CN1247794C - 人角质细胞生长因子-2的生产方法 - Google Patents

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黄阳滨
朱建欣
邱林峰
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Wuhan Guanggu Asia-Pacific Pharmaceutical Co.,Ltd.
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Abstract

本发明提供了一种生产人角质细胞生长因子的方法,包括步骤:(a)在适合的表达条件下,培养大肠杆菌工程菌,该工程细胞携带选自下组的表达载体:pSE280,pSE380和pSE420,且在所述表达载体的多克隆位点插入了人角质细胞生长因子的编码序列,从而表达出人角质细胞生长因子;(b)分离纯化出步骤(a)中表达的KGF-2。本发明方法不仅表达量高,而且分离纯化工艺简便。本发明还提供了相应的表达载体和工程菌。

Description

人角质细胞生长因子-2的生产方法
技术领域
本发明涉及人角质细胞生长因子-2(Keratinocyte Growth Factor-2,KGF-2)的生产方法,以及用于该方法的表达载体和宿主细胞。
背景技术
慢性创伤的治疗随着损伤的严重程度而变化。部分和全厚度损伤一般通过敷裹和用药物或手术清除坏死的组织即清创。抗生素可用来防止感染,部分厚度损伤到全厚度损伤代表了慢性损伤病人的最大类群,最需要KGF-2这样的细胞因子的治疗。全厚度损伤的病人损伤扩展到肌肉,肌腱或者骨头,有脓毒病的极大风险,通常采用外科治疗。慢性创伤的治疗一直是临床上难于解决的问题,没有有效的手段。美国每年有几乎3百万病人,欧洲也有接近的数目,该病的治疗是目前医疗上亟待解决的问题。最常见的慢性创伤包括静脉溃疡,糖尿病性溃疡和压力溃疡。
静脉溃疡是由于慢性静脉疾病引起的踝和下肢皮肤损伤,往往极为疼痛,其原因是低端血流减弱,郁积,静脉压力升高,导致浮肿和皮肤的轻微发红以及皮肤紧缩,逐渐发展到溃疡。
糖尿病性溃疡指糖尿病患者由于下肢缺血和神经病变造成的肢端慢性损伤;引起溃疡的起因可能仅是老茧、水泡或者是小石子和碎片等。由于血液供应不足,导致修复创伤组织和抵御感染能力减弱;同时,神经病变造成肢端敏感性降低,使得起初的损伤未被察觉,直到其发展为严重的慢性损伤。
压力溃疡定义为在身体的骨突出部位的组织由于未减轻的压力引起的损伤,即通常所说的褥疮。压力溃疡常见于不能活动的病人,由于骨与床和椅子等硬物表面挤压,组织受到连续的压力,造成皮肤的慢性损伤。除了不能移动,病人患压力溃疡的原因可能还与糟糕的营养状态、脱水以及其它抑制创口愈合的疾病等。
粘膜炎是指口腔、咽喉、胃肠道粘膜组织的炎症和溃疡。通常与癌症的化疗与放疗有关。常见的症状包括口腔溃疡、发红、和肿胀以及腹部绞痛,腹泻,胃肠道溃疡、出血等。防碍了患者进食摄取营养,导致脱水和营养不良,患者不得不采取输液、麻醉止痛、非肠道营养供应等治疗。同时,具有保护性作用的粘膜的损伤,可能使病人承受严重感染危险。严重的粘膜炎迫使癌症患者的放化疗剂量减少,限制了治疗计划实施,影响了治疗效果。粘膜炎粘膜炎影响大约15-40%接受正常剂量化疗病人和76-100%接受高剂量化疗的骨髓移植病人。粘膜炎也对所有的接受头颈部和胃肠道放疗的病人造成影响。
炎性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)包括了一些导致胃肠道损伤的慢性炎症。常见的是溃疡性大肠炎(ulcerative colitis,UC)和局限性回肠炎(Crohn′s disease,CD)。溃疡性大肠炎是以结肠直肠的粘膜急性炎症为特征的反复发作的慢性疾病。其特征是只发生于大肠,炎症仅限于黏膜,肠损伤常发生于临近区域。Crohn氏病能够影响胃肠道的任何区域,其特征是结构损伤发生于肠壁的所有结构层,到肠系膜(附着在小肠和到腹壁的其它器官的组织层)以及局部淋巴结,损伤呈片状或区段发生。
炎性肠病的临床病征包括腹部绞痛、直肠流血、持续腹泻、发烧和疲乏。一些病人不得不放弃工作,因为随时都需要卫生间。炎性肠病的病因和病理知之甚少,虽然外在的感染因素可能引发或造成炎性肠病,而且可以肯定免疫系统参与到组织的损伤,但是从已有的资料中可以清楚地看到,遗传因素决定着个体的易感程度。目前对炎性肠病的这两种类型尚无特效的治疗手段。手术(如造瘘术)通常用于特定的并发症(脓肿或梗阻)或严重的溃疡性结肠炎,消炎或免疫抑制药物则用于控制症状。
炎性肠病的治疗药物有5-aminosalicylic acid agents(5-ASA agents),类固醇,和免疫调节剂。可以抑制病人的炎症和免疫应答来组织进一步肠损伤。尽管采用了包括上述药物的综合治疗,许多病人仍然无法控制病情。目前的治疗带来的副作用使得疾病的治疗受到制约,使用aminosalicylates和一些免疫调节剂的副作用包括头疼、皮疹,使用类固醇的通常副作用是失眠、出汗、情绪变化、糖代谢的改变、体貌改变,过度的毛发生长、骨流失、白内障、肌肉虚弱。此外,这些组合治疗对于减轻症状仅仅是部分有效的。需要更为有效和患者能够良好耐受的治疗来减少炎性肠病的发生和严重程度。
上皮细胞几乎占人体细胞的三分之一,是人体皮肤的主要细胞类型,上皮细胞构成了口腔、咽喉、胃肠道和其它几个组织的表面组织以及毛囊组织。KGF-2能够促进上皮细胞的生长,当上皮组织受到损伤的时候表达被激活。其通过聚集成纤维细胞,胶原和结缔组织到创口位置,产生新的组织而使创口愈合。当皮肤损伤发生的时候,创口边缘形成厚的粉红色皮肤,结痂;当创口愈合后,皮肤恢复到正常厚度。
1996年,Yamasaki等(Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2000Nov;279(5))从鼠的胚胎中扩增到与角质细胞生长因子(Keratinocyte Growth Factor,KGF)具有高度同源的一种崭新的细胞因子,称为角质细胞生长因子-2(KGF-2),又叫做成纤维细胞生长因子-10(Fibroblast Growth Factor-10,FGF-10)。之后,Emoto等(J Burn Care Rehabil 2000Jan-Feb;21(1 Pt 1):5-9)克隆到人的KGF-2cDNA,其编码的蛋白由208个氨基酸组成,N端有37个氨基酸的疏水信号肽,成熟蛋白171个氨基酸(38-208aa),理论分子量为19.3kDa,对肝素具有较强的亲和作用。
KGF-2能特异性的结合于靶细胞表面的酪氨酸激酶受体FGFR2IIIb(KGFR)、FGFR1而触发信号传导,从而发挥生理作用。体外活性研究表明,在0.1-5nM(2-100ng/mL)浓度时对角质上皮细胞Bal/MK具有显著的促分裂作用,对成纤维细胞NIH3T3无作用,而在高于5nM的浓度时对NIH3T3同样具有显著的促进分裂和生长作用。研究表明,KGF-2 mRNA的表达主要是在胚胎的发育过程之中,以及在特定的成年组织如肺、前列腺。在胚胎发育过程中KGF-2是起始肢芽的形成及促进其生长的关键的细胞因子。在创口愈合的过程中KGF-2 mRNA高水平表达,动物试验结果表明,KGF-2在创口愈合中起着重要作用。
Han等(J Pathol 1999 Aug;188(4):431-8)利用消炎痛诱导小鼠小肠溃疡模型研究表明,KGF-2静脉注射显著降低急性和慢性肠损伤。其通过刺激上皮恢复和保护性的前列腺素产生来抑制小肠炎症;烧伤等需要大面积皮肤移植的病人,面临严重的代谢问题和感染致死的危险,Smith等(Pharmacol Exp Ther1999 Jul;290(1):464-71)用无胸腺裸鼠的皮肤移植试验模型,考查KGF-2对皮肤上皮形成动力学的影响,表明KGF-2对移植皮肤的愈合具有极为显著促进作用;Xia等(J Surg Res 1999 Feb;81(2):238-42)利用局部缺血损伤的兔耳真皮溃疡模型,考查KGF-2对创口愈合以及对疤痕形成的影响,结果表明KGF-2显著促进表皮细胞生长,提升上皮形成,此外增强肉芽组织的形成(KGF无此作用),较之KGF-1、TGF-beta等细胞因子,KGF-2最为有效且几乎不引起明显的疤痕;Miceli等利用硫酸葡聚糖钠盐诱导的鼠溃疡模型,发现KGF-2几乎完全恢复肠道表面的正常的细胞构造,表明了其对炎性肠病的临床治疗意义。Jimenez等通过小鼠背部皮肤切割创口模型研究表明,KGF-2对起始和加速外伤性创口愈合具有重要意义。
KGF-2已成功在大肠杆菌(E.coli)中表达,经动物实验证明其对创伤愈合的起始和加速均有明显作用。
Repifermin是HUMAN GEMNOME SCIENCES,Inc(HGS)开发的重组KGF-2的商品名。试验结果表明,在选定的剂量下,全身应用KGF-2是安全的,健康志愿者能够良好耐受,几乎无副作用。
对于将KGF-2用于治疗癌症治疗(骨髓移植前高剂量化疗)相关的粘膜炎II期临床试验结果表明,KGF-2治疗效果显著,病人能够良好耐受,基本没有副作用。因此,KGF-2的应用前景十分广阔。
目前,本领域中大肠杆菌表达KGF-2多以包含体形式,表达量占菌体总蛋白10-15%,需要变性、复性手段,工作量大,得率低,成本高。如HGS公司以pREP4质粒为载体,细菌OD600长至0.4-0.6即以IPTG诱导,诱导3-4小时后获取细菌,6M盐酸胍溶解,再纯化,此工艺KGF-2表达量不可能高,纯化工序又复杂(Ruben;Steven M.,et al.,Keratinocyte growth factor-2,US6077692)。
因此,本领域迫切需要开发高效和/或简便的生产KGF-2的方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高效和/或简便的生产KGF-2的方法。
本发明的另一目的是提供用于该方法的表达载体和宿主细胞。
在本发明的第一方面,提供了一种生产人角质细胞生长因子的方法,该方法包括步骤:
(a)在适合的表达条件下,培养大肠杆菌工程菌,该工程细胞携带选自下组的表达载体:pSE280,pSE380和pSE420,且在所述表达载体的多克隆位点插入了人角质细胞生长因子的编码序列,从而表达出人角质细胞生长因子;
(b)分离纯化出步骤(a)中表达的KGF-2。
在本发明的一优选例中,所述的表达载体是pSE380。
在本发明的另一优选例中,在所述载体的EcoR I/BamH I位点插入了人角质细胞生长因子的编码序列。
在本发明的另一优选例中,所述的人角质细胞生长因子的编码序列编码氨基酸序列SEQ ID NO:2所示的蛋白质,更佳地具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
在本发明的另一优选例中,所述的步骤(b)包括步骤:
(i)对发酵样品通过离心和/或过滤方式去除发酵清液,获得菌体;
(ii)破细胞,获得破菌液;
(iii)对破菌液进行离心以去除菌体碎片,获得破菌液上清液;
(v)层析纯化,所述的层析纯化选自:阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析、及其组合。
在本发明的另一优选例中,在步骤(iii)和(iv)之间,还包括步骤:通过盐析和/或超滤对破菌液上清液进行初步纯化。
在本发明的另一优选例中,所述的培养条件是:培养温度为30-40℃,更佳地34-38℃;葡萄糖或乳糖浓度为0-1.0%,更佳为0.2-0.5%;IPTG做诱导剂,浓度为0.1-1.5mM,且当含有乳糖时,乳糖与IPTG的搭配比例范围是1∶2-1∶4。
在本发明的第二方面,提供了一种表达载体,它是选自下组的表达载体:pSE280,pSE380和pSE420,且在所述表达载体的多克隆位点插入了人角质细胞生长因子的编码序列。
在本发明的一种优选所述的表达载体中,所述的人角质细胞生长因子的编码序列编码氨基酸序列SEQ ID NO:2所示的蛋白质,更佳地所述的编码序列具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
在本发明的第三方面,提供了一种大肠杆菌宿主细胞,该工程细胞携带选自下组的表达载体:pSE280,pSE380和pSE420,且在所述表达载体的多克隆位点插入了人角质细胞生长因子的编码序列。
具体实施方式
本发明人通过深入而广泛的研究,选择出适合KGF-2表达的载体,该载体有助于KGF-2真核基因在原核中的正确翻译,并以可溶性形式存在,从而不仅提高了KGF-2表达量,而且简化了分离纯化工艺,在此基础上完成了本发明。
适用于本发明的KGF-2,包括天然KGF-2及其突变蛋体。这些突变体包括KGF-2的N端缺失、增加或改变0-40个(较佳地0-5个)氨基酸,C端缺失、增加或改变0-20个(较佳地0-5个)氨基酸,分子内部变更0-20个(较佳地0-5个)氨基酸,但保持KGF-2的生物学活性的突变蛋白。
KGF-2cDNA序列是已知的,如SEQ ID NO:1所示,编码一个全长171个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO:2)。适用于本发明的KGF-2编码序列还包括SEQ ID NO:1序列的简并序列。如本文所用,“简并序列”是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质,但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
KGF-2的编码序列可以来源于基因文库,或根据文献报道的KGF-2 cDNA序列,全基因合成。还可以设计引物,通过PCR获得。
适用于本发明的载体包括表达质粒pSE280,pSE380或pSE420(Invitrogen)。
适用于本发明的宿主菌是大肠杆菌(E.coli)。
通常,在KGF-2 cDNA 5′端与3′端分别加起始密码子和终止密码子,并引入特异性酶切位点,然后克隆入表达质粒pSE280,pSE380或pSE420(Invitrogen),转化为与表达载体相容的大肠杆菌宿主菌如BL21(DE3),经筛选鉴定后获得工程菌。本发明的工程菌属于IPTG化学诱导型。
在本发明中,工程菌表达KGF-2的发酵条件没有特别限制。可以采用本领域常规的发酵条件。通常,工程菌在以蛋白胨、酵母粉、NH4Cl或(NH4)2SO4等为氮源,甘油、葡萄糖、乳糖等为碳源的基础培养基中,摇瓶内或发酵罐中进行培养、表达。
此外,通过控制添加各营养成分,控制培养、诱导阶段溶氧(DO)、pH、温度、时间、菌密度、比生长速率等因素,可以进一步提高表达量。
对于培养基的选择,通常包括氮源、碳源、无机盐、微量元素等的选择。
(a)氮源含有机氮源和无机氮源,其中有机氮源如蛋白胨、酵母粉,或二者的混合物,总浓度0.5-2.5%;无机氮源如NH4Cl、(NH4)2SO4等铵盐,浓度0-1.0%。
(b)无机盐包括磷酸盐、枸盐酸盐、Mg2+盐等。较佳地,磷酸盐缓冲体系浓度20-200mM,pH5-8;Mg2+盐0-5mM。
(c)根据M9培养基中的微量元素配方,微量元素可加0.1-2ml/L培液。
(d)碳源包括甘油、葡萄糖、乳糖等。可以是单一碳源,也可以是混合碳源。较佳地,碳源选自下组:甘油浓度为0.1-2%;乳糖浓度为0.1-2%;葡萄糖浓度为0.1-1%。
对于诱导剂而言,可以单独使用IPTG做诱导剂,浓度为0.1-1.5mM,也可以部分用乳糖代替。乳糖及IPTG的搭配比例范围从1∶2-1∶4(IPTG量0.1-1.5mM)。
对于诱导温度而言,诱导温度30-40℃,较佳地34-38℃,更佳地34-36℃,例如约35℃。
对于溶氧(DO)的控制而言,通常在30%以上。
在发酵表达KGF-2后,对表达的KGF-2进行分离。
通常,发酵样品先以离心、过滤等方式去除发酵液上清,获得菌体。缓冲溶液悬浮菌体后,以超声波破碎、高压机械破碎等方式进行完全破菌,获得破菌液。然后对破菌液进行离心以去除菌体碎片,获得破菌液上清液。破菌液上清含目的蛋白质KGF-2。破菌液上清可通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯化,也可直接进行层析纯化。
适用于本发明的层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
(a)凝胶过滤层析:样品超滤浓缩后,可以用凝胶过滤层析去盐及纯化。
(b)离子交换层析(阳离子交换层析、阴离子交换层析):
样品的缓冲系统以稀释、超滤、沉淀后复溶、透稀或凝胶过滤层析等手段进行更换,直至与对应的离子交换柱平衡液系统相似,且电导率小于4000uS/cm,直接上样,盐浓度梯度或pH梯度梯度洗脱。
(c)亲和层析:
选择肝素亲和凝胶介质,盐梯度或肝素梯度洗脱。
经过2-3步纯化,可得到KGF-2纯品,纯化得率65%以上,纯度95%以上,纯品得率约100mg/L发酵液。
纯化后KGF-2可用常规技术制成各种剂型。
在本发明的一个实例中,选择了有助于真核基因在原核细胞中正确翻译的质粒载体pSE系列,构建高效、稳定表达的KGF-2工程菌(大肠杆菌)。经高密度发酵培养,IPTG诱导,KGF-2以可溶形式分泌到胞浆;表达水平高,占菌体总蛋白20%左右,KGF-2表达量达150-200mg/L发酵液。由于表达水平较高,KGF-2又具有天然活性,避免了复杂的复性过程,通过简便、快速的二步纯化方法,即获得高质量的KGF-2纯品,每升发酵液可得KGF-2纯品100mg,产品纯度95%以上。
纯化后原液加入适当辅料,制成KGF-2的注射用粉针剂。初步稳定性试验表明,该粉针剂稳定。
中试研究表明,产品制造工艺稳定,操作简单,周期短,成本低,每升发酵液可获得KGF-2纯品100mg,采用30L发酵罐,批生产能力达15,000剂量(200ug/剂量)。适合产业化生产。
本发明的优点在于:
(1)表达工艺简单。
(2)表达量高。通过控制关键的发酵工艺条件,使表达水平高于目前报道的以包含体形式表达的水平。
(3)纯化工艺简便,回收率高。由于分泌蛋白不是以包含体形式表达,因此简化了纯化工序,使纯化回收率大大提高,使大规模生产重组KGF-2成为可能。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
KGF-2分泌表达系统的构建
1.目的基因的获得
表达质粒为pSE380(Invitrogen),宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
根据文献报道的KGF-2 cDNA序列,合成20段互补的寡核苷酸,并在5′端、3′端分别引入特异酶切位点EcoR I,BamH I,按分子克隆的常规方法,首先用T4噬菌体多核苷酸激酶37℃处理30min。磷酸化的各寡核苷酸片段以等mol数混合,94℃变性5min,立即变至65℃退火10min,然后加入T4连接酶,16℃反应过夜。
2.表达质粒pSE380-KGF-2的构建与转化宿主菌
pSE380质粒用EcoR I,BamH I双酶解后回收大片断,与合成的KGF-2 cDNA片断连接过夜,直接转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3),氨卞青霉素抗性筛选,得到阳性克隆株;小量制备质粒,用限制性内切酶鉴定筛选出含KGF-2全长cDNA序列的阳性克隆,即大肠杆菌BL21(DE3)/pSE3S0-KGF-2。用通用引物进行正、逆向序列分析,证实克隆序列与设计序列完全一致(SEQ ID NO:1)。
摇瓶试验,该工程菌培养后,经IPTG诱导2小时后,目的蛋白表达量占总蛋白10%左右。
同时还用相同方法将KGF-2编码序列克隆入pSE280和pSE420,并转入大肠杆菌如BL21(DE3),其表达量也与BL21(DE3)/pSE380-KGF-2相似。
实施例2
培养基选择
在该实施例中,对几种培养基进行选择(g/L):
  成分   1   2   3   4   5   6
  胰蛋白胨   16   10   5   16   10
  酵母提取物   5   10   5   10   10   2
  K2HPO4   7   2   5
  KH2PO4   8   1   3   2.7
  Na2HPO4   2.5   6   28.6
  (NH4)2SO4   5   0.6
  MgSO4·7H2O   2   1   2.5   2mM
  葡萄糖   5   5   2   10
  NH4Cl   0.1   0.7
  NaCl   5   0.5   5
  柠檬酸钠   1.7
  pH   7.0
结果表明,低浓度的葡萄糖(0.2-0.5%)有助于表达量的提高,但葡萄糖浓度太高不利于表达。在同样条件下,3号培养基的效果最好。
实施例3
上罐表达(5L)
一.菌种:
将大肠杆菌BL21(DE3)/pSE380-KGF-2在LBA中培养20hr,OD600达2.7。
二、基础培养基:实施例2中的培养基2
三、发酵培养阶段:
温度:35℃
pH:6.8
诱导时OD600:2.0
共培养5.5小时
四、发酵诱导阶段:
温度:35℃
PH:6.8
IPTG:乳糖加入量:3∶1(量比,其中IPTG为0.5mM)
诱导结束OD600:5.8
共诱导2小时
五、实验结果:
诱导2hr后,KGF-2表达量占发酵上清液总蛋白18%左右,表达量达100-200ug/ml发酵液(用改良Lowry法测)。
实施例4
温度对诱导水平的影响
在实施例3的基础上,比较以下二种方法:
方法一:
诱导阶段温度为:35℃
方法二:
诱导阶段温度为:42℃
结果:
  方法一   方法二
  KGF-2表达水平(占全菌蛋白比例)   18%   7.2%
实施例5
KGF-2的纯化
1.发酵液4℃下5000rpm离心10min,得菌体。
2.菌体高压破菌,8000rpm离心30min,得上清。
3.超滤浓缩及更换缓冲液:使用Millipore超滤器,超滤膜截流分子量为5KD,超滤时留取浓缩液(作用是去除小分子杂质和盐类)。发酵液上清超滤至体积剩下500ml左右,加入Tris-HCl(PH7.4,20mM),继续超滤;反复此程序,直至样品的电导水平和Tris-HCl(PH7.4,20mM)缓冲液的电导水平接近。
4.层析1(阳离子交换层析):
层析介质:SP Sepharose FF
缓冲液:溶液A:Tris-HCl(PH7.4,20mM)
溶液B:Tris-HCl(PH7.4,20mM)+1M NaCl
上样:将超滤浓缩的KGF-2溶液上样。
清洗:上样后用6CV的溶液A清洗层析柱。
梯度:清洗后用10CV将溶液B从0%升至100%。
收集:收集KGF-2样品峰。
5.层析2(亲和层析):
层析介质:肝素(Heparin)CL-6B
缓冲液:溶液A:Tris-HCl(PH7.4,20mM)
溶液B:Tris-HCl(PH7.4,20mM)+1M NaCl
上样:层析1收集的样品主分。
清洗:上样后用6CV的溶液A清洗层析柱。
梯度:清洗后用10CV将溶液B从0%升至100%。
样品经过此三步纯化,即超滤、阳离子交换层析、亲和层析以后,纯度提高至95%以上。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
                        序列表
<110>上海新生源医药研究有限责任公司
<120>人角质细胞生长因子-2的生产方法
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<210>1
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(513)
<220>
<221>misc_feature
<223>KGF-2编码序列
<400>1
caa gcc ctt ggt cag gac atg gtg tca cca gag gcc acc aac tct tct     48
Gln Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser
1               5                   10                  15
tcc tcc tcc ttc tcc tct cct tcc agc gcg gga agg cat gtg cgg agc     96
Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser
            20                  25                  30
tac aat cac ctt caa gga gat gtc cgc tgg aga aag cta ttc tct ttc    144
Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu Phe Ser Phe
        35                  40                  45
acc aag tac ttt ctc aag att gag aag aac ggg aag gtc agc ggg acc    192
Thr Lys Tyr Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly Thr
    50                  55                  60
aag aag gag aac tgc ccg tac agc atc ctg gag ata aca tca gta gaa    240
Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr Ser Val Glu
65                  70                  75                  80
atc gga gtt gtt gcc gtc aaa gcc att aac agc aac tat tac tta gcc    288
Ile Gly Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala
                85                  90                  95
atg aac aag aag ggg aaa ctc tat ggc tca aaa gaa ttt aac aat gac    336
Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp
            100                 105                 110
tgt aag ctg aag gag agg ata gag gaa aat gga tac aat acc tat gca    384
Cys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala
        115                 120                 125
tca ttt aac tgg cag cat aat ggg agg caa atg tat gtg gca ttg aat    432
Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn
    130                 135                 140
gga aaa gga gct cca agg aga gga cag aaa aca cga agg aaa aac acc    480
Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr
145                 150                 155                 160
tct gct cac ttt ctt cca atg gtg gta cac tca                        513
Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser
                165                 170
<210>2
<211>171
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
Gln Ala Leu Gly Gln Asp Met Val Ser Pro Glu Ala Thr Asn Ser Ser
1               5                   10                  15
Ser Ser Ser Phe Ser Ser Pro Ser Ser Ala Gly Arg His Val Arg Ser
            20                  25                  30
Tyr Asn His Leu Gln Gly Asp Val Arg Trp Arg Lys Leu Phe Ser Phe
        35                  40                  45
Thr Lys Tyr Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Gly Lys Val Ser Gly Thr
    50                  55                  60
Lys Lys Glu Asn Cys Pro Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Thr Ser Val Glu
65                  70                  75                  80
Ile Gly Val Val Ala Val Lys Ala Ile Asn Ser Asn Tyr Tyr Leu Ala
                85                  90                  95
Met Asn Lys Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Asn Asn Asp
            100                 105                 110
Cys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala
        115                 120                 125
Ser Phe Asn Trp Gln His Asn Gly Arg Gln Met Tyr Val Ala Leu Asn
    130                 135                 140
Gly Lys Gly Ala Pro Arg Arg Gly Gln Lys Thr Arg Arg Lys Asn Thr
145                 150                 155                 160
Ser Ala His Phe Leu Pro Met Val Val His Ser
                165                 170

Claims (11)

1.一种生产人角质细胞生长因子-2的方法,其特征在于,该方法包括步骤:
(a)在适合的表达条件下,培养大肠杆菌工程菌,该工程细胞携带选自下组的表达载体:pSE280,pSE380和pSE420,且在所述表达载体的多克隆位点插入了人角质细胞生长因子-2的编码序列,从而表达出人角质细胞生长因子-2,其中所述的人角质细胞生长因子-2的编码序列编码氨基酸序列SEQ ID NO:2所示的蛋白质;
(b)分离纯化出步骤(a)中表达的人角质细胞生长因子-2,即KGF-2。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的表达载体是pSE380。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在所述载体的EcoR I/BamH I位点插入了人角质细胞生长因子-2的编码序列。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的人角质细胞生长因子-2的编码序列是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤(b)包括步骤:
(i)对发酵样品通过离心和/或过滤方式去除发酵清液,获得菌体;
(ii)破细胞,获得破菌液;
(iii)对破菌液进行离心以去除菌体碎片,获得破菌液上清液;
(v)层析纯化,所述的层析纯化选自:阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析、及其组合。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,在步骤(iii)和(iv)之间,还包括步骤:通过盐析和/或超滤对破菌液上清液进行初步纯化。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的培养条件是:培养温度为30-40℃;葡萄糖或乳糖浓度为0-1.0%;IPTG做诱导剂,浓度为0.1-1.5mM,且当含有乳糖时,乳糖与IPTG的搭配比例范围是1∶2-1∶4。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述的培养条件是:培养温度为34-38℃;葡萄糖或乳糖浓度为0.2-0.5%。
9.一种表达载体,其特征在于,它是选自下组的表达载体:pSE280,pSE380和pSE420,且在所述表达载体的多克隆位点插入了人角质细胞生长因子-2的编码序列,其中所述的人角质细胞生长因子-2的编码序列编码氨基酸序列SEQ IDNO:2所示的蛋白质。
10.如权利要求9所述的表达载体,其特征在于,所述的人角质细胞生长因子-2的编码序列是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
11.一种大肠杆菌宿主细胞,其特征在于,该工程细胞携带选自下组的表达载体:pSE280,pSE380和pSE420,且在所述表达载体的多克隆位点插入了人角质细胞生长因子-2的编码序列,其中所述的人角质细胞生长因子-2的编码序列编码氨基酸序列SEQ ID NO:2所示的蛋白质。
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