。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.38(1H,d,J＝1.2Hz),7.34-7.31(9H,m),7.12-7.08(6H,m),6.57(1H,d,J＝2.4Hz),6.30(1H,d,J＝8.4Hz),4.40(1H,dt,J＝8.4,5.2Hz),3.65(3H,s),3.05(2H,d,J＝5.2Hz),2.97(3H,s)。
Ms-His(Trt)-OH的合成
【化6】
Figure BDA0003350947390000101
向Ms-His-OMe(2.21g，4.5mmol)的甲醇溶液(15mL)加1M的氢氧化钾水溶液(9.0mL，9.0mmol)，1.5小时回流。将反应溶液冷却至室温，用10％柠檬酸水溶液调成酸性至pH5，由二氯甲烷进行提取。将得到的有机层用硫酸钠干燥，减压馏去溶液之后，向残渣加二氯甲烷和己烷，使白色固体析出，滤取(2.32g，＞100％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84(1H,s),7.31-7.33(9H,m),7.12-7.09(6H,m),6.82(1H,s),4.13(1H,m),3.34(1H,dd,J＝14.8,3.6Hz),3.17(1H,dd,J＝14.8,6.8Hz),2.90(3H,s)。
【实施例2：肽合成2】
使用肽合成仪(模型：PSSM-8岛津制作所制)、由利用Fmoc法的固相合成法合成在试验中使用的肽。在固相合成中使用的作为非天然氨基酸的Fmoc-TZ-OH、Fmoc-TZ(trt)-OH、及Fmoc-egTZ(trt)-OH从Astatech公司购入。合成具有下述的序列的肽1～34，合成肽的分子量实施质谱分析(MALDI TOF)。如下述表2所示，任何测定值均与理论值良好一致。
【表2】
Figure BDA0003350947390000102
Figure BDA0003350947390000111
Figure BDA0003350947390000121
【实施例3：肽的稳定性试验1】
[测定样品的调制]
对在实施例2中合成的肽1及3～5进行秤量，溶解于磷酸缓冲液(pH7.0)而调制1.0mM的肽溶液。再者，将1.0mM的肽溶液用磷酸缓冲液稀释为100μM。用色谱盘(Merckmillipore公司制Millex-GV，0.22μm)过滤，向LC瓶(Waters Deactivated Qsert Vial)分注滤液。对于调制的肽溶液，在40℃的恒温槽内温育1个月或2个月而得到保存后样品。另外，以同时调制的肽溶液之中未供于保存的样品作为标准样品(初始样品)。将标准样品及保存后样品于-30℃保存至试样分析。
[水分透过率]
以肽水溶液和保存容器的合计重量作为受试体重量，对保存前的受试体重量进行秤量，在各条件的保存后，均同样地对保存后的受试体重量进行秤量。另外，对保存容器的空重量进行秤量，基于下述的式而求出水分透过率。
【数1】
Figure BDA0003350947390000122
将标准样品及保存后样品用涡旋混合器搅拌后，向HPLC瓶(Waters公司制Deactivated Qsert vial)移肽溶液。在下述表3的条件下操作逆相HPLC(HPLC系统：岛津制作所制Prominence)而进行肽溶液的分析，得到层析谱。
[HPLC分析条件1]
柱：Waters公司制XSelect CSH C18、5μm、4.6×250mm
保护柱：Waters公司制XSelect CSH C18、5μm、4.6×20mm Guard Cartridge
检测波长：220nm
移动相A：0.1％蚁酸水溶液
移动相B：0.1％蚁酸乙腈溶液
测定时间：30分钟
测定样品注入量：50μL
流速：1.0mL/min
样品冷却器：4℃
柱温度：40℃
移动相的送液：如下述表3一样变更移动相A及移动相B的混合比而直线浓度梯度控制。
【表3】
样品注入后的时间(分) 移动相A(vol％) 移动相B(vol％)
0～30.0 90→75 10→25
30.0～30.5 75→0 25→100
30.5～36.5 0 100
36.5～37.0 0→90 100→10
37.0～49.5 90 10
在层析谱中，求出肽的峰面积值，由式(2)算出残留率(水分修正前残留率)。另外，对于水分修正前残留率，根据式(3)，通过考虑容器的水分透过率而算出水分修正后残留率。
【数2】
Figure BDA0003350947390000131
【数3】
Figure BDA0003350947390000132
在保存后样品中的肽的水分修正后残留率示于表4。
【表4】
肽No. 40℃，1个月保存 40℃，2个月保存
肽1 37.4％ 21.3％
肽3 76.5％ 60.7％
肽4 42.8％ 28.2％
肽5 94.7％ 85.6％
肽1(PACAP)于40℃1个月保存后，37.4％、于40℃2个月保存后，稳定性低至21.3％。在对于肽1，仅将肽1的第3个残基的天冬氨酸侧链的羧基取代为四唑的肽3中，显示比肽1高的稳定性，另外，即使仅将第8个残基的天冬氨酸侧链的羧基取代为四唑的肽4，与肽1相比稳定性提升。但是显示，在仅将肽1的3及第8个残基的天冬氨酸侧链的羧基取代为四唑的肽5中，与肽3及肽4相比，稳定性进一步提升，对于PACAP的稳定性提升而言，二个四唑取代相比一个四唑取代的更有效。
【实施例4：肽的稳定性试验2】
对在实施例2中合成的肽1、2及6～9进行秤量，溶解于Tris缓冲液(pH7.0)而调制1.0mM的肽溶液。将此溶液用色谱盘(Merckmillipore公司制Millex-GV，0.22μm)过滤。将滤液用Tris缓冲液(pH7.0)稀释为100μM，分注到管(eppendorf公司制的Protein LobindTube)中。将调制的肽溶液在60℃的恒温槽内温育1周或2周而得到保存后样品。另外，以同时调制的肽溶液之中未供于保存的样品作为标准样品(初始样品)。将标准样品及保存后样品于-30℃保存至试样分析。
用下述的HPLC分析条件2测定保存后样品，与实施例3同样地算出保存后样品中的肽的水分修正后残留率。结果示于表6。
[HPLC分析条件2]
柱：Waters公司制XSelect CSH C18、5μm、4.6×250mm
保护柱：Waters公司制XSelect CSH C18、5μm、4.6×20mm Guard Cartridge
检测波长：220nm
移动相A：0.1％蚁酸水溶液
移动相B：0.1％蚁酸乙腈溶液
测定时间：20分钟
测定样品注入量：50μL
流速：1.0mL/min
柱温度：40℃
样品冷却器：25℃
移动相的送液：如下述表5一样变更移动相A及移动相B的混合比而直线浓度梯度控制。
【表5】
样品注入后的时间(分) 移动相A(vol％) 移动相B(vol％)
0～20.0 85→75 15→25
20.0～20.1 75→0 25→100
20.1～24.5 0 100
24.5～25.0 0→85 100→15
25.0～40.5 85 15
【表6】
肽No. 60℃，保存1周 60℃，保存2周
肽1 26.6％ 15.8％
肽2 28.7％ 17.2％
肽6 91.3％ 82.4％
肽7 91.7％ 84.8％
肽8 98.1％ 92.9％
肽9 98.4％ 92.8％
肽1(PACAP)于60℃保存1周后，26.6％保存，在2周后，极其稳定性差到15.8％，另外，使PACAP的N末端乙酰基化的肽2也仅具有同等的稳定性。一方面，在将3位和8位的天冬氨酸的羧基取代为四唑的肽6及7(在肽6中，17位的甲硫氨酸被进一步取代为正亮氨酸(作为序列中的表述，作为使用“N1”的)，在肽7中17位的甲硫氨酸被进一步取代为亮氨酸)中，于60℃保存1周后，91.3％及91.7％保存，在2周后，稳定性大幅地提升至82.4％及84.8％。再者，在将肽6及7的N末端乙酰基化的肽8及9中，于60℃保存1周后，98.1％及98.4％保存，在2周后，稳定性进一步提升到92.9％及92.8％。其中，在60℃的1周及2周的加速试验相当于室温(25℃)中的约1年及约2年。从而，肽8及9被期待于室温稳定2年(90％以上的残留率)。
【实施例5：肽的稳定性试验3】
对在实施例2中合成的肽12～25、27及28进行秤量，溶解于Tris缓冲液(pH7.0)而调制1.0mM的肽溶液。将此溶液用色谱盘(Merckmillipore公司制Millex-GV，0.22μm)过滤。将滤液用Tris缓冲液(pH7.0)稀释为100μM，分注到管(eppendorf公司制的Protein LobindTube)中。将调制的肽溶液在60℃的恒温槽内温育1周或2周而得到保存后样品。另外，以同时调制的肽溶液之中未供于保存的样品作为标准样品(初始样品)。标准样品及保存后样品于-30℃保存至试样分析。
与实施例4同样地算出保存后样品中的肽的水分修正后残留率，结果示于表7。
【表7】
Figure BDA0003350947390000141
Figure BDA0003350947390000151
肽12(将肽9的N末端乙酰基取代为甲磺酰基的肽)显示与肽9同等的稳定性，即使N末端甲磺酰基取代，显示高的稳定性。肽13(将肽9的第16个残基的谷氨酰胺侧链取代为四唑的肽)显示与肽9同等的稳定性，显示将谷氨酰胺侧链取代为四唑的肽，也维持高的稳定性。在肽9的任意的残基被丙氨酸或精氨酸取代或附加的肽14-25、肽27及肽28中，也维持高的稳定性。
【实施例5-2：肽的稳定性试验3】
对在实施例2中合成的肽29～34进行秤量，溶解于Tris缓冲液(pH7.0)而调制1.0mM的肽溶液。将此溶液用色谱盘(Merckmillipore公司制Millex-GV，0.22μm)过滤。将滤液用Tris缓冲液(pH7.0)稀释为100μM，分注到管(eppendorf公司制的Protein LobindTube)中。将调制的肽溶液在60℃的恒温槽内温育2周而得到保存后样品。另外，以同时调制的肽溶液之中未供于保存的样品作为标准样品(初始样品)。标准样品及保存后样品于-30℃保存至试样分析。
与实施例4同样地算出保存后样品中的肽的水分修正后残留率，结果示于表7-2。
【表7-2】
肽No. 60℃，保存2周
肽29 91.9％
肽30 92.2％
肽31 90.1％
肽32 88.7％
肽33 85.3％
肽34 96.9％
肽29(将肽15的N末端乙酰基取代为甲磺酰基的肽)显示与肽15同等的稳定性，即使N末端甲磺酰基取代，也显示高的稳定性。肽30(将肽23的N末端乙酰基取代为甲磺酰基的肽)显示与肽23同等的稳定性，即使N末端甲磺酰基取代，均显示高的稳定性。在肽32～34在肽9的任意的残基被丙氨酸取代的肽32～34中，维持高的稳定性。肽31(将肽32的N末端乙酰基取代为甲磺酰基的肽)显示与肽32同等的稳定性。
【实施例6：肽的稳定性试验4】
对在实施例2中合成的肽10及11进行秤量，溶解于磷酸缓冲液(pH7.0)而调制1.0mM的肽溶液。将此溶液用色谱盘(Merckmillipore公司制Millex-GV，0.22μm)过滤。将滤液用磷酸缓冲液(pH7.0)稀释为100μM，分注到管(eppendorf公司制的Protein LobindTube)中。对于调制的肽，在40℃的恒温槽内温育1个月或2个月而得到保存后样品。另外，以同时调制的肽溶液之中未供于保存的样品作为标准样品(初始样品)。将标准样品及保存后样品于-30℃保存至试样分析。
与实施例4同样地测定保存后样品中的肽的水分修正后残留率，结果示于表8。
【表8】
肽No. 40℃，1个月保存 40℃，2个月保存
肽10 94.0％ 87.8％
肽11 94.2％ 88.8％
表明与N末端是乙酰基的肽10和N甲磺酰基的肽11的结果相比，即使是N末端取代基是乙酰基及N甲磺酰基之任一者的情况，肽以同程度稳定化。
【实施例7：肽的稳定性试验5】
对在实施例2中合成的肽26进行秤量，溶解于Tris缓冲液(pH7.0)而调制1.0mM的肽溶液。将此溶液用色谱盘(Merckmillipore公司制Millex-GV，0.22μm)过滤。将滤液用Tris缓冲液(pH7.0)稀释为100μM，分注到管(eppendorf公司制的Protein Lobind Tube)中。将调制的肽溶液在60℃的恒温槽内温育1周或2周而得到保存后样品。另外，以同时调制的肽溶液之中未供于保存的样品作为标准样品(初始样品)。标准样品及保存后样品于-30℃保存至试样分析。
将保存后样品用下述的HPLC分析条件3测定，与实施例3同样地算出保存后样品中的肽的水分修正后残留率。结果示于表10。
[HPLC分析条件3]
柱：Waters公司制XSelect CSH C18、5μm、4.6×250mm
保护柱：Waters公司制XSelect CSH C18、5μm、4.6×20mm Guard Cartridge
检测波长：220nm
移动相A：0.1％蚁酸水溶液
移动相B：0.1％蚁酸乙腈溶液
测定时间：20分钟
测定样品注入量：50μL
流速：1.0mL/min
柱温度：40℃
样品冷却器：25℃
移动相的送液：如下述表9一样变更移动相A及移动相B的混合比而直线浓度梯度控制。
【表9】
样品注入后的时间(分) 移动相A(vol％) 移动相B(vol％)
0～20.0 82.5→72.5 17.5→27.5
20.0～20.1 72.5→0 27.5→100
20.1～24.5 0 100
24.5～25.0 0→82.5 100→17.5
25.0～40.5 82.5 17.5
【表10】
肽No. 60℃，保存1周 60℃，保存2周
肽26 98.0％ 94.8％
肽26也同样地显示高的稳定性。
【实施例7：PACAP27及其稳定化肽的cAMP测定】
[细胞培养]
将丝裂霉素处理完了的冷冻的CHO-K1细胞(PAC1或高表达VPAC1受体的细胞株：从DiscoveRx公司购入)以成为1.35×104cells/100μl/孔的方式由cell plating reagent(DiscoveRx公司制)调制后，接种到96孔培养板上。将细胞在5％CO2温育器内于37℃培养18～24小时，在板接附细胞。
[试剂调制]
将在实施例2中合成的肽1、2及6～9的粉末以成为0.1mM的方式溶解于水之后，以成为20μM的方式由Cell assay buffer(DiscoveRx公司制)(含0.5mM的IBMX、0.001％BSA)稀释。其后用相同的Cell assay buffer制作稀释5倍系列，在测定中使用。
[cAMP测定]
cAMP测定使用Hit Hunter cAMP assay for Biologics试剂盒(DiscoveRx公司制、Cat.No.90-0075LM25)，根据试剂盒附属的说明书而进行。将cAMP抗体溶液和稀释的各浓度的肽1、2、6～9溶液混合，制作肽-cAMP抗体混合液。接下来，从CHO-K1细胞的培养板除去培养基，用PBS清洗后，将肽-cAMP抗体混合液添加到细胞中，在37℃的5％CO2气氛下温育30分钟。接下来，添加Working detection solution，将培养板用铝箔遮光后，于25℃温育1小时。温育后，添加Solution A，将培养板用铝箔遮光后，于25℃温育3小时。最后，使用GloMax检测器(Prω公司制)，在Luminescence，Integration time(1sec)的条件下检测化学发光信号。将得到的Relative luminescence unit(RLU)值用GraphPad Prism Ver 6.05(Graph Pad公司制)解析，算出各肽中的EC50值。各肽在高表达PAC1R或VPAC1R的细胞株中的cAMP诱导作用的EC50值的结果示于图1、图2及表11。
【表11】
肽No. EC<sub>50</sub>(PAC1R) EC<sub>50</sub>(VPAC1R)
肽1 0.052nM 0.097nM
肽2 0.032nM 0.062nM
肽6 0.079nM 0.093nM
肽7 0.112nM 0.114nM
肽8 0.072nM 0.046nM
肽9 0.063nM 0.043nM
合成的肽1、2及6～9对于PAC1R和VPAC1R的各自的高表达细胞而显示cAMP诱导能，它们的EC50值是与天然肽(肽1：PACAP27)同程度。
当将表6及表11的结果综合时，根据本发明的肽(肽6～9)与PACAP比较而具有在水溶液中的极其改善的稳定性的同时，与PACAP维持同等的生理活性。特别是，通过在室温具有超2年的储藏寿命，作为液体制剂、例如瓶、安瓿、点眼剂等的制品开发变得可能。
【实施例8：PACAP27稳定化肽的cAMP测定2】
[试剂调制]
将在实施例2中合成的肽3～5及10～28的粉末以各自成为0.1mM的方式溶解于水之后，以成为20μM的方式由Cell assay buffer(DiscoveRx公司制)(含0.5mM的IBMX、0.001％BSA)稀释。之后用相同的Cell assay buffer制作稀释5倍系列，在测定中使用。
由与实施例7同样的方法算出肽3～5及10～28中的EC50值。各肽在高表达PAC1或VPAC1的细胞株中的cAMP诱导作用的EC50值的结果示于表12。
【表12】
肽No. EC<sub>50</sub>(PAC1R) EC<sub>50</sub>(VPAC1R)
肽3 0.060nM 0.101nM
肽4 0.040nM 0.053nM
肽5 0.033nM 0.064nM
肽10 0.076nM 0.101nM
肽11 0.038nM 0.190nM
肽12 0.023nM 0.087nM
肽13 0.132nM 0.072nM
肽14 0.074nM 0.099nM
肽15 0.061nM 0.149nM
肽16 0.330nM 0.065nM
肽17 0.099nM 0.132nM
肽18 0.061nM 0.033nM
肽19 0.094nM 0.044nM
肽20 0.080nM 0.040nM
肽21 0.102nM 0.268nM
肽22 0.130nM 0.457nM
肽23 0.079nM 0.072nM
肽24 0.083nM 0.088nM
肽25 0.088nM 0.028nM
肽26 0.066nM 0.075nM
肽27 0.060nM 0.044nM
肽28 0.084nM 0.029nM
根据本发明的肽(肽3～5、10～28)与PACAP比较具有在水溶液中的极其改善的稳定性的同时，与PACAP维持同等的生理活性。
【实施例8-2：PACAP27稳定化肽的cAMP测定2】
[试剂调制]
将在实施例2中合成的肽29～34的粉末以各自成为0.1mM的方式溶解于水之后，以成为20μM的方式由Cell assay buffer(DiscoveRx公司制)(含0.5mM的IBMX、0.001％BSA)稀释。由其用相同的Cell assay buffer制作稀释5倍系列，在测定中使用。
与实施例7同样的方法算出肽29～34中的EC50值。各肽在高表达PAC1或VPAC1的细胞株中的cAMP诱导作用的EC50值的结果示于表12-2。
【表12-2】
Figure BDA0003350947390000181
Figure BDA0003350947390000191
根据本发明的肽(肽29～34)与PACAP比较具有在水溶液中的极其改善的稳定性的同时，与PACAP维持同等的生理活性。
【实施例9：由PACAP27及其稳定化肽的神经营养性角膜炎模型的评价】
通过向大鼠的背部皮下施用辣椒素，制成诱发角膜神经障碍及角膜知觉的减弱，伴随其，诱发泪液量的减少、角膜点状表层炎(以下，SPK)的模型大鼠(非专利文献3：Investigative Ophthalmology&Visual Science(2012),vol.53,No.13,p.8280-8287)。向所述大鼠点眼PACAP27及其稳定化肽，探讨角膜损伤的抑制效果。具体性的实验方法如以下进行。
[辣椒素施用]
向含有10％EtOH、10％Tween80的PBS溶解辣椒素(SIGMA公司制)，以成为50mg/kg·b.w.的方式向4日龄的雄性Wistar/ST大鼠的背部皮下施用。
[点眼液的调制]
基剂向灭菌水100mL溶解0.3g的三羟基甲基氨基甲烷(NACALAI TESQUE公司制)及4.4g的D(-)-甘露糖醇(NACALAI TESQUE公司制)，加1N·HCl，将pH调制到7。肽1及肽9以成为0.1％的方式溶解于基剂。各点眼液于室温保存。点眼从施用辣椒素3周后开始，1天3次、每日、各10μL，点眼到两眼。
[泪液量的测定]
泪液量的测定向大鼠的下外眼角插入ZONe QUICK(步制药)，20秒钟后，用附属的刻度测量染红色的部分的长度。在点眼肽的10分钟前、5分钟前对泪液量进行测定，以平均的值作为点眼前的泪液量。点眼肽，对5分钟后的泪液量进行测定，求出与点眼前的泪液量的差异。结果示于图3。
在诱发神经营养性角膜炎的大鼠中，肽1及肽9的点眼显示同程度的泪液分泌作用。
[SPK的观察]
评价点眼开始2周后的SPK。在异氟烷吸入麻醉下，向眼表面点眼1μL溶解于PBS的1％荧光素钠(和光纯药公司制)水溶液，在1分钟强制闭眼之后，用生理盐水冲洗额外的荧光素染色液。其后，用裂隙灯显微镜观察眼表面，基于相当的眼科21(1)：87-90(2004)的村上等的方法而评价角膜障碍的程度。具体而言，将角膜分为上部－中央部－下部的3区域，对于各区域而根据下述的基准而付评分，以将3区域的各评分合计的值作为SPK评分。〈基准〉0：无点状染色，1：疏(点状的荧光素染色分离)，2：中间(1，3的中间)，3：密(点状的荧光素染色几乎邻接)。结果示于图4。
肽1及肽9的点眼改善由辣椒素施用导致的SPK评分的升高。
[角膜知觉的测定]
角膜知觉使用Cochet-Bonnet角膜知觉计(半田屋商店)进行测定。将角膜知觉计的丝长设定为60mm，使丝与角膜中央垂直接触而进行刺激。对眼睑的反应进行观察，在有反应时记录其丝长。见不到反应之时使各5mm长度变短而进行测定。将上述的操作重复3次，以得到的丝长的平均值作为其个体的角膜知觉阈值(CST)。
肽1及肽9的点眼改善由辣椒素施用导致的角膜知觉的降低。
[角膜神经染色]
使大鼠安乐死之后，摘出眼球，浸渍到Zamboni液(和光纯药公司制)中，于室温静置15分钟。从眼球采集角膜，再次浸渍到Zamboni液中，于室温静置45分钟。其后，取代为含有30％蔗糖的0.1M磷酸缓冲液。确认角膜组织的沉降后，用夹插入切口，浸渍到含有0.1％EDTA、0.01％类型IV-S透明质酸酶(SIGMA公司制)的0.1M磷酸缓冲液(pH5.3)中，于37℃一晚静置。用含有0.3％TritonX-100的PBS-T清洗后，浸渍到含有1％的BSA的PBS-T中，于室温2小时封闭。使Alexa Fluor 488结合小鼠抗β-微管蛋白，ClassIII抗体(BD公司制)于室温一晚反应。用PBS-T清洗后，向载玻片贴附角膜组织，用Vectashield hard set mountingmedium封入。将封入的样品用共聚焦显微镜观察，取得角膜上皮下神经丛的图像。神经层的涡状结构的神经密度通过用图像解析软(Image J)进行Sholl解析来定量。
肽1及肽9的点眼改善由辣椒素施用导致的神经密度的降低。
【实施例10：对于大鼠三叉神经细胞的PACAP27及其稳定化肽的轴索延伸效果的评价】
[三叉神经的单离－培养]
将自日本SLC株式会社购入的大鼠(Slc：Sprague-Dawley 17日龄、含雌雄)由碳酸气体吸入安乐死，采集三叉神经节。将采集的三叉神经节用Hanks'balanced saltsolution(HBSS)清洗后，于37℃用胶原酶A(Roche)处理、30分钟。其后，根据流程而使用神经细胞分散液(Wako)，使细胞分散。再者，根据流程而使用Debris removal solution(Miltenyi biotec)及Myelin removal beads II(Miltenyi biotec)，除去Debris和髓磷脂。将单离的三叉神经细胞用培养液悬浮后，在聚赖氨酸/层粘连蛋白包被完了的8孔室玻片(Corning)上接种至成为2.5×103细胞/孔。培养液使用Neurobasal-A中含B27辅助物(终浓度2％)及GlutaMAX(终浓度2mM)及青霉素/链霉素(终浓度1％)的。培养条件设为二氧化碳浓度5％、空气浓度95％、湿度100％、温度37℃。播种之后，培养24小时，以成为终浓度1μM的方式更换为含肽1、肽9、肽12、肽18、肽31的培养液。对照更换为不含肽的培养液。培养基更换后，再者培养24小时。
[2.染色]
对含肽的培养液进行培养基更换，在2％多聚甲醛液中于室温浸培养24小时后的大鼠三叉神经细胞20分钟而固定。将细胞用PBS清洗，添加含0.1％TritonX-100的2％bovine serum albumin，反应30分钟。用PBS清洗后，使特异性地识别构成神经细胞体及神经突起的神经丝的phospho-neurofilament H抗体(Merk，MAB1592-C)于室温反应1小时。反应1小时后，使荧光标记第二抗体(Invitrogen、#A-11031)于室温反应1小时而对标本进行荧光染色，在荧光显微镜下观察被染色的细胞。被染色的细胞像从荧光显微镜作为图像收取到计算机。
[3.图像解析]
为了评价大鼠三叉神经细胞的神经突起形成的程度，以在收取到计算机的染色细胞的图像中具有细胞体直径的2倍以上长度的神经突起的细胞作为神经突起形成细胞，算出该细胞数占全细胞数的比率(％)(Otori Y，Wei JY，Barnstable CJ.Invest.OphthalmolVis Sci(1998)39，972-981)。结果示于图5(N＝8)。将相对于对照的显著差异由Dunnett检验确定(P＜0.001)。
肽1、肽9、肽12、肽18、肽31显示三叉神经细胞的轴索延伸促进效果。
【制剂例】
含有本发明的肽作为有效成分的医药可例如，制造成如以下一样的处方。举制剂例而进一步具体性地说明本发明的药剂，本发明不限于这些制剂例。
【1.胶囊剂】
(1)肽5 40mg
(2)乳糖 70mg
(3)微晶纤维素 9mg
(4)硬脂酸镁 1mg
1胶囊 120mg
将(1)、(2)、(3)的全量、及(4)的1/2混合之后，颗粒化。向其加其余的(4)，向明胶胶囊封入整体。
【2.锭剂】
(1)肽6 40mg
(2)乳糖 58mg
(3)玉米淀粉 18mg
(4)微晶纤维素 3.5mg
(5)硬脂酸镁 0.5mg
1锭 120mg
将(1)、(2)、(3)的全量、(4)的2/3及(5)的1/2混合之后，颗粒化。向此颗粒加其余的(4)及(5)，加压成型为锭剂。
【3.玻璃体注射液】
1ml中
(1)肽5 40mg
(2)纯化白糖 50mg
(3)氯化钠 2.34mg
(4)聚山梨酯80 适量
(5)磷酸氢二钠 适量
(6)磷酸二氢钠 适量
(7)灭菌纯化水 适量
向(7)灭菌纯化水溶解(1)～(6)而调制玻璃体注射液。
【4.眼药】
100mL中
(1)肽6 100mg
(2)氨丁三醇 300mg
(3)氯化钠 900mg
(4)氯化苯扎铵 适量
(5)灭菌纯化水 适量
向(5)灭菌纯化水溶解(1)～(4)而调整pH，调制点眼液。
序列表
<110> Senju Pharmaceutical Co., Ltd.
<120> 含PACAP肽或PACAP的稳定化肽的神经营养性角膜炎的预防或治疗用组合物
<130> P200319WO
<150> JP2019-091700
<151> 2019-05-14
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 38
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys
20 25 30
Gln Arg Val Lys Asn Lys
35
<210> 2
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 3
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是中性氨基酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是中性氨基酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是中性氨基酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (15)..(15)
<223> Xaa是碱性氨基酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (16)..(16)
<223> Xaa是中性氨基酸或氨基酸，其中谷氨酸的酰胺被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (17)..(17)
<223> Xaa是非极性氨基酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (19)..(19)
<223> Xaa是非极性氨基酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (20)..(20)
<223> Xaa是碱性氨基酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (21)..(21)
<223> Xaa是碱性氨基酸
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (27)..(27)
<223> Xaa是非极性氨基酸
<400> 3
His Xaa Asp Gly Ile Phe Thr Asp Xaa Tyr Xaa Arg Tyr Arg Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Ala Ala Val Xaa
20 25
<210> 4
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 4
His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 5
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 5
His Ser Xaa Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 6
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 6
His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 7
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 7
His Ser Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (17)..(17)
<223> Xaa是Nle
<400> 8
His Ser Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Xaa Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 9
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 9
His Ser Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 10
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (17)..(17)
<223> Xaa是Nle
<400> 10
His Ser Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Xaa Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 11
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 11
His Ser Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 12
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 12
His Ser Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 13
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 甲磺酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (17)..(17)
<223> Xaa是Nle
<400> 13
His Ser Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Xaa Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 14
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 甲磺酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 14
His Ser Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 15
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (16)..(16)
<223> Xaa是氨基酸，其中谷氨酸的酰氨基被四唑取代
<400> 15
His Ser Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Xaa
1 5 10 15
Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 16
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 16
His Ala Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 17
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 17
His Ser Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ala Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 18
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 18
His Ser Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ala Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 19
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 19
His Ser Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Ala
1 5 10 15
Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 20
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 20
His Ser Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Ala Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 21
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 21
His Ser Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Leu Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 22
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 22
His Ser Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Ala
20 25
<210> 23
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 23
His Ser Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Arg Gln
1 5 10 15
Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 24
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 24
His Ser Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Arg Gln
1 5 10 15
Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Arg Arg
20 25 30
<210> 25
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 25
His Ser Xaa Ala Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 26
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 26
His Ala Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ala Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 27
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 27
His Ala Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Ala Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 28
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 28
His Ser Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ala Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Ala
1 5 10 15
Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 29
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 29
His Ser Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ala Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Ala Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 30
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 30
His Ser Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Ala
1 5 10 15
Ala Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 31
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 甲磺酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 31
His Ser Xaa Gly Ile Phe Thr Xaa Ala Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 32
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 甲磺酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 32
His Ser Xaa Ala Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 33
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 甲磺酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 33
His Ser Xaa Ala Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Ala Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 34
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 34
His Ser Xaa Ala Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Ala Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 35
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 35
His Ala Xaa Ala Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln
1 5 10 15
Ala Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 36
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是氨基酸，其中天冬氨酸的羧基被四唑取代
<400> 36
His Ser Xaa Ala Ile Phe Thr Xaa Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Ala
1 5 10 15
Ala Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu
20 25
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 37
Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys
1 5 10
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 38
Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn
1 5 10
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 39
Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys
1 5
<210> 40
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 40
Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg Val
1 5
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 41
Gly Lys Arg Tyr Lys Gln Arg
1 5
<210> 42
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 42
Gly Lys Arg Tyr Lys Gln
1 5
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 43
Gly Lys Arg Tyr Lys
1 5
<210> 44
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 44
Gly Lys Arg Tyr
1

Claims (18)

1.神经营养性角膜炎的预防或治疗用医药组合物，其含由以下的序列所表示的序列、或者其稳定化序列构成的肽：
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVLGKR YKQRVKNK(SEQ ID NO:1)、或者
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVL(SEQ ID NO:2)。
2.权利要求1所述的预防或治疗用医药组合物，
其中由所述稳定化序列构成的肽是在SEQ ID NO:1或2的序列中，3位及/或8位的天冬氨酸残基的羧基被取代为四唑的序列、或者所述序列的一部分发生改变的序列，
其中由所述稳定化序列构成的肽具有与PAC1R、VPAC1R及/或VPACR2的结合性。
3.权利要求1或2所述的预防或治疗用组合物，其含由所述稳定化序列构成的肽，
所述由所述稳定化序列构成的肽是由下述的式所表示的序列中3位及/或8位的天冬氨酸残基的羧基被取代为四唑的序列或其改变序列构成的肽：
H-X1-D-G-I-F-T-D-X2-Y-X3-R-Y-R-X4-X5-X6-A-X7-X8-X9-Y-L-A-A-V-X10(SEQ ID NO:3)
式中，
X1是中性氨基酸，
X2是中性氨基酸，
X3是中性氨基酸，
X4是碱性氨基酸，
X5是中性氨基酸或egTz，
X6是非极性氨基酸，
X7是非极性氨基酸，
X8是碱性氨基酸，
X9是碱性氨基酸，
X10是中性氨基酸，
所述肽具有与PAC1R、VPAC1R及/或VPACR2的结合性，
所述改变序列是SEQ ID NO:3的序列中缺失或附加1个或多个氨基酸的序列。
4.权利要求3所述的预防或治疗用组合物，其中在X1、X2、及X3中的中性氨基酸是丙氨酸或丝氨酸。
5.权利要求3或4所述的预防或治疗用组合物，其中在X4、X8、及X9中的碱性氨基酸是赖氨酸或精氨酸。
6.权利要求3～5之任一项所述的预防或治疗用组合物，其中X5是谷氨酰胺、丙氨酸或egTz。
7.权利要求3～6之任一项所述的预防或治疗用组合物，其中进一步地X6是甲硫氨酸、正亮氨酸、丙氨酸或亮氨酸。
8.权利要求3～7之任一项所述的预防或治疗用组合物，其中X7是缬氨酸或丙氨酸。
9.权利要求3～8之任一项所述的预防或治疗用组合物，其中X10是亮氨酸或丙氨酸。
10.权利要求3～9之任一项所述的预防或治疗用组合物，其中SEQ ID NO:3的3位及8位的天冬氨酸的羧基被取代为四唑。
11.权利要求3～10之任一项所述的预防或治疗用组合物，其中在所述肽中，N末端被乙酰基化或甲磺酰化。
12.权利要求3～11之任一项所述的预防或治疗用组合物，其中在所述肽中，N末端被乙酰基化。
13.权利要求3～12之任一项所述的预防或治疗用组合物，其中缺失1或2个氨基酸。
14.权利要求3～13之任一项所述的预防或治疗用组合物，其中选自以下的序列的1种序列附加到所述肽的C末端：
GKRYKQRVKNK(SEQ ID NO:37)；
GKRYKQRVKN(SEQ ID NO:38)；
GKRYKQRVK(SEQ ID NO:39)；
GKRYKQRV(SEQ ID NO:40)；
GKRYKQR(SEQ ID NO:41)；
GKRYKQ(SEQ ID NO:42)；
GKRYK(SEQ ID NO:43)；
GKRY(SEQ ID NO:44)；
GKR；
GRR；
GK；
GR；及
G。
15.神经轴索延伸促进剂，其含由以下的序列所表示的序列或其稳定化序列构成的肽：
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVLGKR YKQRVKNK(SEQ ID NO:1)、或者
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVL(SEQ ID NO:2)。
16.权利要求15所述的神经轴索延伸促进剂，其中所述神经轴索延伸促进剂使三叉神经的轴索延伸。
17.神经损伤治疗用或神经再生用组合物，其含权利要求15或16所述的神经轴索延伸促进剂。
18.在体外的神经轴索延伸促进方法，其包括在添加由以下的序列所表示的序列或其稳定化序列构成的肽的培养基中培养神经细胞：
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVLGKR YKQRVKNK(SEQ ID NO:1)、或者
HSDGIFTDSY SRYRKQMAVK KYLAAVL(SEQ ID NO:2)。
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