CN106084038A - 一种人重组Irisin蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人Irisin重组蛋白的DNA序列。本发明还公开了一种人Irisin重组蛋白。本发明还公开了人Irisin重组蛋白的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。本发明还公开一种转基因重组菌。本发明还公开了一种人Irisin重组蛋白的制备方法。本发明还公开了一种人Irisin重组蛋白在制备代谢性疾病药物的应用。本发明所提供的方法步骤简便，生产成本低，生产周期短，通过本发明所提供的方法，可得到纯度较高的目的蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域中重组基因的真核表达和纯化方法，特别涉及一种人重组Irisin蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化方法。
背景技术
Irisin是2012年年初在《自然》杂志上报道的一种新的肌肉因子，是蛋白水解酶剪切III型纤连蛋白组件包含蛋白5(fibronectin type III domain-containing protein5，FNDC5)后形成的可分泌多肽片段。人FNDC5的N-端有一个信号序列，中间为III型纤连蛋白结构域(FND)，紧接其后的为疏水氨基酸区和C-末端。Irisin是FNDC5中纤连蛋白结构域的主要部分，是由112个氨基酸残基组成的N-糖基化蛋白质激素，其序列在种属间高度保守，人和小鼠的Irisin氨基酸序列同源性为100％。
发现者用希腊神话中信使女神Iris的名字为Irisin命名，暗喻其像Iris一样，作为骨骼肌的使者，传递骨骼肌的信号，并连接骨骼肌与外周组织的关系。Irisin最重要的生物学功能是通过内分泌、旁分泌和自分泌的方式作用于白色脂肪细胞，使后者转变为具有分解代谢脂肪特征的棕色脂肪细胞，以产热的方式消除白色脂肪，从而起到减肥作用。研究表明，Irisin水平主要反映了肌肉质量，且在年轻的男性运动员中其量高于老年女性；另有研究表明，II型糖尿病患者的血清Irisin水平是降低的，并且与新发II型糖尿病的发病率呈反比，表明Irisin可能在糖耐量和II型糖尿病中发挥关键作用；此外，有关报道还指出Irisin与非酒精性脂肪肝、心率衰竭等病理现象存在一定的相关性。
可以看出Irisin必将是一个很有前景的活性因子，并成为代谢性疾病及其并发症防治的新靶点，有非常大的潜在价值。因此，开发Irisin蛋白的可大规模生产并便于纯化的方法，具有非常大的价值。
但是目前国内外还没有研究报道将该人重组Irisin蛋白用于毕赤酵母中的表达与纯化。
发明内容
发明目的：本发明的第一个目的是提供一种人Irisin重组蛋白的DNA序列。
本发明的另一个目的在于提供一种人Irisin重组蛋白。
本发明的又一个目的是提供含有所述的人Irisin重组蛋白的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。
本发明的又一个目的是提供一种含有所述的人Irisin重组蛋白的转基因重组菌。
本发明的又一个目的是提供一种人Irisin重组蛋白的制备方法。
本发明的又一个目的是提供一种人Irisin重组蛋白在制备代谢性疾病药物的应用。
技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供一种人Irisin重组蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
一种人Irisin重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
含有所述的人Irisin重组蛋白的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。
将所述的DNA序列插入到毕赤酵母分泌表达载体中得到的表达人Irisin重组蛋白的DNA的重组表达载体。
其中，上述毕赤酵母分泌表达载体为pPIC9K。
一种转基因重组菌，所述重组菌是将所述的重组表达载体导入毕赤酵母中，筛选得到转基因重组菌(转基因重组酵母菌株)。
其中，上述毕赤酵母为GS115(购自ivitrogen公司)。
其中，上述的DNA序列、重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产人Irisin重组蛋白中的应用。
一种人Irisin重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1)从人肌肉组织中提取总RNA并做反转录PCR得到其cDNA，以cDNA为模板，PCR得到人Irisin的基因片段，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示；
2)经过PCR将His标签插入人Irisin的基因片段，得到人Irisin-his片段；
3)构建pPIC9K-Irisin-his重组表达载体：将人Irisin-his片段插入毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K，得到重组表达载体pPIC9K-Irisin-his；
4)构建GS115-pPIC9K-Irisin-his重组酵母菌株：重组表达载体pPIC9K-Irisin-his电转化毕赤酵母GS115，并通过组氨酸缺陷筛选和G418筛选得到转基因重组酵母菌株GS115-pPIC9K-Irisin-his；
5)人Irisin重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定：通过甲醇诱导表达和镍柱纯化得到人Irisin重组蛋白，并通过细胞活性试验鉴定其活性。
上述的人Irisin重组蛋白在制备代谢性疾病药物的应用。
有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：本发明所提供的人Irisin重组蛋白的制备方法具有方法易行，操作简便，表达量高，成本低廉，通过本发明所提供的方法，可得到具有生物学活性的人Irisin重组蛋白，可用于代谢性疾病药物的制备。其最主要优势在于：本发明首次以毕赤酵母表达系统实现人Irisin重组蛋白的分泌表达，并通过镍柱纯化，可得到了经过糖基化修饰且具有生物学活性的人Irisin重组蛋白。
附图说明
图1：pPIC9K-Irisin-his重组载体酶切检验琼脂糖电泳分析图(第1泳道M为DNA相对分子质量标准DL5000；第2泳道1为经EcoRI、NotI双酶切的pPIC9K-Irisin-his重组载体；第3泳道2为未经酶切的pPIC9K-Irisin-his重组载体；经双酶切后产生一条Irisin-his条带和一条大于5000bp的质粒条带，表明Irisin-his序列已成功插入表达载体；)
图2：GS115-pPIC9K-Irisin-his重组菌株表型鉴定图(筛选得到的转基因重组酵母菌株在MD和MM平板上都能正常生长，证明本发明所得菌株表型为Mut+)；
图3：GS115-pPIC9K-Irisin-his重组菌株表型PCR法鉴定琼脂糖电泳分析图(第1泳道M为DNA相对分子质量标准DL5000；第2泳道1模板为GS115基因组；第3泳道2模板为pPIC9K-Irisin-his重组载体；第4～8泳道3-7模板为GS115-pPIC9K-Irisin-his不同菌株基因组；以GS115基因组为模板只扩增出一条约2200bp的野生AOX1基因片段，以pPIC9K-Irisin-his重组质粒为模板只扩增出一条约含有目的基因的约800bp的片段，而以GS115-pPIC9K-Irisin-his重组菌株的基因组为模板扩展出了2200bp和800bp两个片段，说明其表型为Mut+；)
图4：GS115-pPIC9K-Irisin-his基因组PCR检验琼脂糖电泳分析图(第1泳道M为DNA相对分子质量标准DL2000；第2～6泳道1-5为以不同转化子基因组做模板PCR产物；第7泳道6为阴性对照；提取重组菌株基因组做PCR能得到与人Irisin-his大小相符的条带，说明pPIC9K-Irisin-his成功转入GS115；)
图5：GS115-pPIC9K-Irisin-his诱导上清SDS-PAGE电泳分析图(第1泳道M为蛋白相对分子质量标准；第2～5泳道1-4为GS115-pPIC9K诱导1-4天上清；第6～9泳道5-8为GS115-pPIC9K-Irisin-his诱导1-4天上清；GS115-pPIC9K-Irisin-his菌株的诱导上清中，在14-29KDa之间含有四个大小不同的明显的蛋白条带，并且这四个条带随着诱导时间的增加而逐渐增加；而空载体菌株GS115-pPIC9K的诱导上清中却没有明显条带；提示GS115-pPIC9K-Irisin-his菌株的诱导上清中可能含有人Irisin重组蛋白；)
图6：GS115-pPIC9K-Irisin-his诱导上清镍柱纯化SDS-PAGE电泳分析图(第1泳道M为蛋白相对分子质量标准；第2泳道1为诱导液上清；第3泳道2为过柱液；第4泳道3为20mM咪唑洗涤液I；第5泳道4为50mM咪唑洗涤液II；第6泳道5为500mM咪唑洗脱液；诱导上清中含有14-29KDa之间含有四个大小不同的明显的蛋白条带；过柱液中不含有蛋白条带，表明这四个大小不同的蛋白条带均被镍柱所吸附；20mM咪唑的洗涤液I只洗涤下少量蛋白；为了提高目的蛋白纯度，将洗涤液咪唑浓度提高到50mM，但在洗涤II中也只有少量蛋白；最后，用含有500mM咪唑的洗脱液洗柱，发现洗脱液中包含了四个大小不同的明显的蛋白条带，表明纯化得到这四个条带都有可能是目的蛋白；)
图7：人Irisin蛋白的糖基化位点分析图(序列中有两个可能的N-糖基化位点，其中一个位点发生糖基化的可能性更是高达将近80％，因此，极有可能是重组蛋白发生了N-糖基化，才导致了大小不均一。)
图8：人Irisin重组蛋白去糖基化SDS-PAGE电泳分析图(第1泳道M为蛋白相对分子质量标准；第2泳道1为重组蛋白；第3泳道2为去糖基化酶处理的重组蛋白；含有14-29KDa之间四个大小不同条带的重组蛋白经过去糖基化酶处理之后，只含有14-20KDa之间两个条带，说明重组蛋白确实发生了N-糖基化；)
图9：人Irisin重组蛋白的Western-Blot鉴定图(第1泳道1为诱导上清；第2泳道2为纯化的重组蛋白；第3泳道3为去糖基化的重组蛋白；GS115-pPIC9K-Irisin-his重组菌株的诱导上清在14-20KDa和20-29KDa位置均呈现出特异性条带，表明本发明所构建的重组菌株可以实现人Irisin的重组表达；镍柱纯化得到重组蛋白在14-20KDa和20-29KDa位置均呈现出特异性条带，而经糖基化处理的重组蛋白只在14-20KDa位置均呈现出特异性条带，通过镍柱纯化得到的重组蛋白所包含的四个条带均为人Irisin重组蛋白，只是在表达过程中发生了不同的剪切、蛋白的降解以及糖基化修饰产生了不同大小的重组蛋白；)
图10：C2C12细胞经人Irisin重组蛋白处理后UCP1mRNA相对于内参β-actin表达量柱状图(Irisin-为无人Irisin重组蛋白处理的阴性对照组；Irisin+500为500ng/mL人Irisin重组蛋白处理组；Irisin+1000为1000ng/mL人Irisin重组蛋白处理组；Irisin+2000为2000ng/mL人Irisin重组蛋白处理组；经人Irisin重组蛋白处理后C2C12细胞的UCP1mRNA表达量明显提高，与对照组相比**p<0.01，表明本发明得到的人Irisin重组蛋白具有生物学活性。)
图11：C2C12细胞经人Irisin重组蛋白处理后elovl3mRNA相对于内参β-actin表达量柱状图(Irisin-为无人Irisin重组蛋白处理的阴性对照组；Irisin+500为500ng/mL人Irisin重组蛋白处理组；Irisin+1000为1000ng/mL人Irisin重组蛋白处理组；Irisin+2000为2000ng/mL人Irisin重组蛋白处理组；经人Irisin重组蛋白处理后C2C12细胞的elovl3mRNA表达量明显提高，与对照组相比**p<0.01，表明本发明得到的人Irisin重组蛋白具有生物学活性。)
具体实施方式
实施例1：构建人Irisin重组蛋白的重组表达载体和转基因重组酵母菌株
1.构建pPIC9K-Irisin-his重组表达载体
从人肌肉中提取总RNA并做反转录PCR得到其cDNA。Genbank已公布人Irisin的mRNA序列(NM_153756)设计引物，以上述得到的cDNA为模板，做PCR得到人Irisin的全长CDS片段。把上述人Irisin的基因片段插入到pMD19-T载体中。命名为pMD19-T-Irisin，并测序确定正确获取目的基因。
根据人Irisin的全长CDS序列设计引物，其中上游引物P1引入EcoRI酶切位点，下游引物P2、P3引入His标签、终止密码子和NotI酶切位点：
P1(Irisin-his-E-F)：5’—TAgaattcGACAGTCCCTCAGCCCCA—3’
P2(Irisin-his-1-R)：5’—GTGATGGTGATGGTGCTCTTTCATGGTTAC—3’
P3(Irisin-his-2-R)：5’—TAgcggccgcTTAATGGTGATGGTGATGGTG—3’
以pMD19-T-Irisin质粒为模板，用P1、P2引物进行PCR扩增。
PCR体系为：
反应条件为：
用1％琼脂糖凝胶回收PCR产物，将其做为模板，用P1、P3引物进行PCR扩增。
PCR体系：
反应条件为：
用1％琼脂糖凝胶回收PCR产物，把PCR产物经EcoRI、NotI双酶切后，连接至经EcoRI、NotI双酶切的pPIC9K载体，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化后的DH5α涂含有氨苄的LB平板进行筛选，37℃培养12h，挑取单菌落接种至3mL含有氨苄的LB液体培养基，37℃摇床培养12h，做菌液PCR鉴定后，抽取质粒用EcoRI、NotI双酶切鉴定，并进行测序以确定正确构建载体，测序正确的重组表达载体命名为pPIC9K-Irisin-his。
2.构建GS115-pPIC9K-Irisin-his转基因重组酵母菌株
将上述构建好的pPIC9K-Irisin-his重组表达载体用SacI线性化，将10μg线性化的质粒和80μL毕赤酵母GS115感受态细胞混合，经1500V，6ms电转之后涂MD平板，28℃培养箱培养3-5天长出转化子。将所有转化子用无菌去离子水洗下涂含有不同浓度G418的YPD平板，28℃培养箱培养3-5天，筛选高拷贝数的转化子。采取煮-冻-煮法提取转化子基因组，做PCR鉴定，鉴定正确的高拷贝转化子命名为GS115-pPIC9K-Irisin-his。
3.GS115-pPIC9K-Irisin-his转基因重组酵母菌株表型鉴定
用灭菌的牙签挑取经G418筛选的高抗性菌株，分别点种至MM和MD平板上，做好标记，确保先在MM平板上点，在28℃培养箱中培养3～5d，查看生长状况，确定表型。另外用煮-冻-煮法提取高抗性菌株基因组，以5’AOX1和3’AOX1引物用PCR方法鉴定重组菌株的表型。两种方法均证明本发明所得到的重组菌株的表型为Mut+。
实施例2：人Irisin重组蛋白的诱导表达、纯化及活性鉴定
1.用甲醇诱导表达人Irisin重组蛋白
将转基因重组酵母菌株GS115-pPIC9K-Irisin-his单菌落接种于3mLYPD培养基中，28℃摇床培养18h活化；将上述菌液按照1％接种于BMGY培养基中，28℃摇床培养16-20h至OD600达到2-6，2500×g，5min离心收集菌体，换用BMMY培养基诱导表达，每24h添加甲醇至1％，连续诱导96h，分别在24h、48h、72h、96h收集上清，SDS-PAGE分析蛋白，筛选高表达菌株。同时以同样条件诱导GS115-pPIC9K空载体菌株作为空白对照。结果显示，GS115-pPIC9K-Irisin-his菌株的诱导上清中，在14-29KDa之间含有四个大小不同的明显的蛋白条带，并且这四个条带随着诱导时间的增加而逐渐增加；而GS115-pPIC9K菌株的诱导上清中却没有明显条带。提示GS115-pPIC9K-Irisin-his菌株的诱导上清中可能含有人Irisin重组蛋白。
2.人Irisin重组蛋白的纯化
取100mL的GS115-pPIC9K-Irisin-his诱导96h上清，用8000KDa透析袋在镍柱2L结合液中透析18h，每6h换一次液；将透析后的诱导上清通过AKT用镍柱纯化，上柱子完成后，分别20mM咪唑洗涤液I、50mM咪唑洗涤液I和500mM咪唑洗脱液洗柱，并收集透析液、过柱液、洗涤液I、洗涤液II和洗脱液做SDS-PAGE电泳分析。结果表明，诱导上清中含有14-29KDa之间含有四个大小不同的明显的蛋白条带；过柱液中不含有蛋白条带，表明这四个大小不同的蛋白条带均被镍柱所吸附；20mM咪唑的洗涤液I只洗涤下少量蛋白；为了提高目的蛋白纯度，将洗涤液咪唑浓度提高到50mM，但在洗涤II中也只有少量蛋白；最后，用含有500mM咪唑的洗脱液洗柱，发现洗脱液中包含了四个大小不同的明显的蛋白条带，表明纯化得到这四个条带都有可能是目的蛋白。
3.人Irisin重组蛋白的糖基化鉴定
用去糖基化酶Glycopeptidase F(购自TaKaRa公司)对含有14-29KDa之间四个大小不同条带的人Irisin重组蛋白进行了去糖基化处理，反应20h后，进行SDS-PAGE电泳检测纯化得到的人Irisin重组蛋白在去糖基化前后的变化。结果显示，含有14-29KDa之间四个大小不同条带的重组蛋白经过去糖基化处理之后，只含有14-20KDa之间两个条带。说明，本发明所得到的人Irisin重组蛋白确实发生了N-糖基化。
4.用BCA法测定人Irisin重组蛋白回收率
用PBS将25mg/mL的BSA标准蛋白稀释成0.5mg/mL的标准品，将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μL加到96孔板的标准品孔中，PBS补足到20μL，将纯化的人Irisin重组蛋白加入到96孔板的待测样品孔中，每孔各加入200μLBCA工作液，37℃放置30分钟，用酶标仪测量吸光度(A562nm)，用标准品吸光度绘制标准曲线(y＝0.9296x-0.0908，R2＝0.998，其中y为蛋白浓度mg/mL，x为吸光度)，计算出样品浓度，最后得出本发明的人Irisin重组蛋白每升培养物回收率达到20毫克以上。
5.人Irisin重组蛋白的活性鉴定
将C2C12细胞(购买于中科院上海细胞库)按照3×105cells/孔接种于24孔板中，用DMEM完全培养基在37℃，5％CO2的培养箱中培养贴壁培养24h；吸弃培养基，用37℃预热的无菌PBS温和地清洗一次细胞；吸弃PBS，更换含有500、1000、2000ng/mL不同浓度人Irisin重组蛋白的培养基继续在37℃，5％CO2的培养箱中培养12h；提取细胞总RNA，用荧光定量PCR方法检测重组蛋白对解偶联蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)和长链脂肪酸3(elongation of very long chain fatty acids protein 3，elovl3)mRNA的表达的影响。其中，解偶联蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)和长链脂肪酸3(elongation of verylong chain fatty acids protein 3，elovl3)mRNA由上海生工生物工程有限公司合成，其结果表明，经过人Irisin重组蛋白处理12h后，C2C12细胞UCP1 mRNA的表达量有显著增高，与对照组相比，其表达量增加了约2倍；elovl3 mRNA的表达量也有明显的增高，与对照组相比，其表达量增加了约2.5倍；并且随着重组蛋白含量的提高，两个下游基因mRNA的表达量也有升高的趋势。表明本发明所得到的人Irisin重组蛋白能够促C2C12细胞UCP1和elovl3mRNA表达的上调，即具有生物学活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种人Irisin重组蛋白的DNA序列，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种人Irisin重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.含有权利要求1所述的人Irisin重组蛋白的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，将权利要求1所述的DNA序列插入到毕赤酵母分泌表达载体中得到的表达人Irisin重组蛋白的DNA的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述毕赤酵母分泌表达载体为pPIC9K。
6.一种转基因重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求4或5所述的重组表达载体电转至毕赤酵母中，筛选得到表达人Irisin重组蛋白的转基因重组酵母菌株。
7.根据权利要求6所述的转基因重组菌，其特征在于，所述的毕赤酵母为GS115。
8.权利要求1所述的DNA序列、权利要求3所述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产人Irisin重组蛋白中的应用。
9.一种人Irisin重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）从人肌肉组织中提取总RNA并做反转录PCR得到其cDNA，以cDNA为模板， PCR得到人Irisin的基因片段，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示；
2）经过PCR将His标签插入人Irisin的基因片段，得到人Irisin-his片段；
3）构建pPIC9K-Irisin-his重组表达载体；
4）构建GS115-pPIC9K-Irisin-his重组酵母菌株；
5）人Irisin重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定。
10.一种权利要求2所述的人Irisin重组蛋白在制备代谢性疾病药物的应用。
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