CN1260359C - 高可溶性表达的天花粉蛋白突变体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高可溶性表达的天花粉蛋白突变体产品及其制备方法。本发明的天花粉蛋白突变体或其片段或衍生物，与天然天花粉蛋白相比至少第242位至247位的氨基酸残基缺失。本发明还提供编码上述突变体或片段或衍生物的核酸，及包含该核酸的载体。本发明还提供制备上述突变体或片段或衍生物的基因工程学方法，以及包含所述突变体、片段或衍生物的药物组合物。本发明的产品与天然天花粉蛋白相比具有大幅度提高了发酵得率的性质，因此更适合实际大规模工业化应用。包含本发明产品的药物组合物能够高效低毒地治疗肿瘤、艾滋病、宫外孕和中期引产等疾病。

Description

高可溶性表达的天花粉蛋白突变体及其制备方法

技术领域

本发明涉及天花粉蛋白突变体(Mutant Trichosanthin，MTCS)，其制备的方法，及其用途。

背景技术

天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是从葫芦科植物栝楼(Trichosanthes Kirilowii M.)的根中分离得到，经鉴定为中国传统中药天花粉的活性成份，有二千余年医学临床应用历史。天花粉蛋白的化学本质是一种分子量为27KDa的I型核糖体失活蛋白(RibosomeInactivating Protein，RIP)，具有RNA-N-糖苷酶活性，能使真核细胞核糖体的28S亚基失活(Zhang JS，Liu WY，The Mechanism of ActionTrichosanthin on Eukaryotic Ribosome RNA N-glycosidase of theCytotoxin，Nucleic Acids Res，20(6)：1271-1275，1992)。成熟的天然天花粉蛋白是由247个氨基酸残基组成。其氨基酸序列的一级结构如图1所示(聂慧玲、郭彦文等，天花粉蛋白基因的克隆及结构分析，第四次中国基因结构、克隆与表达学术讨论会，海口，A-32，1991)。二十世纪七十年代天花粉蛋白在中国被临床应用于中期引产和治疗滋养层来源的疾病，例如葡萄胎(上海实验生物学研究所第二研究室，天花粉蛋白引产原理的探讨.中国科学，19：811-830，1976)。1989年实验室里发现天花粉蛋白能抑制人免疫缺陷病毒(HIV)在急性感染的T淋巴细胞和慢性感染的巨噬细胞中复制(McGrath MS，Hwang KM，Caldwell SE，et al.，GLQ233：An Inhibitor of Human ImmunodeficiencyViruS Replication in Acutely and Chronically Infected Cells ofLymphocyte and Mononuclear Phagocyte Lineage，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：2844-2848，1989)，此后不久天花粉蛋白即在临床上试用于治疗艾滋病。此外天花粉蛋白还具抗其它多种病毒、对白血病细胞具有毒性和抗其它肿瘤的能力(孔梅，柯一保，周美云等，天花粉蛋白诱发白血病细胞K562凋亡的研究，实验生物学报，31(3)：233-243，1998；Zheng YT，Zhang KL，Ben KL，et al.，In Vitro Immunotoxicity andCytotoxicity of Trichosanthin Against Human Normal Immunocytes andLeukemia-lymphoma Cells，Immunopharmacology and Immunotoxicolo-gy，17(1)：69-79，1995；吴裕新，项丹妮，章水平等，天花粉蛋白对胃结肠癌细胞的杀伤作用及其机制的研究，中华消化杂志，13(3)：263-266，1993)。

天花粉蛋白临床应用时偶尔会引起通过IgE介导的速发型过敏反应，极大地限制了它的应用。本申请人提交的PCT国际专利PCT/CN01/01178公开了在第174位到180位、203位到226位或230位到244位氨基酸残基区域内具有至少一个氨基酸残基修饰的天花粉蛋白突变体。这种突变体降低了天花粉蛋白的过敏原性，但基本保留了天花粉蛋白的生物学活性。该申请没有涉及提高天花粉蛋白的可溶性表达的问题，其中多数突变体的发酵得率与重组天花粉蛋白的发酵得率没有显著差别。

重组DNA技术为大规模生产目标蛋白提供了崭新的途径。但人们在分离纯化基因工程表达产物时却遇到了意想不到的困难：很多利用大肠杆菌作为宿主细胞来表达外源基因表达产物时，如表达尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白介素-6、人γ-干扰素等、目标蛋白不仅不能分泌到细胞外，反而在细胞内聚集成没有生物活性的直径约0.1-3.0μm的固体颗粒-包涵体(史晋辉，生命的化学，2000年20卷第6期，283-285页)。这些基因表达产物的一级结构(即氨基酸序列)虽然正确，而其空间结构是错误的，所以没有生物活性。因此，为获得天然状态的目标蛋白，必须在分离回收包涵体后，溶解包涵体并设法使其中的目标蛋白质恢复应有的天然构象和活性。分离包涵体并复性蛋白质的操作步骤从收集大肠杆菌细胞开始，然后将细胞破碎匀浆离心，回收包涵体后，加入尿素、盐酸胍等变性剂溶解包涵体，使之成为可溶性伸展态，再除去变性剂使表达产物折叠恢复天然构象及活性。但在实际操作中发现，在体外折叠时，蛋白质分子间由于存在大量错误折叠和聚合，复性效率往往很低，一般来说，蛋白质的复性效率在20％左右。复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，很大程度上与蛋白质本身的性质有关。有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95％以上，而一些蛋白至今没有找到能够对其进行复性的方法，如天花粉蛋白和白介素-11等，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。

天花粉蛋白的分子结构较特殊，不含二硫键，同时具有较高的疏水性。天花粉蛋白分子上有两个比较集中的疏水区，大的结构域在α₁、α₄、α₅和大的β折叠的交界处，形成一个大范围的疏水区。小的结构域在α₇螺旋和β₁₁，β₁₂反平行β折叠以及一些伸展肽链段的交界处形成疏水区。这些疏水残基的相互作用促使蛋白质肽链折叠的形成和维持蛋白质结构的稳定(《天花粉蛋白》，第二版，科学出版社，2000，P.69)。通常在发酵产物中，重组天花粉蛋白主要以包涵体的形式存在，可溶性部分大概只占5％左右。同时在包涵体的溶解和复性的过程中，由于结构的关系，重组天花粉蛋白极易变性沉淀，复性率极低。申请人的实验室曾使用不同的试剂，在不同的浓度等条件下操作，如不同浓度的盐酸胍、尿素、Triton-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。结果使用前三者的复性率均小于1％；使用SDS虽可使包涵体溶解，但无法在以后处理过程中彻底清除SDS，所得成品虽然能以可溶性状态存在，但其光谱等特性改变较大，很可能是残留在分子内部的SDS的影响，表明构象异常。另外所得的产品的生物活性也受到一定影响。同时美国食品和药物管理局明确规定在基因工程产品的生产过程中不允许有SDS参与，所以使用SDS也不是一个可行的选择。

因此，至今无法找到有效可行的重组天花粉蛋白包涵体的复性方法，发酵表达产物中可溶性部分的多少决定了发酵的得率，对其工业化的基因工程生产的效率至关重要。对天花粉蛋白突变体而言，由于它在自然界中并不存在，故一般通过基因工程的方法生产，因此发酵液中可溶性部分得率的高低直接影响其医药工业应用的前景。

发明简述

本发明提供了高可溶性表达、从而具有高发酵得率的天花粉蛋白突变体和其制备方法。

本发明涉及一种天花粉蛋白突变体，其氨基酸序列与天然天花粉蛋白的氨基酸序列相比至少具有如下修饰：第242位至247位氨基酸残基缺失。

在一个优选的实施方案中，本发明的天花粉蛋白突变体或其片段或衍生物中，还可以包括第174-180位和/或203-226位氨基酸残基区域内的至少一个氨基酸残基的改变。

上述天花粉蛋白突变体或其片段或衍生物，其中第204位苏氨酸可被置换。

上述天花粉蛋白突变体或其片段或衍生物，其中第174位精氨酸可被置换。

上述天花粉蛋白突变体或其片段或衍生物，其中所述第204位苏氨酸可被一个酸性氨基酸或一个疏水性氨基酸残基置换。

上述天花粉蛋白突变体或其片段或衍生物，其中所述第174位精氨酸可被一个酸性氨基酸或一个疏水性氨基酸残基置换。

上述天花粉蛋白突变体或其片段或衍生物，其中所述第204位苏氨酸可被门冬酰胺或甘氨酸置换。

上述蛋白突变体或其片段或衍生物，其中所述第174位精氨酸可被门冬氨酸或甘氨酸置换。

本发明还涉及编码依据本发明的天花粉蛋白突变体的核酸。

本发明还涉及含有依据本发明的核酸的载体、特别是表达载体，以及用依据本发明的核酸或依据本发明的载体转化的宿主细胞。

本发明还涉及一种制备天花粉蛋白突变体的方法，包括在有利于所述蛋白突变体表达的条件下培养用含所述突变体之表达载体转化的原核宿主细胞，并从培养物中回收所述蛋白突变体；其中所述表达载体中突变体的编码基因已经过修饰，该修饰至少包括编码天然天花粉蛋白第242-247位氨基酸的核苷酸序列的缺失。

本发明还涉及含有依据本发明的天花粉蛋白突变体和药物可接受载体或赋型剂的药物组合物。

本发明还涉及作为药物的依据本发明的天花粉蛋白突变体。

本发明还涉及依据本发明的天花粉蛋白突变体在制备治疗病毒性疾病如艾滋病、治疗肿瘤、治疗宫外孕和/或引产的药物中的应用。

最后，本发明涉及一种在哺乳动物中引产、治疗宫外孕、治疗病毒性疾病和/或治疗肿瘤的方法，包括给予需要治疗的哺乳动物治疗有效量的依据本发明的天花粉蛋白突变体。

发明详述

本发明的发明人发现，第242位至247位氨基酸残基缺失的天花粉蛋白，在DNA重组生产中可溶性部分得率提高。

本发明的天花粉蛋白突变体可以通过DNA重组技术在原核宿主中得到高可溶性表达。即在相同的发酵条件下，本发明的天花粉蛋白突变体比重组天然天花粉蛋白具有更高的基因工程生产得率。

另外，本发明的天花粉蛋白突变体还具有低过敏原性而基本保留天然天花粉蛋白的生物学活性。由于本发明的天花粉蛋白突变体比天然天花粉蛋白在相同的发酵条件下具有更高的基因工程生产的得率，更适合大规模工业化应用，具有更好的医药工业应用前景。

在本申请说明书和权利要求中，氨基酸残基的位置编号参照图1中的残基编号。

本发明中所用术语“疏水性氨基酸”特别是指甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Try)和甲硫氨酸(Met)。术语“亲水性氨基酸”特别是指丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)，半胱氨酸(Cys)，酪氨酸(Tyr)，门冬氨酸(Asp)，门冬酰胺(Asn)，谷氨酸(Glu)，谷氨酰胺(Gln)，赖氨酸(Lys)，精氨酸(Arg)、和组氨酸(His)。术语“碱性氨基酸”特别是指赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、和组氨酸(His)。术语“酸性氨基酸”特别是指门冬氨酸(Asp)、门冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、和谷氨酰胺(Gln)。

本发明的天花粉蛋白突变体与天然天花粉蛋白的氨基酸序列相比至少具有如下修饰：第242位至247位氨基酸残基缺失。

除第242位至247位氨基酸残基缺失外，本发明的天花粉蛋白突变体还可以包含其他氨基酸残基的修饰，例如一个或多个氨基酸残基的插入、缺失和、或置换，或者一个或多个氨基酸残基的化学修饰，只要所形成的突变体保留在原核生物中高可溶性表达的能力。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明的天花粉蛋白突变体与天然天花粉蛋白相比具有低免疫原性但基本保留天然天花粉蛋白的一项或多项生物活性。例如，本发明的天花粉蛋白突变体可以含有PCT国际专利PCT/CN01/01178公开的第174位到180位和/或203位到226位氨基酸残基区域内的至少一个氨基酸残基修饰。如该PCT申请中所述，所述氨基酸残基的“修饰”指氨基酸残基的缺失、插入、添加、置换或化学修饰。氨基酸残基的修饰优选能引起在被修饰的氨基酸位点的电荷改变。术语氨基酸残基的“置换”优选指用疏水性氨基酸残基置换亲水性氨基酸残基、用亲水性氨基酸残基置换疏水性氨基酸残基、用碱性氨基酸残基置换酸性氨基酸残基，或用酸性氨基酸残基置换碱性氨基酸残基。优选地，天花粉蛋白突变体在174-180区域中含有至少一个选自表1中的氨基酸残基修饰。

表1

原氨基酸残基及其序号	优选的修饰
		Arg174Val175Asp176Lys177Thr178Phe179Leu180	被Glu、Asp或Gly置换缺失被Lys或Gly置换被Glu、Asp或Gly置换被Gly或Ala置换缺失缺失

对于203-226区域中的氨基酸残基修饰，优选为选自表2中的氨基酸残基修饰：

表2

原氨基酸残基及其序号	优选的修饰
		Ser203，Ser211Thr204，Thr224，Thr226Asn205，Asn206，Asn217，Asn220Gly207Gln208，Gln219，Gln221Phe209Glu210Pro212Val213，Val214，Val215，Val223Ile216，Ile225Ala218Arg222	被Gly或Ala置换被Gly或Ala置换被Lys或Gly置换缺失被Lys或Gly置换缺失被Lys或Gly置换缺失缺失缺失缺失被Glu，Asp或Gly置换

例如，本发明的发明人发现，下列优选的本发明天花粉蛋白突变体除具有高可溶性表达的性质外，与天然天花粉蛋白相比还具有较低的免疫原性并基本保留了天然天花粉蛋白的生物活性。

在一个优选实施方案中，本发明的天花粉蛋白突变体含有如下氨基酸残基的修饰：氨基酸残基第242位至247位被缺失。

在另一个优选实施方案中，本发明的天花粉蛋白突变体含有如下氨基酸残基的修饰：氨基酸残基第242位至247位被缺失并且氨基酸残基第204位苏氨酸被门冬酰胺或甘氨酸置换。

在另一个优选实施方案中，本发明的天花粉蛋白突变体含有如下氨基酸残基的修饰：氨基酸残基第242位至247位被缺失并且氨基酸残基第174位精氨酸被门冬氨酸或甘氨酸置换。

本发明还涉及编码本发明天花粉蛋白突变体的核酸。

本发明的天花粉蛋白突变体可以按本领域技术人员已知的基因工程或肽合成方法制备(Merrifield J，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154.1963)。优选通过对天然天花粉蛋白基因的改造和在适当生物宿主中表达上述改造好的基因来制备。

本发明编码上述天花粉蛋白突变体的核酸可以克隆在适当的载体中，特别是表达载体如质粒载体pET-3d或pET-3a。

本发明的核酸或含有该核酸的载体可被用来转化适当的原核宿主细胞，如大肠杆菌。这种转化了的宿主细胞可用于培养生产本发明的天花粉蛋白突变体。本发明同样涉及这种被转化了的宿主细胞。

因此，本发明还涉及一种制备天花粉蛋白突变体的方法，包括在有利于所述蛋白突变体表达的条件下培养用含所述突变体之表达载体转化的原核宿主细胞，并从培养物中回收所述蛋白突变体；其中所述表达载体中突变体的编码基因已经过修饰，该修饰至少包括编码天然天花粉蛋白第242-247位氨基酸的核苷酸序列的缺失。

本发明方法中所使用的原核宿主可以是任何适合天花粉蛋白表达的原核生物，本发明方法中优选使用大肠杆菌。

利用本技术领域人员已知的基因工程方法，可对天然天花粉蛋白基因进行修饰，例如可以采用PCR法或单链突变法。

为了克隆编码成熟天花粉蛋白的DNA序列，必要时在编码天然天花粉蛋白的DNA序列的5’端前和3’端后分别引进适当的限制性内切酶位点，引入起始密码子和终止密码子。例如在编码天然天花粉蛋白的DNA序列的5’端引入NcoI位点(CCATGG)，从而引进了起始密码子ATG，同时在成熟天然天花粉蛋白的第-1位加了一个甲硫氨酸；或引进限制性内切酶NdeI位点(CATATG)，从而使成熟天然天花粉蛋白的第1位氨基酸残基从天门冬氨酸改为甲硫氨酸。在编码成熟天花粉蛋白的DNA序列的3’端后可引进限制性内切酶BamHI位点(GGATCC)，从而引进了终止密码子。

在获得天花粉蛋白的DNA克隆后，对编码待突变部位氨基酸序列的DNA序列进行修饰，以获得编码本发明天花粉蛋白突变体的基因。由于氨基酸遗传密码子的简并性，对一个氨基酸位置的突变在基因水平上可以有多个方案。对特定部位的DNA序列的定点改造可以利用商业上可买到的试剂盒，例如Bio-Rad公司的Muta-Gene Phagemid invitro Mutagenesis Kit，按厂家提供的说明来方便地进行。

将定点突变得到的编码天花粉蛋白突变体的DNA序列用适当的限制性内切酶如NcoI(或NdeI)和BamHI酶切，然后克隆进表达载体如质粒载体pET-3d(或pET-3a)。所得的突变表达载体用常规方法转化合适的宿主细胞如大肠杆菌BL21(DE3，plysS)。将筛选出的转化子在适当的培养基中培养，按需在适当时加诱导剂如IPTG诱导天花粉蛋白突变体表达。通过常规方法，包括菌体破碎、离心、柱层析分离纯化等，从培养物中分离所表达的天花粉蛋白突变体。

在与本申请实施例4相同的条件下发酵生产未经修饰的重组天花粉蛋白，其中使用含TCS基因的质粒pET-3d-TCS(该质粒的制备见PCT/CN01/01178的实施例1)。最后得到重组天花粉蛋白的发酵得率为40mg/每升发酵液左右。从本发明的实施例可见，本发明的天花粉蛋白突变体的发酵产率可达120-150mg/L，有了大幅度的提高。这是通过对天花粉蛋白的氨基酸残基的特定修饰，产生特殊的结构而导致的优良的突变体蛋白性质。高得率是所有利用发酵的方法生产的基因工程类产品所共同追求的重要目标。虽然对同一产品运用不同的发酵生产条件可以导致不同的得率，并可以通过研究确定某一产品的较优化的发酵条件，但某一个产品的得率的高低最终是由它本身所固有的结构性质条件所决定的。本发明的天花粉蛋白突变体比较重组天花粉蛋白在相同的发酵条件下所得的产品得率有了大幅度地提高，从而提高比生产速率，并降低生产成本，更加适合大规模工业化应用。

如下面的试验实施例所述，本发明的天花粉蛋白突变体例如氨基酸残基第242位至247位被缺失的MTCS(L6)，具有低免疫原性并基本保留天然天花粉蛋白的生物活性。

从试验结果可见，通过本对天花粉蛋白的氨基酸残基的特定修饰，本发明的天花粉蛋白突变体与天然天花粉蛋白相比降低了过敏原性，并很好地保留了天然天花粉蛋白的各项生物活性。因此本发明的天花粉蛋白突变体适用于治疗天然天花粉蛋白的适应症。更具体地，这些适应症包括但不局限于以下项目。

1.治疗各类肿瘤。在一定的剂量范围内，本发明的天花粉蛋白突变体对肿瘤细胞有强烈毒性作用，而不损伤正常细胞，故不良反应极微。

2.病毒性疾病，特别是艾滋病。在艾滋病的治疗上本发明的天花粉蛋白突变体因其较低的过敏原性较天然天花粉蛋白毒副反应低，对病人更安全。

3.宫外孕和中期引产。与天花粉蛋白作为引产药物时每个引产妇女一生中只能使用一次不同，本发明的天花粉蛋白突变体因其低过敏原性使得多次安全地使用成为可能。

本发明的天花粉蛋白突变体可以与药学可接受载体或赋型剂一起被包含在药物组合物中使用。相应地，本发明还提供了这样的药物组合物，包括有效治疗剂量的天花粉蛋白突变体和药学可接受的载体或赋形剂。这样的载体或赋型剂的实例有但不局限于，盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、丙二醇及聚乙二醇等之一或其组合。这样的药物组合物应该适于具体的给药方式。

本发明也提供了一种药物包装或试剂盒，包括一个或多个装有一种或多种本发明的药物组合物的成分的容器。依据本发明的天花粉蛋白突变体也可与其它的治疗化合物组合使用。

依据本发明的药物组合物可用多种方式，诸如口服、局部、静脉内、腹膜内、肌肉内、肿瘤内、皮下、鼻内或真皮内途径，给药于哺乳动物宿主，例如人类。这些药物组合物用于治疗或预防具体疾病或症状时，应按根据该疾病或症状的有效剂量使用。本发明天花粉蛋白突变体的使用剂量可以参照天然天花粉蛋白的有效剂量确定。

以下实施例的目的是举例说明，无意限制本发明的范围。

附图说明

图1列出天然天花粉蛋白的氨基酸序列(序列1)及编码该氨基酸序列的核苷酸序列(序列2)。第1至247位氨基酸的区域为成熟天然天花粉蛋白的氨基酸序列。

具体实施方式

实施例1

编码MTCS(L6)(氨基酸残基第242位至247位被缺失)的DNA的生成和克隆

为本实验设计了突变引物1。

引物1：5’GCG TTG CTG CTG TAG GAT CCC AAT ATG GCATAG 3’(序列3)

引物1的特点是将编码第242位至247位氨基酸的密码子删除。

选用Bio-Rad公司提供的利用噬菌粒进行的体外突变药盒(Muta-Gene Phagemid in vitro Mutagenesis Kit，目录号170-3576)，按药盒中所附的说明进行操作。通过DNA序列分析验证所获突变DNA产物。详见该药盒厂家说明。

简言之，该方法包括以下步骤。

取含有编码重组天花粉蛋白基因的DNA的质粒pTZ-19U-TCS转化大肠杆菌Cj236，经一系列操作抽提到含Uracil的单链模板(详见PCT/CN01/01178)与0.1到0.3pmol突变引物、退火缓冲液和水混合，混合物先加热至70℃，在40分钟时间内缓缓冷却到30℃。如此冷却后的混合物放入冰浴中，加入3单位的T₄DNA连接酶和1单位的T₄DNA聚合酶。将该合成混合物在冰浴中放置5分钟，然后在25℃放置5分钟，最后在37℃放置90分钟。加入90ul终止缓冲液终止合成反应。用该经突变后的DNA产物转化用氯化钙处理的感受态大肠杆菌MV1190。将转化子铺板于含青霉素的平板上，37℃培养过夜。挑选数个单菌落，分别抽提质粒，最后经DNA序列测定证实符合突变设计。在本实施例情况下该质粒为pTZ-19U-MTCS(L6)。

质粒pTZ-19U-MTCS(L6)接着经NcoI和BamHI在37℃双酶解2小时，通过低熔点琼脂糖凝胶电泳分离和回收天花粉蛋白突变体基因片段。然后该片段利用T4DNA连接酶在4℃与事先同样经NcoI和BamHI双酶解的表达型质粒pET-3d(Novagen，目录号：69421-3)连接过夜，得到可供表达用的质粒pET-3d-MTCS(L6)。

实施例2

编码MTCS(L6，M204)(氨基酸残基第242位至247位被缺失并且氨基酸残基第204位苏氨酸被门冬酰胺置换)的DNA的生成和克隆

除根据实验设计和使用了不同的突变引物1和2外，突变和克隆的操作步骤均按实施例1中所描述的进行，藉此得到质粒pET-3d-MTCS(L6，M204)。

为本实验设计了两个突变引物：

引物1：5’GCG TTG CTG CTG TAG GAT CCC AAT ATG GCATAG 3’(序列3)，引物1的特点是将编码第242位至247位氨基酸的密码子删除；和

引物2：5’ATA GCG AGT AAT AAT AAT GGA 3’(序列4)，引物2的特点是将原204位的Thr的密码子改变成Asn的密码子。

由于密码子的简并性，下划线部位的碱基还可以用其它编码Asn的碱基替代，如AAC。

实施例3

编码MTCS(L6，M174)(氨基酸残基第242位至247位被缺失并且氨基酸残基第174位精氨酸被甘氨酸置换)的DNA的生成和克隆

除根据实验设计和使用了不同的突变引物1和3外，突变和克隆的操作步骤均按实施例1中所描述的进行，藉此得到质粒pET-3d-MTCS(L6，M174)。

为本实验设计了两个突变引物：

引物1：5’GCG TTG CTG CTG TAG GAT CCC AAT ATG GCATAG 3’(序列3)，引物1的特点是将编码第242位至247位氨基酸的密码子删除，和

引物3：5’ATT GGG AAG GGT GTT GAC AAA 3’(序列5)，引物3的特点是将原174位的Arg的密码子改变成Gly的密码子。

由于密码子的简并性，下划线部位的碱基还可以用其它编码Gly的碱基替代，如GGA、GGC或GGG。

实施例4

MTCS(L6)的表达

实施例1中所得含MTCS(L6)的质粒pET-3d-MTCS(L6)转化经氯化钙处理过的感受态大肠杆菌BL21(DE3，plysS)(Novagen公司产品)。简言之，轻轻混合1-100ng pET-3d-MTCS(L6)质粒DNA和100ul感受态细胞。经在冰浴中放置30-60分钟，该混合物在42℃热休克90秒后，再放回冰浴中。5分钟后在该混合物中加入0.5ml的LB培养液，接着在37℃振荡培养1小时。取1/10该培养后的混合物用0.1mlLB培养液稀释后铺在含青霉素和氯霉素的LB培养板上。这些板在37℃培养过夜，然后挑取大小形态均匀的单菌落。转化子在37℃用含青霉素和氯霉素的LB培养液培养过夜后，再用含青霉素和氯霉素的M9ZB培养液在同样温度使用Bioengineering公司出品的NLF22-30L型发酵罐放大发酵培养至A₅₇₀≈0.8。加IPTG至终浓度为0.5mM，继续培养3小时后离心收集菌体。菌体经超声破碎后，离心取上清液上CM-Sephadex或CM-Sephorose柱层析。用含0.1mM PMSF的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)洗柱，直至A₂₈₀下降到基线，然后用0.1-0.4M线性梯度的NaCl的洗脱液洗脱。其主峰即为以可溶性产品形式表达的MTCS(L6)，没有包涵体问题的困扰，无需变性复性处理。在每升的发酵液中经分离纯化可得120mg左右的纯品。

MTCS(L6)的氨基酸序列除了氨基酸残基第242位至247位被缺失外，与序列表1的氨基酸序列一致。

实施例5

MTCS(L6，M204)的表达

用实施例2中所得含有编码MTCS(L6，M204)的DNA的质粒pET-3d-MTCS(L6，M204)转化大肠杆菌BL21(DE3，plysS)。按实施例4的基因转化、表达和蛋白纯化所用相同的步骤操作，藉此得到MTCS(L6，M204)。MTCS(L6，M204)的氨基酸序列除了氨基酸残基第242位至247位被缺失并将原204位Thr改变成Asn外，与重组天花粉蛋白的氨基酸序列一致。每升的发酵液中以可溶性产品形式表达的本品经分离纯化可得150mg左右的纯品。

实施例6

MTCS(L6，M174)的表达

用实施例3中所得含有编码MTCS(L6，M174)的DNA的质粒pET-3d-MTCS(L6，M174)转化大肠杆菌BL21(DE3，plysS)。按实施例4的基因转化、表达和蛋白纯化所用相同的步骤操作，藉此得到MTCS(L6，M174)。MTCS(L6，M174)的氨基酸序列除了氨基酸残基第242位至247位被缺失并将原174位Arg改变成Gly外，与重组天花粉蛋白的氨基酸序列一致。每升的发酵液中以可溶性产品形式表达的本品经分离纯化可得140mg左右的纯品。

对比实施例1

未修饰的重组天花粉蛋白rTCS的表达

用按PCT/CN01/01178的实施例1所制备的含未修饰重组天花粉蛋白(rTCS)之编码DNA的质粒pET-3d-TCS转化大肠杆菌BL21(DE3，plysS)。按实施例4的相同操作步骤进行基因转化、表达和蛋白纯化，获得rTCS。所述rTCS的氨基酸序列与序列1的氨基酸序列一致。每升的发酵液中以可溶性产品形式表达的产品经分离纯化得到约40mg的纯品。

对比实施例2

天花粉蛋白突变体MTCS(M177，203，236)的重组表达

用按PCT/CN01/01178的实施例6所制备的含天花粉蛋白突变体MTCS(M177，203，236)之编码DNA的质粒pET-3d-MTCS(M177，203，236)转化大肠杆菌BL21(DE3，plysS)。按实施例4的相同操作步骤进行基因转化、表达和蛋白纯化，获得MTCS(M177，203，236)。所述MTCS(M177，203，236)的氨基酸序列，除第177位的赖氨酸改变为谷氨酸、第203位的丝氨酸改变为甘氨酸以及第236位的谷氨酰胺改变为甘氨酸外，与序列1的氨基酸序列一致。每升的发酵液中以可溶性产品形式表达的产品经分离纯化得到约20mg的纯品。

试验实施例

试验实施例1

MTCS(L6)生物学活性和免疫反应能力的检测

RIP活性按Pelhem & Jackson方法测定(H.K.B.Pelhem and R.J.Jackson，Eur.J.Biochem.67：247-256，1976)。兔网织红细胞裂解液为Promega产品。[3H]亮氨酸为New England Nuclear产品。

引产活性测定按Nie HL，et al.，Position 120-123，a PotentialActive Site ofTrichosanthin，Life Sciences，62(6)：491-500，1998中所述的常规方法进行。以怀孕11天的ICR小鼠为模型。动物背部注射75nmol/Kg MTCS(L6)，48小时后处死。解剖记录总胎鼠数及死亡胎鼠数(包括胎儿吸收点)，计算胎鼠死亡率。

按He XH，et al.，Effects of Chemical Modification of Lysine andArginine Residues of Trichosanthin on its Reactivity with IgE，ActaBiochemica et Biophysica Sinica，26：657-662，1994所述的竞争性ELISA方法，检测样品体外与IgE的反应能力。

上述各试验中均用天然天花粉蛋白作为阳性对照。结果列于下表3中。

表3：天花粉蛋白突变体的过敏原性及生物活性检测结果

	体外与IgE反应能力	RIP活性	引产活性
				天然天花粉蛋白	100％	100％	100％
MTCS(L6)	≤30％	100％	100％

试验实施例2

按常规的MTT方法(Kong M，et al.，Study on TrichosanthinInduced Apoptosis of Leukemia K562 Cells，Acta BiologiaeExperimentalis Sinica，31(3)：233-243，1998)进行体外培养下对肿瘤细胞的毒性作用的检测。K562为人红白细胞型白血病细胞株，对照用人正常外周血淋巴细胞，从临床采集。检测结果显示MTCS(L6)对K562细胞的半抑制剂量IC₅₀值为11ug/ml，对人正常外周血淋巴细胞的IC50值高于1000ug/ml以上。故在一定的剂量条件下，该天花粉蛋白突变体对肿瘤细胞有强烈的毒性，而不损伤正常体细胞。

试验实施例3

MTCS(L6)抗HIV生物学活性的检测

抗HIV活性按Zheng等的方法(Zheng YT，BenKL and Jin SW，Anti-HIV-1 activity of trichosanthin，a novel ribosome inactivatingprotein Acta Pharmacol.Sin.2000，21：179-182)测定，检测MTCS(L6)和TCS对HIV-1诱导C8166细胞病变产生合胞体的抑制作用；同时以捕捉p24抗原ELISA方法检测MTCS对实验株HIV-1 IIIB在急性感染C8166细胞中复制的抑制作用；另外以MTT方法检测MTCS对C8166细胞的细胞毒性。检测结果表明：MTCS(L6)能有效抑制HIV-1诱导淋巴细胞病变，能有效抑制HIV-1的复制，其治疗指数均＞10。表明MTCS(L6)具有显著的抗HIV-1作用，与野生型天花粉蛋白(TCS)相当。以天然TCS抗HIV的活性为100％，MTCS(L6)的活性也为100％。

Claims (17)

1.一种天花粉蛋白突变体，其氨基酸序列与天然天花粉蛋白的氨基酸序列相比至少具有如下修改：第242位至247位氨基酸残基缺失。

2.权利要求1的天花粉蛋白突变体，其中还包括第174-180位和/或203-226位氨基酸残基区域内的至少一个氨基酸残基的改变。

3.权利要求2的天花粉蛋白突变体，其中第204位苏氨酸被置换。

4.权利要求2的天花粉蛋白突变体，其中第174位精氨酸被置换。

5.权利要求3的天花粉蛋白突变体，其中所述第204位苏氨酸被一个酸性氨基酸或一个疏水性氨基酸残基置换。

6.权利要求4的天花粉蛋白突变体，其中所述第174位精氨酸被一个酸性氨基酸或一个疏水性氨基酸残基置换。

7.权利要求5的天花粉蛋白突变体，其中所述第204位苏氨酸被门冬酰胺或甘氨酸置换。

8.权利要求6的天花粉蛋白突变体，其中所述第174位精氨酸被门冬氨酸或甘氨酸置换。

9.编码权利要求1至8之任一项的天花粉蛋白突变体的核酸。

10.包含权利要求9的核酸的载体。

11.用权利要求9的核酸或权利要求10的载体转化的宿主细胞。

12.一种制备天花粉蛋白突变体的方法，包括在有利于所述蛋白突变体表达的条件下培养权利要求11的宿主细胞。

13.包含权利要求1至8之任一项的天花粉蛋白突变体和药学可接受的载体或赋形剂的药物组合物。

14.权利要求1至8之任一项的天花粉蛋白突变体在制备治疗病毒性疾病、治疗肿瘤、引产和/或治疗宫外孕的药物中的应用。

15.权利要求14的应用，其中所述药物为用于引产的药物。

16.权利要求14的应用，其中所述药物为用于治疗艾滋病的药物。

17.权利要求14的应用，其中所述药物为用于治疗肿瘤的药物。