CN1315207A - 一种用重组基因转染的异体皮肤 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用CTLA4Ig重组基因转染的、并能够表达CTLA4Ig重组蛋白质的异体皮肤。本发明的异体皮肤可用于覆盖、封闭烧伤创面,促进创面的愈合并减少创面疤痕形成。

Description

一种用重组基因转染的异体皮肤

本发明涉及一种用重组基因转染的异体皮肤，具体地说，本发明涉及一种用CTLA4Ig重组基因转染的异体皮组织，用于覆盖烧伤等创面，从而促进创面愈合，减少疤痕形成。

对烧伤创面异体(种)皮肤移植的研究是现代烧伤治疗的迫切需要：烧伤是一类发生率及致残率均较高的特殊类型创伤，其根本问题就是创面问题，如果烧伤创面得不到及时有效的覆盖、封闭，必将引起患者机体内环境的紊乱、感染及多脏器功能障碍的发生；此外，还将出现创面的非生理性愈合，使疤痕形成增加，残疾程度加剧。因此，对烧伤创面的研究一直是烧伤界研究的热点及难点。

异体皮及异种猪皮早已应用于烧伤创面治疗中，但由于移植后的免疫排斥反应，使它们的应用及疗效受到了极大地限制。深度烧伤创面需经皮肤移植才能愈合，而大面积、特大面积烧伤患者自体皮源严重不足，需经非自体(异体和异种)皮覆盖创面，但非自体皮将在短时间内(2-4周)被排斥，即使是试图通过近年发展起来的微粒皮技术封闭创面，也需应用异体(种)皮覆盖于微粒皮上，以为自体微粒皮提供合适的生长增生条件，但我们在临床上发现：在微粒皮还没有完全生长覆盖创面前，异体(种)皮就由于免疫排斥等而坏死脱落，使微粒皮失去继续生长扩展的环境，从而使手术达不到理想的效果。另外，切取自体皮同样也是一种创伤，很多患者不愿切取自体皮，而希望有其它皮肤代替。所以如何延长烧伤创面异体(种)移植皮肤成活甚至永久成活的研究是现代烧伤治疗的迫切需要。

影响器官移植成功的关键是免疫排斥反应，迄今，防治移植排斥反应的主要对策是通过过各种途径抑制宿主的免疫功能。也正是由于免疫抑制性药物如环疱霉素、FK506、OKT3等的问世，包括皮肤移植在内的器官移植取得了长足的进展。但是这些药物都有一个共同的特点，其抑制机体免疫功能的作用是非特异的、全面持久的，从而易引发感染、产生肿瘤等严重后果。所以近年来医学界提出了特异性免疫耐受理论：即机体仅对移植抗原产生耐受，而保留机体的其它免疫功能。目前诱导宿主特异性免疫耐受主要有以下四种方法：(1)胸腺中注射供体细胞或MHC抗原；(2)封闭CD4和CD8T淋巴细胞；(3)改造供体的MHC抗原；(4)阻断T细胞辅助刺激信号系统。其中，阻断T细胞辅助刺激信号系统被认为是最有前途的方法。从免疫耐受理论出发，并结合临床实际，近来又有人提出了局部免疫耐受(1ocal immunetolerance)理论，即通过各种方法在移植局部环境中抑制宿主的免疫功能，引发局部免疫耐受。这样，既达到延长移植物存活时间，又使对宿主自身免疫功能的影响降到最低程度。这对烧伤治疗尤为关键，因烧伤病人，特别是严重烧伤患者，免疫功能紊乱，免疫力低下，而致极易并发感染。如此时再抑制患者的免疫功能，则更易引发致命性感染等严重后果。所以我们综合阻断T细胞辅助信号和局部免疫耐受两个学术观点，并结合烧伤创面治疗实际特点，通过在烧伤创面诱导移植皮肤局部特异性免疫耐受，而达到延长移植异种皮肤成活甚至永久成活的目的。

皮肤移植的免疫排斥反应是典型的细胞性排斥反应，活化的T细胞在皮肤移植排斥反应中起着决定性作用。而近年的研究表明，T细胞必须在TCR/MHC识别及辅助刺激信号共同作用下才能完全活化。阻断辅助刺激信号，将会引起T细胞的无反应，或细胞凋亡(apoptosis)。迄今，已发现多种辅助刺激信号系统，如B7/CD28-CTLA4系统，CD40/CD40L系统，CD95(Fas)/FasL系统等。但迄今的研究认为，在所有的辅助刺激信号系统中，B7/CD28-CTLA4系统的作用最大、最肯定。可溶性CTLA4能竞争性阻断抗原提呈细胞的B7分子与T细胞上的CD28结合，从而阻断T细胞的完全活化。研究表明，外源性CTLA4可明显抑制各种抗原刺激的T细胞的活化。但它并不影响T细胞的细胞毒性等功能，此时的T细胞同样对入侵的病毒、细菌等具有免疫能力；并且CTLA4只有在应用时才阻断T细胞的活化，没有持续及累加效应。这些是目前各种正在应用的免疫抑制剂无法比拟的。研究表明，CTLA4对以T细胞过度活化为主要原因的自身免疫性疾病等有明显的治疗作用；它还能明显延长心、肾、胰岛等移植器官的成活。在现有技术中，没有它在烧伤创面皮肤移植方面的应用。同时由于CTLA4的制备、提纯困难，全身甚至局部应用费用昂贵，且研究发现，只有当机体内的CTLA4一直维持在某一水平，其诱导移植物特异性免疫耐受的能力才最明显。说明，直接应用CTLA4纯品不但难度较大，而且效果有限。

本发明的目的是提供一种用CTLA4Ig重组基因转染的异体皮肤，用于覆盖、封闭烧伤创面。

本发明提供了一种用CTLA4Ig重组基因转染并能够表达CTLA4Ig重组蛋白质的异体皮肤。所述的异体皮肤是指来源于不同于烧伤患者的个体的皮肤。它可以是来源于同种的个体，例如其他的人，也可以是来源于不同种的个体，例如猪，羊，牛，马等。在本发明中可以使用任何动物物种来源的皮肤，但优选使用猪皮肤。所述猪皮肤可以是任何一种品系的猪的皮肤，例如荣昌猪，五指山猪等(以近交或标准品系的猪皮肤为佳)；所述的猪皮肤可以是任何年龄的猪皮肤(以取自小于6个月猪龄的猪皮肤为佳)。

本发明中所述的CTLA4是人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4分子胞外区部分。用于本发明的CTLA4可以是该分子胞外区全长的CTLA4，也可以是包括其中一部分的CTLA4片段。本发明的CTL4最好还包括信号肽。所述的Ig是人免疫球蛋白IgGγ1，其核苷酸序列包括人IgGγ1铰链区、CH1及CH2区；CTLA4与Ig的相连方式是铰链区连接。优选的用于本发明的CTLA4基因具有如图6所示的核苷酸序列。

为了使重组的CTLA4Ig基因在被转化的组织中进行表达，该基因应与可驱动该基因表达的启动子有效连接。有效连接是指启动子与重组基因的连接方式可以使该启动子能够引导该重组基因在皮肤细胞中进行表达。本发明中可以使用任何已知的可以在皮肤细胞中引导外源基因表达的启动子。这些启动子可以是SV40、CMV及CAG等，最好为CAG启动子。

为了转化进皮肤细胞中，重组基因与启动子连接的重组核苷酸可以被整合在一种载体中。只要能够保证所述的重组基因在皮肤细胞中表达，可以使用任何其它的方式将重组基因导入皮肤细胞。在使用载体时可以使用任何一种已知的可以将重组核酸转化到皮肤细胞中的载体，例如腺病毒载体，逆转录病毒载体，优选使用腺病毒载体。在腺病毒载体中，重组核酸的整合位点最好是SwaI酶切位点。

猪皮肤的切取和处理方法是首先取下大张全厚新鲜猪皮，再用鼓式取皮机反制成较厚的中厚皮。然后将Adv-CTLA4Ig体外转染待移植皮肤。

附图简要说明

图1是pCTLA4Ig融合蛋白表达载体构建示意图；

图2是Adv-CTLA4Ig载体构建示意图；

图3是Adv-CTLA4Ig在培养细胞中的表达，A:293细胞；B：人成纤维细胞；C:HeLa细胞；

图4表示Adv-CTLA4Ig载体体外传染大鼠皮肤免疫组化；

图5表示霜剂型Adv-CTLA4Ig载体转染猪皮肤免疫组化；

图6表示CTLA4融合蛋白结构示意图(A)，以及信号肽和CTLA4胞外区DNA序列和氨基酸序列(B)。

使用本发明的转基因异体皮肤，为大面积病人的治疗争取了时间；为一些不愿切取自体皮或自体皮源因难的患者烧伤或取皮创面的提供了良好的生长条件，促进了创面的愈合；由于转基因猪皮有效保护了创面而使创面疤痕形成减少。

具体地说，本发明构建的AdV-CTLA4Ig表达载体能转染0.1-0.6厘米厚的、用于移植的皮肤组织，包括猪皮和人皮组织；该AdV-CTLA4Ig转染之猪皮或人皮能表达CTLA4Ig；该AdV-CTLA4Ig转染之猪皮或人皮中游离的AdV-CTLA4Ig能转染创面肉芽组织；该AdV-CTLA4Ig转染之猪皮或人皮可用于人体表损伤的覆盖，且存活期显著长于未转染之猪皮或人皮(从10天左右至20天以上)；该AdV-CTLA4Ig转染之猪皮或人皮尤其适用于人体表烧伤创面的覆盖，包括创面覆盖的微粒皮的保护。

实施例

实施例1

Ig融合蛋白表达载体的构建(图1)

1．外周血单核细胞(PBMC)的分离、活化常规分离健康人外周血单个核细胞，RPMI1640调节细胞密度为1×10⁶细胞/毫升，加入PMA(15nM)和抗CD3单抗(10微克/毫升)，37℃5％CO₂培养6小时，使淋巴细胞活化，高表达CTLA-4 mRNA。2．细胞总RNA的提取、鉴定

1)提取：离心收集活化PBMC，PBS(DEPC)洗细胞×2，按每1×10⁷PBMC加入1毫升Tripure，混匀，RT5分钟，再加0.2毫升氯仿，剧烈震荡15秒，RT5分钟，10000转/分离心15分钟，将上层无色水相移至另一离心管，加入0.5毫升异丙醇，混匀，-20℃10分钟，10000转/分离心15分钟，加1毫升75％乙醇洗涤沉淀，待沉淀干燥后加入200微升DEPC水溶解，-20℃保存。

2)RNA电泳：1.5％甲醛变性琼脂糖凝胶到板制胶，凝固后置1×MOPS电泳液中；5微升RNA样品与15微升载样缓冲液，95℃水浴变性2分钟，50V，电泳，紫外检测RNA完整性。

3)RNA含量测定：RNA样品稀释后在紫外分光光度仪上测O.D.₂₆₀和O.D.₂₈₀值,RNA浓度(微克/毫升)=O.D.₂₆₀×40×稀释倍数。3．引物设计

通过计算机辅助分析，根据基因库中人CTLA-4基因序列，设计如下三条引物，其中引物1#包括CTLA-4胞外区N末端7个氨基酸残基和抑瘤素M信号肽C端15个氨基酸残基；引物2#对应于CTLA-4119-125位氨基酸残基，并引入BclⅠ酶切位点；引物3#包含抑瘤素M信号肽其余氨基酸残基并与引物1#的抑瘤素M信号肽部分重叠，在引物3#的5’端引入HindⅢ酶切位点。引物由中科院上海细胞所合成，PAGE纯化。引物1#:CTCAGTCTGGTCCTTGACCTCCTGTTTCCAAGCATGGCGA

    GCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC引物2#：TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTC

                ------BclⅠ引物3#：GCAAGCTTCAATGGGTTGACTGCTCACACAGAGGACGCTG

       ——--HindⅢ

    CTCAGTTCGGTCCTTGCATCT4．RT-PCR扩增CTLA-4胞外区cDNA片段

1)cDNA第一链合成(逆转录)：将总RNA10微升，oligo(dT₁₂)2微升，ddH₂O(DEPC)11.5微升，混匀后65℃水浴变性10分钟，迅速置冰上，再加入5x逆转录缓冲液8微升，100mMDTT2微升，RNasin0.5微升，2mM dNTP4微升，AMV2微升，(总体积40微升)，42℃1小时，-20℃保存。

2)PCR反应：先以cDNA第一链为模板，以引物1#和2#进行第一轮扩增，条件为：cDNA第一链5微升，10×PCR缓冲液5微升，10mMdNTP4微升，引物2#和3#各-1微升(终浓度l00nM),ddH₂O 29.5微升，95℃变性7分钟，加Taq酶0.5微升，总体积50微升，循环条件：94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，30个循环后72℃7分钟；随后以第一轮PCR反应产物为模板，以引物2#和3#进行第二轮扩增，反应条件同前，2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。5．质粒提取

按质粒提取试剂盒说明书操作，100微升ddH₂O,1洗脱质粒DNA。6．大肠杆菌感受态的、冻存

参照《分子克隆》(金冬雁，黎孟枫译，《分子克隆实验指南》，第二版北京：科学出版社1996；P852-907)CaCl₂制备取大肠杆菌感受态，加入终浓度10-15％甘油，-70℃冻存。7．质粒及重组DNA的转化

取冻存大肠杆菌感受态细菌，加入质粒或DNA连接产物1-2微升，轻轻混匀后，冰浴30分钟，42℃水浴2分钟，加入900微升LB培养基，37℃水浴60分钟，取适量涂布于含100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂板上。37℃孵箱培养过夜。8．DNA片段的回收按DNA片段回收试剂盒说明书操作。9．PCR扩增片段与Ig融合蛋白表达载体的连接

将第二轮PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，回收所需片段，经HindⅢ、BclⅠ双酶切后，与经同样酶切的pX/Ig载体片段：载体3∶1的比例，根据DNA快速连接试剂盒说明连接，转化MC1061感受态菌，HindⅢ、XbaⅠ酶切鉴定阳性转化克隆插入片段大小。10．序列测定

酶切鉴定插入片段大小正确的重组质粒，经HindⅢ、XbaⅠ双酶切后定向插入pUC19质粒中，采用Sanger双脱氧测序法，以质粒双链DNA为模板，在pUC19通用引物引导下,ABI Prism377全自动测序仪自动测序。

实施例2

CTLA-4Ig逆转录病毒表达载体的构建(图2)

将pLXSN和pUC19-CTLA-4Ig分别用用EcoRI和HindⅢ进行酶切，然后分别用dATP,dNTP与DNA大肠杆菌聚合酶Klenow片段进行填平，再用BamHI进行酶切，将电泳回收pLXSN的大片段和pUC19-CTLA-4Ig的小片段进行连接，即得到CTLA-4Ig的表达pLXCTLA-4Ig。

实施例3

CTLA4Ig腺病毒表达载体的构建(图3)1．将cDNA片段末端平端化。

醇沉cDNA(0.5pmol)离心管中加入10×缓冲液1μl，再加无菌双蒸水至9μl,70℃ 5分钟，加入1μl T4DNA多聚酶，轻轻混合，不得剧烈振荡，37℃中温育5分钟，用DNA Dilition缓冲液调DNA浓度为1μg、50μl，充分混匀。转至冰浴中灭活多聚酶，可直接用于连接反应(如不能马上应用，则应立即抽提醇沉，再用DNA Dilition缓冲液溶解后储存于-20℃)。2．将平末端化的cDNA插入pAxCAwt柯氏质粒中。将pAxCAwt线性化：pAxCAwt 5μl,h缓冲液5μl,SwaI2μl,ddH₂O38μl，混匀后25℃温育2小时；加EDTA液至终浓度为10mM，酚氯仿抽提，加入平末端cDNA片段约0.2μg.，混匀后醇沉，末完全干燥前，加入5μlDNA溶解及5μl连接缓冲液，25℃温育2小时，醇沉，末完全干燥前加入h缓冲液5μl,SwaI 2μ1,ddH₂O至50μl,25℃温育2小时，以降低野生型病毒及裸病毒出现的可能性。3．用入噬菌体包装插入了CTLA4基因的粘粒。

将入噬菌体包装kit中的提取物离心至管底，加入5μl用TE溶解的2μg质粒DNA，加入无菌双蒸水至终体积为25μl，混匀后离心将提取物及质粒DNA离至管底，RT温育2小时，加入0.5毫升SM缓冲液及25毫升氯仿，轻轻混匀，离心30秒钟，取出上清至一新的离心管，注意不得取出絮状物，用SM缓冲液100、1000、10000倍稀释上清，各取100μl加入100μl用SM缓冲液稀释至A₆₀₀为2.0的DH5α(LE392)中，RT吸附、平衡20分钟，以1/100,1/10涂布Amp抗性的LB平板，37℃温育过夜(10-16小时)，挑选阳性菌落扩增，提取质粒。4．鉴定CTLA4的正确插入

质粒DNA10μl，缓冲液2μl,SalⅠ1μl,ddH₂O 16μl，混匀后37℃温育2小时，醇沉，末完全干燥前，加入5μlDNA溶解缓冲液及5μl连接缓冲液，混匀后25℃温育2小时，转化感受态大肠杆菌，扩增阳性克隆，提取质粒，酶切、PCR、Dot Blotting鉴定。5．将阳性克隆质粒的进一步扩增

将入噬菌体包装kit中的提取物离心至管底，加入5μl用TE溶解的2μg质粒DAN，加入无菌双蒸水至终体积为25μl，不必混匀，离心将水中的提取物及质粒DNA离至管底，RT温育2小时，加入0.5毫升SM缓冲液及25毫升氯仿，轻轻混合，高速度离心30Sec，取出上清至一新的离心管，注意不得取出絮状物，用SM缓冲液100、1000、10000倍稀释上清，各取100μl加入100μl用SM缓冲液稀释至A₆₀₀为2.0的DH5α(LE392)中，RT吸附、平衡20分钟，以1/100,1/10涂布Amp抗性的LB平板，37℃温育过夜(10-16小时)；将所剩包装质粒加入50毫升含Amp的LB培养基中培养过夜，如克隆多于10个以上，则提取质粒备用；如克隆少于10个，则弃相应的SM缓冲液稀释上清。6．将正确插入质粒与腺病毒大质粒共转染293细胞

1)将5中提取的质粒DNA用HEPES缓冲液调浓度为100微克/毫升，取45微升加入5微升DNA-TPC,轻轻混合，将其缓慢滴加至含30微升DOTAP的无菌玻璃管中，边滴边轻轻混合，再加入HEPES缓冲液约20微升至总体积为100微升，室温放置15分钟；另取一瓶融合度接近100％的培养293细胞，去除培养液，加入转染混合液，轻轻摇动，使转染混合液均匀散布，放入细胞培养箱中培养4小时，去除转染混合液，加入新鲜培养液，于第三天收集培养上清及漂浮细胞。7．筛选阳性细胞克隆

293细胞，调细胞密度至1×10⁵/毫升，再10倍稀释，取不同稀释度的细胞接种96孔板，每孔100微升，复孔，培养每5天后再加入培养液50微升，培养15天后，收集培养8天后细胞才漂浮或破裂孔之上清，尽量收集最大稀释度孔，将上清行点免疫检查，提取上清中DNA，行PCR检查。8．将阳性克隆在293细胞中扩增

将阳性克隆上清稀释成0.5毫升，加入80％融合、培养293细胞的3.5cm培养皿中，均匀散布，在细胞培养箱中培养，每15分钟，轻轻摇晃一次，培养1小时后，加入2毫升培养液，继续培养72小时，收集上清及漂浮细胞，用此上清同样感染293细胞，而扩增腺病毒表达载体，收集腺病毒，-80℃冰箱保存。

实施例4

Adv-CTLA4Ig对体外培养细胞的转染1．CTLA4Ig腺病毒载体的制作

293包装细胞培养至70％-90％融合后，0.1MPBS漂洗细胞3次后加入重组腺病毒原液直接感染，37℃CO₂恒温培养箱1小时后，取出加入含5％胎牛血清的DMEM培养液，培养3天后收集细胞及上清，在液氮反复冻融5次后，4℃10000转/分离心20分钟，0.22um膜除菌，-70℃保存备用。使用时，将转染液调PH为7.2。2．病毒滴度的测定

空斑实验法：将293细胞以2×10⁶细胞/孔接种于6孔板，培养20至24小时后，以0.3毫升/孔加入将用无血清DMEM依次10倍稀释的病毒液。细胞培养箱中培养转染1小时(每15分钟轻轻摇晃一次，以使病毒均一散布。)。弃去病毒液后，每孔加入1毫升含0.5％细胞用低熔点琼脂糖及5％胎牛血清的完全DMEM细胞培养液覆盖。7天后观察。以镜下可区分的细胞病变作为蚀斑形成单位(Plaque Forming Unite,PFU)。用接近100％细胞出现病变的病毒稀释度，代入以下公式计算病毒滴度：病毒滴度(PFU)=[12×10⁵稀释度×10个病毒/细胞]÷0.3毫升(因大约每10个病毒感染一个细胞，在7天后细胞出现完全病变)。3．转染

取生长状态良好，增殖活跃的293细胞，用胰蛋白酶消化计数，按1.5×10⁵细胞滴于盖玻片中央，放于37℃CO₂恒温培养箱1小时(注意防止细胞干片)，待细胞贴壁后加入含5％小牛血清的DMEM培养液10mL/培养皿，培养12小时即可进行转染。即先用无菌吸头取出培养液，消毒0.1MPBS轻轻柔洗细胞片1次后按1mL/盖玻片/培养皿加入转染液，放入37℃CO2恒温培养箱转染2、4、6、8、9小时，继之37℃0.1MPBS洗细胞3次，换用含5％小牛血清的DMEM常规培养至12、18、24、36、60小时。同样转染人成纤维细胞、表皮细胞及HeLa细胞。4．免疫组化法检测细胞CTLA-4Ig表达

将上述转染的293细胞、人成纤维细胞、表皮细胞及血管内皮细胞在预定时间终止，用0.1MPBS洗3次后，用4％多聚甲醛(pH7.3)固定8小时、0.1MPBS浸泡8小时，随后进行免疫组化检测CTLA-4Ig表达。同时用未转染相应细胞做空白对照。5．转染细胞形态观察及活性检测

取出转染细胞玻片，甩干培养基后立即滴4％苔盼蓝染3钟后观察，死亡细胞染成兰色，活细胞不被染色。在显微镜下观察转染细胞形态及活性变化。发现CTLA-4Ig腺病毒感染腺病毒包装细胞293细胞，3-5天左右感染的细胞在局部开始包膜收缩、变圆、粘附性降低，然后漂起，并可呈串珠样排列。由于局部细胞的脱落漂起而出现无细胞区，区周边有细胞附着即病毒病变空斑。而以腺病毒感染人成纤维细胞、HeLa胞后则未见细胞形态改变及空斑形成，显示重组腺病毒是一种复制性缺陷病毒，在无E1表达的细胞内不能复制，也证明了腺病毒携带的CTLA-4Ig不与宿主基因整合，故无基因毒性。6．转染细胞CTLA-4Ig的定性、定量、定位表达显微镜下观察转染细胞免疫组化结果发现：棕黄色阳性棵粒见于细胞浆。在高倍镜下记数100个细胞记录其中的阳性细胞数。发现293细胞转染1小时后再培养8小时CTLA-4Ig开始表达，36小时后所有细胞均呈强阳性；人成纤维细胞及表皮细胞在转染4小时后培养12小时开始表达，36小时达高峰，阳性表达率为50％，提示腺病毒载体能有效转染皮肤组织。并发现腺病毒滴度、细胞种类、转染时间、培养时间对转染细胞的CTLA-4Ig表达均有显著影响。腺病毒载体转染效率呈浓度依耐性(将滴度为7×10⁸PFU/毫升的腺病毒稀释15倍HeLa、人成纤维细胞无CTLA-4Ig表达，而滴度为7×10⁸PFU/毫升时转染培养足够时间HeLa、人成纤维均有阳性表达)，说明病毒滴度对于提高转染效率至关重要。在一定时间范围内，相同滴度的转染液，转染时间、培养时间延长，阳性表达细胞数越多。在达到足够转染时间，细胞可有100％阳性表达。结果还显示所构建腺病毒表达载体对不同细胞的转染效率不同，293细胞转染效率最高，HeLa细胞次之80％，成纤维转染效率最低，60％细胞阳性染色。对照组未转染细胞均未见棕黄色阳性细胞，表明正常细胞无CTLA-4Ig表达(见图3)。

实施例5

Adv-CTLA4Ig体外转染待移植皮肤(Ⅰ)：

用DMEM培养液调重组腺病毒载体滴度至5×10⁸/L，将取自6个月龄的荣昌猪的皮肤块放入其中于细胞培养箱中培养。于培养后不同时相点取皮肤组织块行冰冻切片，免疫组织化学检查。结果发现，在转染6小时后就可见有目的蛋白CTLA4Ig的表达，在培养后24、36小时可见CTLA4Ig表达进一步增加，在转染后48、72小时后见CTLA4Ig的表达不再增加。镜下见CTLA4Ig主要在成纤维细胞及毛囊上皮细胞表达(见图4)。Adv-CTLA4Ig体外转染待移植皮肤(Ⅱ)：

用将滴度为2×10⁹/L的霜剂型重组腺病毒载体直接涂于皮肤真皮面后，置于细胞培养箱中培养。于培养后不同时相点取皮肤组织块行冰冻切片，免疫组织化学检查。结果与(Ⅰ)类似(见图5)。

实施例6

Adv-CTLA4Ig转染猪皮在鼠烧伤创面的应用1．将上述用Adv-CTLA4Ig转染猪皮肤缝植于烧伤Balb/c小鼠背部2×2cm切痂创面。术后发现：

(1)移植皮肤局部及周边组织有CTLA4Ig的表达。

(2)Adv-CTLA4Ig转染的猪皮存活时间平均为21天，最长超过28天。而对照组存活时间为8到9天；

(3)Adv-CTLA4Ig转染的异体皮肤所覆盖的肉芽组织也表达CTLA4Ig。2．将上述用Adv-CTLA4Ig转染猪皮肤缝植于烧伤Wistar大鼠背部3×4cm切痂创面。实验发现：

(1)移植皮肤局部及周边组织有CTLA4Ig的表达。

(2)Adv-CTLA4Ig转染的异体移植皮肤存活时间平均为17天，而对照组存活时间为8到9天；

(3)Adv-CTLA4Ig转染的异体皮肤所覆盖的肉芽组织也表达CTLA4Ig

实施例7

Adv-CTLA4Ig转染猪皮在人烧伤创面的应用

将以上所制转基因猪皮应用于不同情况的烧伤患者，所用最大面积达0.4M²，最小为4×5cm．所移植转基因猪皮在烧伤创面成活好，最长存活时间长达37天，其它病例在移植后不同时间均因治疗需要而手术切除，切除时其生长良好。

Claims (7)

1．一种用CTLA4Ig重组基因转染的、并能够表达CTLA4Ig重组蛋白质的异体皮肤。

2．按照权利要求1所述的异体皮肤，其特征在于，它来源于人皮肤，猪皮肤，羊皮肤，牛皮肤，马皮肤。

3．按照权利要求1所述的异体皮肤，其特征在于，它来源于猪皮肤。

4．按照权利要求3所述的异体皮肤，其特征在于，它来源于小于6个月龄的荣昌猪皮肤。

5．按照权利要求1所述的异体皮肤，其特征在于，所述的CTLA4Ig重组基因中的CTL4部分编码如下的氨基酸序列：-25M    G    V    L    L    T    Q    R    T    L    L    S    L    V    L-10                                         -1   +1A    L    L    F    P    S    M    A    S    M    A    M    H    V    A

               +10                                               +20Q    P    A    V    V    L    A    S    S    R    G    I    A    S    F

                                        +30V    C    E    Y    A    S    P    G    K    A    T    E    V    R    V

               +40                                               +50T    V    L    R    Q    A    D    S    Q    V    T    E    V    C    A

                                        +60A    T    Y    M    M    G    N    E    L    T    F    L    D    D    S

          +70                                                    +80I    C    T    G    T    S    S    G    N    Q    V    N    L    T    I

                                        +90Q    G    L    R    A    M    D    T    G    L    Y    I    C    I    C

              +100                                    +110E    L    M    Y    P    P    P    Y    Y    L    G    I    G    N    G

                                  +120                +125T    Q    I    Y    V    I    D    P    E    P    C    P    D    S    D

6．按照权利要求1所述的异体皮肤，其特征在于，所述的CTLA4Ig重组基因是与SV40、CMV或CAG启动子有效连接的。

7．按照权利要求1所述的异体皮肤，其特征在于，所述的CTLA4Ig重组基因是与CAG启动子有效连接的，该与启动子有效连接的重组基因被整合在腺病毒载体的SwaI位点。

Images