CN102180959B - 改良的鸡白介素2蛋白及其制备方法 - Google Patents
改良的鸡白介素2蛋白及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102180959B CN102180959B CN 201110065038 CN201110065038A CN102180959B CN 102180959 B CN102180959 B CN 102180959B CN 201110065038 CN201110065038 CN 201110065038 CN 201110065038 A CN201110065038 A CN 201110065038A CN 102180959 B CN102180959 B CN 102180959B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- chil
- interleukin
- chook
- albumen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供的改良的鸡白介素2(命名为ChIL-2/A)蛋白，为天然的鸡白介素2(命名为ChIL-2/N)蛋白的改良蛋白，该ChIL-2/A蛋白具有ChIL-2/N蛋白的生物活性，其氨基酸序列为序列表中<400>3所示的序列，由121个氨基酸残基组成；所述改良的ChIL-2/A蛋白与ChIL-2/N蛋白相比，其稳定性大大增加，且活性有明显增强；该改良蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式高效表达，表达后重组蛋白占菌体总蛋白的50％以上，复性回收率达70％以上，且生产周期短，成本低，为该鸡白介素2的大规模生产应用提供了良好的研究基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是改良的鸡白介素2蛋白及其制备方法。
背景技术
1976年Morgan等发现小鼠脾细胞培养上清中含有一种刺激胸腺细胞生长的因子，由于这种因子能促进和维持T细胞长期培养，称为T细胞生长因子(T cell growthfactor，TCGF)，1979年统一命名为白介素2(interleukin 2，IL-2)。
白细胞介素2主要是由T淋巴细胞或T淋巴细胞系产生的一类最有力的T细胞生长因子，属于Th1型细胞因子，在抗肿瘤、抗毒素、免疫调节及感染性疾病的治疗中具有重要作用，它能够有效地提高免疫功能，促进T、B淋巴细胞的增殖、分化并可增强NK细胞、单核细胞等的杀伤活性，也可促进其他细胞因子的分泌以及刺激T细胞在体外的生长。在免疫应答系统中起着极其重要的调节作用，是一种天然的免疫增强佐剂和治疗剂。自1983年人类IL-2基因被首次克隆和测序以来，目前已有几十个物种的IL-2基因被发现。鸡白介素的研究相对于其它哺乳动物来说比较滞后，是由Sundick等1997年首次克隆了鸡IL-2的基因，目前已实现了鸡IL-2基因在大肠杆菌、COS、CHO-K和人肾成纤维细胞中成功表达，且表达产物具有生物活性，为基因工程重组白介素的规模化生产和应用提供了依据。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供改良的鸡白介素2(ChIL-2/A)蛋白。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述改良的鸡白介素2(ChIL-2/A)蛋白的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
改良的鸡白介素2(命名为ChIL-2/A)蛋白，为天然的鸡白介素2(命名为ChIL-2/N)蛋白的改良蛋白，该蛋白具有ChIL-2/N蛋白的生物活性，其氨基酸序列为序列表中<400>3所示的序列，由121个氨基酸残基组成。
优选的，上述改良的鸡白介素2(ChIL-2/A)蛋白经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有ChIL-2/N蛋白活性的ChIL-2/A蛋白的衍生蛋白质。
优选的，上述改良的鸡白介素2(ChIL-2/A)蛋白，为了使鸡白介素2(ChIL-2/A)蛋白或其衍生蛋白质分泌到细胞周质或培养基中，可在所述蛋白质的N端连接上信号肽序列。
优选的，上述改良的鸡白介素2(ChIL-2/A)蛋白，为了使鸡白介素2(ChIL-2/A)蛋白或其衍生蛋白质便于纯化，可在氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。
表1 标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 11 | EQKLISEEDL |
编码上述改良的鸡白介素2(ChIL-2/A)蛋白的优化基因，所述优化基因的核苷酸序列为序列表中<400>1所示的序列。
优选的，上述改良的鸡白介素2(ChIL-2/A)蛋白的优化基因，是在严格条件下杂交且编码ChIL-2/A蛋白的核酸序列，所述严格条件为在0.1×SSPE或0.1×SSC以及0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。
含有上述改良的鸡白介素2(ChIL-2/A)蛋白的优化基因的重组表达载体和重组表达细胞。
表达上述改良的鸡白介素2(ChIL-2/A)蛋白的制备方法，将所述蛋白的优化基因插入到表达载体中，得到含有该蛋白优化基因的重组表达载体，然后将该重组表达载体导入宿主细胞，筛选得到含有重组表达载体的阳性重组细胞，发酵培养该重组细胞，表达得到所述蛋白。
优选的，表达上述改良的鸡白介素2(ChIL-2/A)蛋白的制备方法，所述表达载体为pBV220、pET载体、pQE载体或pPIC9K。
优选的，表达上述改良的鸡白介素2(ChIL-2/A)蛋白的制备方法，所述表达载体为pET21a(+)。
优选的，表达上述改良的鸡白介素2(ChIL-2/A)蛋白的制备方法，所述宿主细胞为大肠杆菌DH5α、TB1或BL21(DE3)。
优选的，表达上述改良的鸡白介素2(ChIL-2/A)蛋白的制备方法，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
优选的，表达上述改良的鸡白介素2(ChIL-2/A)蛋白的制备方法，所述表达为诱导表达，诱导物为异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，诱导浓度为1mmol/L，诱导表达时间为3-5小时。
优选的，表达上述改良的鸡白介素2(ChIL-2/A)蛋白的制备方法，所述诱导表达时间为4小时。
本发明的有益效果是：
上述改良的鸡白介素2(ChIL-2/A)蛋白，与天然的鸡白介素2蛋白相比，其稳定性大大增加，且活性有明显增强；该改良蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式高效表达，表达后重组蛋白占菌体总蛋白的50％以上，复性回收率达70％以上，且生产周期短，成本低，为该鸡白介素2的大规模生产应用提供了良好的研究基础。
附图说明
图1：改良ChIL-2/A蛋白的编码基因与天然ChIL-2/N蛋白的编码基因的序列比对结果；
图2：改良ChIL-2/A蛋白与天然ChIL-2/N蛋白的序列比对结果；
图3：琼脂糖凝胶电泳检测改良ChIL-2/A编码基因与天然ChIL-2/N编码基因的PCR扩增结果，其中，M为Marker，L1为阴性对照，L2为PCR产物电泳结果；
图4：SDS-PAGE检测诱导前后改良ChIL-2/A蛋白与天然ChIL-2/N蛋白在大肠杆菌中的表达结果，其中泳道L1为诱导前，泳道L2为诱导后，M为低分子量蛋白Marker。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的；所有引物合成及测序工作均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
2*YT培养液由溶质和水组成，溶质及其浓度如下：蛋白胨16g/L、酵母粉10g/L、氯化钠5g/L。
发酵培养基由溶质和水组成，溶质及其浓度如下：蛋白胨5克/升、酵母粉5克/升、KH2PO4 2克/升、K2HPO4 4克/升、Na2HPO4·12H2O 7克/升、(NH4)2SO41.2克/升、NH4Cl 0.2克/升、MnSO4·5H2O 0.001克/升、CoCl2·6H2O 0.004克/升、Na2MoO4·2H2O 0.002克/升、ZnCl2 0.002克/升、CuSO4·5H2O 0.001克/升、H3BO4 0.005克/升、FeSO4·7H2O 0.02克/升、CaCl·2H2O 0.02克/升、MgSO4·7H2O 0.3克/升、消泡剂0.2克/升。
补料培养基由溶质和水组成，溶质及其浓度如下：甘油150mL/L、蛋白胨30g/L、酵母粉30g/L、MgSO4·7H2O 5.5mg/L。
PBS缓冲液pH为8.0，由溶质和水组成，溶质及其浓度如下：NaCl137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。
2×Loading Buffer：100mM Tris-HCl(pH6.8)、4％SDS、0.2％溴酚蓝、20％甘油，
变性缓冲液pH为8.5，由溶质和水组成，溶质及其浓度如下：6mol/L盐酸胍，2mmol/L EDTA，50mmol/L Tris·Cl，10mmol/L DTT。
复性缓冲液pH为8.0，由溶质和水组成，溶质及其浓度如下：0.5mol/L左旋精氨酸(L-arg)，2mmol/L EDTA，20％(体积百分含量)甘油，0.9mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSG)，0.1mol/L Tris·Cl。
DNA胶回收试剂盒购自北京博迈德生物科技有限公司，货号DR0103。
原核表达载体pET21a(+)购自NOVAGEN公司，货号69740-3。
大肠杆菌BL21(DE3)购自北京原平皓纪生物科技有限公司，产品目录号为CL103-01。
实施例1
ChIL-2/A基因的合成及其发酵表达
根据天然的鸡白介素2的氨基酸序列(AY029588)和大肠杆菌对氨基酸密码子的偏爱性，设计了含大肠杆菌喜好密码子的改良鸡白介素2(ChIL-2/A)的编码基因，将该ChIL-2/A基因插入到原核表达载体pET21a(+)中，得到重组表达载体ChIL-2/A/pET21a(+)，将重组载体导入原核宿主细胞E Coli BL21(DE3)，筛选阳性克隆得到重组工程菌ChIL-2/A/pET21a(+)/E Coli.BL21(DE3)，发酵该重组工程菌，经分离纯化等步骤得到改良ChIL-2/A蛋白。
具体的试验方法和结果如下：
一、ChIL-2/A基因的合成与扩增
1、参考天然鸡白介素2(AY029588)基因序列，根据大肠杆菌对密码子的偏爱性，替换稀有密码子，调节AT含量，设计ChIL-2/A蛋白编码基因(序列表中<400>1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中<400>3所示)，使其可在大肠杆菌中高效表达，将ChIL-2/A基因交给上海生工生物工程技术服务有限公司人工合成；
2、根据上述ChIL-2/A基因序列，利用Primer Premire软件设计引物，同时分别在引物的5’端引入Nde I酶切位点和EcoR I酶切位点：
上游引物：P ChIL-2/A F1：5’GCGCATATGGCGTCTCTGAGC 3’(划线部分为Nde I酶切位点)
下游引物：P ChIL-2/A R1：5’GCGGAATTCTTATTTCTGCAG 3’(划线部分为EcoR I酶切位点)
以合成的ChIL-2/A基因序列为模板，以P ChIL-2/A F1和P ChIL-2/AR1为引物进行PCR扩增，反应体系含模板1μg，上下游引物各50pmol/L，总反应体系是50μL；反应条件为：94℃、8min；94℃、30sec，54℃、30sec，72℃、30sec，30个循环；最后于72℃，10min；PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示，其中，M为Marker，L1为阴性对照，L2为PCR产物电泳结果，结果表明在380bp左右有条带，用DNA回收试剂盒对PCR产物进行回收，备用。
二、含ChIL-2/A基因的重组质粒及工程菌的构建
1、用限制性内切酶Nde I和EcoRI双酶切上步PCR扩增产物，得到酶切产物；
2、用限制性内切酶Nde I和EcoRI双酶切载体pET21a(+)，回收载体骨架；
3、将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架用连接酶(Biomed公司)4℃连接过夜，得到连接产物；
4、将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落进行菌落PCR和酶切鉴定；菌落PCR所用的引物为F1和R1组成的引物对，得到380bp左右DNA的菌落为阳性菌落；酶切鉴定所用的酶为限制性内切酶Nde I和EcoRI，得到380bp左右DNA的菌落为阳性菌落；将菌落PCR和酶切鉴定均为阳性的菌落交给上海生工测序，测序正确的菌落为重组工程菌，命名为BL21(DE3)-ChIL-2/A/pET21a(+)；重组工程菌的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)，含有重组质粒ChIL-2/A/pET21a(+)；重组质粒ChIL-2/A/pET21a(+)为在pET21a(+)载体的Nde I和EcoRI酶切位点之间插入序列表中<400>1所示的ChIL-2/A基因得到的重组质粒；
5、将重组工程菌BL21(DE3)-ChIL-2/A/pET21a(+)接种于100ml含Amp的液体LB培养基中，在37℃，200rpm(旋转半径为13mm)摇床上震荡培养至OD600值为0.8，取5毫升发酵液置于4℃备用；剩下的发酵液添加诱导物IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，1.0mmol/L，)后继续诱导培养，诱导时间为4h；
6、分别取诱导前后的发酵培养液1mL于EP管中，10000rpm离心10min，弃上清，加入50uL PBS缓冲液和50uL 2×Loading Buffer，煮沸10分钟裂解菌体，然后上样10uL进行SDS-PAGE电泳检测；电泳检测结果如图4所示(泳道L1为诱导前，泳道L2为诱导后，M为低分子量蛋白Marker)，诱导后收集的菌体在14kD左右处出现一条蛋白条带，与预期大小相符；回收该条带的蛋白质进行N端测序，N端5个氨基酸分别为M-A-S-L-S(其中M为起始密码子表达)，表明该蛋白确实为ChIL-2/A蛋白，ChIL-2/A基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了正确表达。
经薄层凝胶扫描仪确定，蛋白占诱导表达后重组工程菌菌体总蛋白的50％以上。
三、ChIL-2/A的发酵生产
1、种子库的制备
将重组工程菌BL21(DE3)-ChIL-2/A/pET21a(+)按1％的比例接种菌液于20ml含100μg/ml的氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基中，37℃，200rmp振荡培养8-10h；然后取少许菌液划线接种于Amp+平板，37℃培养10h左右，挑取5-10个单菌落于20ml含50μg/ml的Amp的LB液体培养基中，37℃、200rmp振荡培养至OD600为0.5，按750ul加50％甘油250ul比例，保种数十支，-20℃保存备用。
2、发酵种子液制备
将上述步骤1制备的种子接种于200ml 2*YT培养液中，接种量为0.05％(体积百分含量)，37℃、220rpm震荡培养11h，得到的菌液即为发酵种子液。
3、发酵生产ChIL-2/A蛋白
发酵培养基121℃、20min高压灭菌后，冷却后加入Amp至终浓度为100μg/ml；然后接种上述步骤2的发酵种子液，接种量为7％(体积百分含量)，37℃通气搅拌培养4.5h(200rpm)，当发酵液OD600值为0.8时加入终浓度为Immol/L的IPTG开始诱导，诱导时间为4h，4h后停罐。
培养过程中随着菌株的生长，培养基中的糖(甘油)逐渐消耗，当碳源消耗完后菌体不再生长，溶氧回升(上升30％左右)，开始流加补料培养基，流加速度由溶氧控制(设定DO＝30％，当DO大于30％流加泵打开流加培养基，DO逐步下降，当DO下降到30％以下流加泵关闭)，大约每小时流加26-35ml培养基；培养过程中用3M NaOH水溶液和10％磷酸水溶液维持pH值7.2。
四、ChIL-2/A蛋白的纯化
1、取5L步骤三得到的发酵液(诱导后)，8000rpm、离心10min收集菌体；
2、按每克菌体加10mL pH8.0的PBS缓冲液，吹打均匀，洗菌体1次，8000rpm离心10min收集菌体；
3、重复步骤2操作1次；
4、按每克菌体加6mL的pH8.0的PBS缓冲液，置冰浴中超声破菌，超声条件为：功率200W，Φ10探头，超声7秒间隔5秒，全程工作时间为30min；超声裂解液在4℃、12000rpm离心30min，收集包涵体；
5、按每克包涵体加入约10mL的变性缓冲液，4℃变性24h，溶解沉淀，而后4℃、12000rpm离心10min，收集上清，即为变性的ChIL-2/A蛋白溶液；
6、将变性蛋白溶液和复性缓冲液按体积比1∶20的比例混合，4℃静置48小时，4℃、12000rpm离心20min，收集上清，即为含有复性后ChIL-2/A的蛋白溶液；
7、采用Bradford法测定复性后ChIL-2/A蛋白溶液的蛋白浓度，计算复性回收率，计算公式为：复性蛋白溶液浓度*体积/变性蛋白质量，结果显示重组蛋白的回收率可达70％；
8、将步骤6所得复性后的蛋白溶液装入透析袋中，用PBS作为透析液，4℃透析4次，每次隔6小时更换一次透析液；
9、将步骤8所得透析后的样品按步骤7所述方法测定蛋白浓度，调整蛋白终浓度为0.1mg/mL，标记好发酵生产批次，最后于-20℃保存备用。
五、ChIL-2/A蛋白发酵生产批次
按照上述方法共发酵生产ChIL-2/A蛋白3批，分别为2008080320080811、20080822。
实施例2
ChIL-2/N基因的合成及其发酵表达
根据GeneBank中AY029588编码鸡白介素2的核苷酸序列去除信号肽后由上海生工生物工程有限公司人工合成ChIL-2/N蛋白的编码基因，将该ChIL-2/N基因插入到原核表达载体pET21a(+)中，得到重组表达载体ChIL-2/N/pET21a(+)，将重组载体导入原核宿主细胞E Coli BL21(DE3)，筛选阳性克隆得到重组工程菌ChIL-2/N/pET21a(+)/E Coli.BL21(DE3)，发酵该重组工程菌，经分离纯化等步骤得到改良ChIL-2/N蛋白。
具体的试验方法和结果如下：
一、ChIL-2/N基因的合成与扩增
1、根据GeneBank中AY029588编码鸡白介素2的核苷酸序列去除信号肽后(序列表中<400>2所示，其编码的氨基酸序列如序列表中<400>4所示)，交给上海生工生物工程有限公司人工合成ChIL-2/N蛋白的编码基因；
2、根据上述ChIL-2/N基因序列，利用Primer Premire软件设计引物，同时分别在引物的5’端引入Nde I酶切位点和EcoR I酶切位点：
上游引物：P ChIL-2/N F2：GCGCATATGGCATCTCTATCA(划线部分为NdeI酶切位点)
下游引物：P ChIL-2/N R2：GCGGAATTC TTATTTTTGCAG(划线部分为EcoRI酶切位点)；
3、以合成的ChIL-2/N基因序列为模板，以P ChIL-2/N F2和P ChIL-2/NR2为引物进行PCR扩增；反应体系含模板1μg，上下游引物各50pmol/L，总反应体系是50μL，反应条件为：94℃、8min；94℃、30sec，54℃、30sec，72℃、30sec，30个循环；最后于72℃，10min；PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示，其中，M为Marker，L1为阴性对照，L3为ChIL-2/N PCR产物电泳结果，结果表明在380bp左右有条带，用DNA回收试剂盒对PCR产物进行回收，备用。
二、含ChIL-2/N基因的重组质粒及工程菌的构建
1、用限制性内切酶Nde I和EcoRI双酶切上步PCR扩增产物，得到酶切产物；
2、用限制性内切酶Nde I和EcoRI双酶切载体pET21a(+)，回收载体骨架；
3、将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架用连接酶(Biomed公司)4℃连接过夜，得到连接产物；
4、将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落进行菌落PCR和酶切鉴定，菌落PCR所用的引物为F1和R1组成的引物对，得到380bp左右DNA的菌落为阳性菌落；酶切鉴定所用的酶为限制性内切酶Nde I和EcoRI，得到380bp左右DNA的菌落为阳性菌落；将菌落PCR和酶切鉴定均为阳性的菌落交给上海生工测序，测序正确的菌落为重组工程菌，命名为BL21(DE3)-ChIL-2/N/pET21a(+)；重组工程菌的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)，含有重组质粒ChIL-2/N/pET21a(+)；重组质粒ChIL-2/N/pET21a(+)为在pET21a(+)载体的Nde I和EcoRI酶切位点之间插入序列表中<400>2所示的ChIL-2/N基因得到的重组质粒；
5、将重组工程菌BL21(DE3)-ChIL-2/N/pET21a(+)接种于100ml含Amp的液体LB培养基中，在37℃、200rpm(旋转半径为13mm)摇床上震荡培养至OD600值为0.8，取5毫升发酵液置于4℃备用；剩下的发酵液添加诱导物IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，1.0mmol/L，)后继续诱导培养，诱导时间为4h；
6、分别取诱导前后的发酵培养液1mL于EP管中，10000rpm离心10min，弃上清，加入50uL PBS缓冲液和50uL 2×Loading Buffer，煮沸10分钟裂解菌体，然后上样10uL进行SDS-PAGE电泳检测；电泳检测结果如图4所示(泳道L3为诱导前，泳道L4为诱导后)，诱导后收集的菌体在14kD左右处出现一条蛋白条带，与预期大小相符；回收该条带的蛋白质进行N端测序，N端5个氨基酸分别为M-A-S-L-S(其中M为起始密码子表达)，表明该蛋白确实为ChIL-2/N蛋白，ChIL-2/N基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了正确表达。
经薄层凝胶扫描仪确定，ChIL-2/N蛋白占诱导表达后重组工程菌菌体总蛋白的30％左右。
三、ChIL-2/N的发酵生产
1、种子库的制备
将重组工程菌BL21(DE3)-ChIL-2/N/pET21a(+)按1％的比例接种菌液于20ml含50μg/ml的Amp的LB液体培养基中，37℃、200rmp振荡培养9h；然后取少许菌液划线接种于Amp+平板，37℃培养10h左右，挑取5-10个单菌落于20ml含50μg/ml的Amp的LB液体培养基中，37℃、200rmp振荡培养至OD600为0.5左右，按750ul加50％甘油250ul比例，保种数十支，-20℃保存备用。
2、发酵种子液制备
将步骤1制备的种子接种于200ml 2*YT培养液中，接种量为0.05％(体积百分含量)，37℃、220rpm震荡培养11h，得到的菌液即为发酵种子液。
3、发酵生产ChIL-2/N蛋白
发酵培养基121℃、20min高压灭菌后，冷却后加入Amp至终浓度为50μg/ml；然后接种步骤2的发酵种子液，接种量为7％(体积百分含量)，37℃通气搅拌培养4.5h(200rpm)，当发酵液OD600值为0.8时加入终浓度为Immol/L的IPTG开始诱导，诱导时间为4h，4h后停罐。
培养过程中随着菌株的生长，培养基中的糖逐渐消耗，当碳源消耗完后菌体不再生长，溶氧回升(上升30％左右)，开始流加补料培养基，流加速度由溶氧控制(设定DO＝30％，当DO大于30％流加泵打开流加培养基，DO逐步下降，当DO下降到30％以下流加泵关闭)，大约每小时流加26-35ml培养基；培养过程中用3M NaOH水溶液和10％磷酸水溶液维持pH值7.2。
四、ChIL-2/N蛋白的纯化
1、取5L步骤三得到的发酵液(诱导后)，8000rpm、离心10min收集菌体；
2、按每克菌体加10mL pH8.0的PBS缓冲液，吹打均匀，洗菌体1次，8000rpm离心10min收集菌体；
3、重复步骤2操作1次；
4、按每克菌体加6mL的pH8.0的PBS缓冲液，置冰浴中超声破菌；超声条件为：功率200W，Φ10探头，超声7秒间隔5秒，全程工作时间为30min；超声裂解液在4℃、12000rpm离心30min，收集包涵体；
5、按每克包涵体加入约10mL的变性缓冲液，4℃变性24小时溶解沉淀，而后4℃、12000rpm离心10min，收集上清，即为变性的ChIL-2/N蛋白溶液；
6、将变性蛋白溶液和复性缓冲液按体积比1∶20的比例混合，4℃静置48小时，4℃、12000rpm离心20min，收集上清，即为含有复性后ChIL-2/N的蛋白溶液；
7、采用Bradford法测定复性后ChIL-2/N蛋白溶液的蛋白浓度，计算复性回收率，计算公式为：复性蛋白溶液浓度*体积/变性蛋白质量，结果显示重组蛋白的回收率可达66％。
8、将步骤6所得复性后的蛋白溶液装入透析袋中，用PBS作为透析液，4℃透析4次，每次隔6小时更换一次透析液；
9、将步骤8所得透析后的样品按步骤7所述方法测定蛋白浓度，调整蛋白终浓度为0.1mg/mL，标记好发酵生产批次，最后于-20℃保存备用。
五、ChIL-2/N蛋白发酵生产批次
按照上述方法共发酵生产ChIL-2/N蛋白3批，分别为2008090120080909 20080919。
实施例3
ChIL-2/A促鸡外周T淋巴细胞增殖的生物活性的测定
1)取新鲜鸡抗凝血5mL，与Hank’s液按体积比1∶1混匀后，轻轻加于10ml的细胞分离液之面上，以1500rpm离心(半径15cm水平转子)15分钟，取T淋巴细胞层放入含15mL Hank‘s液的离心管中，充分混匀后，以1800rpm离心10分钟；吸去上清液，将沉淀细胞反复洗3次；用Hank’s液重新悬起沉淀的细胞；
2)取上述细胞调整细胞浓度至5×106个/mL，加入RPIM1640营养液和终浓度为20μg/mL的ConA，共培养42h；
3)离心收集所扩大培养的鸡外周血T淋巴细胞，用RPIM1640营养液重悬，计数调整其浓度为5×106个/mL，作为应答细胞；取无菌96孔板，每孔加入应答细胞50μL，调零孔不加细胞；
4)将ChIL-2/A蛋白样品适当稀释，使调整后蛋白浓度达到80pg/μL，然后以21、22、23...28梯度依次稀释，每孔加入50μL，每个稀释梯度做6个重复孔，5％CO2、37℃条件下培养36h；同时设置调零孔(RPIM1640培养基，MTT、二甲基亚砜)和阴性对照孔(RPIM1640培养基，细胞、MTT、二甲基亚砜)；
5)每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，继续培养4h后，每孔加入二甲基亚砜100μL，混匀后置于低速震荡的摇床上10min，酶标仪检测仪测定A570值，结果如表2所示。
IL-2主要由活化T细胞产生，又为T细胞增殖所必需，因此IL-2可促鸡外周血淋巴细胞大量增殖，以此进行测定待检样品中IL-2的生物学活性水平。从表2可以看出，纯化的ChIL-2/A稀释到31.25pg/100ul，其诱导鸡外周血T淋巴细胞的增殖能力比空白对照细胞的OD值显著提高(P＜0.01)，判定标准为(实验孔OD570值-调零孔OD570值)/(阴性对照空OD570值-调零孔OD570值)≥1.4为具有明显刺激外周T淋巴细胞增殖的生物活性。
表2 ChIL-2/A促鸡外周T淋巴细胞增殖的生物活性
实施例4
ChIL-2/N促鸡外周T淋巴细胞增殖的生物活性的测定
1)取新鲜鸡抗凝血5mL，与Hank’s液按体积比1∶1混匀后，轻轻加于10ml的细胞分离液之面上，以1500rpm离心(半径15cm水平转子)15分钟，取T淋巴细胞层放入含15mL Hank‘s液的离心管中，充分混匀后，以1800rpm离心10分钟。吸去上清液，将沉淀细胞反复洗3次，反复洗2-3次；用Hank’s液重新悬起沉淀的细胞；
2)取上述细胞调整细胞浓度至5×106个/mL，加入RPIM1640营养液和终浓度为20μg/mL的ConA，共培养42h；
3)离心收集所扩大培养的鸡外周血T淋巴细胞，用RPIM1640营养液重悬，计数调整其浓度为5×106个/mL，作为应答细胞；取无菌96孔板，每孔加入应答细胞50μL，调零孔不加细胞；
4)将ChIL-2/N蛋白样品适当稀释，使调整后蛋白浓度达到80pg/μL，然后以21、22、23...28梯度依次稀释，每孔加入50μL，每个稀释梯度做6个重复孔，5％CO2、37℃条件下培养36h；同时设置调零孔(RPIM1640培养基，MTT、二甲基亚砜)和阴性对照孔(RPIM1640培养基，细胞、MTT、二甲基亚砜)；
5)每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，继续培养4h后，每孔加入二甲基亚砜100μL，混匀后置于低速震荡的摇床上10min，酶标仪检测仪测定A570值，结果如表2所示。
IL-2主要由活化T细胞产生，又为T细胞增殖所必需，因此IL-2可促鸡外周血淋巴细胞大量增殖，以此进行测定待检样品中IL-2的生物学活性水平。从表3可以看出，纯化的ChIL-2/N稀释到62.5pg/100ul，其诱导鸡外周血T淋巴细胞的增殖能力比空白对照细胞的OD值显著提高(P＜0.01)，判定标准为(实验孔OD570值-调零孔OD570值)/(阴性对照空OD570值-调零孔OD570值)≥1.4为具有明显刺激外周T淋巴细胞增殖的生物活性。
表3 ChIL-2/N促鸡外周T淋巴细胞增殖的生物活性
从表2和表3可以看出，ChIL-2/A的刺激外周T淋巴细胞增殖的生物活性是ChIL-2/N的2倍左右。
上述参照具体实施方式对该鸡白介素2蛋白ChIL-2/A及其制备方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.改良的鸡白介素2蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如序列3所示。
2.根据权利要求1所述的改良的鸡白介素2蛋白的衍生蛋白质，其特征在于：为了使权利要求1所述蛋白分泌到细胞周质或培养基中，在权利要求1所述蛋白质的N端连接上信号肽序列。
3.根据权利要求1所述的改良的鸡白介素2蛋白的衍生蛋白质，其特征在于：为了使权利要求1所述蛋白便于纯化，在权利要求1所述蛋白的N端或C端连接上标签，所述标签为Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tag II或c-myc。
4.一种编码权利要求1所述改良的鸡白介素2蛋白的优化基因，其特征在于：所述优化基因的核苷酸序列如序列1所示。
5.含有权利要求4所述改良的鸡白介素2蛋白的优化基因的大肠杆菌表达系统适用的重组表达载体。
6.含有权利要求4所述改良的鸡白介素2蛋白的优化基因的大肠杆菌重组表达细胞。
7.一种权利要求1所述改良的鸡白介素2蛋白的制备方法，其特征在于：将序列1所示蛋白的优化基因插入到大肠杆菌表达系统适用的表达载体中，得到含有该蛋白优化基因的大肠杆菌表达系统适用的重组表达载体，然后将该重组表达载体导入大肠杆菌宿主细胞，筛选得到含有大肠杆菌表达系统适用的重组表达载体的大肠杆菌阳性重组细胞，发酵培养该重组细胞，表达得到所述蛋白。
8.根据权利要求7所述改良的鸡白介素2蛋白的制备方法，其特征在于：所述表达载体为pBV220、pET载体或pQE载体，所述宿主细胞为大肠杆菌DH5α、TB1或BL21(DE3)。
9.根据权利要求7所述改良的鸡白介素2蛋白的制备方法，其特征在于：所述表达为诱导表达，诱导物为异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，诱导浓度为1mmol/L，诱导表达时间为3-5小时。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110065038 CN102180959B (zh) | 2011-03-17 | 2011-03-17 | 改良的鸡白介素2蛋白及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110065038 CN102180959B (zh) | 2011-03-17 | 2011-03-17 | 改良的鸡白介素2蛋白及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102180959A CN102180959A (zh) | 2011-09-14 |
| CN102180959B true CN102180959B (zh) | 2013-04-24 |
Family
ID=44567269
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201110065038 Active CN102180959B (zh) | 2011-03-17 | 2011-03-17 | 改良的鸡白介素2蛋白及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102180959B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103614340B (zh) * | 2013-11-15 | 2015-09-02 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 稳定表达鸡白介素10蛋白的细胞系及其构建方法和应用 |
| CN104561021A (zh) * | 2014-12-22 | 2015-04-29 | 天津瑞普生物技术股份有限公司 | 鸡白介素2表达基因改造方法、利用该方法改造得到的基因 |
| CN105154497A (zh) * | 2015-07-14 | 2015-12-16 | 天津瑞普生物技术股份有限公司 | 一种利用重组大肠杆菌制备鸡白介素2的方法 |
| CN112195182A (zh) * | 2020-08-13 | 2021-01-08 | 南宁学院 | 一种重组鸡白介素2和白介素18蛋白的制备方法及其联合应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1093109A (zh) * | 1993-03-31 | 1994-10-05 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 一种人白细胞介素-2的基因合成、表达质粒的构建及产物的生产工艺 |
| JP4128625B2 (ja) * | 1995-10-17 | 2008-07-30 | ウェイン ステイト ユニヴァーシティ | チキンインターロイキン−１５及びその使用 |
| CN1467291A (zh) * | 2002-03-05 | 2004-01-14 | 浙江大学 | 鸡白细胞介素-2(il-2)基因与真核表达质粒及禽类疫苗的免疫增强剂 |
| CN101870733B (zh) * | 2010-05-14 | 2013-02-06 | 河南科技大学 | 禽il-2与新城疫病毒hn基因重组融合蛋白及其应用 |
-
2011
- 2011-03-17 CN CN 201110065038 patent/CN102180959B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102180959A (zh) | 2011-09-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102180959B (zh) | 改良的鸡白介素2蛋白及其制备方法 | |
| CN101736062B (zh) | 一种重组猪α干扰素标准品的制备方法 | |
| CN109966484B (zh) | 一种免疫增强剂、制备方法、禽流感疫苗和应用 | |
| CN103695341A (zh) | 一种由海洋细菌分泌的褐藻胶裂解酶及其制备方法 | |
| CN104593388B (zh) | 一种鲫鱼疱疹病毒病jdorf25疫苗及制备方法和应用 | |
| CN102911927A (zh) | 一种谷氨酸脱羧酶及其编码基因和用途 | |
| CN102286490B (zh) | 一种鸡干扰素γ的制备复性方法 | |
| CN1119352C (zh) | 人血清白蛋白在毕赤酵母中的表达与纯化 | |
| CN102796758A (zh) | 重组猪α干扰素及其在制备治疗猪巨嗜细胞病毒病的药物中的应用 | |
| CN102994601A (zh) | 一种利用海洋胶原蛋白酶mcp-01制备胶原蛋白小肽的方法 | |
| CN112480227B (zh) | 一种提高鲟鱼抵抗病原菌能力的蛋白及其制备方法与应用 | |
| CN104152515A (zh) | 一种制备重组人粒细胞集落刺激因子的培养基及发酵方法 | |
| CN110845594A (zh) | 可增强长牡蛎免疫应答的重组血清淀粉样蛋白a及制备方法 | |
| CN103589769B (zh) | 一种重组猪干扰素α1基因工程菌的高密度发酵方法 | |
| CN102816815A (zh) | 重组抗菌肽rCrustinI的酵母发酵生产方法 | |
| CN103215274B (zh) | 斜带石斑鱼干扰素IFNγ2及其制备方法和应用 | |
| CN102392042A (zh) | 毕赤酵母制备刀额新对虾精氨酸激酶的方法 | |
| CN105420174A (zh) | 一种表达重组vegf融合蛋白的基因工程菌的构建 | |
| CN103012578A (zh) | 一种重组猪白细胞介素2及其编码基因和表达方法 | |
| CN110606884A (zh) | 一种猪α-干扰素的后提取工艺 | |
| CN106319001B (zh) | 一种重组干扰素γ的产业化制备方法与应用 | |
| CN103937828A (zh) | 一种猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白的制备技术 | |
| CN101560518A (zh) | 一种鸡传染性支气管炎病毒膜蛋白基因及其克隆方法 | |
| CN105969691B (zh) | 粘质沙雷氏菌ll-413菌株及其制备舍雷肽酶的应用 | |
| CN105154497A (zh) | 一种利用重组大肠杆菌制备鸡白介素2的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: SHANG WENYONG Free format text: FORMER OWNER: TIANJIN KANGLAISEN BIOLOGICAL TECHNOLOGY GROUP CO., LTD. Effective date: 20140611 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 300451 TANGGU, TIANJIN TO: 301600 JINGHAI, TIANJIN |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20140611 Address after: 301600 Tianjin city Jinghai Kaitong garden A block 1 door 301 Patentee after: Shang Wenyong Address before: 300451, 4668 new North Road, Tanggu District, Tianjin City, innovation and entrepreneurship Park, plant two floor Patentee before: Tianjin Kanglaisen Biological Technology Group Co., Ltd. |
|
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: NANTONG XINHAI AQUATIC FARMING COOPERATIVES PROFES Free format text: FORMER OWNER: SHANG WENYONG Effective date: 20141027 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 301600 JINGHAI, TIANJIN TO: 226000 NANTONG, JIANGSU PROVINCE |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20141027 Address after: 226000, Jiangsu, Nantong, Tongzhou District Province, riding on shore town, Yan Village 29 groups Patentee after: Nantong Xinhai aquatic farming cooperatives Address before: 301600 Tianjin city Jinghai Kaitong garden A block 1 door 301 Patentee before: Shang Wenyong |