CN1057119C - 新型重组人肿瘤坏死因子衍生物及其制法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人肿瘤坏死因子α衍生物，在人肿瘤坏死因子α衍生物的氨基酸序列中至少在80，90和92中任何一位或二位或三位有变化。更佳地在人肿瘤坏死因子α衍生物的氨基酸序列中80位为丝氨酸和/或90位为组氨酸和/或92位为缬氨酸，最佳地80位为丝氨酸、90位为组氨酸和92位为缬氨酸。本发明还提供含有该衍生物的药物组合物。此外本发明还提供了该衍生物的制备方法及有关的DNA序列、表达载体和宿主细胞。

Description

新型重组人肿瘤坏死因子衍生物及其制法

发明领域

本发明涉及重组蛋白领域，更具体地，本发明涉及新型的重组人肿瘤坏死因子α衍生物。此外，本发明还涉及该新型衍生物的制备方法及含有该衍生物的药物组合物等方面。

背景技术

肿瘤是人类的第二大死因，仅次于心脑血管意外，据估计全世界每年死于各种恶性肿瘤的人数接近1000万。目前对肿瘤的发生原因和发展过程尚不完全明了。临床上常规的治疗方法为手术、化疗及放疗等，对于肿瘤早期患者可采取手术切除合并其它疗法，往往可取得较好的效果，但是对于那些无手术指征的晚期癌症病人，化疗及放疗的效果往往很差，且后两种治疗方法本身具有严重的毒副反应，故而众多的医学科学家都致力于找到一种既有高效抗肿瘤作用，又不影响机体正常功能的治疗方法。

早在十九世纪末，德国的Fehleisen及美国的Coley总结出一套诱导人工感染方法用于治疗晚期肿瘤，并取得了一定的疗效。此后，Coley改用杀死的化脓性链球菌及粘质沙雷氏菌(灵杆菌)滤液治疗癌症病人，并取得了很好的疗效，此一方法后来被称为Coley疗法，所用的制剂也被称为Coley毒素(Coley W.B.J Am MedAsso 1889；31；389.31：456)。这一疗法在1934年被美国医学协会规定为唯一的可用于肿瘤全身治疗的制剂，充分肯定了其在肿瘤治疗中的价值，并开辟了肿瘤生物治疗的先河。

1901年左右，Pfeiffer介绍了细菌内毒素的概念，科学家们很快认识到Coley毒素及肿瘤病人细菌感染所引起的抗肿瘤作用的物质为细菌内毒素(Pfeiffer R.I Hyg Infektionkrankn 1892；11：393)。

Carswell等(Caswell E.A.et al，J Natl Cancer Inst 1975；72：3666)于1975年发现注射卡介苗和内毒素的动物血清中可出现一种抗肿瘤因子，由于该种物质能使肿瘤组织发生出血坏死，而称之为“肿瘤坏死因子”(Tumor Necrosis Factor，简称TNF)。研究发现，肿瘤坏死因子有两种，即肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子β(又名淋巴毒素)；TNFα主要由巨噬—单核细胞群产生，可为卡介苗、内毒素等诱导产生；某些肿瘤细胞如人前髓白血病细胞HL-60在佛波醇酯诱导下，向巨噬细胞方向分化，也可产生TNFα。1984年，Pen-nica等(Pennica D，et al，Nature 1984；312：724)首先克隆了人TNFα基因cDNA，并推导出人TNFα分子由157个氨基酸组成，其中69和101位的两个半胱氨酸在TNFα的活性状态下形成一个二硫键，其分子量约为17KD；与此同时，M.Ikehara等(Ikehara M.et al，Proc Natl Acad Sci U.S.A.，1984；81：5956；Ikehara M.etal，Chem Pharm Bull，1988；36(1)：291)也克隆了人TNFα基因cDNA，并根据大肠杆菌E.Coli密码子优化原则，进行了相应的基因全合成，从而获得了人TNFα的高表达。

国外应用rh-TNFα临床试用的结果表明该因子对多种恶性肿瘤细胞具有明显的杀伤作用，许多患者经过治疗后肿瘤缩小甚至消失，病人病情缓解，生活质量改善，生存期延长，显示出rh-TNFα良好的抗肿瘤作用效果。但在实际应用过程中，亦发现rh-TNFα具有十分明显的毒副反应，包括发热、寒战、低血压、体重下降，个别病人甚至可发生严重的休克，故而限制了rh-TNFα的临床推广应用。

国外应用rh-TNFα的临床I-II期试验已完成，III期正在进行。已获得的有限资料表明rh-TNFα对某些晚期肿瘤具有一定的临床治疗效果。结果还表明瘤内及胸腔内注射明显优于其他给药方式。因此，结果是令人鼓舞的。

鉴于以上情况，国内外对肿瘤坏死因子α的结构和功能进行了研究并对rh-TNFα分子进行改造或修饰研究，以期找到高效、无毒或低毒的TNFα衍生物，以用于临床晚期癌症病人的治疗。90年代初，日本学者Soma等(Soma G.I.et al，Biochem Biophys ResCommun，1987；148：629)首先通过点突变技术，对人TNFα基因进行了修饰，从而得到了N-末端一个或少数几个氨基酸改变的TNFα衍生物，其中的一个(如TNF-S)毒性比原型低10倍左右，但仍保留有效的抗肿瘤作用及其它有益作用。上海复旦大学及中国科学院上海生物工程研究中心亦采用类似途径得到了一些N-或/和C-末端个别氨基酸改变的TNFα衍生物(如复旦的TNFDa、中科院的TNF-Lys2等)，证实毒性低4～5倍，且抗癌作用明显(何晓龙等，生物化学与生物物理学报1995；27：67)。

X.V.Ostade等人(Localization of the active site of human tu-mor necrosis factor by mutational analysis，EMBO J.1991，10(4)，827-836)通过化学修饰、定点诱变等方法对人肿瘤坏死因子结构与其功能关系进行了研究。万晓余等(肿瘤坏死因子结构研究进展，生物化学与生物物理进展，1993，20(5)，351-356)总结了研究结果。这些文献指出，117-119，143-148位的氨基酸替换会导致生物学活性的明显下降，34，50和108位氨基酸的替换可导致其细胞毒活性明显下降。91，32，36，86，和84等位点的突变可导致TNF生物活性的明显下降或丧失。但是未提及对80，90和92位的定点突变的报道。

R.Ito等人(Novel muteins of human tumor necrosis factor-α，Biochim.Biophys.Acta.1991，1096(3)，245-52)公开了用化学合成的人肿瘤坏死因子α基因，并在大肠杆菌中克隆和高效表达。此外用诱变方法产生了5个TNF-α突变蛋白(诱变位分别为73，102，10，116和15)。同样未提及对80，90和92位的定点突变。

W.Fiers等人(Analogs of tumor necrosis factor with alteredaffinities for the 75 KDand 55KD receptors，EP 486908)公开了在序列中至少有一个氨基酸缺失、插入和/或置换的人肿瘤坏死因子衍生物或其盐。其中发生改变的氨基酸位置为29，31和32位。

综上所述，已有技术中未提及有关TNFα氨基酸序列中80，90和92位的点突变。更没有暗示在这些位点发生突变会引起毒性的下降。

发明目的

本发明的目的就是提供一种新的人肿瘤坏死因子α的衍生物(或称衍生物)，它保留了TNFα的生物活性和对肿瘤细胞的杀伤作用，同时又降低其毒副作用。该新型人肿瘤坏死因子α衍生物在氨基酸序列中，在80，90和92位中的任何一位或二位或三位存在氨基酸变化，更佳的是80位为丝氨酸和/或90位为组氨酸和/或92位为缬氨酸，最佳地被表达的人肿瘤坏死因子α衍生物在氨基酸序列中80位为丝氨酸、90位为组氨酸和92位为缬氨酸。

本发明的第二个目的是提供编该TNFα衍生物的DNA序列。

本发明的第三个目的是提供该新的TNFα衍生物的制备方法。它包括：(1)在适合宿主细胞生长的条件下培养已被转化并且能够表达人肿瘤坏死因子α衍生物的宿主细胞，其中被表达的人肿瘤坏死因子α衍生物在氨基酸序列中，在80，90和92位中的任何一位或二位或三位存在氨基酸变化，更佳的是80位为丝氨酸和/或90位为组氨酸和/或92位为缬氨酸，最佳地被表达的人肿瘤坏死因子α衍生物在氨基酸序列中80位为丝氨酸、90位为组氨酸和92位为缬氨酸；(2)从培养上清液或宿主细胞中分离出人肿瘤坏死因子α衍生物，和(3)需要时可以将其转变成可药用盐。

本发明的第四个目的是提供被转化从而能表达该TNFα衍生物的工程菌，以及有关的载体和宿主细胞。

本发明的第五个目的是提供含有该新型TNFα衍生物的药物组合物及其应用方法。该组合物含有有效量的本发明的人TNFα衍生物以及药学上可接受的载体。该组合物可以用于制备治疗肿瘤的药剂。发明描述

本发明的发明者根据TNFα结构与功能关系的研究结果(Yam-agishi J et al，Protein Engineering，1990；3：713)，对原型TNFα分子中部进行了改造，利用定点突变技术成功地对TNFα基因的cD-NA分子进行了改造，首次对其编码成熟蛋白分子的第80，90和92位氨基酸的遗传密码进行了置换从而获得了新型的人肿瘤坏死因子α的衍生物。该新型人肿瘤坏死因子α衍生物在氨基酸序列中，80，90和92位中的任何一位或二位或三位存在氨基酸变化，更佳的是80位为丝氨酸和/或90位为组氨酸和/或92位为缬氨酸，最佳地被表达的人肿瘤坏死因子α衍生物在氨基酸序列中80位为丝氨酸、90位为组氨酸和92位为缬氨酸。其中在80，90和92位都发生置换(即80位为丝氨酸、90位为组氨酸和92位为缬氨酸)的衍生物的毒性较野生型低十倍以上，同时仍保留野生型的人TNFα的抗肿瘤作用，该衍生物被称为重组人肿瘤坏死因子α衍生物3a(RecombinantHuman Tumor Necrosis Factorα Derivative 3a，简称rh-TNFαD3a)。对人肿瘤坏死因子α的第80、90和92位进行氨基酸序列替换而获得的工程蛋白，是一种新的治疗肿瘤的可选生物技术产品。

在本文中术语“人肿瘤坏死因子α衍生物”意指对完整的人肿瘤坏死因子α分子或其片段进行氨基酸置换、添加、缺失或化学修饰而得的衍生物。

本发明的具体技术方案如下：

本发明利用人白血病病人的建株细胞HL60细胞作为人肿瘤坏死因子基因的原始来源，利用基因克隆技术获得编码人肿瘤坏死因子蛋白质的基因cDNA，采用了最新的巨引物法双聚合链反应，实现对人肿瘤坏死因子基因cDNA的定点突变(将编码原型TNFα成熟蛋白质分子的第80，90和92位的异亮氨酸，赖氨酸和天冬酰胺的密码子分别用其它氨基酸替换，更佳地分别用丝氨酸，组氨酸和缬氨酸氨基酸密码子替换)，保证了突变区基因编码序列的准确性；并通过基因测序分析确证了突变区的DNA序列的准确无误。

采用优化的大肠杆菌高表达载体，将经过定点突变的人肿瘤坏死因子基因cDNA克隆到表达载体中，使其在大肠杆菌(如K802菌株)中进行表达，并经过反复的筛选与表达分析获得高表达的工程菌。

用我们研制的工程菌进行发酵培养，工程化生产相应的蛋白质产物，采用多种蛋白质分离技术进行蛋白质纯化，最终获得纯度达98％以上的重组蛋白质。并采用特定的配方，进行对产物的保护，使最终制剂中肿瘤坏死因子α衍生物能较长久保存(0～4℃，二年)。

此外，对本发明的新型人TNFα衍生物进行了大量的实验室研究和临床前研究，证实本发明的新型人TNFα衍生物具有较原型的人肿瘤坏死因子更小的毒副作用，因而临床应用更安全，同时可继续保持其对肿瘤细胞的有效杀死作用，尤其是第80，90和92位的异亮氨酸，赖氨酸和天冬酰胺的密码子分别用相应的丝氨酸，组氨酸和缬氨酸氨基酸密码子取代而产生的衍生物毒性作用下降约10倍，同时其生物学活性和对肿瘤细胞的杀伤作用并不受影响；含有本发明的新型人TNFα衍生物的药物组合物已经过严格的质量检验及药效学和一般药理与毒理学检验，证明是较安全和有效的治疗晚期恶性肿瘤的生物制剂。全部研制工艺流程严格按照国家对生物制品安全的要求，并符合国际上对基因工程产品的全部规定。

附图说明

图1.表达载体pBL结构示意图。

图2.人肿瘤坏死因子基因cDNA表达载体与测序载体的构建图。

图3.人肿瘤坏死因子基因cDNA的定点突变PCR原理示意图。

图4.人肿瘤坏死因子基因定点突变基因cDNA的表达载体与测序载体构建图。

图5.人定位突变肿瘤坏死因子基因cDNA全序列测定图。

图6.人肿瘤坏死因子α衍生物D3a突变区半分子DNA序列测定图。

图7.人重组肿瘤坏死因子α衍生物D3a分子结构图(示DNA序列及推测的蛋白质一级结构图)。其中，图中带下划线的密码子和氨基酸为突变密码子及其相应的替换氨基酸。

下面，结合实施例更详细地阐述本发明。实施例实施例1.人HL-60细胞cDNA文库的构建

人HL-60细胞(源自中国人民解放军军事医学科学院)用RP-MI-1640培养基(GIBCO公司)加10％新生牛血清及青霉素和链霉素培养至细胞生长至单层，然后采用佛波醇酯(PMA，Sigma公司)(10微克/毫升)诱导4小时，收集10^6-9细胞用异硫氰酸胍(Sig-ma公司)法抽提细胞总RNA，用Oligo dT柱(Pharmacia公司)法纯化细胞总mRNA，按照cDNA合成试剂盒(Clontech公司)的说明，进行cDNA第一链和第二链的合成，加上EcoRI接头后连接到λgt10载体中，并包装成相应的λ噬菌体(Clontechλ噬菌体包装试剂盒)，建成HL-60细胞的cDNA文库，文库的滴度为4.5×10⁶。实施例2.人TNFα基因cDNA的PCR扩增

人HL-60cDNA基因文库按Clontech公司试剂盒进行扩增并抽提噬菌体DNA，并用超速离心机纯化，用合成的PCR引物

引物A：(5’端引物，33聚)：ACCGAATTCATG-GTTAGATCTTCCTCTCGTACC

引物B：(3’端引物，34聚)：AACGGATCCCT-CATTACAGAGCAATAATACCAAA

对文库DNA按下述条件进行PCR扩增。

PCR扩增反应管的组成：

                               μl/反应管

H₂O                              10.0

文库DNA(200ng/μl)                2.0

4mM dNTPS                         2.0

1M KCl                            1.25

40mM MgCl₂                       1.25

200mM Tris-HCl，pH8.4             1.25

2％吐温20                         1.25

引物A(0.05mg/ml)                  2.5

引物B(0.05mg/ml)                  2.5

Taq酶(1.0U)                       1.0

总计                              25.0

在反应管配制时，均在冰浴中进行，配制过程按先加水，然后加模板DNA，其它反应组份，最后加Taq酶，然后在反应液上滴上1-2滴石蜡油，然后进行PCR反应，PCR扩增的循环参数为：94℃，60s(变性反应)；55℃，60s(退火反应)；72℃，30s(扩增反应)；共进行32循环。

PCR扩增后产物即进行基因克隆，或保存于-20℃。实施例3.细菌的转化

大肠杆菌JM109，DH5或K802(均系商品化菌株，本实验室保存)从LB平板上挑取单个菌落，培养于2ml LB中，于37℃摇床培养过夜，次日以1％的接种量接种于40ml LB中，在同样条件下培养到光密度值为O.D.＝0.6(580nm波长)，置于冰浴中5分，然后于4℃离心5分(5000rpm/min)，收集细菌用冷的氯化钙溶液(100mM，pH6.8)20ml充分悬浮细菌，然后置于冰浴中25分，于4℃离心5分(5000rpm/min)，收集细菌，细菌用4ml氯化钙溶液悬浮，此即为感受态细菌。将质粒DNA0.3～3μg与100μl感受态细菌混匀，冰浴30分，42℃冲击2分，然后加2ml LB在37℃摇床慢摇30分，离心30秒(5000rpm/min)移去过量的培养基，然后将细菌涂布于含有适当的抗生素的LB平板上，于37℃孵箱中培养过夜。实施例4.巨引物法两次PCR反应基因定点突变

对目标蛋白质进行分子的氨基酸序列替换，从技术上讲是具有相当的难度，但是我们采用了一种全新的PCR技术，即巨引物法两次PCR反应，成功地对人TNFα基因cDNA进行定点突变，使其编码成熟蛋白的第80位、第90位和第92位氨基酸的密码子替换为目标氨基酸密码子，从而获得了所需的工程蛋白。巨引物两次PCR扩增定点突变的原理如图3所示，我们用合成的5’端引物(引物A，实施例2)与含突变碱基突变区的一段基因顺序作为新的3’端引物：

引物C：突变区3’端引物，57聚：

AGCAGACAGCAGAACAACGTGGGTCTGGTAAGAAACAGCGATACGAGAGGAGGTGTG；

扩增出TNFα基因5’端的半分子；同时用含突变碱基突变区的同一段基因顺序作为新的5’端引物：

引物D：突变区5’端引物，57聚：

CACACCTCCTCTCGTATCGCTGTTTCTTACCAGACCCACGTTGTTCTGCTGTCTGCT；

用TNFα基因cDNA的3’端引物作为3’端引物(引物B，实施例2)，扩增出TNFα基因的3’端半分子；由于两个半分子在突变区是一致的，在变性条件下，扩增的半分子基因混合后将形成一个具有突变区结构的分子，其不完整部分用PCR扩增，互为模板和引物进行延伸补齐，从而获得含有突变区序列的TNFα基因cDNA。

两次PCR反应的操作条件如下：

第一次PCR扩增反应5’端半分子反应管的组成(AC)：

                                  μl/反应管

H₂O                                 10.0

质粒pBL-TNF DNA(200ng/μl)           2.0

4mM dNTPS                            2.0

1M KCl                               1.25

40mM MgCl₂                          1.25

200mM Tris-HCl，pH8.4                1.25

2％吐温20                            1.25

引物A(0.05mg/ml)                     2.5

引物C(0.05mg/ml)                     2.5

Taq酶(1.0U)                          1.0

总计                                 25.0

第一次PCR扩增反应3’端半分子反应管的组成(BD)与上述的扩增5’端半分子反应管的组成相同，除了用引物B和C替换引物A和C。PCR扩增的循环参数为：94℃，60s(变性反应)；55℃，60s(退火反应)；72℃，30s(扩增反应)；共进行32循环。

第一次PCR反应结束后，扩增产物用1.5％的琼脂糖电泳分离纯化扩增的DNA片段并回收。

用回收的DNA进行第二次PCR反应(即重叠区延伸反应)，反应管组成如下：

                                        μl/反应管

H₂O                                      10.0

第一次PCR产物AC(200ng/μl)                1.0

第一次PCR产物DB(200ng/μl)                1.0

4mM dNTPS                                 2.0

1M KCl                                    1.25

40mM MgCl₂                               1.25

200mM Tris-HCl，pH8.4                     1.25

2％吐温20                                 1.25

引物A(0.05mg/ml)                          2.5

引物B(0.05mg/ml)                          2.5

Taq酶(1.0U)                               1.0

总计                                      25.0

按相同的方式配制反应管然后进行PCR反应，PCR扩增的循环参数为：94℃，60s(变性反应)；55℃，60s(退火反应)；72℃，30s(扩增反应)；共进行32循环。

扩增得到的PCR产物用于基因克隆(实施例6)。实施例5.DNA序列分析

实施例2和实施例4的PCR扩增产物经过EcoR I和BamH I(本研究所用的各种限制性内切酶均为Promega公司产品)双酶切后，克隆到pUC/M13(Promaga公司)相应的酶切位点上，得到pUC/M13/tnf-cDNA和pUC/M13-mtnf-cDNA.按DNA序列分析试剂盒(Promaga公司)的说明在Pamarcia LKB序列分析仪上进行电泳，测序结果如图5和6所示。其编码成熟蛋白的DNA序列和相应的蛋白质序列如图7所示。实施例6.表达载体的构建1.表达载体pBL

表达载体pBL(美国B Ghosh博士赠送，Das A.et al，ProcNatl Acad Sci U.S.A.，1985；82：4070；Whalen W.，Ghosh B.andDas A.Proc Natl Acad Sci U.S.A.1988；85：2494)结构特点为：由λ噬菌体的P_L启动子控制外源基因cDNA的转录，有温度敏感的N4830(cI_ts)基因，含有核糖体结合优化的SD序列，为氨苄青霉素抗性的高表达质粒，其结构如图1所示。

2.人TNFα基因cDNA的克隆：

从pUC/M13-tnf(实施例5)将经过序列分析证明准确的tnf-cDNA用EcoR I与BamH I双酶切后，连接到经同样酶切的表达载体pBL的EcoR I与BamH I之间缺口，转化大肠杆菌JM109，获得的重组质粒经过常规质粒抽提和酶切鉴定，获得插入有人tnfα-cDNA的表达载体pBL-tnf，如图2。

3.人TNFα基因突变cDNA表达载体的构建：

从pUC/M13-mtnf(实施例5)将经过序列分析证明准确定点突变的mtnf-cDNA用EcoRI与BamHI双酶切后，连接到经同样酶切的表达载体pBL的EcoRI与BamHI之间缺口，转化大肠杆菌DH5菌株，获得的重组质粒经过常规质粒抽提和酶切鉴定，获得插入有人tnfαD3a-cDNA的表达质粒pBL-mtnf，如图4。

4.rh-TNFα基因cDNA和rh-TNFαD3a基因cDNA在大肠杆菌中表达：将构建好的表达载体pBL-tnf和pBL-mtnf分别转化大肠杆菌DH5和K802，获得表达菌株DH5-pBL-tnf(原型蛋白)和K802-pBL-mtnf(突变蛋白)。

5.工程菌株的筛选和质粒稳定性分析

在摇瓶培养和发酵条件下，分析K802-pBL-mtnf表达rh-TNFαD3a的条件与水平(实施例7)，获得肯定的高表达细菌即工程菌，即人重组肿瘤坏死因子α衍生物3a工程菌，中国典型培养物保藏中心保藏编号为：CCTCC No：M 95045。

按下法检查rh-TNFαD3a工程菌的遗传稳定性：

(1).工程菌活化接种于不含氨苄青霉素的LB培养基中，30℃培养24小时；取培养物作为样品，经过充分振荡后用LB稀释，涂布于LB平板上，30℃培养24小时，随机挑取50个单菌落点种于LA平板上(含有60μg/ml氨苄青霉素的LB平板)，于30℃培养24小时，计算LA平板上的菌落数。每一样品取三次重复涂布的菌落数。重组质粒的稳定性定为ST，其值为LA平板上的活细菌菌落数与LB平板上活细菌菌落数的比值。

(2).工程菌在含有氨苄青霉素的LB中活化，并扩增进行发酵，从发酵罐中在不同阶段随机取样，同样按上述方法确定：LB平板上培养的随机50个菌落，点种于LA平板后存活的菌落数同前法计数ST。结果表明，在有选择药物氨苄青霉素存在时重组质粒是非常稳定的，但没有药物选择情况下，重组质粒有一定比例的丢失。实施例7.转化细菌重组蛋白表达分析

肿瘤坏死因子αD3a工程菌株表达重组蛋白的初步分析，采用30L发酵罐发酵，菌液经离心后收集细菌，超声波破菌后直接将细菌裂解液用SDS-PAGE上样缓冲液处理后，进行电泳分析，考马氏亮兰染色后，用紫外密度检测分析仪对电泳后所有蛋白质条带进行密度扫描，测得重组蛋白肿瘤坏死因子αD3a约为菌体总蛋白的22％。

人重组肿瘤坏死因子αD3a的产量，通过测定1L发酵菌液中含有重组肿瘤坏死因子αD3a的活性单位数确定。重组蛋白经过复性后，按国际上标准测定方法以L929细胞进行活性测定，测得其活性约为4.8×10¹⁰U/L菌液，蛋白量约为150mg/L，相应的蛋白比活性为3.2×10⁸U/mg蛋白。实施例8.工程菌的发酵培养

1.工程菌活化：挑取一环冷冻保存的rh-TNFαD3a重组大肠杆菌，接种于LB固体培养基上于30℃过夜，然后转入少量(2～5ml)LB液体培养中于30℃中摇床培养。

2.工程菌扩增：将上述处理的工程菌转入(500ml)LB液体培养基中于30℃培养约4-6小时，转种于5L M9培养基中于种子发酵罐中扩增至A600＝1.0，最后移种于30L发酵罐中(M9培养基)。

3.热诱导：当工程菌生长到对数生长期时(OD值600＝0.4～0.6)，加入0.5％(w/v)葡萄糖，0.2％蛋白胨(w/v)，在5～30分钟内将温度升到42℃热诱导5～8小时，然后离心，收集菌体，得菌体100～150g，用缓冲液洗涤三遍后冻存。实施例9.重组蛋白的纯化

1.破菌：反复超声破菌，每次30秒，连续10次。通过测定260nm光吸收情况判断细菌裂解程度。上清液置-20℃保存待用。

2.盐析：先向超声上清中加入固体硫酸铵至35％饱和度，冰浴(0℃)搅拌1小时，10000rpm离心15分钟。上清加硫酸铵至65％饱和度，0℃搅拌1小时后同上离心，弃上清，沉淀用50mmol/L Tris-HCl，pH8.5溶解。

3.部分纯化：用Sephacryl S-200(6.0×150cm)作分离介质对溶解液进行凝胶过滤层析，洗脱液为含100mmol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl，pH8.0，紫外监测仪连续检测(280nm)和SDS-PAGE凝胶电泳测定各层析峰分子量，收集MW为17KDa的rh-TNFαD3a组分，用L929细胞粗测活性。

4.超滤浓缩：上述含rh-TNFαD3a峰用Millipore超滤器浓缩。

5.rh-TNFαD3a的进一步纯化：浓缩液再过Sephacryl S-200，条件同上，收集rh-TNFαD3a组分。

6.DEAE Sephadex A-50(6.0×50cm)：DEAE-SephadexA-50先用双蒸水浸泡过夜，漂洗几次，倾去上层悬浮胶。再用0.5mol/L HCl浸泡1小时，用双蒸水洗涤至中性，再用0.5mol/LNaOH浸泡30分钟后，用双蒸水洗涤至中性。然后装柱，用含50mmol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl，pH8.5充分平衡后，上样。作50～80mmol/L NaCl梯度洗脱，流速0.8ml/min，280nm处紫外连续监测，收集活性峰。

7.脱盐：采用Sephadex G-25(4.0×120cm)脱去缓冲液中盐成分，平衡液和洗脱液均PBS。

8.过滤：0.22μm滤膜过滤除菌后进行原料检定。

9.半成品检定：原料应做强化检查和比活性测定，比活性应不小于2×10⁷IU/mg蛋白。纯度必须≥95％。

940001批rh-TNFαD3a经前述硫酸铵沉淀，两次Sephacryl S-200和DEAE-Sephadex A-50纯化后，其纯度可达到99％以上，rh-TNFαD3a的比活性1.97×10⁸IU/mg，从128克菌体(30L发酵液)得到的rh-TNFαD3a总活性为1.26×10¹¹IU(640.8mg)(表1)。

                        表1 rh-TNFαD3a(940001批)纯化结果制造步骤         体积(ml)  总蛋白       总活性       比活(IU/      得率(％)   纯化倍数(X)

                        (mg)         (IU)          mg)128g菌体         1430      58466.5    3.85×10¹¹   6.58×10⁶       100          /超声上清盐析后溶解         205       27871.5     2.92×10¹¹  1.05×10⁷   76      1.61st Sephacryl      690       3704.8      2.08×10¹¹  5.61×10⁷   54      8.5S-2002nd Sephacryl      700       1028.3      1.45×10¹¹  1.45×10⁸   37      21.4S-200DEAE Sephadex      140       640.8       1.26×10¹¹  1.97×10⁸   33      29.9A-50实施例10.重组蛋白的生物学活性检测

人重组肿瘤坏死因子α衍生物D3a的生物活性检测按经典的L929细胞毒法进行。测定方法如下：

L929细胞用RPMI-1640加有10％的小牛血清培养，用胰酶消化后，细胞计数，以培养基稀释成2.0×10⁶细胞/ml，用96孔细胞板每孔加细胞液0.1ml(2.0×10⁵细胞/孔)；标准品每个剂量各测三复孔，每孔加0.1ml，以后各孔作倍比稀释，至第10孔，第11，12孔作细胞对照，不加标准品；样品组作6复孔，同样按每孔0.1ml样品，以后作倍比稀释，至第10孔，第11，12孔作对照。置于37℃CO₂孵箱中培养22小时，固定染色后测O.D.值(590nm)，测定值取均数，并按稀释度的对数对O.D.值进行回归分析。按定义取50％细胞杀伤时的最高稀释度为1实验室测定单位，确定样品的活性单位数。每次测定重复三次。

测定新型衍生物样品比活性为：1.97×10⁸IU/mg，与原型肿瘤坏死因子α的比活性相近或更好。实施例11.制备含有重组蛋白的药物组合物

经上述方法制备得到的rh-TNFαD3a原料加入保护剂，冻干即得到rh-TNFαD3a制剂(成品)。

注射用rh-TNFαD3a的处方为：

  rh-TNFαD3a              10¹⁰IU

  人血清白蛋白             25g

  注射用甘露醇(20％)       2000ml

  注射用水加至             10000ml

分装成10000支，1ml/支，每支含1×10⁶IU。配制制剂(成品)的具体工艺为：

1.准确吸取rh-TNFαD3a 10¹⁰活性单位(国家标准品标定)，加入检定合格的人血清白蛋白(上海生物制品研究所)25g(即20％浓度的白蛋白125ml)，再加入20％浓度的注射用甘露醇2000ml，加注射用水至10000ml，轻轻震摇混匀；

2.上述混合液经0.22μm滤膜过滤(Millipore公司Minitan^TM)；

3.分装：上述混合液进行分装，每支1ml，即每支含rh-TNFαD3a10⁶国际单位；

4.冻干：真空干燥；

5.抽检：rh-TNFαD3a冻干后进行常规检查及安全性等试验(包括外观、水份、pH测定，热原试验，无菌试验，活性检测，纯度测定，安全试验等)，均符合要求。实施例12.重组蛋白的N末端氨基酸序列测定

经实施例9纯化的重组蛋白进一步用HPLC C18柱纯化，经过两次纯化，最后获得纯度达到99.9％的重组蛋白。该重组蛋白用美国ABI公司470A型微量气相蛋白顺序仪测定了rh-TNFαD3a N-末端15个氨基酸的序列，其顺序为：Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His，与原型rh-TNFα具有一致的N-末端氨基酸序列。实施例13.重组蛋白突变区氨基酸分析

由于原型TNFα在全身性用药时存在严重的毒副作用，所以本发明中采用两次聚合链反应(Double Polymerase Chain Reaction)对人肿瘤坏死因子基因cDNA进行定位突变，将原型成熟蛋白质的第80、90和92位上的氨基酸残基异亮氨酸、赖氨酸和天冬酰胺分别用丝氨酸、组氨酸和缬氨酸取代，获得了突变的rh-TNFαD3a，其在毒性作用上明显比原型TNFα要小。为了确定rh-TNFαD3a在氨基酸水平上替代的准确性[对其基因水平序列分析(见实施例5)已获得肯定结果]，采用蛋白质分子亚克隆的方法，将其突变区部分及其后的蛋白质半分子进行表达，并从序列分析和表达的人肿瘤坏死因子亚克隆蛋白质分子N末端(成熟分子N-末端第78位起)的氨基酸的序列分析两个角度进行验证。

1.人tnf-cDNA突变区分子的亚克隆：用合成的PCR引物

引物E：5’端引物(36聚)：CCAGAATTCATG-CACACCTCCTCTCGTATCGCTGTT；

引物F：3’端引物(33聚)：AACGGATCCCT-CATTACAGAGCAATAATACCAA；

对pBL-mf-tnf进行按实施例2进行PCR扩增，将扩增产物克隆到PUC/M13的EcoR I和BamH I之间，转化大肠杆菌JM109获得阳性转化子pUC/M13-mf-tnf，按实施例5对其进行序列分析结果如图6所示。

2.突变tnf-cDNA亚克隆表达载体的构建：从pUC/M13-mf-tnf上用EcoRI和BamHI双酶切获得亚克隆分子片段，插入pBL的相应酶切位点上，得到表达载体pBL-mf-cDNA(实施例6)，结果如图6。

3.突变tnf-cDNA亚克隆的表达：将pBL-mf-tnf-cDNA转化大肠杆菌K802，获得表达突变tnf-cDNA亚克隆的表达菌，并纯化其表达突变的肿瘤坏死因子片段的产物。(实施例9)

4.突变tnf-cDNA亚克隆蛋白质的N-末端氨基酸序列测定：将含有表达载体pBL-mf-tnf-cDNA的表达菌用与工程菌相同方法进行发酵，并纯化得到相应的蛋白质，用美国ABI公司的470A型微量气相蛋白顺序仪进行N-末端氨基酸序列测定(实施例12)，结果为：Met-His-Thr-Ser-Ser-Arg-Ile-Ala-Val-Ser-Tyr-Gln-Thr-His-Val-Val-Leu-Leu-Ser-Ala，与我们预期的定点突变氨基酸序列一致。实施例14.重组人肿瘤坏死因子α衍生物3a的特性研究

1.rh-TNFαD3a的分子结构及重要理化特性

rh-TNFαD3a分子量为17kd，由157个氨基酸组成，分子内部第69位和第101位的两个半胱氨酸在活性状态下形成二硫键。对rh-TNFαD3a半成品所进行的SDS-PAGE和多项HPLC技术分析，测得rh-TNFαD3a纯度在98％以上，DNA残留量100pg以下，反相HPLC、HPLC肽图谱及Western Blot等分析均符合WHO有关DNA重组药物的要求。

2.rh-TNFαD3a的药效学

rh-TNFαD3a在极低浓度下(5IU/ml)即可对多种人和鼠源性肿瘤细胞表现出显著的细胞毒作用，这些细胞包括小鼠S180肉瘤细胞、小鼠成纤维细胞(L929)、小鼠Ehrlich腹水癌细胞、小鼠Lewis肺癌细胞、人单核细胞性白血病细胞(U937)、人红白血病细胞(K562)及人肝细胞癌细胞(SMMC-7721)等，而对正常组织如人心肌纤维细胞、人血管内皮细胞及小鼠心肌细胞等无此细胞毒作用。另外，rh-TNFαD3a对小鼠体内的移植瘤均有显著的肿瘤坏死作用，并使小鼠得到痊愈。

3.rh-TNFαD3a的药理及毒理研究

rh-TNFαD3a在常规剂量和给药途径下，对清醒动物的神经系统、麻醉动物的心血管系统和呼吸系统均未有显著的影响。

rh-TNFαD3a的急性毒性试验表明，小鼠尾静脉注射5×10⁷IU/Kg以下，未出现任何毒副反应。当注射剂量≥5.79×10⁷IU/Kg时，部分动物发生死亡，当注射剂量≥1.5×10⁸IU/Kg时，动物全部死亡，其半数死亡剂量(LD50)为8.71±2.47×10⁷IU/Kg(相当于2.18mg/Kg)。说明rh-TNFαD3a在5×10⁷IU/Kg剂量下是安全的，此剂量为通常人常用剂量的2500倍。rh-TNFαD3a的毒性比原型的低约11倍。

rh-TNFαD3a的长期毒性试验表明，大鼠肌注高剂量rh-TNFαD3a(3×10⁶IU/Kg/d，此剂量约为人体常用剂量的150倍)，可有体重和食欲下降，血红蛋白和红细胞数下降及白细胞数在用药后期减少，以上变化均在停药后二周即基本恢复正常。其它中等剂量和小剂量者则通常无明显的改变。

4.rh-TNFαD3a的药代动力学

本项研究采用I¹²⁵标记的rh-TNFαD3a进行了其在大鼠体内的药代动力学研究，结果表明rh-TNFαD3a的半衰期与注射剂量有关，大约在8-12分钟间，其组织学分布主要在、肺、脾、肾、肝、胃等组织中。

5.rh-TNFαD3a的稳定性

rh-TNFαD3a的温度稳定性试验表明，冻干品可在-20℃，20℃保存达二年之久，在37℃下可保存一年，但在56℃则失活。

6.工作参考标准品及三批中试产品的检查结果

按国际标准品，中国药品和生物制品检定所标定了rh-TNFαD3a的国家工作参考标准品(628-rh-TNFαD3a1)；三批样品均通过检定合格。

Claims (15)

1.一种人肿瘤坏死因子α衍生物，其特征在于，在人肿瘤坏死因子α衍生物的氨基酸序列中在80，90和92中任何一位或二位或三位有变化。

2.如权利要求1所述的人肿瘤坏死因子α衍生物，其特征在于，在人肿瘤坏死因子α衍生物的氨基酸序列中80位为丝氨酸和/或90位为组氨酸和/或92位为缬氨酸。

3.如权利要求2所述的人肿瘤坏死因子α衍生物，其特征在于，在人肿瘤坏死因子α衍生物的氨基酸序列中80位为丝氨酸、90位为组氨酸和92位为缬氨酸。

4.一种DNA序列，其特征在于，该DNA序列编码如权利要求1～3所述的人肿瘤坏死因子α衍生物。

5.一种表达载体，特征在于，它含有如权利要求4所述的DNA序列。

6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，该表达载体为pBL-m-tnf。

7.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞已用权利要求5所述的表达载体转化。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞是大肠杆菌。

9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞是人重组肿瘤坏死因子α衍生物3a工程菌，中国典型培养物保藏中心保藏编号为：CCTCC No：M 95045。

10.一种制备人肿瘤坏死因子α衍生物的方法，其特征在于，它包括：

(1)在适合宿主细胞生长的条件下培养已被转化并且能够表达人肿瘤坏死因子α衍生物的宿主细胞，其中被表达的人肿瘤坏死因子α衍生物在氨基酸序列中，在80，90和92位中的任何一位或二位或三位存在氨基酸变化；

(2)从培养上清液或宿主细胞中分离出人肿瘤坏死因子α衍生物。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该方法还包括步骤：将分离出的所述的人肿瘤坏死因子α衍生物转变成可药用盐。

12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的人肿瘤坏死因子α衍生物在氨基酸序列中80位为丝氨酸和/或90位为组氨酸和/或92位为缬氨酸。

13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的人肿瘤坏死因子α衍生物在氨基酸序列中80位为丝氨酸、90位为组氨酸和92位为缬氨酸。

14.一种药物组合物，其特征在于，它含有有效量的如权利要求1～3所述的人肿瘤坏死因子α衍生物或其药用盐，以及药学上可接受的载体。

15.如权利要求14所述的药物组合物的用途，其特征在于，该组合物被用于制备治疗肿瘤的药剂。

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