CN101343640B - 共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒载体、重组腺病毒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了IRES介导的共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒载体及重组腺病毒。是先将CTLA4Ig基因、IRES基因和CTLA4基因顺次插入pAdTrack-CMV穿梭载体中巨细胞病毒启动子的下游，得到携带CTLA4Ig基因、IRES基因和CTLA4基因的重组穿梭载体，再将该重组穿梭载体与病毒骨架载体pAdeasy-1进行同源重组后得到的共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒载体；将该重组腺病毒表达载体转染包装细胞—人胚肾293细胞得到重组腺病毒，重组腺病毒体外感染哺乳动物细胞可使目的细胞具有免疫抑制作用。本发明将在医学领域，尤其是器官移植领域中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒载体、重组腺病毒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组腺病毒，特别是涉及IRES介导的共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒载体、重组腺病毒及其应用。

背景技术

移植是末期组织器官功能衰竭的根治性治疗手段。受者对移植物的排斥是移植成功的主要障碍。近年来，免疫抑制剂的应用推动了器官移植的发展，但是，长期应用免疫抑制剂所引起的多种毒副作用，不仅严重影响了患者的长期生存质量，也极大地限制了器官移植的开展。诱导供者特异性免疫耐受为最终摆脱非特异免疫抑制剂的毒副作用提高受者生存质量带来了希望。随着基因转移技术的迅速发展及基因治疗理论和实践的不断完善，基因治疗逐渐成为在分子水平研究移植免疫耐受的重要手段。

T细胞是移植排斥的主要效应细胞，防止同种异型反应T细胞活化是防止移植排斥发生的主要途径。T细胞活化增殖必须同时存在MHC/抗原肽-TCR和协同刺激信号，阻断协同刺激信号将导致T细胞无能、凋亡或克隆丢失而引发免疫耐受。B7/CD28途径在协同刺激信号通路中的作用最为肯定，干预该途径诱导特异性耐受已成为移植免疫调节的基本思路。作为T细胞表面B7分子的另一个配体，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)与B7分子的亲和力较CD28高数十倍而优先结合B7分子并传递负调控信号，从而阻断T细胞活化。CTLA4-Ig是CTLA-4胞外段与IgG Fc段的融合蛋白，与细胞表面的B7分子结合起到封闭作用，通过阻断B7/CD28协同刺激通路而达到抑制T细胞活化的目的。

内部核糖体进入位点(internal ibosome entry site，IRES)是小RNA病毒类中5’端非翻译区中的一段序列，其二级结构和三级结构构成了蛋白质翻译过程中核糖体的登陆平台，40s核糖体亚单位可以不依赖5’端帽子结构而在内部结合到mRNA上，从而直接对其后的结构基因进行翻译。IRES的这一特点可应用于构建同时表达两个基因的双顺反子真核表达载体。

腺病毒(Adenovirus，Ad)载体系统具有如下特点：a、病毒基因组不整合到宿主的基因组中，也就不会影响宿主结构基因的正常表达；b、可插入较大的外源基因片段(8.5kb)；c、可感染分裂细胞也可感染非分裂细胞，感染谱比较广；d、瞬时表达而不是终身表达，另外载体上带有GFP(绿色荧光蛋白)报告基因，可以通过绿色荧光蛋白的示踪很直观地观察到外源基因的表达。由于腺病毒载体在哺乳动物及其多种细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性，使其在基因治疗的研究中受到人们的青睐，成为当今使用最多的病毒载体之一。

发明内容：

本发明的一个目的是提供一种IRES介导的共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒载体。

本发明所提供的共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒载体，是先将CTLA4Ig基因、IRES基因和CTLA4基因顺次插入pAdTrack-CMV穿梭载体中巨细胞病毒(CMV)启动子的下游，得到携带CTLA4Ig基因、IRES基因和CTLA4基因的重组穿梭载体，再将该重组穿梭载体与病毒骨架载体pAdeasy-1共转化细菌后得到的携带有CTLA4Ig和CTLA4基因的腺病毒质粒载体。

该腺病毒质粒载体为胞外分泌性表达CTLA4Ig，所述CTLA4Ig基因的5’端还连接有抑瘤素M信号肽编码序列。

所述携带CTLA4Ig基因、IRES基因和CTLA4基因的重组穿梭载体与病毒骨架载体pAdeasy-1共转化的细菌为E.coli BJ5183，随后，在该细菌内进行同源重组。

具体来讲，所述共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒载体可简称为pAdeasy-CIC。

本发明的另一个目的是提供一种共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒。

本发明所提供的共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒，将上述共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒载体转染包装细胞-人胚肾293细胞(HEK 293)得到的。

所述共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒载体可通过脂质体介导法转染人胚肾293细胞。

所述共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒感染的哺乳动物细胞也属于本发明的保护范围。

所述哺乳动物细胞可包括干细胞(如骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞等)、组织细胞、树突细胞和骨髓单个核细胞等。

本发明公开了一种由IRES介导的CTLA4Ig(分泌型)及CTLA4(膜结合型)双基因共表达的重组腺病毒载体及共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒。所述重组腺病毒是将本发明携带有CTLA4Ig及CTLA4基因的双顺反子腺病毒质粒载体转染包装细胞得到的。该重组腺病毒可高效感染哺乳动物细胞(如干细胞或组织细胞等)，并在IRES的介导下同时表达分泌型CTLA4-Ig和膜结合型的CTLA4。实验证明，受本发明重组腺病毒体外感染的大鼠骨髓间充质干细胞，可分别在基因水平和蛋白水平检测到CTLA4Ig及CTLA4的共表达，同时，利用CTLA4的免疫抑制作用，可以两种形式同时阻断抗原特异性T细胞活化所需的B7/CD28协同刺激信号，使T细胞活化受阻，从而使得被感染的细胞具有抑制免疫反应的作用。若将本发明的重组腺病毒应用于器官移植中(如制成免疫抑制剂，包括实验制剂和药物)，可抑制移植排斥反应的发生，诱导供者特异性免疫耐受，从而减少或最终摆脱非特异免疫抑制剂的应用，为提高受者生存质量带来了有利保障。本发明将在医学领域，尤其是器官移植领域中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1A为通过RT-PCR从活化的大鼠脾细胞中获得CTLA4全长、CTLA4胞外段及IgGFc段基因片段连接入pT-Easy载体的酶切鉴定结果

图1B为构建携带CTLA4Ig融合基因质粒pIRES2-CTLA4Ig酶切鉴定结果

图1C为构建重组腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CIC的酶切鉴定结果

图1D为构建重组腺病毒质粒pAdeasy-CIC的酶切鉴定结果

图2为重组腺病毒质粒pAdeasy-CIC在293A细胞中包装的显微镜观察结果

图3A为经纯化及传代培养的大鼠骨髓间充质干细胞的细胞形态

图3B为重组腺病毒Ad-CIC感染大鼠骨髓间充质干细胞感染效率的流式细胞术鉴定结果

图3C为重组腺病毒Ad-CIC感染大鼠BMDMSCs后GFP表达的荧光显微镜观察结果

图3D为转基因BMDMSCs CTLA4Ig和CTLA4共表达的RT-PCR鉴定结果

图3E为转基因BMDMSCs CTLA4Ig和CTLA4共表达的Western Blotting鉴定结果

图4为单向混合淋巴细胞反应检测转基因BMDMSCs免疫抑制功能的鉴定结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。

所用引物、DNA序列合成及DNA序列测定均由上海英骏公司完成。

实施例中描述到的的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用；在产业实施中，来源于大鼠、小鼠、猪或人等哺乳动物的各种细胞均为离体的，并包括从细胞库中取得、或商业购买获得，还包括按照已有文献的介绍制备获得，以及经可以商业获取的多种干细胞用已知方法诱导而来的。

实施例1、构建分泌性表达CTLA4Ig和膜结合型表达CTLA4的腺病毒质粒载体pAdeasy-CIC

一、大鼠CTLA4全长、CTLA4胞外段和IgGFc段基因片段的获得

取雄性Wistar大鼠(购自军事医学科学院动物中心)，拉颈处死，在无菌条件下摘取脾脏，用眼科弯镊挤压脾脏组织，过400目筛网收集脾细胞悬液于50mL离心管中，离心，弃上清，洗涤细胞沉淀，用含10％胎牛血清的RPMI1640(Sigma公司产品)培养液(预先加入青-链霉素100U/mL)重悬细胞。将分离得到的脾细胞按2×10⁶/cm²的浓度接种于50mL塑料培养瓶内，向其中加入刀豆蛋白A(ConA，购自Sigma公司)至终浓度为5μg/mL，置于37℃、5％CO₂和饱和湿度的孵箱中进行培养，培养72h后，离心，洗涤细胞。将细胞收集于1.5mL EP管中，加入1mL TRizol试剂(购自Invitrogen公司)并参照试剂盒说明书提取ConA刺激增值细胞的总RNA，然后以提取的总RNA为模板，反转录其中的mRNA为cDNA，20μl反转录体系及反应条件为：5×AMV反转录缓冲液4μl，dNTPs(10mM)2μl，RNAse抑制剂0.5μl，olig dT 1μl，AMV反转录酶2μl，mRNA 0.2μl，DEPC处理水10.3μl，42℃反应1h。根据GeneBank公布的大鼠CTLA4(GenBank号：NP_113862)及IgGFc段(GenBank号：X07189)序列分别设计并合成引物，引物序列如下：

扩增CTLA4全长的引物：

p1(上游引物)：5’-CATCCATGGCTTGTCTTGGACTCCAGA-3’

p2(下游引物)：5’-TAAGCATGCCTCGAGTCAGTTGATTGGAATAAAATAAGGTTG-3’；

扩增IgGFc段的引物：

p3(上游引物)：5’-ACTCCGCGGATTGAGCCCAGAAGACCCAA-3’

p4(下游引物)：5’-ACTGGATCCGTCGACCTATTTACCAGGAGAGCGGGACA-3’；

扩增CTLA4胞外段的引物：

p5(上游引物)：5’-GTGACCCAACCTTCAGTGGTG-3’

p6(下游引物)：5’-ACTCCGCGGGTCTGAATCTGGGCATGGTTC-3’。

以合成的cDNA为模板，分别在上述三对引物的引导下进行PCR扩增，20μl PCR反应体系为：10×PCR缓冲液2μl，dNTPs(2.5mM)1.6μl，上、下游引物各0.5μl，模板4μl，rTaq酶0.2μl，重蒸水11.2μl。反应条件均为：先94℃ 40s，51℃ 40s，72℃ 40s，共30个循环；最后一个循环结束后延伸7min。PCR反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果扩增获得了CTLA4全长、CTLA4胞外段和IgGFc段的特异性片段，大小分别为692bp、378bp、716bp。切胶回收PCR扩增产物，将三个回收片段分别连入pGEM-T-Easy载体(购自Promega公司)中，然后将连接产物分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过100μg/mL氨苄青霉素抗性筛选及“蓝白筛选”，挑取阳性克隆，摇菌，提质粒，用EcoR I对携带有不同目的片段的重组质粒进行单酶切鉴定，结果如图1A所示(泳道1：DL2000 marker，泳道2：CTLA4全长，泳道3：IgGFc段，泳道4：CTLA4胞外段)，携带有CTLA4全长的重组质粒(命名为pT-Easy-CTLA4)可获得692bp的酶切片段，携带有CTLA4胞外段的重组质粒(命名为pT-Easy-CTLA4胞外段)可获得378bp的酶切片段，携带有IgGFc段的重组质粒(命名为pT-Easy-IgGFc)可获得716bp的酶切片段，与预期结果一致。再对三种质粒进行序列测定，结果与GeneBank公布的大鼠CTLA4全长、CTLA4胞外区和IgGFc段的基因序列完全一致，表明获得了序列正确的大鼠CTLA4全长、CTLA4胞外段和IgGFc段基因片段。

二、5’端连接有抑瘤素M信号肽编码序列的CTLA4Ig融合基因的获得

根据GeneBank公布的去除信号肽的大鼠CTLA4胞外区编码序列及抑瘤素M信号肽编码序列(GenBank号：NM_020530)设计引物，引物序列如下：

p6：5’-ACTCCGCGGGTCTGAATCTGGGCATGGTTC-3’；

p8：5’-CTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGTGACCCAACCTTCAGTGGTG-3’；

p9：5’-CAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGC-3’；

p10：5’-TCAGAATTCAGATCTATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTC-3’。

经过三次PCR扩增，引物分别为p8+p6，p9+p6和p10+p6，第一次PCR反应以步骤一获得的CTLA4胞外区片段为模板，以后每一次PCR模板为前一次PCR扩增产物，50μl PCR反应体系为：10×Pyrobest Buffer缓冲液5μl，dNTPs(2.5mM)4μl，上、下游引物各1.5μl，模板6μl，Pyrobest DNA聚合酶0.25μl，重蒸水31.75μl。PCR反应条件均为：先94℃40s，53℃40s，72℃40s，共30个循环；最后一个循环结束后延伸7min。反应结束后，对最终PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，可见453bp的特异性条带出现，与预期结果一致。切胶回收该目的片段，并在末端加A尾，10μl反应体系及反应条件为：10×PCR缓冲液1μl，凝胶回收产物7μl，dATP(2mM)1μl，rTaq酶1μl，在72℃条件下反应30分钟。然后，将加尾产物连接于pGEM-T-Easy载体中，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过100μg/mL氨苄青霉素抗性筛选及“蓝白筛选”，挑取阳性克隆，摇菌，提质粒，进行序列测定，测定结果证实在CTLA4胞外段上游(5’端)成功引入抑瘤素M信号肽序列，将该融合基因命名为M信号肽-CTLA4胞外段，将携带有该融合基因的克隆载体命名为pT-M信号肽-CTLA4胞外段。

取质粒pT-M信号肽-CTLA4胞外段及pIRES2-EGFP(购自美国BD公司，先用EcoRI酶切，凝胶电泳回收两种质粒的EcoR I酶切产物，再用Sac II酶切该酶切产物，20μl酶切体系及反应条件分别为：(1)10×H Buffer2μl，EcoR I 1μl，质粒5μl，重蒸水12μl，37℃酶切2h；(2)10×T Buffer2μl，0.1％BSA 2μl，Sac II 1μl，质粒5μl，重蒸水10μl，37℃酶切2h。再凝胶电泳回收两种质粒的Sac II酶切产物。应用快速连接试剂盒(购自TaKaRa公司)对电泳回收的酶切片段进行连接反应，即将M信号肽-CTLA4胞外段片段连接入载体pIRES2-EGFP中，将该重组载体命名为pIRES2-CTLA4胞外段，12μl连接体系及连接条件为：质粒酶切片段3μl，插入片段3μl，Solution I 6μl，混匀后在16℃水浴中反应30分钟。反应结束后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过25μg/mL卡那霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，摇菌，提质粒，用EcoRI及Sac II进行双酶切鉴定，结果经酶切获得了453bp和5.3kb的DNA片段，与预期结果相符。先后用BamH I和Sac II分别酶切上述重组质粒pIRES2-CTLA4胞外段及pT-Easy-IgGFc质粒，20μl酶切体系及反应条件分别为：(1)10×K Buffer 2μl，BamH I 1μl，质粒10μl，重蒸水7μl，混匀后，37℃酶切2h；(2)10×T Buffer 2μl，0.1％BSA 2μl，Sac II 1μl，质粒10μl，重蒸水5μl，混匀后，37℃酶切2h。反应结束后，对两种质粒的双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收5.3kb的pIRES2-CTLA4胞外段酶切片段及716bp的pT-Easy-IgGFc酶切片段，用快速连接试剂盒对两酶切片段进行连接反应，即将IgGFc片段插入质粒pIRES2-CTLA4胞外段的下游，得到含有CTLA4Ig融合基因(5’端连接有抑瘤素M信号肽序列)的重组载体，命名为pIRES2-CTLA4Ig，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过25μg/mL卡那霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，摇菌，提质粒，用EcoRI和BamH I进行双酶切鉴定，鉴定结果如图1B所示(泳道1为DL2000 marker，泳道2、3、4为pIRES2-CTLA4Ig酶切片段)，经酶切得到了大小约1170bp的特异性条带，与预期结果相符。将该重组质粒-20℃保存备用。

三、构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CTLA4Ig-IRES2-CTLA4(pAdTrack-CIC)

用Sal I和Bgl II分别双酶切腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV(购自美国stratagene公司)和质粒pIRES2-CTLA4Ig，20μl酶切体系及反应条件为：10×HBuffer 2μl，质粒10μl，Sal I 1μl，Bgl II 1μl，重蒸水6μl，混匀，37℃水浴反应2h。反应结束后，对两种双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，分别回收线性化的pAdTrack-CMV穿梭质粒和CTLA4Ig融合基因片段(5’端连接有抑瘤素M信号肽序列)，应用快速连接试剂盒将CTLA4Ig融合基因片段连入线性化的穿梭质粒pAdTrack-CMV中，连接体系及反应条件为：pAdTrack-CMV质粒4μl，CTLA4Ig片段6μl，Solution I 10μl，在16℃水浴中反应30分钟。反应结束后，取2μl连接产物常规转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过25μg/mL卡那霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，摇菌，提质粒，用Sal I和Bgl II进行双酶切鉴定，结果经酶切得到了大小约1170bp的特异性条带，与预期结果相符。将该携带有CTLA4Ig融合基因片段(5’端连接有抑瘤素M信号肽序列)的重组质粒命名为pAdTrack-CTLA4Ig。-20℃保存质粒备用。

挑取前述“蓝白筛选”平板上的蓝色克隆，此为自身环化的pGEM-T-Easy载体，摇菌，提取质粒。用Sph I和Nco I双酶切步骤一获得的CTLA4全长基因片段，20μl酶切体系及反应条件为：10×K Buffer 2μl，质粒10μl，0.1％BSA 2μl，Sph I1μl，Nco I 1μl，重蒸水5μl，混匀，37℃水浴反应2h。然后，应用快速连接试剂盒通过这两个位点将CTLA4全长基因片段连接入自身环化的pGEM-T-Easy载体中，得到携带CTLA4全长基因片段的正向重组质粒，命名为pT-CTLA4。再用EcoR I和Nco I双酶切pT-CTLA4和pIRES2-EGFP，酶切体系同上。酶切后，对两种酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收585bp的IRES2片段与692bp的pT-CTLA4双酶切产物，再将两者连接，10μl连接体系及连接条件为：pT-CTLA4双酶切产物1μl，IRES23μl，T₄DNA连接酶1μl，2×连接buffer 5μl，混匀后，4℃连接过夜(12-24小时)。反应结束后，将连接产物常规转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过100μg/mL氨苄青霉素素抗性筛选，挑取阳性克隆，摇菌，提质粒，用EcoR I和Nco I进行双酶切鉴定，结果经酶切得到了大小约1276bp的特异性条带，与预期结果相符。将该携带有IRES2基因和CTLA4全长基因片段(命名为IRES2-CTLA4)的重组质粒命名为pT-IRES2-CTLA4。-20℃保存质粒备用。

用Sal I和Xho I分别对重组质粒pT-IRES2-CTLA4和pAdTrack-CTLA4Ig进行双酶切，20μl酶切体系及反应条件为：10×H Buffer 2μl，质粒10μl，Sal I 1μl，Xho I 1μl，重蒸水6μl，混匀，在37℃水浴中反应2h。反应结束后，对两种双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，分别回收1.0kb的线性化重组穿梭质粒pAdTrack-CTLA4Ig和1276bp的IRES2-CTLA4片段，然后以3∶1的摩尔比将IRES2-CTLA4片段连接入线性化的质粒pAdTrack-CTLA4Ig中，10μl连接体系及连接条件为：pAdTrack-CTLA4Ig 1μl，IRES2-CTLA4片段3μl，T₄DNA连接酶1μl，2×连接buffer 5μl，混匀后，4℃连接过夜。反应结束后，将连接产物常规转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过25μg/mL卡那霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，接种于5mL LB液体培养基(含25μg/mL卡那霉素)中在37℃下摇菌过夜，提质粒，用XhoI和Bgl II进行双酶切鉴定，结果如图1C所示(泳道1为DL15000 DNA marker，泳道2、3、4、5、6、7、8为重组质粒酶切片段)，经酶切得到了大小约2483bp的特异性条带，与预期结果相符。将该携带有目的基因片段的腺病毒穿梭质粒命名为pAdTrack-CTLA4Ig-IRES2-CTLA4(简称pAdTrack-CIC)。-20℃保存质粒备用。

四、细菌内同源重组获得腺病毒质粒pAdeasy-CIC

用冰WB液(10％超纯甘油+90％无菌水)制备大肠杆菌BJ5183感受态细菌，40μl/EP管分装，-70℃保存备用。用限制性内切酶PmeI(购自Biolab公司)切重组穿梭质粒pAdTrack-CIC，使其线性化，反应体系及反应条件为：穿梭质粒1μg，1％BSA 0.2μl，10×NEB Buffer 42μl，PmeI 1μl，添加双蒸水至20μl，在37℃下孵育2h。反应结束后，用70％乙醇沉淀线性化质粒，室温干燥15min后，溶于5μlddH₂O中。再将线性化的穿梭质粒pAdTrack-CIC与100ng超螺旋腺病毒骨架质粒pAdEasy-1(购自美国stratagene公司)用电穿孔法共转化至40μl大肠杆菌BJ5183感受态细胞中进行同源重组，电转化条件为：2500V，200Ω，25μF。然后，将菌液从电转杯中移入EP管中，添加900μl LB液体培养基，在37℃下温和振摇(150r/min)培养45min。分别取100μl、200μl、300μl菌液涂布于含25μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上，在该受体菌中pAdTrack-CIC与pAdEasy-1的同源序列之间同源重组，重组后的质粒由原来的pAdEasy-1氨苄青霉素抗性变为卡那霉素抗性，因此只有重组体或pAdtrack-CMV才具有卡那霉素抗性。将抗性平板置于37℃下孵育16-20h。选取在卡那霉素抗性平板上长出的8个小克隆，分别接种于5mL含25μg/mL卡那霉素的LB培养液中，在37℃下摇菌过夜。培养结束后，提取质粒，通过0.7％琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定，结果重组质粒均大于40kb，与预期结果相符。根据电泳结果，选取重组质粒，用限制性内切酶Pac I(购自Biolab公司)进行单酶切，酶切反应体系及反应条件为：重组质粒1μg，1％BSA 0.2μl，10×NEB Buffer1 2μl，PacI 1μl，添加双蒸水至20μl，在37℃下孵育2h。反应结束后，对酶切产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如1D所示(泳道1为DL15000 DNA marker，泳道2、3、4、5为酶切片段)，经酶切可以产生4.5kb小片段及38.6kb的大片段，检测结果证明成功构建了携带有CTLA4Ig融合基因(5’端连接有抑瘤素M信号肽序列)、IRES2基因和CTLA4全长基因片段(命名为CTLA4Ig-IRES2-CTLA4)的重组腺病毒质粒，命名为pAdeasy-CIC。将经鉴定的阳性重组子二次转化至大肠杆菌DH 5α感受态细胞，提取重组腺病毒质粒pAdeasy-CIC，用Pac I酶切5μg重组腺病毒质粒使其线性化，酶切条件为：在37℃下孵育2h。向其中加入等体积酚/氯仿，混匀，4℃、12000rpm离心2min。将上清转移至另一EP管中，加2倍体积的无水乙醇，振荡混合，室温放置2min，然后4℃，12000rpm离心5min。去除上清，再向沉淀中加入70％乙醇，混匀，4℃、12000rpm离心5min。去除上清，室温干燥沉淀15min。最后，向沉淀中加入50μl无菌TE缓冲液溶解质粒，贮存于-20℃备用。

实施例2、脂质体介导重组腺病毒质粒pAdeasy-CIC转染人胚肾293A细胞进行病毒包装及扩增与滴度测定

一、脂质体介导重组腺病毒质粒pAdeasy-CIC转染人胚肾293A细胞进行病毒包装

在准备转染前1天，用60mm平皿中接种7.5×10⁵人胚肾293A细胞(购自南京凯基生物有限公司))，置于37℃、CO₂培养箱中培养。转染前3-4h进行换液，以保证细胞呈指数生长(加5mL培养基)；准备转染用实施例1获得的线性化质粒pAdeasy-CIC和脂质体Lipofectamine 2000(购自Invitrogen公司)：(1)用500μl无血清DMEM培养液(购自Sigma公司)稀释15-20μg线性化pAdeasy-CIC质粒DNA；(2)用500μl无血清DMEM稀释20μl脂质体Lipofectamine 2000，轻轻混匀，不超过5min；(3)将(1)和(2)混匀(轻弹)作用20min(不超过30min)。将线性化pAdeasy-CIC质粒DNA与脂质体混合物加入培养皿中，轻轻混匀后，置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育10-12h。弃掉培养基，洗1-2次，改用含5％胎牛血清的DMEM培养基5mL，在相同条件下继续培养48h后，换新培养基DMEM(含5％胎牛血清)，用荧光显微镜观察重组腺病毒(命名为Ad-CIC)的产生，腺病毒的产生可通过其表达的GFP进行监测。在脂质体介导转染7-10天后，可以清楚地看到细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)的发生，即细胞开始聚集并且从平皿上脱落，当所有细胞都出现该现象就认为完全发生了CPE。完全的CPE发生在转染后10-14天出现，结果如图2所示(A为光镜下结果，B为荧光显微镜下结果)。在完全CPE后收集细胞，于-70℃和37℃之间反复冻融3-4次，然后4℃、5000rpm离心10min，去除细胞碎片，将包装好的腺病毒毒液进行分装，100μl/管，冻存于-70℃备用。

二、重组腺病毒的扩增

将293A细胞接种于60mm平皿中，单层培养36h达90％融合时(约5-10×10⁵/平皿)，吸去单层细胞培养基，小心加入50μl步骤一获得的重组腺病毒Ad-CIC毒液，并添加无血清DMEM培养液，使之刚好覆盖到有细胞的平皿。小心晃匀，在37℃、5％CO₂培养箱中培养20min后，再将培养液晃匀；培养2h后，小心加入5mL新配制的含5％胎牛血清的DMEM培养基；培养3-4天，用荧光显微镜观察GFP表达情况及细胞的CPE现象。待细胞完全CPE后，收集细胞悬液，反复冻融3次，将重组腺病毒Ad-CIC从胞体上释放出来，4℃、5000rpm低速离心10min，去除细胞碎片。为得到滴度更高的病毒，如此反复“感染-收集-冻融”3次。将最终获得的腺病毒毒液分装后-70℃冻存。

三、重组腺病毒Ad-CIC的滴度测定(TCID50法)

收集293A细胞，用含2％胎牛血清的高糖DMEM培养液稀释细胞，使其浓度为1×10⁵/mL。取两个96孔板，每孔分别加入100μl细胞悬液(1×10⁴/孔)，置37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。取Ad-CIC毒液100μl稀释于990μl的培养液(2％胎牛血清的高糖DMEM)中(10²倍稀释)，混匀后，取200μl稀释于1.8mL培养液中(10³倍稀释)，如此进行系列稀释，直至10¹⁰倍稀释。向96孔板每排前10个孔加入100μl稀释好的病毒液，A排-G排孔的病毒稀释度依次为10³，10⁴，10⁵-10¹⁰倍。每排孔的病毒稀释倍数相同。向各排孔加毒液时，要从高稀释倍数开始，余孔加100μl培养液作阴性对照。将2个96孔板置37℃、5％CO₂培养箱中培养10天。10天后，在显微镜下计数每排发生CPE孔数的比例，带入公式：T＝10^1+d(s-0.5)TCID50/mL(T滴度，D＝Log稀释倍数，S＝阳性比例的总和)，将TCID50/mL转化为PFU/mL的公式为：TCID50/mL＝1×10^-0.7PFU/mL。最后测得收获的重组腺病毒Ad-CIC的滴度为6.1×10⁷PFU/mL。

实施例3、检测重组腺病毒Ad-CIC体外转染目的细胞的转染效率、表达情况以大鼠骨髓间充质干细胞(BMDMSCs)为例，检测本发明重组腺病毒Ad-CIC体外感染目的细胞(哺乳动物细胞)的感染效率、目的基因的表达鉴定，具体检测方法如下：

一、大鼠骨髓间充质干细胞(BMDMSCs)的分离

取雄性LEWIS大鼠(购自北京维通利华实验动物中心)，拉颈处死后浸入75％酒精10分钟。用无菌剪刀等手术器械分离大鼠股骨，用注射器吸取低糖DMEM培养液(购自Sigma公司)反复冲洗骨髓腔至颜色发白(约3-4次)。用400目筛网过滤冲洗液，离心，弃上清，收集细胞。将骨髓细胞沉淀用PBS重悬，然后将其轻轻叠加到密度为1.083g/mL的大鼠淋巴细胞分离液(购自TBD公司)上，1800rpm离心30分钟(室温下)，小心吸取界面间的乳白色单个核细胞层，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液(预先加入青-链霉素100U/mL)中充分混匀，离心，弃上清，洗涤细胞沉淀。将分离的细胞按2×10⁵/cm²的浓度接种于装有低糖DMEM完全培养液的50mL塑料培养瓶中，置于37℃、5％ CO₂和饱和湿度的孵箱中培养48h后更换新鲜培养液，弃掉未贴壁细胞，以后每隔2-3天换液一次。待细胞长到80％融合时，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞进行传代培养，方法为：用细巴斯德吸管将消化细胞吹打成单细胞悬液后，以1×10⁵/mL的浓度接种于新的低糖DMEM培养液中，每隔2-3天换液一次，细胞传代，细胞形态如图3A所示，表明得到了经纯化的BMDMSCs，备用。

二、重组腺病毒Ad-CIC体外感染BMDMSCs及感染效率的流式细胞术检测

1、MOI值(Multiplicity of Infection)测定

向六孔板的各孔中分别种入2×10⁵个293A细胞，常规培养24h后，分别用0、2、5、10、25、50μl Ad-CIC重组腺病毒毒液感染细胞，继续培养72h。在显微镜下观察，发现加入50μl病毒液的孔发生完全CPE，根据以下公式计算MOI值：

根据AdEasy Vector Systerm操作说明书提示，此病毒液的体积相当于MOI＝10-20，所以计算结果与粗略估计的病毒滴度相当。

2、重组腺病毒Ad-CIC体外感染BMDMSCs的感染效率测定

将扩增至第3代的大鼠BMDMSCs按2×10⁵/瓶接种于4个T 25-cm²的塑料培养瓶中，常规培养24h后，向各瓶依次加入MOI值为0、50、100、150的病毒量的重组腺病毒Ad-CIC毒液感染细胞，置37℃、5％CO₂培养箱中培养48h。培养结束后，用0.25％胰酶消化各瓶细胞，离心，洗涤，重悬于500μl的PBS缓冲液中，用流式细胞仪检测各管细胞的GFP的表达率。结果如图3B所示，MOI值为150时，感染效率可达到98.67％。

三、重组腺病毒Ad-CIC在BMDMSCs中的表达鉴定

1、GFP表达鉴定

用0.25％胰酶消化第3代大鼠BMDMSCs，按2×10⁵/瓶接种于4个T-25cm²的塑料培养瓶中，培养24h后，按MOI＝150的病毒量用Ad-CIC感染细胞，分别培养1、3、7、14天后在荧光显微镜下观察GFP的表达情况，结果如图3C所示，感染24h即有GFP表达，在第3天时表达量最强，以后逐渐开始减弱，在第14天时仍有表达。

2、RT-PCR鉴定基因水平CTLA4Ig及CTLA4的共表达

按MOI＝150的病毒量用Ad-CIC感染第3代大鼠BMDMSCs，常规培养3天，用TRIZOL试剂并参照试剂盒说明书提取被感染细胞的总RNA，然后以提取的总RNA为模板，反转录其中的mRNA为cDNA，20μl反转录体系为：5×AMV反转录缓冲液4μl，dNTPs(10mM)2μl，RNAse抑制剂1μl，AMV反转录酶0.5μl，mRNA 2μl，重蒸水11.5μl。然后以合成的cDNA为模板，分别在CTLA4Ig引物P1(上游引物)：5’-ATGGGGGTACTGCTCACACA-3’及P2(下游引物)：5’-CTATTTACCAGGAGAGCGGGA-3’和CTLA4全长引物P1(上游引物)5’-CATAGATCTATGGCTTGTCTTGGACTCCAGA-3’及P2(下游引物)5’-TAACTCGAGTCAGTTGATTGGAATAAAATAAGGTTG-3’的引导下进行PCR扩增，20μl PCR反应体系为：10×PCR缓冲液2μl，dNTPs(2.5mM)1.6μl，正、反向引物各1μl，模板1μl，rTaq酶0.2μl，重蒸水13.2μl。同时，以大鼠β-actin基因为参照，用于扩增大鼠β-actin基因的引物序列为P3’(上游引物)：5’-AGAAAATCTGGCACCACACC-3’和P4’(下游引物)：5’-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3’。PCR反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3D所示(泳道1、7为DL15000 DNA marker，泳道2为Ad-CTLA4全长感染BMDMSCs，泳道3为Ad-CIC感染BMDMSCs，泳道4为Ad-CTLA4Ig感染BMDMSCs，Ad-GFP感染BMDMSCs，泳道5为BMDMSCs)，可见大小约为1170bp的特异性条带出现，表明目的基因CTLA4Ig(1170bp)和CTLA4全长(692bp)在经Ad-CIC感染的大鼠BMDMSCs的mRNA水平上均获得表达，且前者的表达量明显高于后者。

3、Western blotting鉴定蛋白水平CTLA4Ig及CTLA4的共表达

按MOI＝150的病毒量用Ad-CIC感染第3代大鼠BMDMSCs，常规培养3天后，取10⁷个被重组腺病毒Ad-CIC感染的大鼠BMDMSCs，并以Ad-GFP(用上述相同方法获得的不含外源基因CTLA4Ig-IRES-CTLA4基因，仅含有GFP基因的重组腺病毒)、Ad-CTLA4Ig(用上述相同方法获得的不含外源基因IRES-CTLA4，仅含有GFP基因和CTLA4Ig基因的重组腺病毒)、Ad-CTLA4(用上述相同方法获得的不含外源基因CTLA4Ig基因和IRES基因，仅含有GFP基因和CTLA4全长基因的重组腺病毒)感染的大鼠BMDMSCs作对照，分别加入200μl RAPA细胞裂解液(50mM Tris，150mMNaCl，5mM EDTA，1％NP40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，1mM PMSF，10μg/mL aprotinin，1mM NaVO4)在4℃下裂解过夜，然后12000rpm离心30分钟，吸取上清，用BCA法测定蛋白浓度为4900μg/mL。然后，取等量的经不同重组腺病毒感染的细胞裂解液进行不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，再用半干式转印的方法将蛋白质转移至PVDF膜上，接着用5％脱脂奶粉封闭2小时，一抗均为兔来源抗CTLA4抗体(购于santa cruz公司)，4℃孵育过夜(12-24小时)，用TBST洗膜3次，每次10分钟，然后加入辣根过氧化物酶偶连的抗兔二抗(购于中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育1小时后，用TBST洗膜4次。最后，用ECL化学发光检测试剂盒(购自Santa Cruz公司)于暗室自显影。检测结果如图3E所示，发现被本发明重组腺病毒Ad-CIC感染的大鼠BMDMSCs中同时表达有CTLA4Ig和CTLA4全长蛋白，而对照组未出现CTLA4Ig和CTLA4全长蛋白共表达，与预期结果相符，从而在蛋白水平上证明CTLA4Ig和CTLA4全长在经Ad-CIC感染的大鼠BMDMSCs中获得表达。

实施例4、检测被重组腺病毒Ad-CIC体外转染的目的细胞的免疫抑制功能(混合淋巴细胞反应，mixed lyphocyte response，MLR)

以大鼠骨髓间充质干细胞(BMDMSCs)为例，检测本发明重组腺病毒Ad-CIC体外感染目的细胞(哺乳动物细胞)后，目的细胞的免疫抑制功能。

按MOI＝150的病毒量用Ad-CIC感染感染扩增至第3代的大鼠BMDMSCs 24h后，依次用0.25％胰酶和0.02％EDTA消化受感染的BMDMSCs，离心，洗涤，加入丝裂霉素C(终浓度为25μg/mL)，再将感染细胞置于37℃，5％CO₂孵箱中孵育30min。然后，洗涤细胞3次，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液重悬细胞，按1×10⁵/孔、1×10⁴/孔、1×10³/孔的密度接种到96孔板中，在相同条件下继续培养过夜。同时以同样密度接种的重组腺病毒Ad-CTLA4Ig感染的大鼠BMDMSCs作为对照。

拉颈处死LEWIS大鼠(购自北京维通利华实验动物中心)及DA大鼠(购自哈尔滨医科大学实验动物中心)各1只，无菌剖取其脾脏分离脾细胞。向DA大鼠脾细胞重悬液中加入丝裂霉素C(终浓度为25μg/mL)，置37℃、5％CO₂孵箱中孵育30min，洗涤3次，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为1×10⁷/mL，用作MLR的刺激细胞。将LEWIS大鼠脾细胞作为反应细胞，同样用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为1×10⁷/mL。吸去上述预先接种有转基因大鼠BMDMSCs的96孔板中的培养液，然后向每孔中分别加入100μl的反应细胞和刺激细胞悬液建立混合淋巴细胞培养体系，混匀后将96孔板置于37℃，5％CO₂孵箱中培养56h，加³H标记的脱氧胸腺嘧啶核苷酸(³H-TdR，中国科学院原子能研究所)，标记16h，用细胞收集器收集细胞于滤纸上，烤干后，加入闪烁液，用液体闪烁计数仪(Beckman公司)检测cpm值，并进行比较分析。结果如图4所示(Control为阴性对照)，被腺病毒Ad-CIC感染的大鼠BMDMSCs具有抑制培养体系中反应细胞增值的作用，且其抑制作用强于被腺病毒Ad-CTLA4Ig感染的大鼠BMDMSCs，证明本发明共表达CTLA4Ig及CTLA4的腺病毒Ad-CIC可以更高效地阻断T细胞的活化，具有较强的免疫抑制功能，说明可用于制备免疫抑制剂，包括实验制剂和药物。

Claims (9)

1.共表达CTLA4Ig和CTLA4的腺病毒表达载体，是先将CTLA4Ig基因、IRES基因和CTLA4基因顺次插入pAdTrack-CMV穿梭载体中巨细胞病毒启动子的下游，得到携带CTLA4Ig基因、IRES基因和CTLA4基因的重组穿梭载体，再将该重组穿梭载体与病毒骨架载体pAdeasy-1共转化细菌后得到的携带有CTLA4Ig和CTLA4基因的腺病毒质粒载体；所述CTLA4Ig基因的5’端还连接有抑瘤素M信号肽编码序列。

2.根据权利要求1所述的腺病毒表达载体，其特征在于：所述携带CTLA4Ig基因、IRES基因和CTLA4基因的重组穿梭载体与病毒骨架载体pAdeasy-1共转化的细菌为E.coli BJ5183，随后，在该细菌内进行同源重组。

3.根据权利要求2所述的腺病毒表达载体，其特征在于：所述共表达CTLA4Ig和CTLA4的腺病毒表达载体命名为pAdeasy-CIC。

4.共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒，是将权利要求1-3任一项所述共表达CTLA4Ig和CTLA4的腺病毒表达载体转染人胚肾293细胞得到的。

5.受权利要求4所述的重组腺病毒感染的哺乳动物细胞。

6.根据权利要求5所述的哺乳动物细胞，其特征在于：所述哺乳动物细胞包括干细胞、组织细胞、树突细胞和骨髓单个核细胞。

7.根据权利要求6所述的哺乳动物细胞，其特征在于：所述干细胞为骨髓间充质干细胞或脂肪干细胞。

8.权利要求4所述的共表达CTLA4Ig和CTLA4的重组腺病毒在制备免疫抑制剂中的应用。

9.根据权利要求8所述应用，所述免疫抑制剂为实验制剂或免疫药物。

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