CN103145851A

CN103145851A - 重组蛋白PACAP38-NtA及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN103145851A
Application number: CN2013100576577A
Authority: CN
Inventors: 洪岸; 吴陆生; 陈小佳
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Guangzhou Hengning Biotechnology Co ltd
Priority date: 2013-02-22
Filing date: 2013-02-22
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2033-02-22
Also published as: CN103145851B

Abstract

本发明公开了一种重组蛋白PACAP38-NtA及其编码基因与应用。该重组蛋白PACAP38-NtA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码该重组蛋白PACAP38-NtA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列克隆至原核表达载体pET-3c中，转染到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到表达重组蛋白PACAP38-NtA的菌株。本发明使用小型生物反应器发酵该菌株，使用常用的离子交换层析和镍柱亲和层析两步纯化法，操作简单，能获得高纯度的目的蛋白。获得的重组PACAP38-NtA融合蛋白能与层粘连蛋白特异性结合，能有效的促进神经元样细胞PC12进行增殖和分化，作用于小鼠角膜刮伤部位，能提高损伤部位的修复能力，可用于制备角膜损伤修复的药品。

Description

重组蛋白PACAP38-NtA及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种重组蛋白，特别涉及一种重组蛋白PACAP38-NtA及其编码基因与应用。

背景技术

垂体腺苷酸环化酶激活多肽（Pituitary Adenylate Cyclase-activatingPolypeptide，PACAP）是Miyata等于1989年在研究下丘脑促垂体激素时发现的一种具有广泛生物学活性的多肽，是促胰液素/高血糖素/血管活性肠肽(vasoaetive intestinal peptide，VlP)家族中的新成员。

PACAP在体内存在两种形式，分别为含38个氨基酸的PACAP38和缺失羧基端11个氨基酸的截短肽PACAP27。PACAP38比PACAP27在组织中的含量更丰富，活性更高。PACAP及其受体不仅分布在中枢神经系统和周围神经系统，而且在周围组织和器官也广泛分布，如胰腺、胰岛、消化道、生殖腺等。PACAP主要有3种受体：PACIR、VPACIR和VPAC2R。PACIR是PACAP的特异性受体，受体VPACIR和VPAC2R是PACAP和VIP共同的受体。受体PACIR比VPACIR和VPAC2R在中枢神经系统的含量及分布多，3种受体在外周各脏器组织中均分布广泛。鉴于其分布及生物学特性，大量实验表明PAC1R在介导神经系统的发育和保护方面起重要作用。在眼部，PACAP及其受体主要分布在角膜、虹膜、睫状神经节、脉络膜和视网膜等处。

PACAP及其特异受体PACI在眼部分布广泛，PACAP不仅有营养及修复神经作用，还促角膜上皮修复及参与调解眼表炎症反应。因此对角膜瓣术后神经修复及角膜感觉功能恢复有重要促进作用，而仅用PACAP38作用于角膜及角膜神经，虽也具有一定的修复作用，但其使用量较大，修复时间较长。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种重组蛋白PACAP38-NtA。

本发明的另一目的在于提供编码所述的重组蛋白PACAP38-NtA的基因。

本发明的再一目的在于提供表达所述的重组蛋白PACAP38-NtA的菌株及其发酵方法以及所述的重组蛋白PACAP38-NtA的纯化方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种重组蛋白PACAP38-NtA，其氨基酸序列如下所示：

HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRIKNKGSGGGSGGGGSGGGGSNCPERELQEEEEEANVVLTGTVEEIMNDVPVHHTYSCKVRVWRYLKGKDIVTHEILLDGGNKVVIGGFGDPLICDNQVSTGDTRIFFVNPAPQYMWPAHRNELMLNSSLMRITLRNLEEVEHCVEEHRKLLADKPNSYFTQTPPTP；

编码所述的重组蛋白PACAP38-NtA的核苷酸序列如下所示：

CACTCTGACGGTATCTTCACCGACTCTTACTCTCGTTACCGTAAACAGATGGCTGTTAAAAAATACCTGGCTGCTGTTCTGGGTAAACGTTACAAACAGCGTATCAAAAACAAAGGTTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTAACTGCCCGGAACGTGAACTGCAGGAAGAAGAAGAAGAAGCTAACGTTGTTCTGACCGGTACCGTTGAAGAAATCATGAACGACGTTCCGGTTCACCACACCTACTCTTGCAAAGTTCGTGTTTGGCGTTACCTGAAAGGTAAAGACATCGTTACCCACGAAATCCTGCTGGACGGTGGTAACAAAGTTGTTATCGGTGGTTTCGGTGACCCGCTGATCTGCGACAACCAGGTTTCTACCGGTGACACCCGTATCTTCTTCGTTAACCCGGCTCCGCAGTACATGTGGCCGGCTCACCGTAACGAACTGATGCTGAACTCTTCTCTGATGCGTATCACCCTGCGTAACCTGGAAGAAGTTGAACACTGCGTTGAAGAACACCGTAAACTGCTGGCTGACAAACCGAACTCTTACTTCACCCAGACCCCGCCGACCCCG；

所述的重组蛋白PACAP38-NtA的制备方法，包括将编码重组蛋白PACAP38-NtA的核苷酸序列重组到表达载体上，将表达载体转入宿主细胞中，得到表达重组蛋白PACAP38-NtA的菌株；接着将表达重组蛋白PACAP38-NtA的菌株发酵，发酵得到的菌体破碎，纯化，得到重组蛋白PACAP38-NtA。

一种表达重组蛋白PACAP38-NtA的菌株，是将上述核苷酸序列转染到大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）得到；

所述的表达重组蛋白PACAP38-NtA的菌株，更优选通过如下制备方法得到：

（1）重组原核表达载体pET-3c/PACAP38-NtA的构建

①设计PACAP38-NtA的基因序列，基因合成，得到了编码重组蛋白PACAP38-NtA的基因；

②使用引物F1和引物R1对步骤①得到的编码重组蛋白PACAP38-NtA的基因进行PCR扩增，得到Xba I-PACAP38-NtA-BamH I基因，该基因具有起始密码子ATG和两个终止密码子TAA、TGA，以及C末端含有6个His标签位点（引物R1被方框包围住的部分）；

引物F1：5’-ATGCTCTAGAATGCACTCTGACGGTATCTTC-3’；

引物R1：5’-ATCGGGATCCTCATTA

CGGGGTCGGCGGGGT-3’；

③将步骤②中获得的PCR产物与

18-T连接，得到重组克隆载体

18-T/PACAP38-NtA；

④用Xba I和BamHI双酶切步骤③得到的

18-T/PACAP38-NtA，得到具有突出粘性末端的PACAP38-NtA片段；用Xba I和BamH I双酶切载体pET-3c，得到具有突出粘性末端的线性载体pET-3c；将具有突出粘性末端的PACAP38-NtA片段和具有突出粘性末端的线性载体pET-3c连接，得到重组载体pET-3c/PACAP38-NtA；

（2）重组菌株的获得：将重组载体pET-3c/PACAP38-NtA转染到大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3），得到表达重组蛋白PACAP38-NtA的重组菌株；

步骤（1）①中所述的基因合成为通过基因合成公司进行合成；

步骤（1）②中所述的PCR扩增的条件优选为：95℃ 5分钟；95℃ 30秒、63℃ 30秒、72℃ 40秒，30个循环；72℃延伸10分钟；

所述的表达重组蛋白PACAP38-NtA的菌株的发酵方法，包含如下步骤：

1）活化：将表达重组蛋白PACAP38-NtA的重组菌株进行活化；活化的培养基为含氨苄西林和氯霉素的LB液体培养基；活化的条件为37℃，180rpm振荡培养8～10h；

2）种子液的制备：将活化后的表达重组蛋白PACAP38-NtA的重组菌株逐级放大至发酵罐培养所需的种子液；逐级放大的培养基为含氨苄西林和氯霉素的LB液体培养基；每一级培养的条件为37℃、180～200rpm培养10h～12h；

3）发酵罐发酵：将种子液按体积比1:10接种到发酵培养基中；发酵的初始条件为37℃、200rpm、通气量3L、保持溶氧在30%～50%；菌体发酵1h后再加入甘油作为碳源，在细菌进入对数增长期（A600为6.0～7.0）时加入IPTG进行诱导表达，同时将转速增大到600rpm，增大通气量至6L，诱导4h后放罐，在诱导期间，保持转速为600rpm，通气量为6L，溶氧保持在30%～50%；发酵培养基的组成如下：每升中含蛋白胨20g、酵母提取物20g、NaCl 3.3g、KH₂PO₄1g、K₂HPO₄3.9g，pH 7.2～7.4，蒸馏水溶解定容，121℃灭菌20min；

步骤1）中所述的活化的步骤优选为：将表达重组蛋白PACAP38-NtA的重组菌株按体积比1:50接种于5ml含氨苄西林和氯霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养8～10h，使表达菌活化；

步骤2）中所述的种子液的制备优选包含以下步骤：将活化后的达重组蛋白PACAP38-NtA的重组菌株按体积比1:50接种于5ml含氨苄西林和氯霉素的LB液体培养基中，37℃、180～200rpm培养10h～12h，得到菌液；接着再按体积比1：50接种于300mL含氨苄西林和氯霉素的LB液体培养基中，37℃、180～200rpm，培养10h～12h；

所述的氨苄西林的浓度优选为0.1mg/ml；

所述的氯霉素的浓度优选为34μg/ml；

步骤3）中所述的甘油的用量为：每3L发酵培养基中加入浓度为质量百分比2%的甘油200ml；

所述的重组蛋白PACAP38-NtA的纯化方法，包含以下步骤：

I、菌体的溶解：将上述发酵罐发酵收集得到的菌体按体积比1:10重悬于缓冲液（20mM Tris，pH 8.0）中，以65%振幅超声破碎后，20000rpm、4℃离心1h收集上清液；

II、阴离子交换层析：先以1～5倍柱体积的缓冲液（20mM Tris，pH 8.0）平衡Q sepharose fast flow离子交换柱；然后将步骤①得到的上清液过的Qsepharose fast flow离子交换柱，使蛋白结合到离子交换柱上；用洗脱液进行洗脱，收集在A280波长下具有吸收峰的洗脱液，将其在亲和层析结合缓冲液中进行透析，其中洗脱液为20mM Tris+0.05M NaCl、pH8.0，亲和层析结合缓冲液为50mM NaH₂PO₄+300mM NaCl、pH 8.0；

III、Ni-NTA树脂亲和层析：先以5倍柱体积的亲和层析结合缓冲液平衡Ni-NTA柱；然后将步骤②透析后得到的蛋白溶液上平衡好的Ni-NTA柱，用洗脱液洗脱，收集在A280波长下具有吸收峰的洗脱液，得到纯化的目的重组蛋白PACAP38-NtA，洗脱液为50mM NaH₂PO₄+300mM NaCl+5mM咪唑、pH 8.0；

所述的重组蛋白PACAP38-NtA可用于制备修复损伤角膜的药品。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明提供的重组蛋白PACAP38-NtA既具有PACAP38的神经营养和神经修复功能，并且具有NtA的靶向结合层粘连蛋白的功能。由于将PACAP38-NtA作为眼部外用药来研究开发，不参与体内血液循环，就避免了其在体内产生抗性的风险，从而当角膜出现损伤时，PACAP38-NtA能特异性结合于损伤部位，使其修复功能得到更好的发挥，其用量较少，且促角膜修复作用较好，能在较短的时间内完成修复作用。

（2）本发明通过密码子优化，得到本发明所提供的编码重组蛋白PACAP38-NtA的核苷酸序列。将该编码重组蛋白PACAP38-NtA的核苷酸序列重组于pET-3c原核表达系统中，在大肠杆菌BL21(DE3)表达得到的重组蛋白PACAP38-NtA。

（3）本发明所提供的PACAP38-NtA基因的发酵方法，能得到较高产量的蛋白量。

（4）本发明所提供的PACAP38-NtA基因两步纯化方法，能得到纯度较高的PACAP38-NtA蛋白。

附图说明

图1是表达重组蛋白PACAP38-NtA的大肠杆菌BL21（DE3）的诱导时间摸索图；其中：泳道M为蛋白质Marker（TaKaRa公司，D530A），泳道1为未添加IPTG诱导得到的蛋白，泳道2～6为添加1mmol/L IPTG分别诱导1h、2h、3h、4h、5h得到的蛋白。

图2是表达重组蛋白PACAP38-NtA的大肠杆菌BL21（DE3）的IPTG浓度摸索图；其中：泳道M为蛋白质Marker（TaKaRa公司，D530A），泳道1为未添加IPTG诱导得到的蛋白，泳道2～6分别为添加0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L IPTG诱导3h得到的蛋白。

图3是表达重组蛋白PACAP38-NtA的大肠杆菌BL21（DE3）的温度摸索图；其中：泳道M为蛋白质Marker（TaKaRa公司，D530A），泳道1、3、5为未添加IPTG分别在28℃、30℃和32℃条件下诱导3h得到的蛋白，泳道2、4、6为添加1mmol/L IPTG分别在28℃、30℃和32℃条件下诱导3h得到的蛋白。

图4是表达重组蛋白PACAP38-NtA的大肠杆菌BL21（DE3）在3L发酵罐中进行发酵的菌体生长曲线图。

图5是重组蛋白PACAP38-NtA及野生型PACAP38分别与层粘连蛋白的结合能力的检测图。

图6是重组蛋白PACAP38-NtA及野生型PACAP38分别对PC12细胞的促增殖作用的结果图。

图7是重组蛋白PACAP38-NtA及野生型PACAP38分别对PC12细胞的促分化作用的结果图。

图8是重组蛋白PACAP38-NtA及野生型PACAP38分别对C57小鼠损伤角膜的修复作用效果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

设计PACAP38-NtA蛋白和PACAP27-NtA的氨基酸序列，序列分别如下：

PACAP38-NtA的氨基酸序列：

PACAP27-NtA的氨基酸序列：

HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGSGGGSGGGGSGGGGSNCPERELQEEEEEANVVLTGTVEEIMNDVPVHHTYSCKVRVWRYLKGKDIVTHEILLDGGNKVVIGGFGDPLICDNQVSTGDTRIFFVNPAPQYMWPAHRNELMLNSSLMRITLRNLEEVEHCVEEHRKLLADKPNSYFTQTPPTP。

根据大肠杆菌密码子的偏好性，分别推测其核苷酸序列如下：

编码PACAP38-NtA的核苷酸序列：

编码PACAP27-NtA的核苷酸序列：

CACTCTGACGGTATCTTCACCGACTCTTACTCTCGTTACCGTAAACAGATGGCTGTTAAAAAATACCTGGCTGCTGTTCTGGGTTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTAACTGCCCGGAACGTGAACTGCAGGAAGAAGAAGAAGAAGCTAACGTTGTTCTGACCGGTACCGTTGAAGAAATCATGAACGACGTTCCGGTTCACCACACCTACTCTTGCAAAGTTCGTGTTTGGCGTTACCTGAAAGGTAAAGACATCGTTACCCACGAAATCCTGCTGGACGGTGGTAACAAAGTTGTTATCGGTGGTTTCGGTGACCCGCTGATCTGCGACAACCAGGTTTCTACCGGTGACACCCGTATCTTCTTCGTTAACCCGGCTCCGCAGTACATGTGGCCGGCTCACCGTAACGAACTGATGCTGAACTCTTCTCTGATGCGTATCACCCTGCGTAACCTGGAAGAAGTTGAACACTGCGTTGAAGAACACCGTAAACTGCTGGCTGACAAACCGAACTCTTACTTCACCCAGACCCCGCCGACCCCG。

其中粗体字母显示分别是PACAP38与PACAP27的氨基酸序列和核苷酸序列。

上述2条核苷酸序列均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并装载于pUC57中，作为扩增PACAP38-NtA和PACAP27-NtA的模板DNA。然后进行PCR扩增得到目的片段，目的片段通过上游引物F1引入ATG作为起始密码子，通过下游引物R1在C端引入6个CAT作为His标签，还引入了TAA和TGA两个终止密码子。

引物F1：5’-ATGCTCTAGAATGCACTCTGACGGTATCTTC-3’；

引物R1：5’-ATCGGGATCCTCATTAATGATGATGATGATGATGCGGGGTCGGCGGGGT-3’；

分别对以上2段核苷酸序列进行PCR扩增，将XbaI酶切位点引入核苷酸序列的5’端，将BamHI酶切位点引入核苷酸序列的3’端。

PCR的反应体系为：模板DNA 1μl（10ng/μl）、引物F1 1μl（1μM）、引物R1 1μl（1μM）、3d H₂O（三蒸水）2μl、2×PCR Mix 5μl（广州东盛生物科技有限公司）。

PCR的反应条件为：95℃ 5分钟；95℃ 30秒、63℃ 30秒、72℃ 40s，30个循环；72℃延伸10分钟。

进行PCR扩增获得PCR产物，通过质量体积比1%的琼脂糖凝胶电泳，使用Omega凝胶回收试剂盒对得到的PCR产物分别纯化回收。纯化后的PCR产物与

18-T Vector（TaKaRa公司）连接。

连接体系如下：

18-T Vector1μl、PCR产物DNA 1μl、3dH₂O3μl、SolutionⅠ 5μl，16℃连接6小时。

连接后通过冰CaCl₂法转化大肠杆菌DH5α（购自广州展晨生物科技有限公司），具体操作步骤如下：接种50μl大肠杆菌DH5α于5ml LB培养基中，180rpm、37℃摇2h，冰上静置30min后收集菌液于EP管中，7000rpm离心3min后得菌体，弃上清。用800μl冰CaCl₂（0.1M）重悬后，7000rpm离心3min后弃上清，得菌体。再加入50μl CaCl₂重悬菌体。加入0.5～1μl重组质粒，冰上静置30min。42℃水浴热击90s，冰上静置2min。最后加入200μl预热的SOC培养基，180rpm，37℃振荡45min。

通过在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上进行筛选，每个平板取5个白色菌斑接种于含有50μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中进行扩增，用质粒抽提纯化试剂盒（Omega公司）抽提质粒DNA，测序。根据测序结果，各确认1个序列完全正确的克隆，分别记作

18-T/PACAP38-NtA和

18-T/PACAP27-NtA。

使用XbaI酶（TaKaRa公司）和BamHI酶（TaKaRa公司）分别进行双酶切

18-T/PACAP38-NtA和18-T/PACAP27-NtA。同时也使用XbaI酶（TaKaRa公司）和BamHI酶（TaKaRa公司）双酶切载体pET-3c（Novagen）。

18-T/PACAP38-NtA和

18-T/PACAP27-NtA的酶切体系如下：质粒DNA 72μl（1μg/μl）、Xba I酶3μl、BamH I 3μl、10×buffer K 20μl、ddH₂O 2μl，共100μl体系，37℃酶切3小时。酶切后通过质量体积比1%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收试剂盒回收酶切后的PCR产物。

载体pET-3c的酶切体系如下：质粒DNA 15μl（1μg/μl）、Xba I酶1μl、BamHI1μl、10×buffer（10倍浓度的缓冲液）K 1μl、ddH₂O（双蒸水）2μl，共20μl体系，37℃酶切3小时。

通过连接酶Ligation high（TOYOBO）连接酶切后回收的质粒DNA产物和载体pET-3c，连接体系如下：酶切后载体pET-3c 1μl、酶切后DNA 4μl、Ligationhigh5μl，共10μl体系，16℃连接6h。再将连接得到的产物，同样通过冰CaCl₂法转化大肠杆菌DH5α，并用含氨苄青霉素的LB琼脂平板上进行筛选，挑取单克隆并进行扩增后，抽提质粒，再运用Xba I酶和BamH I酶双酶切法进行验证，然后通过测序各确定1个序列完全正确的克隆，分别记作pET-3c/PACAP38-NtA和pET-3c/PACAP27-NtA。

实施例2

融合基因表达载体pET-3c/PACAP38-NtA和pET-3c/PACAP27-NtA在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达。

将含有重组载体pET-3c/PACAP38-NtA和pET-3c/PACAP27-NtA的大肠杆菌DH5α克隆分别接种于含50μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的的液体LB培养基中，37℃培养12h，用Omega质粒抽提试剂盒抽提质粒DNA。

将pET-3c/PACAP38-NtA和pET-3c/PACAP27-NtA质粒分别转化大肠杆菌BL21（DE3）（购自Novagen公司）感受态细胞（感受态细胞的制备方法同上提到的冰CaCl₂法）。转化时分别取上述纯化的pET-3c/PACAP38-NtA和pET-3c/PACAP27-NtA质粒100μg作为DNA样品对大肠杆菌BL21（DE3）进行转化，得到的表达菌种分别记作PACAP38-NtA/BL21(DE3)和PACAP27-NtA/BL21(DE3)。将重组菌株保种于甘油中（850μl菌液+150μl纯甘油）。

将带有重组质粒的表达菌PACAP38-NtA/BL21(DE3)和PACAP27-NtA/BL21(DE3)分别按体积比1：50的比例转接到5ml含50μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的的液体LB培养基中，37℃，180rpm摇菌两小时，然后加入一定量的IPTG进行诱导表达。分别改变其诱导时间、IPTG终浓度及诱导温度，对最适诱导条件进行摸索。

其中，在对诱导时间摸索时，IPTG的终浓度为1mmol/L，在32℃诱导表达5小时。每小时取样一次（同时接种5支LB管，取样时一次取一支，保证有足够多的样品用于SDS-PAGE分析），每次1ml，得到的菌液8000rpm离心1min后去上清，菌体加入40μl灭菌水及10μl 5×loading buffer（5倍浓度的上样缓冲液），混匀后煮沸5min，进行15%SDS-PAGE分析。结果如图1所示，表明诱导4小时后，蛋白表达量能够满足要求，延长诱导时间，蛋白表达量不会有很大程度的增加。

在对IPTG加入培养基后的终浓度进行摸索时，分别用终浓度为0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1mM的IPTG进行诱导，32℃诱导3h。分别取样进行15% SDS-PAGE分析，结果如图2所示，表明在0.2mM～1mM的IPTG终浓度范围内，蛋白表达量变化不大。

在对诱导温度摸索时，IPTG的终浓度为1mmol/，分别28℃、30℃、32℃的温度条件下，诱导3h。分别取样进行15% SDS-PAGE分析，结果如图3所示，表明：此三个温度条件下均有一定量的蛋白表达，但温度在30℃时，蛋白表达量较高。

综合考虑图1～3的结果，选定以30℃，1mmol/L IPTG诱导4h作为获取重组蛋白PACAP38-NtA的上罐条件。

另外，对PACAP27-NtA/BL21(DE3)也采用类似于PACAP38-NtA/BL21(DE3)的表达方式，同时也对其诱导时间、IPTG终浓度及诱导温度进行了摸索，最后发现，PACAP27-NtA/BL21(DE3)的诱导的最优条件为：28℃，0.8mmol/L IPTG诱导5h。

实施例3小型生物反应器中发酵培养重组蛋白

对实施例2中获得的PACAP38-NtA/BL21(DE3)和PACAP27-NtA/BL21(DE3)菌种分别进行摇瓶的放大培养，即按体积百分比2%接种量接种于2支5mL含50μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的的液体LB培养基，37℃摇床培养12h后，再按体积百分比2%接种量转接至300mL含50μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的的液体LB培养基（摇瓶为1000mL）中，37℃，180rpm，培养12h，得300ml的种子液。

将3L发酵培养基倒入发酵罐中，pH、溶氧电极等安装到发酵罐上，以棉花和锡纸封好管路出口，121℃，灭菌18min。种子补料瓶、酸碱补料瓶、甘油补料瓶亦高压灭菌，备用。

发酵培养基：蛋白胨60g，酵母提取物60g，NaCl 10g，KH₂PO₄3g，K₂HPO₄11.7g，蒸馏水溶解，定容至3L，pH 7.2～7.4。反应时设定初始条件为37℃，200rpm，通气量3L，待以上参数稳定后校正溶氧，保持发酵期间溶氧在30%～50%，再将300ml种子液转入3L发酵培养基中，取初始培养液测量A600nm，1h后向培养基中加入2%（w/w）甘油200ml，每隔一段时间取样测量A600nm，绘制菌体生长曲线图，如图4所示。在菌种进入快速增长期（A600nm=6.76，上发酵罐3h）时加入1mol/L IPTG3ml，30℃进行诱导，保持转速保持为600rpm，通气量保持为6L，保持溶氧在30%～50%，4h后放罐，SDS-PAGE检测，Image J灰度扫描重组蛋白PACAP38-NtA和PACAP27-NtA的表达量，其表达量分别为42%和40%。

实施例4高纯度的重组蛋白PACAP38-NtA和PACAP27-NtA的获取

I、先对PACAP38-NtA蛋白的纯化条件进行摸索：

将发酵菌体按体积比1:10比例重悬于缓冲液（20mM Tris、pH 8.0）中，以65%振幅超声破碎后，20000rpm、4℃离心1h收集上清液。再通过阴离子交换层析和Ni-NTA树脂亲和层析两步纯化法获得纯度在95%以上的PACAP38-NtA融合蛋白。

（1）阴离子交换层析步骤：先以100ml的缓冲液（20mM Tris，pH8.0）以1ml/min的流速过Q sepharose fast flow柱（柱体积为50ml），使柱子得以平衡，然后以含不同盐浓度的洗脱缓冲液（20mM Tris，（0.05M、0.1M、0.2M、0.4M、0.8M、1M）NaCl，pH 8.0）进行洗脱，收集具有吸收峰（A280nm）的洗脱液。收集具有吸收峰的洗脱液，进行SDS-PAGE分析。结果表明，含盐浓度0.05MNaCl的缓冲液（即20mM Tris，0.05M NaCl，pH 8.0）进行洗脱，只产生一个吸收峰，收集该吸收峰内产生的洗脱液，将其在亲和层析结合缓冲液（50mMNaH₂PO₄+300mM NaCl、pH 8.0）中进行透析。

（2）Ni-NTA树脂亲和层析步骤：先以50ml亲和层析结合缓冲液保持1ml/min的流速平衡Ni-NTA柱（柱体积为10ml），然后以含不同咪唑浓度的亲和层析结合缓冲液（50mM NaH₂PO₄+300mM NaCl+（5mM、50mM、120mM、250mM）咪唑，pH 8.0）进行洗脱。收集具有吸收峰（A280nm）的洗脱液，进行SDS-PAGE分析。结果表明，含5mM咪唑的亲和层析结合缓冲液过柱洗脱就能得到目的蛋白，HPLC分析，目的蛋白纯度在95%以上。

将重组蛋白PACAP38-NtA用透析袋（MD44）在纯水中透析36h达到脱盐的目的，最后用Millipore超滤管（3K）进行浓缩，4℃、6000g离心90min。然后将超滤浓缩液分装至小瓶冻干。最后得到PACAP38-NtA融合蛋白的量经过计算可知：每升发酵液可获得24mg PACAP38-NtA蛋白，得率为85%。

II、重组蛋白PACAP27-NtA的获得以相同的纯化方式，每升发酵液可获得20mg PACAP27-NtA蛋白，得率是83%。

III、重组蛋白PACAP38-NtA和PACAP27-NtA的纯度的检测与层粘连蛋白结合活性的检测

将蛋白加超纯水溶解，经HPLC进行纯度测定，测定结果显示纯度大于95%。再经质谱分析，测得PACAP38-NtA的分子量为28923D，PACAP27-NtA的分子量为27522D。

将纯化后的PACAP38-NtA和PACAP27-NtA融合蛋白同时与层粘连蛋白（laminin，LN）（sigma公司）通过间接ELISA方法检测其与LN的结合活性，并测定其相对亲和力，以野生型PACAP38（sigma，A1439）和PACAP27（sigma）作为阳性对照，以纯水作为阴性对照。具体方法如下：

（1）用包被液（pH 7.0、0.1M Tris-NaCl缓冲液）稀释层粘连蛋白（sigma公司）至5μg/ml，以100μl/孔加至96孔酶标板内，4℃过夜。

（2）扣干包被液，用PBST（PBS配方：NaCl 8.0g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，加水至1000mL，pH7.4；加吐温-20即为PBST，吐温-20的终浓度为体积百分比0.05%）以300μl/孔加至96孔酶标板内，洗板1次，每次3min。

（3）用质量体积百分比2.5%的BSA（250mg BSA+10ml PBST）封闭液，以300μl/孔加至板内，室温放置1小时。

（4）将待测样品（PACAP-NtA融合蛋白和野生型PACAP）分别PBS稀释为7个不同浓度梯度（10μM、2μM、0.4μM、0.08μM、0.016μM、0.0032μM、0.00064μM）。每孔加入100μl各种稀释度的样品，每个稀释度做3个复孔，空白对照孔只加入超纯水。

（5）在37℃条件下孵育1h。用PBST洗涤液以300μl/孔洗板3次，每次3min。

（6）用封闭液将兔抗人PACAP一抗（抗PACAP38和抗PACAP27都能用，即Anti-MGC29506(PACAP)(151-165)antibody produced in rabbit）（sigma公司，SAB1101601）按体积比1:1000的比例稀释，加入酶标孔中，每孔加入100μl，在37℃条件下孵育1h。用PBST洗涤液以300μl/孔洗板3次，每次3min。

（7）用PBST将山羊抗兔IgG（Fc）/HRP二抗按体积比1:3000的比例稀释，每孔加入100μl稀释后的抗体。

（8）在37℃条件下孵育1h。用PBST洗涤液以300μl/孔洗板3次，每次3min。

（9）TMB显色液按200μl/孔上样，在37℃条件下避光孵育15分钟，可见显色。用1M硫酸以50μl/孔加至板内终止反应。在450nm波长下读取OD值。

PACAP38-NtA的检测结果如图5所示，与野生型PACAP38进行比较分析发现，本发明中的重组蛋白PACAP38-NtA可以与人LN特异性结合，没有NtA末端的野生型PACAP38不能与LN特异性结合。

而PACAP27-NtA与层粘连蛋白的结合能力的ELISA实验则表明其不能与LN特异性结合，因此，PACAP38-NtA融合蛋白具有NtA的特性，而PACAP27-NtA则不具备此特性。

实施例5

对纯化后的重组蛋白PACAP38-NtA和PACAP27-NtA进行以下的活性检测。

I、重组蛋白PACAP38-NtA和PACAP27-NtA对PC12细胞的促增殖活性研究

（1）取生长至90%的已分化PC12细胞（ATCC CRL-1721，来自中国科学院上海生科院细胞资源中心），用1ml胰酶常规消化使细胞充分分散，并用1ml细胞培养液（DMEM（Gibco）+10%（v/v）HS（广州蕊特生物科技有限公司，001002）+5%（v/v）FBS（胎牛血清，Bioind））稀释细胞。

（2）取96孔板，将细胞以8000个/孔接种于96孔板（100μl每孔），5%CO₂培养箱中37℃培养24小时。

（3）弃孔中原有培养基，换饥饿培养基（DMEM+0.5%（v/v）FBS）100μl/孔，5%CO₂培养箱中37℃培养24小时，进行饥饿处理。

（4）弃孔中原有的饥饿培养基，用饥饿培养基将重组蛋白PACAP-NtA和野生型PACAP分别稀释至500nM、50nM、5nM、0.5nM、0.05nM。

（4）每孔加入100μl各种稀释度的样品，每个稀释度5个复孔。阴性对照只加入100μl饥饿培养基。

（5）5%CO₂培养箱中37℃培养24小时。

（6）加入CCK8（每孔10μl）试剂（DOJINDO）后在450nm/630nm双波长读取OD值。

PACAP38-NtA检测结果如图6所示，表明本发明中的PACAP38-NtA融合蛋白具有对PC12细胞的促增殖作用。在0.05nM～50nM范围内，与野生型PACAP38进行比较分析发现，PACAP-NtA融合蛋白的促PC12细胞增殖能力略强于野生型PACAP。

而同样方法检测PACAP27-NtA对PC12细胞的促增殖作用，结果显示，PACAP27-NtA不具备野生型PACAP27的功能，不能有效的促进PC12细胞增殖，这说明，本发明中优化条件后所获得的融合蛋白PACAP38-NtA具有PACAP38的生物学活性功能，而同样条件表达并进行纯化后的PACAP27-NtA并不具有PACAP27的生物学活性功能。

II、PACAP-NtA融合蛋白对PC12细胞的促分化活性研究

（1）取生长至90%的已分化PC12细胞（ATCC CRL-1721，来自中国科学院上海生科院细胞资源中心），用1ml胰酶常规消化使细胞充分分散，并用饥饿培养基（即DMEM（Gibco）+0.5%（v/v）FBS（胎牛血清，Bioind））稀释至5.0×10⁶个/ml。

（2）准备插入式细胞培养板（BD Falcon^TM Multiwell 24 well insert system.3μm pores），取出小室，在配套的24孔板的孔中分别加入用饥饿培养基稀释得到的100nM PACAP38-NtA和100nM PACAP27-NtA，每孔500μl，以100nM的野生型PACAP38和PACAP27-NtA为对照。

（3）小室中加入PC12细胞悬液100μl，即5×10⁴个/孔，37℃分别培养3h、6h、12h和24h。

（4）在相应的时间点取出小室，对小室底部膜进行下述处理：以PBS（同上配制）清洗膜3次，甲醛固定15min；再用PBS清洗3次0.1%结晶紫染色5min；再用PBS清洗后进行镜检拍照，并将膜浸入体积百分比33%冰醋酸进行脱色，200μl/孔，收集脱色液，570nm酶标仪上测OD值；以蛋白浓度为X轴，OD值为Y轴，绘制曲线。

图7为PACAP38-NtA的检测结果，结果显示重组蛋白PACAP38-NtA具有对PC12细胞的促分化作用。与野生型PACAP38进行比较分析发现，PACAP38-NtA融合蛋白的促PC12细胞分化能力与野生型PACAP的促分化能力类似。而对PACAP27-NtA的促PC12细胞分化的结果显示，其不具备促PC12细胞突起生长的能力，这说明，本发明中优化条件后所获得的融合蛋白PACAP38-NtA具有PACAP的生物学活性功能，而PACAP27-NtA不具备此功能。

以上实验表明，PACAP27-NtA融合蛋白不具备相应的生物学活性，故选定PACAP38-NtA作为后续实验蛋白。

III、动物实验验证PACAP38-NtA融合蛋白的体外修复作用

（1）取8周大C57小鼠（购自中山大学实验动物中心，SPF级），腹腔注射质量体积比10%的水合氯醛70μl进行麻醉后，在解剖镜下用微型角膜刀（MK2000）在角膜上实施刮伤实验，得到一个直径5mm圆形角膜瓣区域。

（2）用质量体积比0.2%荧光素钠水溶液（阿拉丁试剂，F105615）10μl，对眼部损伤部位进行染色处理。然后用大量生理盐水冲洗眼部，则损伤部位着上绿色，拍照记录，标记为0h。

（3）将角膜被损伤的小鼠随机分为三组，分别滴加10μl的生理盐水、100nm的PACAP38-NtA及100nm的野生型PACAP38，待药稍吸收后再滴加一定量（一滴，约50μl）的氯霉素滴眼液，防止眼部发炎，然后正常给予饮食和水，每隔12h补药一次。

（4）分别于12h、18h、24h、36h对小鼠的眼部修复程度进行观察，并拍照记录。

实验结果如图8所示，图示结果显示：分别滴加生理盐水、PACAP38-NtA及PACAP38的三组小鼠的角膜修复时间分别是36h、18h和24h。即PACAP38-NtA作用18小时即可修复，野生型PACAP38需作用24小时才能达到PACAP38-NtA的作用效果。表明PACAP38-NtA确实能有促进角膜修复的作用，其修复效果更胜于PACAP38。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种重组蛋白PACAP38-NtA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的重组蛋白PACAP38-NtA的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.一种表达重组蛋白PACAP38-NtA的菌株，其特征在于：是将权利要求2所述的核苷酸序列转染到大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）得到。

4.根据权利要求3所述的表达重组蛋白PACAP38-NtA的菌株，其特征在于通过如下制备方法得到：

（1）重组原核表达载体pET-3c/PACAP38-NtA的构建

②使用引物F1和引物R1对步骤①得到的编码重组蛋白PACAP38-NtA的基因进行PCR扩增，得到Xba I-PACAP38-NtA-BamH I基因，该基因具有起始密码子ATG和两个终止密码子TAA、TGA，以及C末端含有6个His标签位点；

引物F1：5’-ATGCTCTAGAATGCACTCTGACGGTATCTTC-3’；

引物R1：5’-ATCGGGATCCTCATTAATGATGATGATGATGATGCGGGGTCGGCGGGGT-3’；

③将步骤②中获得的PCR产物与

18-T连接，得到重组克隆载体

18-T/PACAP38-NtA；

④用Xba I和BamHI双酶切步骤③得到的

（2）重组菌株的获得：将重组载体pET-3c/PACAP38-NtA转染到大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3），得到表达重组蛋白PACAP38-NtA的重组菌株。

5.根据权利要求4所述的表达重组蛋白PACAP38-NtA的菌株，其特征在于：步骤（1）②中所述的PCR扩增的条件为：95℃ 5分钟；95℃ 30秒、63℃ 30秒、72℃ 40秒，30个循环；72℃延伸10分钟。

6.权利要求3～5任一项所述的表达重组蛋白PACAP38-NtA的菌株的发酵方法，其特征在于包含如下步骤：

3）发酵罐发酵：将种子液按体积比1:10接种到发酵培养基中；发酵的初始条件为37℃、200rpm、通气量3L、保持溶氧在30%～50%；菌体发酵1h后再加入甘油作为碳源，在细菌进入对数增长期时加入IPTG进行诱导表达，同时将转速增大到600rpm，增大通气量至6L，诱导4h后放罐，在诱导期间，保持转速为600rpm，通气量为6L，溶氧保持在30%～50%；发酵培养基的组成如下：每升中含蛋白胨20g、酵母提取物20g、NaCl 3.3g、KH₂PO₄ 1g、K₂HPO₄ 3.9g，pH 7.2～7.4，蒸馏水溶解定容，121℃灭菌20min。

7.根据权利要求6所述的表达重组蛋白PACAP38-NtA的菌株的发酵方法：步骤1）中所述的活化的步骤为：将表达重组蛋白PACAP38-NtA的重组菌株按体积比1：50接种于5ml含氨苄西林和氯霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm振荡培养8～10h，使表达菌活化；

步骤2）中所述的种子液的制备包含以下步骤：将活化后的达重组蛋白PACAP38-NtA的重组菌株按体积比1:50接种于5ml含氨苄西林和氯霉素的LB液体培养基中，37℃、180～200rpm培养10h～12h，得到菌液；接着再按体积比1：50接种于300mL含氨苄西林和氯霉素的LB液体培养基中，37℃、180～200rpm，培养10h～12h；

所述的氨苄西林的浓度为0.1mg/ml；

所述的氯霉素的浓度为34μg/ml；

步骤3）中所述的甘油的用量为：每3L发酵培养基中加入浓度为质量百分比2%的甘油200ml。

8.权利要求1所述的重组蛋白PACAP38-NtA的纯化方法，包含以下步骤：

I、菌体的溶解：将权利要求6所述的发酵罐发酵得到的菌体按体积比1:10重悬于组成为20mM Tris、pH8.0的缓冲液中，以65%振幅超声破碎后，20000rpm、4℃离心1h收集上清液；

II、阴离子交换层析：先以1～5倍柱体积的20mM Tris、pH 8.0缓冲液平衡Q sepharose fast flow离子交换柱；然后将步骤①得到的上清液过的Q sepharosefast flow离子交换柱，使蛋白结合到离子交换柱上；用洗脱液进行洗脱，收集在A280波长下具有吸收峰的洗脱液，将其在亲和层析结合缓冲液中进行透析，其中洗脱液为20mM Tris+0.05M NaCl、pH8.0，亲和层析结合缓冲液为50mMNaH₂PO₄+300mM NaCl、pH 8.0；

III、Ni-NTA树脂亲和层析：先以5倍柱体积的亲和层析结合缓冲液平衡Ni-NTA柱；然后将步骤②透析后得到的蛋白溶液上平衡好的Ni-NTA柱，用洗脱液洗脱，收集在A280波长下具有吸收峰的洗脱液，得到纯化的目的重组蛋白PACAP38-NtA，洗脱液为50mM NaH₂PO₄+300mM NaCl+5mM咪唑、pH 8.0。

9.权利要求1所述的重组蛋白PACAP38-NtA在制备修复损伤角膜药品中的应用。