CN1323715C - c－ski基因及其多肽在制备促进组织修复及减轻瘢痕形成药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学领域，具体说是涉及c-ski基因和该基因多肽在制备促进组织修复及减轻瘢痕形成药物中的应用。体外及体内试验证明转染c-ski基因和应用其多肽产物，能使成纤维细胞增殖能力显著增加，凋亡率下降，促进皮肤伤口愈合速度，而且在促愈的同时还具有生长因子不具备的降低皮肤伤口愈合后瘢痕形成的功能。因此，c-ski基因和该基因多肽具有重要的药用价值，以其主要活性成分与多种载体结合或与赋形剂联合，制备成针剂、水剂、乳剂、霜剂、膏剂等制剂形式应用于皮肤等上皮组织和其他组织损伤的治疗，具有既促进损伤愈合又减轻瘢痕形成双重功效的特点。

Description

c-ski基因及其多肽在制备促进组织修复及减轻瘢痕形成药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体地说涉及c-ski基因和该基因表达的多肽用于促进组织修复及减轻瘢痕形成作用的医药的生产，该医药用于动物或人的组织损伤修复的治疗。

技术背景

组织损伤特别是创伤是影响机体健康的一个重要的病征，在我国每年因创伤致伤的人有数百万，创伤者中几乎都具有不同程度的皮肤创伤，更让人担忧的是，专家们预测，进入21世纪以后，创伤人数可能成倍地增长。为此，如何加快创伤后组织修复的同时降低修复后的瘢痕形成，是临床上的一个重要问题，也是提高损伤康复生活质量的需要。虽然，目前人们研究并发现了许多促修复因子，其中最有代表性是生长因子(bFGF、KGF等)，但是，由于这些因子中有的受到创面受体表达缺乏、变异、蛋白酶浓度升高及生长因子比例失衡等因素的影响，难以达到理想的促愈效果^[1]，有的甚至有增加瘢痕形成的副作用，使这些因子的应用受到很大的限制；而且当前对于如何防治过度瘢痕的形成仍缺乏有效手段，而过度的瘢痕形成，不仅影响美观，严重的还可以影响机体的功能，给人们的生活和工作及交往带来不便。因此，如何在促进愈合的同时防止过度瘢痕的形成，目前仍是医学界的难题。

组织损伤愈合的本质是细胞周期和凋亡的平衡问题，促进细胞周期进行、抑制凋亡而使修复细胞增殖是促进伤口愈合的基础，同时过多的炎症反应等其他因素也会影响伤口愈合，导致愈合延迟；而影响瘢痕形成的因素也很多，如胶原的过多分泌、细胞外基质过多沉积等加上进一步的胶原收缩而形成瘢痕。因此，目前寻找一种即影响细胞增殖而促进细胞愈合同时影响胶原的合成分泌的因子是治疗组织尤其上皮损伤修复治疗关键。

C-ski是病毒癌基因v-ski的细胞内的同源物，首先发现于禽类动物^[2]，在不同类型的组织和细胞中分布广泛，从国外关于c-ski的研究工作看，c-ski在促进神经系统发育、造血细胞及成纤维细胞等的增殖和分化，肌肉、肝分化中具有一定作用^[3、4]。目前还没有文献将c-ski与组织损伤修复方面相联系的报道。

本发明内容：

本发明的一个目的是开发c-ski基因所具有的药用价值，将其应用于促进组织损伤修复治疗的药物中，以发挥其促进损伤修复的同时减轻瘢痕形成的双重功效。

本发明的另一个目的是开发c-ski多肽所具有的药用价值，将其应用于促进组织损伤修复治疗的药物中，以发挥其促进损伤修复的同时减轻瘢痕形成的双重功效。

我们对c-ski的的作用进行了一系列相关研究，其中通过c-ski重组质粒的转基因及其多肽应用，我们发现：

首先，在体外细胞试验中，c-ski可以提高修复细胞的增殖能力，而且以剂量依赖的方式刺激成纤维细胞增殖：从细胞周期分析发现，c-ski对细胞周期G1期的进展具有显著的刺激作用；并具有明显降低细胞凋亡作用。通过X射线照射转染c-ski的成纤维细胞我们发现24小时后的凋亡率由对照组的18％下降到8.1％。同时在对成纤维细胞胶原的研究发现，转染c-ski降低胶原蛋白和RNA的合成。这些发现给c-ski的促进创伤修复及减轻瘢痕形成作用的深入研究打下基础。

其次，在动物试验上，c-ski转基因应用于伤口治疗，c-ski重组表达体局部皮下注射后可以加快大鼠皮肤伤口愈合速度，使注射伤口比对照伤口提前约3天愈合；尤为重要的是，应用c-ski的伤口，愈合后的瘢痕面积明显减小，与对照相比瘢痕内的胶原丛数量减少，而且排列有规律，这也为c-ski的促进创伤修复及减轻瘢痕形成作用在形态学上提供了解释。

最后，经基因工程技术生产的c-ski多肽，局部皮下注射于实验动物，所得结果与转染表达型重组体结果基本一致。从而，验证了c-ski多肽也具有促进组织修复的作用。

根据本领域技术人员所共知的：消化道、呼吸道、泌尿生殖道与皮肤都属于上皮结构，其损伤修复过程也相似；软组织及骨、软骨、关节的修复中成纤维细胞具有重要组用，而试验证实了c-ski对成纤维细胞的促增殖作用。因此，可以推测c-ski在各种软组织脏器如肝脏、心脏和肌肉、神经、呼吸道、消化道、泌尿道、骨、软骨、关节等组织修复中也具有促进作用。

c-ski是信号通路的重要中间因子，其作用机理不同于各种生长因子，它的作用不受受体表达缺乏、变异、蛋白酶浓度升高及生长因子比例失衡等因素的影响，因此其对损伤修复有更广泛的促进作用，更重要的是c-ski具有不同于其他生长因子在促进损伤修复的同时还有降低瘢痕形成的作用，这使其具有重要的药用价值。加上其作用可比生长因子更加直接、高效，应用的可操作性强，将会使其在制备新型的促损伤修复药物中具有良好的药用前景。

本发明所指的c-ski基因(多核苷酸)，是由编码具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的多核苷酸组成。本发明的多核苷酸序列包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列。本发明所用c-ski的多核苷酸的序列是人的c-ski多核苷酸序列，是由Nomura，N.等人首先克隆出来的。本发明所用c-ski基因包含的多核苷酸序列全长为2187个碱基，其编码了728个氨基酸。c-ski在不同的物种间和组织内分布极为广泛，小鼠所有的组织中均检测到了c-ski的表达，以神经和肌肉组织表达最为丰富。

本发明所用c-ski基因可以是DNA形式或是RNA形式。c-ski基因可以是SEQ ID NO：1中部分或全部核苷酸序列。如本领域人员所知的，基因的不同组成部分在发挥功能中作用不同，因此基因不须全序列也可以完成全长序列所具有的功能，所以部分核苷酸序列可以具有全部核苷酸序列所具有的实质功能；而且c-ski基因还可以包括SEQ ID NO：1多核苷酸的个别或多个核苷酸的取代变异、缺失变异和插入变异，如本领域人员所知的，一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，可不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明的c-ski基因包括各种与人c-ski基因同源性大于60％的同源物。如本领域人员所知的，同源物可具有相同的功能，而且同源性越大功能越相近。

本发明所用的c-ski基因(多核苷酸)序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸。

本发明所用的人c-ski核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据GeneBank所载的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。这对普通技术人员是显而易见的。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

本发明还涉及具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的c-ski多肽或具有由SEQID NO：1编码的氨基酸序列的c-ski多肽，以及这种多肽的片段，修饰物。

本发明所用的多肽可以是天然多肽或合成多肽，可以是SEQ ID NO：2中部分或全部氨基酸序列，以及其中个别或多个氨基酸的取代、缺失和插入变异的多肽以及同源物，正如在c-ski基因中所述，这些变化并不影响其实质功能，这也是本领域人员所共知的。

术语“多肽产物及修饰物”是指有关SEQ ID NO：2多肽和一种可以是：(1)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；或者(2)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代包含取代基；或者(3)这样一种，其中成熟多肽与另一种化合物融合，所述化合物如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)；或者(4)这样一种，其中附加的氨基酸序列融合进成熟多肽，用来纯化成熟多肽，或者(5)这样一种，其中附加增加其穿透能力的引导多肽，用来帮助其进入细胞，等等，如本领域人员所知的，这些改变并不影响其实质功能。通过本文的阐述，这样的“多肽产物及修饰物”被认为在本领域技术人员的知识范围之内。

本发明所用的多肽的获得，可以通过基因重组技术(转基因)、生物工程或生化方法等方法进行，其中基因重组技术比较常用，可以利用本发明的重组质粒，经基因工程产生宿主细胞(转染)，利用扩增宿主细胞的方法大量生产本发明的多肽。这些方法和其它方法被认为在本领域技术人员的知识范围内。

其中，重组获得多肽的方法，一般来说有以下步骤：

(1)、用本发明的编码人c-ski基因的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)、在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3)、从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

在步骤(2)中，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在步骤(3)中，重组多肽可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括但并不限于：常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明所用蛋白的多肽及修饰物除了重组法产生之外，还可用固相技术通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-PhasePeptideSynthesis，WHFreemanCo.，SanFrancisco；MerrifieldJ.(1963)J.AmChem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(FosterCity，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体，术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and hthans，J Bio Chem.1988，263：3521，)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。

可以用多种方法将合适的DNA序列插入到载体中。一般来说，用本领域已知的方法将DNA序列插入到适当的限制性核酸内切酶位点。这样的方法和其它方法被认为在本领域技术人员的知识范围内。

可以用AMP(抗氨苄青霉素的基因)载体或者其它带有选择性标记的载体从任何所需的基因选择启动子区。两种合适的载体是PCDNA3.0和PCM7。本发明用的PCDNA3.0，其真核生物启动子包括CMV立即早期、早期和完全SV40、增进在哺乳动物细胞表达的Hygromycin resistance gene。对适当的载体与启动子的选择健康在普通的技巧本领域的水平之内。

本发明涉及的包含以上所述构建体的宿主细胞。可以是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，或低等真核细胞，如酵母细胞，或者可以是原核细胞，如细菌细胞。在原核细胞转染中，可以由磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔有效地将构建体引入到宿主细胞中(Davis，L 。，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物学中的基本方法，(1986))；而转染真核细胞可以通过病毒性载体系统和非病毒载体系统。病毒载体可以是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、复合病毒载体、疱疹病毒、牛痘病毒、小病毒或其他病毒。非病毒载体包括裸DNA、脂质体、基因枪、复合基质介导等，这些载体在本领域技术人员的知识范围之内。

本发明是直接应用裸DNA(nakedDNA)，而裸DNA是最简单的非病毒体，与其它载体的基因转移相比，其转染效率较低，但具有许多优点：1副作用少，尤其减少基因突变的潜在危险；2质粒可以携带较长的外源基因，最长可达48kb；3DNA不与宿主细胞染色体整合，表达时间相对较短，因创伤愈合的治疗基因表达不需要长期表达；4质粒构建简单，纯化过关时不具有感染性和免疫原性，不易引起免疫应答反应，可以反复注射；5在分裂和未分裂细胞中均能表达。因此裸DNA在创伤愈合治疗中在即能达到治疗效果的同时又很安全，更适合于临床应用。裸DNA在本范例中应用但是在本发明中适用的载体包括但不限于此。

本发明所用的c-ski基因和多肽，用于人和哺乳动物组织修复和减少修复瘢痕的治疗。而术语″创伤修复”是指机械性或非机械性所致组织损伤的修复，包括但不限于皮肤、消化道、泌尿道、呼吸道、脏器、肌肉、神经等各种软组织及骨、软骨、关节等创伤、缺损的修复。其给药途径，可以局部注射，也可以局部纤维注射等，这些方法在本领域技术人员的知识范围之内。

本发明所述的基因、多肽的应用，采用常规的方法制备药学上适宜制剂型式的外用药组合物，包括与多种载体(即不干扰活性成分的活性的无毒材料)结合或与赋形剂组合来应用，组合物可以是无菌的水溶液或非水溶液、聚合物、营养剂、混悬液或者乳剂等，使其使用量占整个剂量的40-60％。

本发明的基因、多肽的应用，其应用方式可以通过局部、皮下、皮内、肌肉及静脉注射，或喷雾剂、水剂、膏剂等直接散布于伤口或组织上等。这些方法在本领域技术人员的知识范围之内。

本发明的基因、多肽的应用，以有效地促进创伤愈合和减轻瘢痕形成的量给药。本发明的基因、多肽在药物制剂中的浓度40-60％，创伤后即刻应用，每个伤口c-ski基因剂量：50-200ug/天，每周应用一次；每个伤口c-ski多肽剂量：25-250ug/天，每三天应用一次。但是施用于患者的剂量及剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、药物载体及制剂性状、治疗者的身体条件及健康状况、不同创伤组织、还有诊断医生的判断等。

在本发明的毒理试验中，分别应用大量c-ski重组质粒未发现动物有急性毒性反应，同时在成瘤性观察中，治疗侧与对照侧未见差异。而C-ski多肽的毒理试验进一步证明其是无毒物质。

附图说明

下列图是用来说明本发明实施方案，而无意用来限定本发明权利要求所包括的范围。

图1：转c-ski基因动物实验，大鼠的两侧伤口分别为注射c-ski质粒侧和单纯创伤对照侧，从创伤后3、9、15、21天的伤口愈合情况自身对照看来，可以看出注射c-ski质粒侧比单纯创伤对照侧明显加快了伤口愈合。

图2：伤口愈合后10天瘢痕面积情况，大鼠的两侧伤口，右侧(B)为c-ski质粒注射侧，左侧(A)为单纯创伤对照侧，可以看出，c-ski质粒注射侧瘢痕面积明显比单纯创伤对照侧小。

图3：体外转染成纤维细胞胶原分泌试验，RT-PCR的mRNA分析显示：c-ski转染后I型胶原mRNA的转录水平明显低于对照组。图中1为DNA marder；2为pcDNA3.0转染组；3为c-ski转染组。

本说明书和权利要求书中使用的下列术语除非特别说明具有如下的含义：

术语“基因和基因序列”—是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因组或合成的DNA或RNA，它们可以是单链或双链的，代表有义链或反义链。类似地，术语“多肽”、“氨基酸序列”是指寡多肽或蛋白质序列及其片段或部分。当本发明中的“多肽”、“氨基酸序列”涉及一种天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，这种“多肽”或“蛋白质”不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸。

术语中“部分或全部基因(氨基酸)序列”是指SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2序列的部分或全部。

术语“变异”是指一种具有一个或多个核苷酸改变包括氨基酸序列中的氨基酸的缺失、插入或替换。变异可具有“保守性”改变，其中替换后的核苷酸编码的氨基酸具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸。变异也可具有“非保守性”改变，如用色氨酸替换甘氨酸。“缺失”—是指核苷酸序列中一个或多个核苷酸的缺失。“插入”或“添加”—是指在核苷酸序列中的改变导致与天然存在的分子相比，一个或多个核苷酸的增加。“替换”是指由不同的核苷酸替换一个或多个核苷酸。

术语“同源性”—是指序列的相似程度，可以是部分同源或完全同源。“部分同源”是指一种部分序列相同。

术语“修饰物”，当有关SEQ ID NO：1的基因序列或有关SEQ ID NO：2多肽时，指基本上保持与这样多肽具有相同的生物功能或活性，但存在个别或多个氨基酸的甲基化或其他的变化，以及与另一种化合物融合等。

术语“机械性或非机械性”损伤，“机械性”是指通过外力如暴力、枪弹等导致的组织损伤，而“非机械性”是指不是通过外力而有本身缺陷或其他原因如感染、溃疡等导致的织损伤。

术语“组织”指组织胚胎学定义的组织，包括皮肤等各种上皮组织，肌组织、脏器组织等各种软组织和骨、软骨等组织。

具体实施方式

下面举例用于说明本发明的一些具体实施方案，而不是用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验手册(New Youk：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)、所购试剂盒的操作手册的条件进行。

实施例1 pcDNA3.0-c-ski重组质粒的制备、扩增、提取纯化

1、pcDNA3.0-c-ski重组质粒的制备：

pcDNA3.0-c-ski制备：

将c-ski的cDNA(参考文献，N Nomura，et al.Nucleic Acids Research，1989，17(14)：5489-5500)通过EcoR I、Xho I内切酶处理克隆入载体FLAG-pcDNA3.0(参考文献，Shingo Akiyoshi，et al.J Biol Chem，1999，274(49)，35269-35277)，制备出pcDNA3.0-c-ski重组质粒。

2、感受态细菌的制备：

从-70℃冰箱内取出冻存的大肠杆菌菌株DH5α，握在手中解冻，用接种环将细菌接种到普通LB固体培养基，置37℃培养箱内培养过夜。次日挑取单菌落接种到含5ml普通LB液体培养基的试管中，37℃摇床150rpm振荡培养过夜。取1ml过夜菌加入含100ml普通LB液体培养基的500ml烧瓶中，37℃振荡培养箱剧烈振荡(200rpm)培养2-3小时，至OD₆₀₀在0.3-0.4。将菌液加入到50ml预冷的离心管中，冰浴10min，于4℃4000rpm离心10min，弃上清，加入10ml冰预冷的0.1M CaCl₂重悬沉淀，冰浴30min。如上离心，弃上清，加入冰预冷的0.1M CaCl₂ 2ml重悬沉淀。菌液可直接用于转化，或分装成200μl/管，加入70％体积的80％甘油，保存于-70℃低温冰箱备用。

3、感受态细菌的转化：

取上述制备的感受态DH5α200μl，室温下加入质粒DNA 100ng，对照感受态菌液内不加质粒DNA，冰浴30min，42℃水浴热休克90秒，37℃水浴5min，迅速冰浴1-2分钟，然后加入37℃预热的普通LB培养基1ml，37℃摇床温和振荡(120rpm)复苏1小时，取100μl涂于LB固体培养基中，培养基分为含Amp(100μg/μl)和不含Amp两种，37℃培养过夜，以长出单菌落为转化成功。

4、大量扩增：

先小量扩增，挑出已转化成功的质粒阳性克隆，接种于5ml含Amp的LB的液体培养基中，150rpm，37℃培养过夜。然后大量扩增，取上菌液1ml加入500ml含Amp的LB中，150rpm，37℃培养过夜(16小时)。(可保存一些含质粒的菌液)

5、先小剂量提取并验证扩增是否成功。按照质粒小量抽提试剂盒说明进行(E.Z.N.A plasmid minprep kit，omega)。

6、大量提取：

按照质粒大量抽提试剂盒说明进行(E.Z.N.A plasmid maxiprep kit，omega)：将阳性克隆在500ml含Amp的LB的培养基扩增后，菌液离心，室温，4000g，10min，倾倒培养基，加入7.0ml的solution1/Rnase A，旋涡混匀，将细胞悬浮液转入30ml的离心管中，加入7.0ml solution 2，轻柔颠倒混匀7-10次，获得清亮的裂解液，室温敷育10min，加入10ml的solution 3，颠倒轻柔混匀数次，直到白色絮状沉淀形成。离心，室温，12,000g，10min，小心将上清吸出，加到一个干净的HiBand DNA过滤柱中(下面接一个50ml的离心管)，离心，室温，4,000g，5min，弃滤过液，加入5ml的buffer HB到过滤柱中，离心同上，弃滤过液，加入10ml的DNA Wash Buffer到过滤柱中，离心，室温，4,000g，5min，弃滤过液。加入10ml的纯酒精，离心，室温，4,000g，5min，弃滤过液，再次离心同上，干燥柱子。将过滤柱在65℃的真空烤炉中烘干后，将柱子放入一个干净的50ml的离心管，加入1.5ml的无菌TE，离心，室温，3,500g，5min，可以重复洗脱一次，或者用第一次的洗脱液进行第二次洗脱，以获得高浓度。所得质粒-70℃保存。

7、鉴定：取出5μl电泳，看有无质粒条带。

酶切鉴定体系如下：

质粒DNA       5μl

EcoR I(Hind III)    2μl

Xho I         2μl

10×H buffer  2μl

H₂O          9μl

              20μl

              ↓

       37℃， 1小时

              ↓

       1％琼脂糖电泳

              ↓

     紫外下观察并拍照

结果见图3：c-ski基因中具有EcoR I酶切位点而无Hind III和Xho I酶切位点，因此c-ski质粒用EcoR I和Xho I酶切成三条带：一条为载体质粒pcDNA3.0约5Kb，另两条为c-ski被酶切成两大小约为1.5Kb，经Hind III和Xho I酶切两条带：一条为载体质粒pcDNA3.0约5Kb，另一条为c-ski约大小约为3Kb。

8、定量：在紫外分光光度计下定量。

取样品1∶100稀释(DW)，后在紫外分光光度计下检测，要注意OD260/280值的稳定。

实施例2重组质粒应用于促进皮肤伤口愈合、降低愈合后瘢痕形成

1、模型制备

动物：Wistar大白鼠，健康状况良好，雌雄不拘，体重200±20。

创伤：大鼠经3％戊巴比妥钠腹腔麻醉(1ml/Kg)后，以剪毛剪剪去臀部的毛，碘伏、酒精消毒后，以记号笔在大鼠双侧臀部对应部位各画直径为2.0cm的圆，沿画线以眼科剪制成一个圆形切割伤，深达皮下组织全层，但勿伤及皮下筋膜层，不缝合，单笼饲养。避免感染，如发现伤口感染则剔除。

2、质粒注射：

采取大鼠自身对照，大鼠自身两个伤口的一侧注射c-ski质粒另一侧为空白创伤对照(注入空pcDNA3.0质粒作对照)。

注射剂量为100ug/每个伤口，而质粒溶于生理盐水中，浓度100ug/200ul。每次每个伤口注射200ul(即100ug质粒，当对照为pcDNA3.0时，其注射剂量与c-ski质粒剂量相同)。

注射方式为伤口周围的上、下、左、右四个点，距伤口边缘约5mm的皮下注射，每点注射50ul。

注射时间为创伤后立即注射。每周注射一次。

3、动物观察：

于伤后每三天测一次愈合面积。愈合后10天检测瘢痕面积并取标本用于瘢痕的观察(免疫组化检测瘢痕的构成)。

4、结果：见图1、2

实施例3  c-ski多肽制备、扩增、提取纯化

1、c-ski重组质粒的制备及鉴定：

同实施例1

2、c-ski重组体的扩增、提取纯化。

扩增：重组表达质粒pcDNA3.0-c-ski转化大肠杆菌DH5α，并扩增(同c-ski质粒的转化、扩增)。

提取：扩增的菌液离心后悬浮于PBS中，超声裂菌、离心，弃上清。向沉淀中加入2mol/L尿素，悬浮沉淀，离心弃去上清，以除去杂蛋白。再用8mol/L尿素溶解沉淀的蛋白，用变性稀释液4倍，过滤除去不溶组织后，在Ni-NTA-agarose柱上亲和层析。用6mol/L盐酸胍去杂蛋白，最后用250mmol/L尿素洗脱，收集洗脱的蛋白，透析后冻干保存。

也可根据见文献(Sadamitsu Asoh.，Et al.Neuroscience.2002，99(26)：17107-17112和Daiya Ozaki，et al.Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，2004，313(3)：522-527)通过SDS/PAGE电泳来纯化蛋白。

实施例4

c-ski多肽应用于加速皮肤伤口愈合、降低愈合后瘢痕形成

动物模型及注射分组、观察同实例2。

注射剂量为50ug每个伤口，溶于生理盐水中(25ug/50ul)，注射100ul每个伤口。注射方式同实例2。

试验结果与使用c-ski重组质粒相似，促进伤口愈合同时减轻瘢痕形成。

实施例5  c-ski多肽的毒理试验

1、急性毒性试验：包括口服、静脉注射和最大极限量给药试验；

2、Ames试验；

3、小鼠骨髓细胞微核试验；

4、鼠精子畸性试验；

5、小鼠睾丸染色体畸变试验；

6、慢性致死试验；

7、亚慢性毒性(90天)喂养试验；

8、传统致畸试验；

试验结果表明，c-ski多肽属无毒物质。急性毒性试验中，Wister大鼠皮下注本品剂量分别为10mg/只，是正常注射50倍，仍未见急性中毒反应；而在长期毒性试验中，剂量高达20mg/只，经四周试验未出现中毒反应；在生殖试验中，以常用100ug/只动物喂养小鼠，经三次传代，证明c-ski多肽对小鼠受孕、妊娠、分娩、哺乳及子鼠发育均无影响。

本发明提供c-ski基因和该基因多肽产物在制备促进损伤修复及减轻瘢痕形成药物中的应用。通过构建该基因重组质粒，体外试验可以促进成纤维细胞增殖，降低细胞凋亡率；c-ski基因重组质粒或其多肽直接注射入皮下，可以促进伤口愈合，减少皮肤伤口愈合后的瘢痕，因此，c-ski基因及多肽在组织损伤修复治疗中具有很好的药物应用前景。

1 SEQ ID NO：1

(1)序列特征

a长度：2187

b类型：核酸

c链性：单链

d拓扑结构：线性

(2)分子类型：mRNA

(3)基因序列号及作者：a序列号：X15218.1

                     b作者：Nomura，N.et al.

(4)序列描述：SEQ ID NO：1

0001 atggaggcgg cggcaggcgg ccgcggctgt ttccagccgc acccggggct gcagaagacg

0061 ctggagcagt tccacctgag ctccatgagc tcgctgggcg gcccggccgc tttctcggcg

0121 cgctgggcgc aggaggccta caagaaggag agcgccaagg aggcgggcgc ggccgcggtg

0181 ccggcgccgg tgcccgcagc caccgagccg ccgcccgtgc tgcacctgcc cgccatccag

0241 ccgccgccgc ccgtgctgcc cgggcccttc ttcatgccgt ccgaccgctc caccgagcgc

0301 tgcgagaccg tactggaagg cgagaccatc tcgtgcttcg tggtgggagg cgagaagcgc

0361 ctgtgtctgc cgcagattct caactcggtg ctgcgcgact tctcgctgca gcagatcaac

0421 gcggtgtgcg acgagctcca catctactgc tcgcgctgca cggccgacca gctggagatc

0481 ctcaaagtca tgggcatcct gcccttctcg gcgccctcgt gcgggctcat caccaagacg

0541 gacgccgagc gcctgtgcaa cgcgctgctc tacggcggcg cctacccgcc gccctgcaag

0601 aaggagctgg ccgccagcct ggcgctgggc ctggagctca gcgagcgcag cgtccgcgtg

0661 taccacgagt gcttcggcaa gtgtaagggg ctgctggtgc ccgagctcta cagcagcccg

0721 agcgccgcct gcatccagtg cctggactgc cgcctcatgt acccgccgca caagttcgtg

0781 gtgcactcgc acaaggccct ggagaaccgg acctgccact ggggcttcga ctcggccaac

0841 tggcgggcct acatcctgct gagccaggat tacacgggca aggaggagca ggcgcgcctc

0901 ggccgctgcc tggacgacgt gaaggagaaa ttcgactatg gcaacaagta caagcggcgg

0961 gtgccccggg tctcctctga gcctccggcc tccataagac ccaaaacaga tgacacctct

1021 tcccagtccc ccgcgccttc cgaaaaggac aagccgtcca gctggctgcg gaccttggcc

1081 ggctcttcca ataagagcct gggctgtgtt caccctcgcc agcgcctctc tgctttccga

1141 ccctggtccc ccgcagtgtc agcgagtgag aaagagctct ccccacacct cccggccctc

1201 atccgagaca gcttctactc ctacaagagc tttgagacag ccgtggcgcc caacgtggcc

1261 ctcgcaccgc cggcccagca gaaggttgtg agcagccctc cgtgtgccgc cgccgtctcc

1321 cgggcccccg agcctctcgc cacttgcacc cagcctcgga agcggaagct gactgtggac

1381 accccaggag ccccagagac gctggcgccc gtggctgccc cagaggagga caaggactcg

1441 gaggcggagg tggaagttga aagcagggag gaattcacct cctccttgtc ctcgctctct

1501 tccccgtcct ttacctcatc cagctccgcc aaggacctgg gctccccggg tgcgcgtgcc

1561 ctgccctcgg ccgtccctga tgctgcggcc cctgccgacg cccccagtgg gctggaggcg

1621 gagctggagc acctgcggca ggcactggag ggcggcctgg acaccaagga agccaaagag

1681 aagttcctgc atgaggtggt caagatgcgc gtgaagcagg aggagaagct cagcgcagcc

1741 ctgcaggcca agcgcagcct ccaccaggag ctggagttcc tacgcgtggc caagaaggag

1801 aagctgcggg aggccacgga ggccaagcgt aacctgcgga aggagatcga gcgtctccgc

1861 gccgagaacg agaagaagat gaaagaggcc aacgagtcac ggctgcgcct gaagcgggag

1921 ctggagcagg cgcggcaggc ccgggtgtgc gacaagggct gcgaggcggg ccgcctgcgc

1981 gccaagtact cggcccagat cgaagacctg caggtgaagc tgcagcacgc ggaggcggac

2041 cgggagcagc tgcgggccga cctgctgcgg gagcgcgagg cccgggagca cctggagaag

2101 gtggtgaagg agctgcagga acagctgtgg ccgcgggccc gccccgaggc tgcgggcagc

2161 gagggcgctg cggagctgga gccgtag

以上仅供参考，以genbank所载序列为准。

2 SEQ ID NO：2

(1)序列特征

a长度：728

b类型：氨基酸

c拓扑结构：线性

(2)分子类型：多肽

(3)基因序列号及作者：a序列号：GI：36483

                     b作者：Nomura，N.et al.

(4)序列描述：SEQ ID NO：2

MEAAAGGRGCFQPHPGLQKTLEQFHLSSMSSLGGPAAFSARWAQEAYKKESAKEAGAAAV

PAPVPAATEPPPVLHLPAIQPPPPVLPGPFFMPSDRSTERCETVLEGETISCFVVGGEKRLCLP

QILNSVLRDFSLQQINAVCDELHIYCSRCTADQLEILKVMGILPFSAPSCGLITKTDAERLCN

ALLYGGAYPPPCKKELAASLALGLELSERSVRVYHECFGKCKGLLVPELYSSPSAACIQCLD

CRLMYPPHKFVVHSHKALENRTCHWGFDSANWRAYILLSQDYTGKEEQARLGRCLDDVK

EKFDYGNKYKRRVPRVSSEPPASIRPKTDDTSSQSPAPSEKDKPSSWLRTLAGSSNKSLGCV

HPRQRLSAFRPWSPAVSASEKELSPHLPALIRDSFYSYKSFETAVAPNVALAPPAQQKVVSSPP

CAAAVSRAPEPLATCTQPRKRKLTVDTPGAPETLAPVAAPEEDKDSEAEVEVESREEFTSSLS

SLSSPSFTSSSSAKDLGSPGARALPSAVPDAAAPADAPSGLEAELEHLRQALEGGLDTKEAK

EKFLHEVVKMRVKQEEKLSAALQAKRSLHQELEFLRVAKKEKLREATEAKRNLRKEIERLR

AENEKKMKEANESRLRLKRELEQARQARVCDKGCEAGRLRAKYSAQIEDLQVKLQHAEA

DREQLRADLLREREAREHLEKVVKELQEQLWPRARPEAAGSEGAAELEP

以上仅供参考，以genbank所载序列为准。

参考文献

1、utroneo KR.Gene therapy for tissue regeneration.J Cell Biochem 2003；88(2)：418-25

2、Li Y，Turck CM，Teumer JK，et al.Unique sequence，ski，in Sloan-Ketteringavian retroviruses with properties of a new cell-deriVed oncogene.J Virol 1986；57(3)：1065-72

3、Lyons GE，Micales BK，Herr MJ，et al.Protooncogene c-ski is expressed inboth proliferating and postmitotic neuronal populations.Dev Dyn1994；201(4)：354-65

4、Soeta C，Suzuki M，Suzuki S，et al.Possible role for the c-ski gene in theproliferation of myogenic cells in regenerating skeletal muscles of rats.Dev GrowthDiffer 2001；43(2)：155-64。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但等同或等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围内。

Claims (3)

1、一种已知基因c-ski在制备促进皮肤组织损伤修复和/或减轻瘢痕形成药物中的应用，其中c-ski基因具有SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列。

2、一种已知基因c-ski表达的多肽在制备促进皮肤组织损伤修复和/或减轻瘢痕形成药物中的应用，其中c-ski多肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3、权利要求1中的基因c-ski和权利要求2中的基因c-ski表达的多肽在制备促进皮肤组织损伤修复和/或减轻瘢痕形成药物中的应用。

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