CN103589769B - 一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法，属于发酵工程技术领域。采用自行构建并表达rPoIFNα1的重组大肠埃希菌BL21/pET-32a-rPoIFNα1作为生产菌种，在37℃发酵2~3h后，按每升发酵液一次性添加浓度为50g/L~100g/L的诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)后，再32℃培养4~5h结束此过程。本发酵方法可以实现rPoIFNα1的高效表达，目的蛋白表达量占菌体总蛋白的40%以上，效价高达1×10⁶IU/ml以上，且为可溶性蛋白，避免了包涵体表达需要变复性难题，缩短了生产周期，为rPoIFNα1的工业化生产奠定了坚实基础。

Description

一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法

技术领域

本发明主要涉及一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法，属于发酵过程技术领域。

背景技术

干扰素（interferon，IFN）是病毒感染诱导机体产生的一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫调节作用的蛋白质，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖及发挥抗肿瘤的活性。按照干扰素的产生细胞、生化特征及在机体免疫方面所发挥的作用不同，分为α、β、γ三类。α型干扰素在体内外能发挥广谱、高效抗病毒作用的机制主要是抑制病毒蛋白质的合成，并能选择性地作用于受感染细胞，且在使用后无任何药物残留。目前全球已有60多个国家和地区应用人基因工程重组干扰素制剂治疗大约30多种病毒性疾病。

动物用干扰素的研究目前已得到不少成果，畜牧业生产上的研究及应用已受到高度关注。最早在国内应用于兽医临床的是动物白细胞干扰素，由于这种干扰素需采用生化分离的方法获得，工艺成本高，规模化生产困难等。而基因工程技术的发展为动物用干扰素大量生产提供了新的平台。自1986年Lefevre首次克隆出猪α干扰素（porcineinterferonalpha，PoIFNα）基因以来，迄今已有多种兽用干扰素基因被克隆、表达和进行生物学功能研究。我室采用基因工程技术获得了一种重组猪干扰素ɑ（重组猪α干扰素的制备方法，专利号2008100201804），临床试用结果表明其可有效治疗猪病毒性腹泻等疾病。

目前基因工程重组猪干扰素ɑ规模化发酵生产技术存在如下问题：1）表达的猪干扰素ɑ蛋白多是以无活性的包涵体形式存在，必须在纯化过程中增加变复性步骤，既增加了生产成本，又影响了蛋白质生物学活性；2）基因工程重组猪干扰素ɑ表达量低，效价不高难以达到产业化要求。

本发明以自行构建的重组大肠埃希菌BL21/pET-32a-rPoIFNα1作为生产菌种，采用本发酵方法，在发酵细菌破碎上清中获得目的蛋白，不产生包涵体，省去了包涵体变性、复性等步骤，最大程度上保证了rPoIFNα1生物学活性，并采用超滤浓缩技术粗纯蛋白，缩短了生产周期。

发明内容

本发明目的就是为了弥补已有技术的缺陷，提供一种。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法，包括以下步骤：

（1）种子菌培养：将---18--20℃保存的工作种子菌的菌种接种种子培养基中，使用回转恒温调速摇床进行培养；控制转速215~220r/min，培养温度37℃，初始pH值6.8~7.2，培养时间9.5~10h；

（2）发酵：将培养好的种子液按接种量1~2%接入发酵罐进行发酵，发酵培养基量为18~22L，即向发酵罐中通入无菌空气，通气量为1.4~1.6L/min，保持发酵罐内的含氧量在10~20%，设定培养温度35~38℃，机械搅拌转速为210~230r/min，加入2~4mol/L的氨水，控制发酵pH在7.0~7.1；

（3）补料：发酵2~3h，紫外分光光度仪测定OD₆₀₀为0.4~1.0后，每隔一小时添加蛋白胨20~100g，酵母粉10~40g，葡萄糖5~20g，（NH₄）₂SO₄1~5g，添加2~4次；

（4）诱导：补料2~3h后，紫外分光光度仪测定OD₆₀₀为1.0时，一次性添加浓度为50~100g/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)补料液5-40ml，蛋白胨10-50g，酵母粉10~50g，甘油20~100ml，（NH₄）₂SO₄2~10g，然后将温度调至32℃进行目的蛋白的诱导表达4~6h；

（5）革兰染色及菌体湿重的测定：诱导表达4~6h后，发酵结束，收集菌液，经革兰染色初步检测菌体形态，并在转速为7000r/min，温度为4℃的条件下离心12~16min后，取菌体沉淀物，测定菌体湿重，范围应在0.0200~0.0250g/ml；

（6）第一次离心：在转速为7000r/min，温度为4℃的条件下离心13~16min后留取菌体沉淀；

（7）重悬沉淀的菌体：重悬时每100g湿重菌体加1L的1×PBS（NaCl8g/L，KCl0.2g/L，Na₂HPO₄2.9g/L，KH₂PO₄0.2g/L）；

（8）破碎菌体：用机械破碎的方法，破碎时用800bar的压力连续对菌体冲撞3-4遍，经革兰氏染色，检测破菌率达到95%以上；

（9）第二次离心：在转速为12000r/min，温度为4℃的条件下离心14~16min后取上清液；

（10）超滤浓缩：将第二次离心得到的上清液使用0.22μm孔径的膜包进行超滤收集通过膜包的下游液体，再用30kD孔径的膜包进行10倍浓缩，收集未通过膜包的上游液体，即为rPoIFNα1的粗制品。

所述种子培养基的组成为：工业级蛋白胨1~10g/L，工业级酵母粉1~5g/L，NaCl1~10g/L，pH5.1~7.1。

所述发酵培养基的组成为：工业级蛋白胨1~10g/L，工业级酵母粉1~5g/L，葡萄糖0.1~1g/L，NaCl1~10g/L，甘油0.1~3.33ml/L,消泡剂0.01~0.33ml/L。

本发明的优点是：

本发酵方法可以实现rPoIFNα1的高效表达，目的蛋白表达量占菌体总蛋白的40%以上，效价高达1×10⁶IU/ml以上，且为可溶性蛋白，避免了包涵体表达需要变复性难题，缩短了生产周期，为rPoIFNα1的工业化生产奠定了坚实基础。

附图说明

图1：发酵结束的工程菌菌液革兰染色结果（×1000）

图2:工程菌菌液破碎后革兰染色结果（×1000）

图3：rPoIFNα1SDS-PAGE检测结果

M：蛋白分子标准;

泳道1：本工艺发酵生产rPoIFNα1工程菌总蛋白；

泳道2：本工艺发酵生产rPoIFNα1工程菌包涵体蛋白；

泳道3：本工艺发酵生产rPoIFNα1工程菌细菌破碎上清蛋白；

泳道4：BL21空菌总蛋白对照。

具体实施方式

实施例1

（1）种子菌培养：将---20℃保存的工作种子菌的菌种接种种子培养基中，使用回转恒温调速摇床进行培养；控制转速220r/min，培养温度37℃，初始pH值7.1，培养时间10h；

（2）发酵：将培养好的种子液按接种量1%接入30L发酵罐进行发酵（发酵培养基量20L），即向发酵罐中通入无菌空气，通气量1.5L/min，保持发酵罐内的含氧量在10～20%，设定培养温度37℃，机械搅拌转速为220r/min，流加3mol/L氨水控制发酵pH在7.0～7.1；

（3）补料：发酵2～3h，紫外分光光度仪测定OD₆₀₀为0.4～1.0后，每隔一小时添加蛋白胨20～100g，酵母粉10～40g，葡萄糖5～20g，（NH₄）₂SO₄1～5g，添加3次；

（4）诱导：补料2～3h后，紫外分光光度仪测定OD₆₀₀为1.0时，一次性添加浓度为50～100g/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)补料液5～40ml，蛋白胨10～50g，酵母粉10～50g，甘油20～100ml，（NH₄）₂SO₄2～10g，然后将温度调至32℃进行目的蛋白的诱导表达4～6h；

（5）革兰染色及菌体湿重的测定：诱导表达4～6h后，发酵结束，收集菌液，经革兰染色初步检测菌体形态（如图1所示），并在转速为7000r/min，温度为4℃的条件下离心15min后，取菌体沉淀物，测定菌体湿重，范围应在0.0200～0.0250g/ml；

（6）第一次离心：在转速为7000r/min，温度为4℃的条件下离心15min后留取菌体沉淀；

（7）重悬沉淀的菌体：重悬时每100g湿重菌体加1L的1×PBS（NaCl8g/L，KCl0.2g/L，Na₂HPO₄2.9g/L，KH₂PO₄0.2g/L）；

（8）破碎菌体：用机械破碎的方法，破碎时用800bar的压力连续对菌体冲撞3遍，经革兰氏染色，检测破菌率达到95%以上（如图2所示）；

（9）第二次离心：在转速为12000r/min，温度为4℃的条件下离心15min后取上清液；

（10）膜包超滤浓缩：将第二次离心得到的上清液使用0.22μm孔径的膜包进行超滤收集通过膜包的下游液体，再用30kD孔径的膜包进行10倍浓缩，收集未通过膜包的上游液体，即为rPoIFNα1的粗制品。

（11）rPoIFNα1粗制品的总蛋白含量的测定：采用Lowry法测定总蛋白含量为4～5mg/ml；

（12）rPoIFNα1粗制品的目的蛋白含量测定：采用非还原性SDS-PAGE电泳法测定目的蛋白表达量占菌体总蛋白的40%以上（如图3所示）；

（13）rPoIFNα1粗制品的效价测定：

材料：rhIFNα1国家标准品：购自中国食品药品检定研究院，干扰素α1国家标准品；细胞：人传代羊膜细胞（WISH）和人喉癌传代细胞（Hep-2）均由中国科学院上海细胞所提供；病毒：攻击病毒为水疱性口炎病毒（VSV）。

测定方法：微量细胞病变抑制法，用rhIFNα1国家标准品为对照，检测出生产的rPoIFNα1粗制品效价可达到1×10⁶IU/ml以上。

Claims (1)

1.一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）种子菌培养：将---18~-20℃保存的工作种子菌的菌种接种种子培养基中，使用回转恒温调速摇床进行培养；控制转速215~220r/min，培养温度36~38℃，初始pH值6.8~7.2，培养时间9.5~10h；所述种子培养基的组成为：工业级蛋白胨1~10g/L，工业级酵母粉1~5g/L，NaCl1~10g/L，pH5.1~7.1；

（2）发酵：将培养好的种子液按接种量1-2%接入发酵罐进行发酵，发酵培养基量为18~22L，即向发酵罐中通入无菌空气，通气量为1.4~1.6L/min，保持发酵罐内的含氧量在10~20%，设定培养温度37℃，机械搅拌转速为210~230r/min，加入2~4mol/L的氨水，控制发酵pH在7.0~7.1；所述发酵培养基的组成为：工业级蛋白胨1~10g/L，工业级酵母粉1~5g/L，葡萄糖0.1~1g/L，NaCl1~10g/L，甘油0.1~3.33ml/L,消泡剂0.01~0.33ml/L；

（3）补料：发酵2~3h，紫外分光光度仪测定OD₆₀₀为0.4~1.0后，每隔一小时添加蛋白胨20~100g，酵母粉10~40g，葡萄糖5~20g，（NH₄）₂SO₄1~5g，添加2~4次；

（4）诱导：补料2~3h后，紫外分光光度仪测定OD₆₀₀为1.0时，一次性添加浓度为50~100g/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)补料液5~40ml，蛋白胨10~50g，酵母粉10~50g，甘油20~100ml，（NH₄）₂SO₄2~10g，然后将温度调至32℃进行目的蛋白的诱导表达4~6h；

（5）革兰染色及菌体湿重的测定：诱导表达4~6h后，发酵结束，收集菌液，经革兰染色初步检测菌体形态，并在转速为7000r/min，温度为4℃的条件下离心12~16min后，取菌体沉淀物，测定菌体湿重，范围应在0.0200~0.0250g/ml；

（6）第一次离心：在转速为7000r/min，温度为4℃的条件下离心13~16min后留取菌体沉淀；

（7）重悬沉淀的菌体：重悬时每100g湿重菌体加1L的1×PBS，即NaCl8g/L，KCl0.2g/L，Na₂HPO₄2.9g/L，KH₂PO₄0.2g/L；

（8）破碎菌体：用机械破碎的方法，破碎时用800bar的压力连续对菌体冲撞3~4遍，经革兰氏染色，检测破菌率达到95%以上；

（9）第二次离心：在转速为12000r/min，温度为4℃的条件下离心14~16min后取上清液；

（10）超滤浓缩：将第二次离心得到的上清液使用0.22μm孔径的膜包进行超滤收集通过膜包的下游液体，再用30kD孔径的膜包进行10倍浓缩，收集未通过膜包的上游液体，即为rPoIFNα1的粗制品。