CN103305468A - 一种高表达鼠hdac6的抗病毒感染转基因鼠 - Google Patents

Abstract

本发明是一种制备高表达鼠HDAC6且具有高抗病毒感染能力的转基因鼠的方法。该方法是将序列表中序列1导入哺乳动物胚胎干细胞(ES细胞)中，获得高表达鼠HDAC6蛋白的转基因细胞；以所述转基因细胞利用4-8细胞阶段胚胎注射的方法获得转基因胚胎；将所述的转基因胚胎通过手术法移入小鼠子宫内进行妊娠，获得具有生殖系转移的嵌合体转基因后代，通过后代交配产生纯合的转基因小鼠。本发明的方法能在转基因鼠体内稳定表达鼠HDAC6并显著提高鼠的抗病毒感染能力和降低病毒感染死亡率。

Description

一种高表达鼠HDAC6的抗病毒感染转基因鼠

技术领域

本发明涉及制备高表达鼠组蛋白去乙酰化酶6的转基因鼠的方法，属于生物与新医药领域。

背景技术

组蛋白去乙酰化酶6(Histone deacetylase 6，HDAC6)对提高人类或动物的抗病毒感染能力和研究肿瘤细胞的迁移机制、药物作用靶点具有重要作用。

组蛋白去乙酰化酶(HDACs)是一组在细胞染色质水平、通过诱导组蛋白去乙酰化来调通包括染色质重组、转录活化和抑制、细胞周期、细胞分化及细胞凋亡等一系列生物学效应的酶，特别是与基因活化后的及基因转录表达调通有关。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACIs)则是一类抑制HDACs作用的化合物。HDACs通常仅有一个催化结构域，目前研究表明其作用是对核内与染色体结合的组蛋白进行去乙酰化作用，从而调控基因的表达。HDAC6是组蛋白去乙酰化酶家族的一个重要成员。与其它HDACs不同HDAC6是一种特殊的组蛋白去乙酰化酶，每个蛋白分子具有2个催化结构域，除了调控组蛋白的乙酰化水平外，其对胞质种微管蛋白的乙酰化水平同样具有调节作用。而微管蛋白与肿瘤细胞的迁移、病毒入侵时对细胞的调节具有重要作用。HDAC6主要分布在细胞质中，通过影响细胞骨架相关蛋白以及Hsp90等蛋白的乙酰化水平，在多种细胞活动中发挥调节作用。HDAC6可以通过多种机制，发挥其广谱抗病毒活性，对多种病毒具有抗性并增强机体的免疫力：一方面，HDAC6可以通过对细胞膜内侧的细胞骨架的调节，影响细胞膜的动态性，抑制病毒包膜与细胞膜的融合，阻止病毒的入侵，另一方面，HDAC6还可以通过抑制病毒复制相关基因的转录，阻止病毒的包装过程；并促进病毒特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)清除被病毒感染的细胞，从而增强机体的抗病毒能力；除此之外，在病毒感染时，细胞内的HDAC6可以激活IRF3转录因子，促进β-干扰素基因的表达。研究表明，组蛋白去乙酰化酶6可以调控I型HIV病毒对人类细胞的感染能力(Agustin Valenzuela-Fernandez等，Molecular Biology of the Cell，2005)。

我们所建立的过表达Hdac6基因的转基因小鼠为病毒感染的防御机制的解析提供了新的材料，也将为神经退行性疾病及癌症等疾病的治疗带来新的曙光。除此之外，还为将来大型农业动物的基因改造打下了坚实的理论基础。

发明内容

本发明是一种制备高表达鼠HDAC6且具有高抗病毒感染能力的转基因鼠的方法。

该发明提供的方法是将序列表中序列1 DNA序列导入哺乳动物细胞中，获得高表达鼠HDAC6蛋白的转基因细胞；以所述转基因细胞利用4-8细胞阶段胚胎注射的方法获得转基因胚胎；将所述的转基因胚胎通过手术法移入小鼠子宫内进行妊娠，获得具有生殖系转移的嵌合体转基因后代，通过后代交配产生纯合的转基因小鼠。

其中，所述哺乳动物细胞可以是胚胎干细胞。

所述基因序列及克隆引物、所述转基因细胞和所述克隆胚胎也属于发明的保护范围。

本发明的方法能在转基因鼠体各组织内稳定表达鼠HDAC6并显著提高鼠的抗病毒感染能力和降低病毒感染死亡率。

附图说明

图1为鼠HDAC6载体结构示意图。

图2为鼠HDAC6载体XhoI和NotI双酶切示意图，M：分子量marker(1kb DNAladder)；1、2、3、4：质粒编号。

图3为由DK26/V6.5ES获得的嵌合体小鼠。

图4转基因鼠尾巴组织中Hdac6基因的转录水平检测。B1、B2、B3、B4、B5、G1、G2、G3、G4分别为毛皮为黑色和灰色的转基因小鼠编号，ICR、C57为对照组小鼠名称。

图5为转基因小鼠的抗病毒感染情况分析。TG为病毒处理组，WT为对照组。与对照相比，在相同的病毒感染的情况下，转基因小鼠的存活时间和存活数量明显高于对照组。

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可以从商业途径获得。

引物合成及序列测定由invitrogen(北京公司)完成。

反转录试剂盒和lipo转染试剂购于invitrogen公司。

RNA提取试剂盒购于Qiagen公司。

Pfu DNA扩增酶、克隆载体、胶回收试剂盒购于transgen公司。

表达载体来自于invitrogen公司，但经过改造。

酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等分子生物学实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。

限制性内切酶购于Takara公司。

实施例1，鼠HDAC6真核表达载体构建

通过在NCBI网站上查询到小鼠HDAC6(Gene ID：15185)的mRNA序列，我们设计了鼠HDAC6全长克隆引物1对，分别在上下游引物加入XhoI和NotI酶切位点(上游引物：5’-ctagctcgagATGACCTCCACCGGCCAAGATT-3’，下游引物1：5’-gatcgcggccgcTTAGTGTGAGTGGGGCATGTCCTC-3’)，鼠HDAC6完整编码序列如序列1所示。

序列1，鼠HDAC6的编码区DNA序列

1    ATGACCTCCA CCGGCCAAGA TTCTTCTACT AGACAGCGAA AGAGTAGGCA

51   CAATCCCCAG TCACCCCTTC AGGAATCCAG CGCCACCTTG AAGCGTGGTG

101  GAAAGAAGTG TGCTGTACCC CACTCCAGCC CCAATCTAGC GGAGGTAAAG

151  AAGAAAGGCA AAATGAAGAA GCTGAGCCAA CCAGCTGAAG AGGACCTAGT

201  TGTGGGGCTT CAAGGGCTGG ATCTGAACCC TGAGACAAGA GTGCCAGTTG

251  GTACTGGATT GGTGTTTGAT GAACAACTAA ATGACTTCCA TTGCCTTTGG

301  GATGACAGCT TCCCTGAAAG CCCTGAGCGG CTCCATGCCA TCAGAGAGCA

351  ACTGATCCTG GAGGGCCTCC TGGGCCGCTG TGTGTCCTTT CAGGCCCGGT

401  TCGCTGAGAA GGAGGAGCTG ATGTTGGTTC ACAGCCTGGA ATACATTGAT

451  CTGATGGAGA CAACCCAGTA CATGAATGAA GGGGAGCTTC GAGTACTGGC

501  AGAAACCTAT GATTCAGTGT ATCTGCATCC GAACTCATAT TCCTGTGCCT

551  GCCTGGCTAC AGGCTCTGTC CTCCGGCTGG TAGATGCACT CATGGGGGCT

601  GAGATTCGGA ATGGCATGGC CGTCATCAGG CCTCCTGGAC ACCATGCTCA

651  GCACAATCTT ATGGATGGGT ATTGCATGTT CAACCATCTG GCTGTGGCTG

701  CCCGCTATGC GCAAAAGAAG CACCGCATTC AGAGGGTTCT CATCGTGGAC

751  TGGGATGTGC ACCATGGTCA AGGAACACAG TTCATCTTCG ACCAGGACCC

801  CAGTGTCCTT TATTTCTCCA TCCACCGATA TGAACATGGT CGCTTCTGGC

851  CCCACCTTAA GGCTTCTAAC TGGTCCACTA TAGGTTTTGG CCAAGGCCAA

901  GGATATACCA TCAATGTACC TTGGAACCAG ACGGGCATGC GGGACGCTGA

951  CTACATTGCT GCTTTCCTGC ACATCCTGCT GCCAGTTGCC TCGGAGTTTC

1001 AGCCTCAACT GGTCTTGGTG GCCGCTGGAT TTGATGCCCT CCACGGAGAC

1051 CCCAAGGGAG AGATGGCTGC CACGCCAGCA GGATTTGCCC ACCTAACCCA

1101 TTTGCTCATG GGTTTGGCAG GAGGCAAGTT GATTCTGTCC CTGGAGGGTG

1151 GCTATAACCT CCGTGCCCTG GCTAAGGGAG TCAGTGCTTC ACTCCACACC

1201 CTTCTTGGAG ACCCTTGCCC CATGCTGGAG TCCTGTGTTG TACCTTGTGC

1251 AAGCGCCCAG ACTTCCATCT ACTGCACTCT AGAAGCCCTT GAACCCTTCT

1301 GGGAGGTCCT GGAGAGATCA GTTGAGACCC AGGAGGAAGA TGAAGTGGAA

1351 GAAGCCGTGC TAGAAGAGGA GGAGGAGGAA GGTGGCTGGG AGGCCACTGC

1401 ACTGCCCATG GATACATGGC CACTGCTCCA GAACCGCACT GGGCTGGTCT

1451 ATGATGAGAA GATGATGAGT CACTGCAACC TCTGGGACAA TCATCACCCT

1501 GAGACACCTC AGCGCATCTT ACGCATCATG TGTCACCTGG AGGAGGTGGG

1551 CCTTGCGGCT CGCTGTCTCA TCCTACCTGC TCGGCCTGCC CTGGACTCTG

1601 AGCTCCTTAC CTGCCACAGT GCTGAGTACG TGGAGCATCT CCGCACCACA

1651 GAAAAGATGA AAACCCGGGA TCTGCACCGT GAAGGTGCCA ACTTTGACTC

1701 CATCTACATC TGCCCCAGCA CCTTTGCCTG CGCAAAGCTT GCCACAGGCG

1751 CTGCCTGCCG CCTGGTGGAA GCTGTGCTCT CGGGAGAGGT TCTAAATGGC

1801 ATTGCAGTAG TGCGCCCTCC AGGACACCAC GCGGAGCCAA ATGCTGCCTG

1851 TGGTTTCTGC TTTTTCAACT CAGTAGCTGT AGCTGCTCGC CATGCCCAGA

1901 TCATTGCTGG ACGTGCCCTG CGGATCCTAA TCGTGGATTG GGATGTTCAT

1951 CATGGTAATG GAACTCAGCA CATATTTGAG GATGACCCTA GTGTATTATA

2001 CGTGTCCCTG CACCGGTATG ACCGTGGCAC TTTCTTCCCC ATGGGGGATG

2051 AGGGTGCCAG TAGCCAAGTA GGCCGAGATG CAGGTATAGG CTTCACTGTC

2101 AATGTGCCCT GGAATGGGCC CCGCATGGGT GATGCTGATT ACCTGGCTGC

2151 ATGGCATCGT CTGGTACTTC CCATCGCCTA TGAGTTTAAC CCAGAACTGG

2201 TGCTGATCTC AGCTGGCTTT GATGCTGCAC AAGGGGATCC GCTGGGGGGC

2251 TGCCAAGTAA CACCGGAGGG TTATGCCCAC CTCACCCACC TACTGATGGG

2301 CCTTGCTGGT GGCCGTATTA TTCTTATTCT AGAGGGTGGA TACAATTTGG

2351 CATCTATCTC TGAGTCTATG GCTGCCTGCA CCCATTCCCT CCTTGGAGAC

2401 CCACCACCCC AGCTTACTTT GCTGCGACCG CCACAGTCAG GAGCCCTGGT

2451 TTCAATCAGT GAGGTCATCC AAGTCCATCG CAAATACTGG CGCAGTTTGC

2501 GGTTGATGAA AATGGAAGAC AAGGAAGAAT GCTCTAGTTC TAGGCTTGTC

2551 ATCAAGAAGT TGCCCCCAAC AGCCAGTCCT GTATCAGCTA AGGAAATGAC

2601 CACACCGAAA GGAAAGGTTC CTGAAGAAAG CGTGAGGAAG ACCATAGCAG

2651 CACTACCTGG GAAAGAGTCT ACTCTAGGCC AGGCTAAATC AAAGATGGCT

2701 AAGGCTGTGC TTGCTCAGGG CCAGTCCTCA GAACAAGCTG CTAAGGGAAC

2751 TACACTGGAT CTGGCTACCT CAAAGGAGAC TGTGGGAGGA GCCACGACGG

2801 ACCTGTGGGC CTCAGCAGCT GCTCCTGAAA ACTTCCCTAA CCAGACCACC

2851 TCTGTGGAGG CTTTGGGAGA AACTGAGCCA ACGCCTCCAG CCTCGCATAC

2901 AAACAAGCAG ACCACAGGGG CTTCACCTCT GCAGGGAGTC ACGGCTCAGC

2951 AGTCCCTACA GCTTGGGGTT CTCAGCACTT TGGAGCTAAG CAGAGAAGCA

3001 GAGGAAGCCC ATGATTCTGA GGAGGGCCTG CTAGGGGAAG CCGCTGGAGG

3051 TCAGGACATG AACAGCTTGA TGCTGACACA AGGATTTGGG GACTTTAATA

3101 CCCAGGATGT ATTTTATGCT GTGACCCCAC TATCCTGGTG TCCCCATTTG

3151 ATGGCAGTAT GCCCCATTCC TGCAGCAGGC CTAGATGTGT CCCAACCTTG

3201 TAAGACCTGT GGAACAGTCC AGGAGAACTG GGTGTGTCTG ACTTGCTATC

3251 AGGTGTACTG CAGTCGCTAT GTCAATGCCC ATATGGTCTG CCACCATGAA

3301 GCCTCTGAAC ACCCGCTGGT CCTCAGCTGT GTTGACCTGT CTACCTGGTG

3351 TTATGTCTGT CAGGCTTATG TCCACCACGA GGATCTCCAA GATGTGAAGA

3401 ACGCTGCCCA CCAGAACAAG TTTGGGGAGG ACATGCCCCA CTCACACTAA

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通过对鼠HDAC6的全长序列扩增、与克隆载体连接、鼠DHAC6测序、克隆质粒提取、质粒双酶切、目的片段回收、目的片段与表达载体连接、表达载体酶切鉴定和PCR扩增鉴定等一系列过程(方法详见《分子克隆(第三版)》)，获得鼠HDAC6的chicken actin启动子的过表达载体，如图1所示。此质粒经XhoI与NotI双酶切，可被切成大小分别为6886bp(载体骨架)和3450bp(鼠HDAC6)的两个片段，如图2所示。

实施例2，鼠HDAC6转基因ES细胞系的构建

将外源基因导入胚胎干细胞内的方法有很多，其中包括细胞电转、Lipofectamine2000转染、病毒感染等。在本研究中，我们采取了电转化的方式将图1过表达鼠HDAC6的质粒导入到胚胎干细胞中来构建Hdac6转基因ES细胞系，再用此转基因ES细胞系来构建转基因鼠。

电转过程如下：

(1)当ES细胞的密度长至70％-80％时，即可用作电转。在电转前3个小时，给细胞换上新鲜的培养液。

(2)用胰酶将细胞消化下来(0.25％TE，37℃，30s)，计数，电转所需细胞量为107个/次。

(3)12,00rpm离心3min，吸去上清，用750ul的PBS将细胞重悬，吹打均匀后转移至电转杯中。

(4)将之前准备好的线性化质粒(50μl)加至电转杯中，轻弹杯壁，将二者混匀，室温静置3min。

(5)电转。选择衰减波电转模式，电转参数设置如下：电压250V，电容500μF，电阻100Ω，杯径4mm。

(6)电转好以后，室温静置5min，再将细胞悬液转移至事先铺好饲养层细胞的100mm平皿上。

(7)电转后24h，向培养液中加入终浓度为1.25μM的嘌呤霉素进行药物筛选。在筛选的过程中阴性克隆会被逐渐杀死。以后每24小时给细胞换一次液，加一次药。大约筛选1-2周后(不同的细胞系所需的时间不同)，克隆即可长成。

(8)挑克隆。挑克隆前首先将皿中的培养液吸走，向其中加入3ml左右的PBS；在体式镜或倒置相差显微镜下，用200μl的移液器进行挑取，将挑取的ES克隆放在盛有50μl 0.25％TE的EP管或96孔板中，37℃，消化30s，后用50μl ES培养液中和；最后将细胞悬液吸至事先铺好饲养层细胞的24孔板中培养。

(9)待克隆长好后，传代或冻存。经行PCR扩增鉴定，获得核型正常的阳性ES细胞系。

实施例3，鼠HDAC6，转基因鼠的制作

一、正常发育小鼠胚胎的收集与培养

(1)激素注射：按照5IU/只的剂量给雌性小鼠注射孕马血清促性腺激素(PMSG)。46-48hr后，按照5IU/只的剂量注射人绒毛膜促性腺激素(hCG，Sigma)。

(2)胚胎收集：将雌性小鼠与可育雄性小鼠按照1∶1的比例合笼。次日清晨检查雌性小鼠的阴道栓，将见栓的小鼠分出单独饲养直至注射hCG 16-20hr后将小鼠断脊椎处死。取出小鼠的输卵管部分，放入HKSOM操作液中，在体式显微镜下划开输卵管膨大的壶腹部，收集颗粒细胞-卵母细胞复合体。用0.1％透明质酸酶消化开颗粒细胞后，将单细胞受精卵转移至HKSOM中洗3-4次以中和消化反应，然后再移至事先预热(＞1h)的KSOM中培养，至第三天上午胚胎即可发育至4-8细胞阶段。

二、准备胚胎注射用的ES细胞

(1)吸去培养基，用PBS洗涤2次，加入适量的0.25％Trysin-EDTA，37℃消化30s后，加入ES细胞培养基终止消化，并将克隆充分吹打成单细胞。

(2)将含有细胞悬液的培养皿放在培养箱静置，差速贴壁法去除饲养层细胞。

(3)30min后将含ES细胞的上清吸至15ml离心管，4500rpm离心3min。

(4)用胚胎注射缓冲液(每1ml ES细胞培养液中加入20μl Hepes)重悬细胞，4℃放置约30min以除去死细胞。

(5)弃去上部2/3液体，留余下1/3细胞悬液用于胚胎注射。

三、胚胎注射

(1)预先准备好口径为80-90μm的持卵针及口径为6-8μm的平口注射针。

(2)收集处于4细胞8细胞阶段的小鼠胚胎，置于覆盖有矿物油的KSOM微滴中备用；将ES细胞悬液放入同一皿的另一微滴中。调整持卵针和注射针到同一水平面。于显微操作仪下，用注射针将ES细胞吸入，使之在注射针内排成一线。用持卵针吸住胚胎并加以固定，施加Piezo脉冲使注射针穿破胚胎透明带，小心地将ES细胞推入透明带与质膜之间的间隙。每个胚胎约放入10-15个ES细胞。注射完后将重构后的胚胎放回KSOM培养液中继续培养，至囊胚期时，准备移植。

四、囊胚移植

取性成熟的KM母鼠与结扎公鼠同笼，第二天见栓记为0.5dpc。取2.5dpc假孕KM母鼠作为代孕鼠，接受胚胎移植。用2.5％三溴乙醇腹腔注射麻醉受体小鼠，计量0.01ml/g体重。待小鼠麻醉后，用剪刀将其背部手术部位的毛剪掉。用70％乙醇擦拭消毒，于背部中线一侧1cm处，第一根肋骨下方用手术剪一个小口。用镊子夹住白色的脂肪垫，连同输卵管、子宫一起拉出体外，并用缝合针在子宫上扎一个小口。用口吸管吸一些培养基，然后吸入一个小气泡，再吸入8-10个注射过ES细胞的重构胚胎。将吸管尖端沿子宫上的针扎小口插入子宫，将胚胎由吸管吹到子宫内。将子宫连同卵巢、输卵管放回腹腔，缝合皮肤。18天后观察母鼠产子情况。

实施例4，鼠HDAC6转基因鼠抗病毒感染能力分析。

HDAC6转基因小鼠和对照小鼠，在相同的条件下进行2周的病毒侵染实验。每天记录小鼠的体重和存活情况，两周后，HDAC6转基因小鼠的体重及存活率都明显高于对照组。

Claims (6)

1.一种转基因细胞，是将序列表中的序列1导入哺乳动物体细胞中，获得的高表达鼠组蛋白去乙酰化酶6转基因细胞。

2.根据权利要求1所述的转基因细胞，其特征在于：所述哺乳动物细胞为胚胎干细胞。

3.一种制备克隆胚胎的方法，是以权利1或权利2所述的转基因细胞利用4-8细胞阶段胚胎注射的方法获得转基因胚胎。

4.一种制备转基因家畜的方法，是将权利要求3所述方法制备的克隆胚胎通过手术法移入小鼠子宫内进行妊获得转基因小鼠。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述动物为小鼠。

6.一种DNA分子，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。

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