CN1093109A - 一种人白细胞介素-2的基因合成、表达质粒的构建及产物的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
白细胞介素-2是作为一种免疫药物可用于治疗
某些病毒和治疗癌症，有很好的应用前景，临床需要
量很大，是国际上竞相开发的产品。本发明是通过构
建带有天然白细胞介素-2基因的表达质粒，在大肠
杆菌中高效表达，表达量达菌体总蛋白的30—
40％。本发明还建立了一种高效的包涵体分离技术
和获得高比活的白细胞介素-2纯化方法，这为大量
生产白细胞介素-2创造了优越的条件。
Description
本发明为一种用基因工程技术生产人白细胞介素-2的方法，国际专利分类为CN12 15/26。
近年来发现细胞分泌一系列具有不同活性的细胞因子，其中许多因子有很强的抗病毒和抗肿瘤作用，如白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子等。它们有的能直接杀伤肿瘤细胞，有的能激活免疫效应细胞和诱导产生其他细胞因子，共同有效地清除肿瘤细胞、病毒或细菌感染的细胞，起到防病和治病的作用。由于这些因子的重要生物学作用使得它们成为目前基因工程药物研究和开发的主要对象。
白细胞介素-2（IL-2）是其中最有应用开发前景的细胞因子之一。尤其是通过IL-2激活免疫细胞而用以进行的过继免疫治疗，已成为肿瘤治疗一个十分有力的手段。估计IL-2对下述方面的疾病有潜在的医疗价值：
1.通过激活LAK（Lymphokine Activated Killer）细胞，清除病毒感染的细胞而起到防病治病作用。如对病毒性乙型肝炎的治疗;
2.通过激活LAK细胞，清除细菌感染的细胞。如治疗麻疯病。
3.通过激活LAK及TIL（Tumor Infitcating Lymphocyte）细胞杀仿和清除癌变细胞。已经证实，将IL-2直接注入肿瘤组织，疗效可达50%以上（如对黑色素瘤，局部循环应用效果更好）。
4.作为免疫佐剂，乙型肝炎表面抗原（HBsAg）对成年人的免疫原性较差，故无预防作用，但加入IL-2后，可大为提高其免疫原性，产生较多的抗HBs，这将有实用价值。
5.IL-2对其它免疫功能低下的疾病，如AIDS和SCID等也可能有治疗作用。
由于IL-2的实用价值，全世界有许多公司和厂家在研制生产IL-2的新方法和新工艺。鉴于遗传密码有简并性，鉴于大肠杆菌对氨基酸密码子的喜爱与人细胞的不同，本发明通过专门设计合成了能生产人天然IL-2的基因，它不改变产物人IL-2的氨基酸组成与排列顺序，而提高了基因在大肠杆菌中的表达水平。通过将一人工合成的IL-2基因组装入专门设计的，有强表达能力的载体PLy-4中，构建成IL-2表达质粒PLy-4S。它能在大肠杆菌中高表达，使IL-2占菌体总蛋白的30-40%。同时，本发明也提供了一种高效的产物IL-2的分离纯化技术。在制得纯净的包涵体后，只用一步Sephacryl S-200柱层杆就可获得纯度＞95%，比活达2×106单位/毫克蛋白的IL-2。产品经PAGE及HPLC分析验证，N未端15个氨基酸顺序分析均证明它与天然IL-2相同。生物功能测定与天然IL-2一样。因此，本发明具有大规模生产的意义。
本发明的示意图说明如下：
图1，合成设计的人IL-2基因及其相应的氨基酸顺序。
图2，合成的IL-20个小片段的顺序。
图3，IL-2基因大片段合成及完整基因组装示意图。
图4，合成的IL-2基因序列测定。
图5，完整IL-2基因组装过程。
图6，IL-2表达质粒的构建。
图7，IL-2表达质粒的酸切鉴定。
1.λDNA标准Ⅲ（EcoRI+HindⅢ）
2.EcoRI+BamⅢ酶切
3.BamHI+ScaLI酶切
4.BgLⅡ+EcoRI酶切
图8，温度诱导表达IL-2。
图中：30，42分别代表30℃，42℃培养。
图9，图8的黑度扫描。
图10，包涵体分离的结果。
图11，Sephacvye S-200分离IL-2。
图12，IL-2的电泳鉴定。
图13，还原型IL-2的HPLC鉴。
图14，氧化型IL-2的HPLC鉴定。
图15，IL-2对维持CTLC-2的细胞生长的作用。
图16，IL-2单抗体IL-2生物功能的抑制作用。
图17，IL-2活化LAK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
通过下述实施例对本发明的技术特征作详细描述。
实施例1：
材料与方法。
（1）限制性内切酶、T4DNA聚合酶、T4DNA连接酶、CIP碱性磷酸酯酶、DNA聚合酶I Klenow片段和DNA分子量标准Ⅲ、Ⅴ均购自Boehringer公司和Biolabs公司。
（2）菌种与质粒。JM101、103和105，BMH71-18 K802为本实验室保存;JF1125由刘爱萍赠予;PRC23由Crowl赠予;PTZ-12、PLR-1由本实验室构建。
（3）放射性同位素α-32P-dATP、α-32P-dCTP和r-32P-ATP购自Amersham公司。
（4）使用ABI公司和DNA合成仪、试剂及方法合成DNA片段。
（5）化学试剂。Tris购自Sigma公司，SDS购自Serve公司，Sephacryl S-200购自Pharmacia公司;RPM1-1640购自日本制药株式会社;标准IL-2（2×106单位/毫克蛋白质）购自Boehringer公司。
（6）质粒DNA制备，DNA序列分析，DNA转化及转化子筛选，限制性内切酶水解等常规方法均参照Molecular Cloning[1982]。
（7）工程菌发酵，挑单个含IL-2的工程菌菌落接种于3ml LB培养基中，30℃摇床培育过夜，然后按2%比例接种于M9培养基（补加VitB1，4mg/L，AMP 50mg/L）。30℃培养到OD600为0.35-0.55时，将温度升高到42℃，再培养3小时，让IL-2大量表达。
（8）IL-2产物鉴定用SDS-PAGE法。电泳产物用岛津CS-930双波长扫描仪进行黑度扫描。
（9）IL-2活性检测方法：参照文献Glillis，S，etal，J·Immunol，120∶2027-2032，1978。
（10）包涵体制备法，发酵后，离心5000rpm，10'，菌体用PBS洗一次，每1克湿菌加50ml PBS，用上海超声波仪器厂CSF-1A型超声波发生器破菌，每次30秒，间隔30秒，反复计10次。然后离心15000rpm15’，弃上清液，沉淀即包涵体。
（11）柱层析纯化IL-2。上述包涵体用PBS洗1次，加入盐酸胍至8M浓度，PH7.5，溶解，离心除去不溶物，上用同一条件平衡的SephacrylS-200层析柱，分离纯化IL-2。
实施的具体步骤分别叙述如下：
1.IL-2基因的合成及鉴定。
第一步是设计基因;第二步是合成小片段;第三步是合成大片段;第四步是组装成完整的基因;第五步是鉴定。
A.基因的设计（图1）
IL-2由133个氨基酸组成，其基因有399 bp，加上起始密码子ATG，终止密码子TAG和TGA及5'和3’，末端克隆时用的限制性内切酶切点，共有426 bp。将它分为20个小片段来合成，20个小片段的序列见图2。这些片段中一些氨基酸密码子是选用了大肠杆菌喜爱的密码子。
B.小片段合成。
用二异丙亚磷酰胺保护的单体，以亚磷酸三酯法在ABI公司的DNA合成仪上进行。反应结束后，取出带有合成DNA片段的多孔玻璃珠（CPG）柱，加浓氨水，密封，55℃过夜，脱去保护基，将DNA片段从硅胶树脂上洗脱下来。将上清液转移到小管子中，用重蒸水洗涤CPG柱，合并上清液，减压冷冻抽干。加TE溶解，用7M urea-20%PAGE分离，切下DNA片段，浸泡在TE（PH8.0）-0.3M NaCl中，洗脱DNA片段。用乙醇沉淀后，溶于重蒸水，上Sephadex G25柱，回收DNA片段。取1n mol合成的DNA小片段，用γ-32PATP和T4多核苷酸激酶标记后，上同一凝胶电泳鉴定，证明纯度是好的。
C.大片段合成
如图3所示，将各相应的DNA小片段，有的如上法加5'-P，有的不必加，用T4DNA连接酶连接成FⅠ和FⅡ两个大片段。在将FⅠ和FⅡ组装成完整基因前要测DNA序列，鉴定合成基因的准确性。为此，分别将FⅠ和FⅡ片段与相应限制性内切酶水解的M13mp18RF DNA相连接，连接后转Ce JM105受体菌。经筛选后，取有外源DNA片段的单个噬菌斑制取单链重组M13mp18-IL-2FⅠ和M13mp18-IL-2FⅡ DNA，用末端终止法测定DNA序列，证明FⅠ和FⅡ的DNA序列准确无误。
D.完整IL-2基因组装
如图4所示，先用限制性内切酶EcoRI和PStI切开含FⅠ大片段的M13mp18-FI，用限制性内切酶PStI和BamHI切开含FⅡ大片段的M13mp18-FⅡ，再用限制性内切酶EcoRI和BamHI切开M13mp18RFONA，组装成含FⅠ和FⅡ片段，即完整IL-2基因的M13m 19-Syn IL-2质粒，结果如图5所示。
E.鉴定
由上述过程可知，含完整IL-2合成基因的M13mp19-Syn-IL-2RFDNA中有一个EcoRⅠ和一个Bam HI切口，它们分别位于IL-2基因的5’末端和3’末端，用这两个酶水解这一重组DNA可得到两个片段，一个是载体M13mp19，一个是合成的IL-2基因。
2.表达载体PLY4的构建
我们构建了一个高表达的载体。其技术特征是含有强启动子PRPL;含有温度敏感的PRPL启动子阻遏蛋白的基因CIts857;含有合适的SD-ACG距离;含有较好的转录终止信号;含有“MCS”区。分别叙述如下：
（1）选择PRPL作启动子的原因是表达率高;可以通过温度改变诱导IL-2的产出，有利于生产。
（2）一般在带有PRPL和CIts 857基因的表达载体中，CIts857基因是用BglⅡ组装进入的，这样的片段有2.4Kb大小，这不仅片段较大，而且在组装后要筛选方向正确的产物。我们研究了入DNA中PRPL启动子与CIts857基因结构，发明了用BglⅡ和PLtI两个酶切出一个包含PR和CIts857的DNA片段，并能够很容易地，定向地组装入载体。这样CIts857的整入和切都十分方便，还省去了CI857方向筛选的工作。
（3）SD顺序与ATG起始密码子之间有AATTC五个碱基，试验证明是最合适的顺序间距。
（4）5S rRNA基因的终止信号是一个强终止信号，将它纳入IL-2基因的3’末端有助于基因转录的有效终止，从而节约了能量和减少基因连续而造成的产品不纯，这都可大为提高大肠杆菌中LL-2的表达效率。
（5）PLy4含有的MCS区来自PVC19，包含有多个单一限制性内切酶的点，有利于外源基因的插入。
3.表达质粒PLy4-Syn rIL-2的构建。
用限制性内切酶EcoRI和BamHI水解M13mp 19-SynIL-2，经电泳后回收IL-2合成基因，与用同样两种限制性内切酶水解的PLy4重组就得到构建在表达载体PLy4上的IL-表达质粒PLy4-Syn IL-2（图6）。为验证IL-2基因是否已克隆入此质粒，同样，用EcoRI和BamHI水解这一质粒，图7显示其中确实含有合成的IL-基因。
4.IL-2的发酵生产
将PLy4-Syn IL-2转化宿主菌K802，构成IL-2的基因工程菌。工程菌在30℃，过夜培养后，以2%比例接种于补充VitB1（4mg/L）和AMP（50mg/L）的M9培养基中，30℃培养呈OD600为0.35-0.55，在5分钟内将度升至42℃，IL-2就诱导产生。温度诱导表达IL-2占菌体总蛋白的32-37.9%，说明这一表达质粒的表达效率是高的。
5.工程菌保存及稳定性。
工程菌保存于25%甘油中，-20℃。传代培养基为软琼脂糖，软琼脂糖菌在4℃保存。为检查工程菌的稳定性，每传10代作一次酶的图谱分析，结果与原始菌种相同。在50代时进行的IL-2基因序列分析与原始基因相同，证明本发明中的工程菌是十分稳定的。
6.IL-2的分离纯化
由于IL-2在细菌中表达得快，产量高，并以包涵体颗粒存在于细菌，本发明中提供了包涵分离和进一步层析纯化的技术，可以快速、高速地得到IL-2产物。
a.包涵体的制备
发酵后，5000rpm，10分钟离心，沉淀菌体，用PBS洗涤后，以每克湿菌体用50ml PBS的比例悬浮菌体。用超声波破菌体后，于15000rpm，15分钟离心，得到包涵体。本法分离的包涵体几乎包含了细菌中产生的全部IL-2（图10），为进一步纯化IL-2打下良好的基础。
b.一步色层制备IL-2
用8M盐酸胍溶解包涵体后，上用同一溶液平衡的Sephacryl S-200柱，分部收集，可得到一个含IL-2的主峰（图11）。本发明中IL-2的一步色层分离是简便、快速、产量高、纯度好。
7.IL-2产物的鉴定
a.SDS-PAGE。
图12表明，上柱后的IL-2是纯的。
b.HPLC鉴定
图13、图14是IL-2的HPL鉴定，其主峰中IL-2含量达99%以上。
C.N末端分析
N端15个氨基酸鉴定结果与天然一样。顺序是：A·P·T·S·S·S·T·K·T·Q·L·Q·L·E·H·L·L。
8.IL-2产物的生物功能鉴定
a.维持CTLL-2细胞的增殖作用
图15显示，本发明制备的IL-2可维持CTLL-2细胞生长28天以上，细胞数目增加了1000倍。不加IL-2或同时加入IL-2单抗时，细胞很快死亡。
b.IL-2单抗对IL-2生物功能的抑制作用。
取T淋巴细胞，加入本发明制取的IL-2到20单位/毫升，再加不同量的单抗，所得结果如图16。IL-2单抗含量在15μg/ml对20μ/ml的IL-2无抑制作用，但单抗增到50μg/ml时则有明显抑制作用，到200μg/ml时可100%地抑制IL-2的生物功能，这一抑制作用是不能用鼠等其它来源的单抗代替，有种属特异性，这说明本发明的IL-2制品是种专一的。
C.IL-2对NK细胞活性的增强作用
Comcentration of Release of91Cr(5)
rIL-2(U/ml)
Blood donor 1 Blood donor 2
0 23.18 23.96
10 22.46
100 32.19 33.30
1000 44.98 35.02
10000 19.94 6.91
100000 3.24 1.38
从表上说明本发明制备的IL-2对NK细胞活性有增强作用。
d.IL-2对LAK细胞的诱导及其对肿瘤细胞的杀伤作用。
图17表明IL-2可诱导LAK细胞的生长。随着培养时间延长，其增殖作用与杀伤作用增大。用IL-2诱导的LAK细胞处理HL-60细胞株及人新鲜肺细胞表明，LAK对此三类细胞均有杀伤作用，杀伤率为37.96-54.84%。
Claims (2)
1、一种人白细胞介素-2(IL-2)基因的合成，表达质粒的构建及产物的生产工艺，其特征是：
a.使用人工设计、化学合成的基因，基因结构式如下：
GA ATT CTT ATG GCT CCG ACT TCT TCT TCT ACT AAA AAG ACT CAG
Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln
CTT CAG CTG GAA CAT CTG CTG CTG GAC CTC CAG ATG ATC CTG AAC
Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn
GGT ATC AAC AAC TAC AAA AAC CCG AAA CTG ACC CGT ATG CTG ACC
Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr
TTC AAA TTC TAC ATG CCG AAA AAA GCT ACC GAA CTG AAA CAT CTG
Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu
CAG TGC CTT GAA GAA GAA CTG AAA CCG CTG GAA GAA GTT CTG AAC
Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn
CTG GCT CAG TCT AAA AAC TTC CAT CTG CGT CCG CGT GAC CTG ATC
Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Are Pro Are Asp Leu Ile
TCT AAC ATC AAC GTT ATC GTT CTG GAA CTG AAA GGT TCT GAA ACC
Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
ACC TTC ATG TGC GAA TAC GCT GAC GAA ACC GCT ACC ATC GTT GAG
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
TTC CTG AAC CGT TGG ATC ACC TTC TGC CAG TCT ATC ATC GTT GAG Thr Phe Met Glu Tyr Asp GLu Thr llEVal Glu TTC GTG AAC GGT TGG ATC ACC TTC TCC CAGTCT TCT ACC Phe Leu Asn Arg Trp lle Phe Cys GlnSer lle Ser Thr GTG ACC TGA TAG GAT CC
Leu Thr TermTerm
IL-2由133个氨基酸组成，合成的该基因有399bp，加上起始密码子ATG，终止密码子TAG和TGA及5′和3′，末端克隆用的限制性内切酶切点，共有426 bp，选用了大肠杆菌使用频率高的密码子，使合成的il-2基因能在大肠杆菌中高效表达，产生大量的人Il-2，而不改变IL-2的氨基酸顺序；
(b)将合成的IL-2基因克隆入带有Pl启动子Cl t857温控阻遏蛋的基因、核糖体t1t25SrRNA终止信号和MCS区的基因载体PLy4后，构建成IL-2的表达质粒Ply4-Syn IL-2，转化大肠杆菌后获得高效表达；
(c)表达产物以包涵体的形成存在，得包涵体产物后用8M盐酸胍溶解，上Sephacryl S-200柱，一步柱层析可以得到纯度＞95%，经活＞2×106国际单位/毫克的IL-2。
2、根据要求1所述的IL-2表达质粒的构建，其特征是使用了表达载体PLy-4，它是由PL强启动子、CIts857温度敏感的PL启动子阻遏蛋白基因，这个基因与PL启动子相连的片段是用Pst和BglⅡ两个限制性内切酶组装入质粒的，易于切出，SD顺序与起始密码子之间有AATTC5个碱基距离和在插入基因的3'末端的转录终止信号t1t2（来自5SRNA基因），以上结构使PLy-4载体成为一个高效表达载体。
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|---|---|---|---|
| CN 93112388 CN1093109A (zh) | 1993-03-31 | 1993-03-31 | 一种人白细胞介素-2的基因合成、表达质粒的构建及产物的生产工艺 |
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|---|---|---|---|---|
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| CN111896734A (zh) * | 2020-05-29 | 2020-11-06 | 湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司 | 2019-nCoV双靶点抗体检测微球复合体组合、制备方法、试剂盒及试剂盒使用方法 |
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