CN101818171B - 人ski基因真核表达载体、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人ski基因真核表达载体、制备方法及其应用。该人ski基因真核表达载体包含载体pUC118片段和人ski基因片段。本发明还涉及该人ski基因真核表达载体的制备方法及其在制备促进组织修复、伤口愈合及抑制瘢痕形成的制剂中的应用。制备成基因注射液或可涂布在伤口处的制剂或利用pUC118-Ski基因注射液进行皮肤注射或与赋形剂联合制备成乳剂、霜剂、膏剂等制剂形式涂抹于损伤处，可以长期、稳定的表达出具有生物活性的Ski，具有促进组织修复、伤口愈合的同时抑制瘢痕形成的双重作用。

Description

人ski基因真核表达载体、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种真核表达载体，尤其涉及人ski基因真核表达载体、制备方法及应用。

背景技术

组织修复、创伤愈合是由于外伤或其他因素造成皮肤等组织缺损后，局部组织通过再生、重建进行修补恢复的一系列病理生理过程。目前众多的促修复和愈合措施中，生长因子的应用最有代表性，如TGF-β，bFGF等，但是其强烈的有丝分裂原活性在促进伤口愈合同时可带来胶原分泌旺盛，造成瘢痕过度增生和愈合质量的下降，限制了其在临床的应用；而在目前的瘢痕治疗中，主要是针对于已形成的瘢痕的治疗，如手术、加压、放射、类固醇注射、干扰素、硅酮及激光等方法(周元国.加强创伤耐受性差异的分子基础研究，促进分子创伤学的发展.创伤外科杂志2002：4(5)：257-259)，这些方法大都治疗效果不好，有的副作用很大甚至影响修复和愈合。因此，寻求新的促修复分子，既能正向加速修复细胞增殖、促进愈合，又能降低胶原合成、负向调节瘢痕的形成，使两个矛盾的过程协调统一，对促进创伤愈合尤其是放创复合伤、大面积创伤、烧伤等难愈伤口愈合和具有纤维化倾向的组织修复，降低瘢痕形成，改善修复质量有着十分重要的意义。

ski是一种鸟类癌基因v-ski的细胞内同源物，首先发现于禽类动物(Li Y，Turck CM，Teumer JK，et al.J Virol.1986；57(3)：1065-72)，在不同类型的组织和细胞中分布广泛。ski参与促进神经系统发育、造血细胞的增殖和分化、肌肉、肝分化及再生等作用(Mizuide M，Hara T，Furuya T，et al.J Biol Chem.2003；278(1)：531-6)。过去几年，我们在国际上首先发现ski基因是一种新的创伤修复相关基因(Liu X，Zhang E，Li P，et al.Wound Repair Regen.2006；14(2)：163-172)，具有促愈合和减轻瘢痕形成的双重作用，ski基因的这一应用前途已公开于公开日为2005年01月12日的第ZL 200410022266.2号专利中。但是此质粒结构较为复杂并且没有用于人体实验的报道，因此其是否适用于临床基因治疗还存在着很多未知的问题。为了便于临床实验和研发基因治疗药物，需要构建使用方便、安全的Ski真核表达质粒。

pUC118结构简单，除含有1个氨苄青霉素抗性基因(Ampr)外，还有1个插入失活的lacZ基因、自身复制起始位点和多克隆位点，具有临床使用方便、应用安全的特点，国外已有成功将其应用与临床的报道。因此，我们以pUC118质粒为载体，酶切连接目的基因、CMV启动子等构建pUC118-Ski真核表达质粒。

发明内容

本发明的目的在于构建一种能在皮肤组织和其它组织中表达的人ski基因表达载体，其可以作为一种基因药物，直接进行伤口周围局部注射(或静脉注射)、涂敷，使其在损伤组织长期、稳定、特异表达，应用于皮肤、食道、肠道等上皮组织和其他组织、器官损伤，尤其是放创复合伤、大面积创伤、烧伤、慢性溃疡和褥疮等难愈伤口以及各种疤痕的预防和治疗，以取得较传统药物更好的疗效。

本发明所述的人ski基因真核表达载体，其包含载体pUC118片段和人ski基因片段。

其中，所述人ski基因片段为SEQ ID NO：3序列，由SEQ ID NO：1-2所示核苷酸的引物从人皮肤原代成纤维细胞(来自临床包皮过长患者，经患者同意)总RNA中扩增获得。

本发明所述的人ski真核表达载体，具有CMV启动子和BGH终止子。

本发明还提供所述的人ski基因真核表达载体的制备方法，其主要包含步骤：

1)通过PCR从人包皮培养原代成纤维细胞总RNA中获得人ski基因片段；

2)步骤1)获得的人ski基因序列经HindIII和XhoI双酶切后插入pUC118质粒中获得载体pUC118片段；

其中步骤1)中应用的扩增引物为SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸；步骤2)还包含在pUC118质粒上插入CMV启动子和BGH终止子。

本发明所述的人ski基因真核表达载体可以应用于制备促进组织修复、伤口愈合及抑制瘢痕形成的制剂。

本发明还提供促进组织修复、伤口愈合及抑制瘢痕形成的制剂，其包含上述的人ski基因真核表达载体。

所述制剂为注射液、乳剂、霜剂、膏剂或喷雾剂。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1：真核表达质粒pUC118图谱

Amp^r-氨苄青霉素抗性基因；kb-千碱基对；EcoR I、Xal I、和Nar I-限制性内切酶；flori-线状噬菌体复制起始区；pBR322 ori-大肠杆菌质粒克隆载体复制启始区；pGEX primer-谷胱甘肽转移酶(GST)基因融合系统引物；内切酶EcoR I和Nar I之间的片段为pUC118的多克隆位点，目的DNA连接在插入CMV启动子和BGH终止子之间的内切酶HindIII和Xho I之间。

图2：ski基因被克隆到真核表达质粒pUC118上，经HindIII单酶切和HindIII+EcoR I双酶切鉴定图谱。

图3：pUC118-Ski转基因治疗，观察大鼠皮肤伤口愈合情况。

转pUC118-Ski基因动物实验，大鼠的两侧伤口分别为注射pUC118-Ski质粒侧和单纯创伤对照侧，从创伤后3、6、12、15天的伤口愈合情况自身对照看来，可以看出注射pUC118-Ski质粒侧伤口愈合比单纯创伤对照侧明显加快。

图4：伤口愈合后30，45天瘢痕面积情况，大鼠的两侧伤口，左侧为单纯创伤对照侧，右侧为pUC118-Ski质粒注射侧，可以看出，pUC118-Ski质粒注射侧瘢痕面积明显比单纯创伤对照侧小。

具体实施方式

主要试剂

1.大肠杆菌DH5α(本实验中心保存)

2.质粒：pcDNA3.0和pUC118(大连宝生物工程有限公司)

3.RNA提取试剂盒：TRIzol RNA提取试剂盒(GIBCO BRL公司)

4.质粒抽提试剂盒：小量抽提(GFXTM Micro Plasmid Prep Kit，Pharmacia)大量抽提(E.Z.N.A.Plasmid Maxiprep Kit，Omega)

5.DNA Marker：DL 15000(大连宝生物有限公司)

6.Hind III、EcoR I、NruI、PvuII和Xho I限制性内切酶(大连宝生物生物工程有限公司)

7.电泳级琼脂糖(BIOWEST，上海YITO公司分装)

8.转染试剂：lipofectamine2000(invitrogen，美国)

主要试剂配制

1.LB培养基1000ml：10g蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，溶解后加水至1L，pH调至7.0，高压灭菌后，4℃保存。

2.含Amp的LB固体培养基：每升LB培养基加15g琼脂，高压灭菌。冷却至55℃后，加入Amp至浓度为100μg/ml，倾至培养基。

3.0.1M CaCl₂ 500ml：称取无水CaCl₂ 11.1g，溶于400ml的双蒸水中，定容至500ml，过滤除菌后，室温保存。

4.TE缓冲液(pH8.0)：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，调pH8.0。

5.10×TBE电泳缓冲液：Tris碱108g，硼酸55g，0.5mol/L EDTA 40ml，调pH8.0，加水至1L。

实施例1 pUC118-Ski重组质粒的构建、扩增、提取纯化

1、pUC118-Ski重组质粒的构建：

用NruI和PvuII酶切pcDNA3.0真核表达载体，回收含CMV启动子(真核表达启动子)和BGH(牛生长激素)终止子的片段插入到pUC118载体上。

提取人成纤维细胞中总RNA(按照TRIzol RNA提取试剂盒进行，GIBCO BRL公司)。

采用RT-PCR方法扩增出人ski基因(SEQ ID NO：3所示核苷酸序列及SEQ IDNO：4所示氨基酸序列)，根据Genebank上已发表的人ski基因序列进行引物设计，并在基因上下游分别插入酶切位点HindIII和Xho I。

引物序列为：

上游引物：5-AAGCTTCATGGAGGCGGCGG-3(SEQ ID NO：1)

下游引物：5-TCAAATCCGAAGTGCTCGAG-3(SEQ ID NO：2)

人ski基因序列经HindIII和XhoI双酶切插入前期构建的、带有CMV启动子和BGH终止子片段的pUC118中，构建出pUC118-Ski真核表达质粒。

2、感受态细菌的制备：

从-70℃冰箱内取出冻存的大肠杆菌菌株DH5α，解冻，用接种环将细菌接种到普通LB固体培养基，置37℃培养箱内培养过夜。次日挑取单菌落接种到含5ml普通LB液体培养基的试管中，37℃摇床150rpm振荡培养过夜。取1ml过夜菌加入含100ml普通LB液体培养基的500ml烧瓶中，37℃振荡培养箱剧烈振荡(200rpm)培养2-3小时，至OD₆₀₀(optical density)在0.3-0.4。将菌液加入到50ml预冷的离心管中，冰浴10分钟，于4℃4000rpm离心10分钟，弃上清，加入10ml冰预冷的0.1M CaCl₂重悬沉淀，冰浴30分钟。如上离心，弃上清，加入冰预冷的0.1M CaCl₂ 2ml重悬沉淀。菌液可直接用于转化，或分装成200μl/管，加入70％体积的80％甘油，保存于-70℃低温冰箱备用。

3、感受态细菌的转化：

取上述制备的感受态DH5α200μl，室温下加入质粒DNA 100ng，对照感受态菌液内不加质粒DNA，冰浴30分钟，42℃水浴热休克90秒，37℃水浴5分钟，迅速冰浴1-2分钟，然后加入37℃预热的普通LB培养基1ml，37℃摇床温和振荡(120rpm)复苏1小时，取100μl涂于LB固体培养基中，培养基分为含Amp(100μg/μl)和不含Amp两种，37℃培养过夜，以长出单菌落为转化成功。

4、大量扩增：

先小量扩增，挑出已转化成功的质粒阳性克隆，接种于5ml含Amp的LB的液体培养基中，150rpm，37℃培养过夜。然后大量扩增，取上菌液1ml加入500ml含Amp的LB中，150rpm，37℃培养过夜(16小时)。(可保存一些含质粒的菌液)

5、先小剂量提取并验证扩增是否成功。按照质粒小量抽提试剂盒说明进行(E.Z.N.A plasmid minprep kit，omega)。

6、大量提取：

按照质粒大量抽提试剂盒(E.Z.N.Aplasmid maxiprep kit，omega)说明进行：将阳性克隆在500ml含Amp的LB的培养基扩增后，菌液离心，室温，4000g(重力加速度)，10分钟，倾倒培养基，加入7.0ml solutionl/Rnase A的溶液，旋涡混匀，将细胞悬浮液转入30ml的离心管中，加入7.0ml solution 2，轻柔颠倒混匀7-10次，获得清亮的裂解液，室温敷育10分钟，加入10ml的solution3，颠倒轻柔混匀数次，直到白色絮状沉淀形成。离心，室温，12,000g，10分钟，小心将上清吸出，加到一个干净的HiBand DNA过滤柱中(下面接一个50ml的离心管)，离心，室温，4,000g，5分钟，弃滤过液，加入5ml的buffer HB到过滤柱中，离心同上，弃滤过液，加入10ml的DNA Wash Buffer到过滤柱中，离心，室温，4,000g，5分钟，弃滤过液。加入10ml的纯酒精，离心，室温，4,000g，5分钟，弃滤过液，再次离心同上，干燥柱子。将过滤柱在65℃的真空烤炉中烘干后，将柱子放入一个干净的50ml的离心管，加入1.5ml的无菌TE，离心，室温，3,500g，5分钟，可以重复洗脱一次，或者用第一次的洗脱液进行第二次洗脱，以获得高浓度。所得质粒-70℃保存。

7、鉴定：取出5μl，1％的琼脂糖电泳鉴定酶切条带。

酶切鉴定体系如下：

质粒DNA                   5μl

Hind III(EcoR I)          2μl

10×H缓冲液               2μl

H₂O                       9μl

                          20μl

结果请见图2：ski基因中具有EcoR I酶切位点而无Hind III酶切位点，因此pUC118-Ski质粒用Hind III酶切成1条带，为载体质粒pUC118和目的基因ski约8Kb(泳道4)，经Hind III和EcoR I酶切成两条带：ski基因被酶切成两条片段，一段与载体质粒pUC118连在一起大小约4.2Kb，另一段大小约为1.8Kb(泳道3)。泳道2为pUC118质粒对照，泳道1为分子量marker。

8、定量：在紫外分光光度计下定量。

取样品1∶100稀释，后在紫外分光光度计下检测，要注意OD260/280值的稳定。

实施例2pUC118-Ski质粒应用于促进皮肤伤口愈合和降低愈合后瘢痕的形成

1.模型制备

动物：Wister大白鼠，健康状况良好，雌雄不拘，体重200±20g。

创伤：大鼠经3％戊巴比妥钠腹腔注射(1ml/mg)后，以剪毛剪剪去臀部的毛，碘伏，酒精消毒后，以记号笔在大鼠双侧臀部对应部位各画直径为2.0cm的圆，沿划线以眼科剪制成一圆形切割伤，深达皮下组织全层，但勿伤及皮下筋膜层，不缝合，单笼饲养，避免感染，如发现伤口感染应剔除。

2.质粒注射

采用大鼠自身对照，大鼠自身两个伤口一侧注射pUC118-Ski质粒，另一侧为空白创伤对照(注入空pUC118质粒作对照)。注射剂量为100μg/每个伤口，质粒溶于生理盐水中。注射方式为伤口周围的上、下、左、右四个点，距伤口边缘约为5mm的皮下注射，每点注射25μg。注射时间为创伤后立即注射，每周注射一次。也可以采用将pUC118-Ski质粒与赋形剂联合制备成乳剂、霜剂、膏剂等制剂形式涂抹于伤口处。

3.动物观察

于伤后每3天测一次愈合面积，愈合后10天检测瘢痕面积并取标本用于瘢痕的观察(免疫组化检测瘢痕的构成)。

结果请参见图3A-3D、图4A-4B：pUC118-Ski重组表达体局部皮下注射后可以加快大鼠皮肤伤口愈合速度，使注射伤口比对照伤口提前约3天愈合；尤为重要的是，应用pUC118-Ski的伤口，愈合后的瘢痕面积明显减小，与对照相比瘢痕内的胶原层数量减少，而且排列有规律。采用兔耳增生性瘢痕模型转pUC118-Ski基因治疗也验证了此结果，转pUC118-Ski基因后创面愈合加速，总愈合时间比对照侧缩短了15％；也使愈后兔耳增生性瘢痕减小，表现为瘢痕高度和体积分别较对照下降，差异非常显著。

结论：pUC118-Ski具有促进伤口愈合及抑制瘢痕形成的双重作用。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学野战外科研究所

<120>人ski基因真核表达载体、制备方法及其应用

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>扩增人Ski基因的上游引物

<400>1

aagcttcatg gaggcggcgg                        20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>扩增人Ski基因的下游引物

<400>2

tcaaatccga agtgctcgag                        20

<210>3

<211>2187

<212>DNA

<213>人Ski基因的核苷酸序列

<400>3

atggaggcgg cggcaggcgg ccgcggctgt ttccagccgc acccggggct gcagaagacg     60

ctggagcagt tccacctgag ctccatgagc tcgctgggcg gcccggccgc tttctcggcg    120

cgctgggcgc aggaggccta caagaaggag agcgccaagg aggcgggcgc ggccgcggtg    180

ccggcgccgg tgcccgcagc caccgagccg ccgcccgtgc tgcacctgcc cgccatccag    240

ccgccgccgc ccgtgctgcc cgggcccttc ttcatgccgt ccgaccgctc caccgagcgc    300

tgcgagaccg tactggaagg cgagaccatc tcgtgcttcg tggtgggagg cgagaagcgc    360

ctgtgtctgc cgcagattct caactcggtg ctgcgcgact tctcgctgca gcagatcaac    420

gcggtgtgcg acgagctcca catctactgc tcgcgctgca cggccgacca gctggagatc    480

ctcaaagtca tgggcatcct gcccttctcg gcgccctcgt gcgggctcat caccaagacg    540

gacgccgagc gcctgtgcaa cgcgctgctc tacggcggcg cctacccgcc gccctgcaag    600

aaggagctgg ccgccagcct ggcgctgggc ctggagctca gcgagcgcag cgtccgcgtg    660

taccacgagt gcttcggcaa gtgtaagggg ctgctggtgc ccgagctcta cagcagcccg    720

agcgccgcct gcatccagtg cctggactgc cgcctcatgt acccgccgca caagttcgtg    780

gtgcactcgc acaaggccct ggagaaccgg acctgccact ggggcttcga ctcggccaac    840

tggcgggcct acatcctgct gagccaggat tacacgggca aggaggagca ggcgcgcctc    900

ggccgctgcc tggacgacgt gaaggagaaa ttcgactatg gcaacaagta caagcggcgg    960

gtgccccggg tctcctctga gcctccggcc tccataagac ccaaaacaga tgacacctct   1020

tcccagtccc ccgcgccttc cgaaaaggac aagccgtcca gctggctgcg gaccttggcc  1080

ggctcttcca ataagagcct gggctgtgtt caccctcgcc agcgcctctc tgctttccga  1140

ccctggtccc ccgcagtgtc agcgagtgag aaagagctct ccccacacct cccggccctc  1200

atccgagaca gcttctactc ctacaagagc tttgagacag ccgtggcgcc caacgtggcc  1260

ctcgcaccgc cggcccagca gaaggttgtg agcagccctc cgtgtgccgc cgccgtctcc  1320

cgggcccccg agcctctcgc cacttgcacc cagcctcgga agcggaagct gactgtggac  1380

accccaggag ccccagagac gctggcgccc gtggctgccc cagaggagga caaggactcg  1440

gaggcggagg tggaagttga aagcagggag gaattcacct cctccttgtc ctcgctctct  1500

tccccgtcct ttacctcatc cagctccgcc aaggacctgg gctccccggg tgcgcgtgcc  1560

ctgccctcgg ccgtccctga tgctgcggcc cctgccgacg cccccagtgg gctggaggcg  1620

gagctggagc acctgcggca ggcactggag ggcggcctgg acaccaagga agccaaagag  1680

aagttcctgc atgaggtggt caagatgcgc gtgaagcagg aggagaagct cagcgcagcc  1740

ctgcaggcca agcgcagcct ccaccaggag ctggagttcc tacgcgtggc caagaaggag  1800

aagctgcggg aggccacgga ggccaagcgt aacctgcgga aggagatcga gcgtctccgc  1860

gccgagaacg agaagaagat gaaagaggcc aacgagtcac ggctgcgcct gaagcgggag  1920

ctggagcagg cgcggcaggc ccgggtgtgc gacaagggct gcgaggcggg ccgcctgcgc  1980

gccaagtact cggcccagat cgaagacctg caggtgaagc tgcagcacgc ggaggcggac  2040

cgggagcagc tgcgggccga cctgctgcgg gagcgcgagg cccgggagca cctggagaag  2100

gtggtgaagg agctgcagga acagctgtgg ccgcgggccc gccccgaggc tgcgggcagc  2160

gagggcgctg cggagctgga gccgtag                                      2187

<210>4

<211>728

<212>PRT

<213>人Ski基因的氨基酸序列

<400>4

Met Glu Ala Ala Ala Gly Gly Arg Gly Cys Phe Gln Pro His Pro Gly

1               5                   10                  15

Leu Gln Lys Thr Leu Glu Gln Phe His Leu Ser Ser Met Ser Ser Leu

            20                  25                  30

Gly Gly Pro Ala Ala Phe Ser Ala Arg Trp Ala Gln Glu Ala Tyr Lys

        35                  40                  45

Lys Glu Ser Ala Lys Glu Ala Gly Ala Ala Ala Val Pro Ala Pro Val

    50                  55                  60

Pro Ala Ala Thr Glu Pro Pro Pro Val Leu His Leu Pro Ala Ile Gln

65                  70                  75                  80

Pro Pro Pro Pro Val Leu Pro Gly Pro Phe Phe Met Pro Ser Asp Arg

                85                  90                  95

Ser Thr Glu Arg Cys Glu Thr Val Leu Glu Gly Glu Thr Ile Ser Cys

            100                 105                 110

Phe Val Val Gly Gly Glu Lys Arg Leu Cys Leu Pro Gln Ile Leu Asn

        115                 120                 125

Ser Val Leu Arg Asp Phe Ser Leu Gln Gln Ile Asn Ala Val Cys Asp

    130                 135                 140

Glu Leu His Ile Tyr Cys Ser Arg Cys Thr Ala Asp Gln Leu Glu Ile

145                 150                 155                 160

Leu Lys Val Met Gly Ile Leu Pro Phe Ser Ala Pro Ser Cys Gly Leu

                165                 170                 175

Ile Thr Lys Thr Asp Ala Glu Arg Leu Cys Asn Ala Leu Leu Tyr Gly

            180                 185                 190

Gly Ala Tyr Pro Pro Pro Cys Lys Lys Glu Leu Ala Ala Ser Leu Ala

        195                 200                 205

Leu Gly Leu Glu Leu Ser Glu Arg Ser Val Arg Val Tyr His Glu Cys

    210                 215                 220

Phe Gly Lys Cys Lys Gly Leu Leu Val Pro Glu Leu Tyr Ser Ser Pro

225                 230                 235                 240

Ser Ala Ala Cys Ile Gln Cys Leu Asp Cys Arg Leu Met Tyr Pro Pro

                245                 250                 255

His Lys Phe Val Val His Ser His Lys Ala Leu Glu Asn Arg Thr Cys

            260                 265                 270

His Trp Gly Phe Asp Ser Ala Asn Trp Arg Ala Tyr Ile Leu Leu Ser

        275                 280                 285

Gln Asp Tyr Thr Gly Lys Glu Glu Gln Ala Arg Leu Gly Arg Cys Leu

    290                 295                 300

Asp Asp Val Lys Glu Lys Phe Asp Tyr Gly Asn Lys Tyr Lys Arg Arg

305                 310                 315                 320

Val Pro Arg Val Ser Ser Glu Pro Pro Ala Ser Ile Arg Pro Lys Thr

                325                 330                 335

Asp Asp Thr Ser Ser Gln Ser Pro Ala Pro Ser Glu Lys Asp Lys Pro

            340                 345                 350

Ser Ser Trp Leu Arg Thr Leu Ala Gly Ser Ser Asn Lys Ser Leu Gly

        355                 360                 365

Cys Val His Pro Arg Gln Arg Leu Ser Ala Phe Arg Pro Trp Ser Pro

    370                 375                 380

Ala Val Ser Ala Ser Glu Lys Glu Leu Ser Pro His Leu Pro Ala Leu

385                 390                 395                 400

Ile Arg Asp Ser Phe Tyr Ser Tyr Lys Ser Phe Glu Thr Ala Val Ala

                405                 410                 415

Pro Asn Val Ala Leu Ala Pro Pro Ala Gln Gln Lys Val Val Ser Ser

            420                 425                 430

Pro Pro Cys Ala Ala Ala Val Ser Arg Ala Pro Glu Pro Leu Ala Thr

        435                 440                 445

Cys Thr Gln Pro Arg Lys Arg Lys Leu Thr Val Asp Thr Pro Gly Ala

    450                 455                 460

Pro Glu Thr Leu Ala Pro Val Ala Ala Pro Glu Glu Asp Lys Asp Ser

465                 470                 475                 480

Glu Ala Glu Val Glu Val Glu Ser Arg Glu Glu Phe Thr Ser Ser Leu

                485                 490                 495

Ser Ser Leu Ser Ser Pro Ser Phe Thr Ser Ser Ser Ser Ala Lys Asp

            500                 505                 510

Leu Gly Ser Pro Gly Ala Arg Ala Leu Pro Ser Ala Val Pro Asp Ala

        515                 520                 525

Ala Ala Pro Ala Asp Ala Pro Ser Gly Leu Glu Ala Glu Leu Glu His

    530                 535                 540

Leu Arg Gln Ala Leu Glu Gly Gly Leu Asp Thr Lys Glu Ala Lys Glu

545                 550                 555                 560

Lys Phe Leu His Glu Val Val Lys Met Arg Val Lys Gln Glu Glu Lys

                565                 570                 575

Leu Ser Ala Ala Leu Gln Ala Lys Arg Ser Leu His Gln Glu Leu Glu

            580                 585                 590

Phe Leu Arg Val Ala Lys Lys Glu Lys Leu Arg Glu Ala Thr Glu Ala

        595                 600                 605

Lys Arg Asn Leu Arg Lys Glu Ile Glu Arg Leu Arg Ala Glu Asn Glu

    610                 615                 620

Lys Lys Met Lys Glu Ala Asn Glu Ser Arg Leu Arg Leu Lys Arg Glu

625                 630                 635                 640

Leu Glu Gln Ala Arg Gln Ala Arg Val Cys Asp Lys Gly Cys Glu Ala

                645                 650                 655

Gly Arg Leu Arg Ala Lys Tyr Ser Ala Gln Ile Glu Asp Leu Gln Val

            660                 665                 670

Lys Leu Gln His Ala Glu Ala Asp Arg Glu Gln Leu Arg Ala Asp Leu

        675                 680                 685

Leu Arg Glu Arg Glu Ala Arg Glu His Leu Glu Lys Val Val Lys Glu

    690                 695                 700

Leu Gln Glu Gln Leu Trp Pro Arg Ala Arg Pro Glu Ala Ala Gly Ser

705                 710                 715                 720

Glu Gly Ala Ala Glu Leu Glu Pro

                725

Claims (8)

1.一种人ski基因真核表达载体，其特征在于，包含载体pUC118片段和人ski基因片段，其中所述的载体pUC118片段来自大连宝生物工程有限公司，人ski基因片段由SEQ ID NO：3所示核苷酸构成。

2.根据权利要求1所述的人ski基因真核表达载体，其特征在于，所述人ski基因真核表达载体具有CMV启动子和BGH终止子。

3.权利要求1所述的人ski基因真核表达载体的制备方法，其特征在于，包含步骤：

1)通过PCR从人成纤维细胞总RNA中扩增获得人ski基因片段；

2)步骤1)获得的人ski基因序列经HindIII和XhoI双酶切后插入pUC118载体中获得pUC118-Ski真核表达质粒；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中应用的扩增引物为SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)还包括：在pUC118质粒上插入CMV启动子和BGH终止子。

6.权利要求1所述的人ski基因真核表达载体在制备促进各种伤口愈合、组织修复及抑制瘢痕形成的制剂中的应用。

7.一种促进组织修复、伤口愈合及抑制瘢痕形成的制剂，其特征在于，其包含权利要求1所述的人pUC118-Ski真核表达载体。

8.根据权利要求7所述的促进组织修复、伤口愈合及抑制瘢痕形成的制剂，其特征在于，所述制剂制备成注射液、乳剂、霜剂、膏剂或喷雾剂。

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