CN1058972C - 用动物乳房生产人的生长激素 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种可在动物乳腺组织中表达并且其产物与天然人生长激素相同的人生长激素基因，还提供了将所述基因置于特定启动子控制之下转移生产转基因动物的方法，所述动物可在其奶中产生人的生长激素，从而提供了利用动物乳房作为反应器生产人生长激素的技术。

Description

用动物乳房生产人的生长激素

本发明涉及新的人生长激素生产方法及新的人生长激素基因，将该基因置于特定启动子控制下，转移至动物中，使其仅在动物乳腺中表达。

人生长激素是一种蛋白质类激素，由一个基因编码，正常情况下在脑垂体中生产，然后分泌到血液中，发挥其生理功能。在重组DNA技术出现之前，人的生长激素只能从死人脑垂体中提取，产量非常低。据文献报道，用猪的脑垂体提取猪的生长激素，提取一克生长激素需使用8000个垂体。据此推算，从人的垂体中提取生长激素，产量也差不多。重组DNA技术出现之后，人类可以用基因工程技术生产人的生长激素。其主要过程是：从人的脑垂体中提取信使RNA，在试管中用信使RNA模板，使用酶学反应合成一条与信使RNA碱基互补的DNA，然后去掉信使RNA，再用酶学方法合成与信使相同的DNA。至此，就完成了人生长激素基因的人工合成。这个人工合成的人生长激素基因与适当载体连结后，可以转入大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞系或动物细胞系中生产，经过适当化学处理和反复提纯后，就得到医用的人生长激素。

现有技术的主要缺点有三方面，第一：产量比较低。用大肠杆菌、酵母菌和昆虫细胞系生产人生长激素，从每升发酵液中只能提取出几十毫克至一两百毫克生长激素。用动物细胞系培养生产人生长激素的产量更低，从每升培养液获得的生长激素还不到一毫克。第二：生产成本很高。用发酵法生产生长激素，激素存在于细胞之内，必须首先破碎细胞，然后从几千种细菌蛋白质中把生长激素提纯出来。在提纯过程中每一步都会造成损失，回收率只有20-30％。所以，总的成本比较高。第三：活性差，激素分子是一种蛋白质，其生物学活性依赖其立体构型。用微生物生产出的人生长激素，其立体构型不正确，没有生物学活性。为了恢复其正确立体构型，一般都采取在强还原溶液中(如8M尿素溶液)使其拉伸成线性分子，然后再通过缓慢的复性过程使其重新折叠成天然立体构型，恢复活性。在这一过程中，不可能使所有激素分子都有天然立体构型。因此，由这种方法生产的人生长激素活性较差。

本发明目的在于提供一种人生长激素的基因，以及提供一种可在动物乳房中高效表达该基因的载体结构，并且构造一种产量高，生产成本低的生长激素生产方法，所生产的生长激素完全和从垂体中提取的一样具有天然活性，可替代用微生物发酵方法生产人的生长激素。

附图说明：图1：pBLGH62的构建。图2：用动物乳房生产人生长激素工艺示意。图3：转基因小鼠的PCR检测结果。图4：小鼠基因组DNA的Southern杂交结果。

本发明所涉及的是一种可以在动物乳腺组织表达并且其产物与天然人生长激素相同的生长激素基因，其DNA结构如下所示：

----TATAA----进入BLG外显子----AAGCACGACCCCAGGTCGACAACCC以下进入hGH序列

GATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACGCTCAC

CTAGCTGCA ATG GCT ACA G GTAAGCGCCCCTAAAATCCCTTTGGGC

ACAATGTGTCCTGAGGGGAGAGGCAGCGACCTGTAGATGGGACGGGGGCA

CTAACCCTCAGGTTTGGGGCTTCTGAATGAGTATCGCCATGTAAGCCCAGT

ATGGCCAATCTCAGAAAGCTCCTGGTCCCTGGAGGGATGGAGAGAGAAAA

ACAAACAGCTCCTGGAGCAGGGAGAGTGCTGGCCTCTTGCTCTCCGGCTCC

CTCTGTTGCCCTCTGGTTTCTCCCCAG      GC TCC CGG ACG TCC CTG CTC

CTG GCT TTT GGC CTG CTC TGC CTG CCC TGG CTT CAA GAG GGC AGT

GCC TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT AGT

CTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAG

GAG TTT

GTAAGCTCTTGGGGAATGGGTGCGCATCAGGGGTGGCAGGAAGGGGTGAC

TTTCCCCCGCTGGGAAATAAGAGGAGGAGACTAAGGAGCTCAGGGTTTTTC

CCGAAGCGAAAATGCAGGCAGATGAGCACA CGCTGAGTGAGGTTCCCAGA

AAAGTAACAATGGGAGCTGGTCTCCAGCGTAGACCTTGGTGGGCGGTCCTT

CTCCTAG     GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA

TTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC TGT TTC TCA GAG TCT ATT

CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCC

GTGAGTGGATGCCTTGACCCCAGGCGGGGATGGGGGAGACCTGTAGTCAG

AGCCCCCGGGCAGCACAGGCCAATGCCCGTCCTTCCCCTGCAG         AAC CTA

GAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTG GAG

CCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC CTG GTG TAC

GGC GCC TCT GAC AGC AAC GTC TAT GAC CTC CTA AAG GAC CTA GAG

GAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG             GTGGGGGT

GGCGCTAGGGGTCCCCAATCTTGGAGCCCCACTGACTTTGAGAGCTGTGTTA

GAGAAACACTGCTGCCCTCTTTTTAGCAGTCCAGGCCCTGACCCAAGAGAAC

TCACCTTATTCTTCATTTCCCCTCGTGAATCCTCTAGCCTTTCTCTACACCCTG

AAGGGGAGGGAGGAAAATGAATGAATGAGAAAGGGAGGGAGCAGTACCCA

AGCGCTTGGCCTCTCCTTCTCTTCCTTCACTTTGCAG    AGG CTG GAA GAT

GGC AGC CCC CGG ACT GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAG

TTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA CTC AAG AAC TAC

GGG CTG CTC TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG GTC GAG ACA

TTC CTG CGC ATC GTG CAG TGC CGC TCT GTG GAG GGC AGC TGT GGC

TTC TAG  CTGCCC

注：序列中黑体字母表示外显子序列。

表1.人生长激素基因DNA序列

上述基因经转化真核生物的培养细胞，或经过转基因动物技术插入动物染色体之后，可以表达为人的生长激素，其氨基酸组成如下：

Met    Ala    Thr    Gly    Ser    Arg    Thr    Ser    Leu

Leu    Leu    Ala    Phe    Gly    Leu    Leu    Cys    Leu

Pro    Trp    Leu    Gln    Glu    Gly    Ser    Ala    Phe

Pro    Thr    Ile    Pro    Leu    Ser    Arg    Leu    Phe

Asp    Asn    Ala    Ser    Leu    Arg    Ala    His    Arg

Leu    His    Gln    Leu    Ala    Phe    Asp    Thr    Tyr

Gln    Glu    Phe    Glu    Glu    Ala    Tyr    Thr    Pro

Lys    Glu    Gln    Lys    Tyr    Ser    Phe    Leu    Gln

Asn    Pro    Gln    Thr    Ser    Leu    Cys    Phe    Ser

Glu    Ser    Ile    Pro    Thr    Pro    Ser    Asn    Arg

Glu    Glu    Thr    Gln    Gln    Lys    Ser    Asn    Leu

Glu    Leu    Leu    Arg    Ile    Ser    Leu    Leu    Leu

Ile    Gln    Ser    Trp    Leu    Glu    Pro    Val    Gln

Phe    Leu    Arg    Ser    Val    Phe    Ala    Asn    Ser

Leu    Val    Tyr    Gly    Ala    Ser    Asp    Ser    Asn

Val    Tyr    Asp    Leu    Leu    Lys    Asp    Leu    GLu

Glu    Gly    Ile    Gln    Thr    Leu    Met    Gly    Arg

Leu    Glu    Asp    Gly    Ser    Pro    Arg    Thr    Gly

Gln    Ile    Phe    Lys    Gln    Thr    His    Ser    Lys

Phe    Asp    Thr    Asn    Ser    His    Asn    Asp    Asp

Ala    Leu    Leu    Lys    Asn    Tyr    Gly    Leu    Leu

Tyr    Cys    Phe    Arg    Lys    Asp    Met    Asp    Lys

Val    Glu    Thr    Phe    Leu    Arg    Ile    Vae

Gln    Cys    Arg    Ser    Val    Glu    Gly    Ser

Cys    Gly    Phe

上述人生长激素的一级结构同从人脑垂体提取的天然人生长激素完全相同。因此，用动物培养细胞或动物体生产上述基因的产品，可以代替从人脑垂体提取的生长激素。

本发明还涉及一种表达人生长激素基因的载体结构，其构建方法是将人生长激素基因上游插入牛乳球蛋白启动子，并去掉人生长激素的启动子，使人生长激素基因置于牛乳球蛋白基因启动子的控制之下。牛乳球蛋白的启动子的核苷酸序列如附图1所示，牛乳球蛋白启动子和人生长激素基因重组的技术路线如附图1所表示。附图1是pBLGH62的构建。其中牛BLG基因5’R.E(调控序列)的5’末端位于牛BLG基因转录起始位点上游650bp处，3’末端位于转录起始位点下游11bp处。

本发明涉及的另一个方面是通过基因转移的方法生产转基因动物，所说的转基因动物是指其染色体上含有本发明中描述的牛乳球蛋白基因启动子和人生长激素基因融合在一起的DNA片段。这种动物可以在其奶中生产人的生长激素，这种动物的制备方法可以用向单细胞阶段的胚胎注射DNA的方法。也可以用其它的方法，如用精子作载体或用逆转录病毒作载体将DNA携带进胚胎。本发明所涉及的是利用动物乳房作反应器生产人生长激素的方法，它与用发酵细菌或动物细胞培养的方法从介质中提取生长激素有重大差别。其工艺过程如附图2所示，可作如下描述：

(1)人生长激素基因向动物转移

对供卵母畜一次耳静脉注射孕马血清促性腺激素(PMSG)20单位/公斤体重。注射后七十二小时观察发情状况，若表现明显发情状况，于耳静脉注射排卵激素(HCG)20单位/公斤体重，立即用自然交配或人工授精法配种。注射HCG后20-22小时，于腹部中央作一切口(切口大小视畜种而定)，轻轻拉出子宫及卵巢，清点卵巢上排卵窝数目，同时用PBS缓冲液从子宫角和输卵管结合部注入输卵管，在输卵管的近卵巢端接PBS于表面皿中。然后，将表面皿放在解剖镜下清点所得胚胎数并将它们转移到一滴新鲜的PBS液中，液滴上盖上一滴液体石蜡油，防止水分蒸发，收集到的胚胎可以在二氧化碳培养箱中暂存，条件为箱中CO₂5％，湿度100％，温度37℃。

向胚胎细胞转移DNA主要用显微注射法。将欲被注射的动物胚胎置于一块经硅化处理的载玻片上，覆盖上PBS和液体石蜡。然后，将玻片放在微分干涉相差显微镜(DIC显微镜)下。对于猪、羊和牛的胚胎，在放置在显微镜下之前，还需作离心处理，以便将胚胎细胞内的脂肪球移到一旁，使细胞核显现出来。作离心处理的条件是在台式离心机上以8000转/分的速度离心5分钟，然后立刻放到DIC显微镜下。注射DNA时，用一根外径100微米，内径10-20微米的细玻璃管将胚胎吸住，然后用一根外径为1微米的玻璃针直接向细胞核注射DNA溶液，注射量为2-3PL(百万分之二微升)内含基因分子600至1000个。注射后的胚胎放在二氧化碳培养箱中作短暂保存后，移植到作同样PMS G和HCG处理，但不予配种的受体母畜的子宫角和输卵管结合部位内。将子宫角送回腹腔，作抗菌处理后缝合。接受胚胎移植后的母畜将会怀孕并生出后代。

(2)转基因动物检测：

接受胚胎移植的母畜产生后代时，将新生儿耳部或尾部剪下小块组织，提取总DNA。将总DNA和经过不同内切酶消化的DNA置于琼脂糖凝胶电泳系统中分离。将凝胶片上的DNA条带转移到尼龙膜上，用鉴定探针进行Southern分子杂交分析。

综上所述，本发明涉及一种全新的生产人的生长激素的工艺，它和现行的提取技术和用微生物发酵生产的技术有重大差别，在重要经济技术指标上优于现行技术。具体差别和优点表现在：

A、使用的基因结构不同。现行提取法是用人的脑垂体直接提取蛋白质，未涉及基因分离和在人体以外表达。用微生物发酵生产所用的基因是以信使RNA为模板用酶学方法合成的，是一种人造基因，在自然界并不存在。从结构上讲，它只包括体内合成人生长激素的全部遗传密码，没有称作内含子(Intron)的间隔DNA序列。本发明所用的基因是从人类染色体上切下来的。包括编码生长激素的外显于(Exon)，内含子(Intron)和上、下游调控序列。

B、基因在体内工作方式不同。现行用基因工程微生物生产人生长激素的工艺，基因在微生物体内按微生物的方式转录成信使RNA，信使RNA直接和核糖体结合生产人生长激素肽链。本发明的基因在乳腺细胞的细胞核内，首先转录成一条信使RNA的前体、进入细胞质后经过剪切和加工，变成成熟的信使RNA，再通过核糖体合成人生长激素肽链。

C、初始产品形式不同。基因工程微生物合成的人生长激素，在细胞内被紧密地包在一种叫包涵体(Inclosion Body)的细胞器中，没有任何生物活性。这种初始产品必须在体外通过化学方法将分子拉直，然后使其慢慢折叠成天然三维结构，以恢复其生理活性。由于体外条件与体内不同，即使经过变性和复性过程，得到的人生长激素同天然品有差别，生理活性较低，本发明的工艺过程是让乳腺细胞在体内对人的生长激素进行加工，然后分泌到乳汁中，生长激素的三维结构与天然品完全相同，生理活性较好。

D、总体工艺过程不同，现行的用重组微生物生产人的生长激素，是一个工业过程，重组微生物在发酵罐内用合成培基培养；生产出大量细菌后用离心机收集，收集的细菌经破碎后得粗的总蛋白；总蛋白经分步提纯后得到生长激素。本发明生产人生长激素的过程是一个农业过程。动物用饲料饲养，挤出奶之后通过提纯得到生长激素。

本发明从根本上改革了现行的人生长激素生产工艺，其效果表现为三个主要方面。第一，产量提高很多倍，用现行方法生产人生长激素，每升发酵液的理论产量可达数百毫克。但由于要使生长激素变性和恢复天然构型，又要从上千种细胞蛋白中提纯，最终产量只有每升数十毫克。本发明用动物乳房生产，每一升奶中人生长激素的产量可达5-10克。由于分泌到奶中的人生长激素与天然产品相同，不需要重新将蛋白分子拉直和折叠，加上奶中其它蛋白质只有少数几种，提纯回收率可高达90％。两项因素相加，可使生产效率比现有技术提高50-100倍。第二，生产成本低。用动物乳房生产人的生长激素，研制转基因动物的过程比较复杂。一旦有了这种动物，生产过程相当简单，不需要工厂，也不需要人工培养基，是一个养牛养羊和挤奶过程。由于奶中生长激素含量高，提纯工艺简单，总成本大约是现有技术的1％，有很好市场竞争力。第三，产品质量好，乳腺组织可以对生长激素进行正确加工，分泌的生长激素与脑垂体生产的生长激素相同。此外，由于奶中生长激素含量很高，其它蛋白数量只有几种，而不是像细菌破碎之后那样有几千种，产品可以提得很纯。因此，用乳房生产的人生长激素品质好。

用动物乳房生产人的生长激素是一种新的工艺过程，目前尚无任何产品由这种工艺生产并在市场上销售。

下面的实施例是对本发明的进一步说明，而非限制本发明范围，本发明的保护范围参见权利要求书。

实施例1BLG/hGH转基因小鼠实验模型

在本实验中，应用DNA显微注射法将牛乳球蛋白启动子(BLG)和人生长激素基因(hGH)融合结构DNA输入小鼠胚胎，生产出乳房分泌人生长激素的小鼠。

一、实验材料

1、实验动物  昆明小白鼠和昆明小鼠与C57 BL的杂交鼠，购自计划生育研究所动物部

2、仪器  倒置相差显微镜(日本尼康)

         显微操作仪(德国Leitz)

         拉针仪(日本Narishige PD-5型)

         解剖显微镜(东分公司)

         二氧化碳培养箱(pharmacia)

3、药品  三溴乙醇，60％乳酸钠，氯化钙，透明质酸酶、丙酮酸钠均购自美国Sigma公司，牛血清白蛋白(组分V)购自华美公司。PMSG，HCG购自天津实验动物研究所，其余药品为国产。

4、地高辛DNA标记和检测试剂盒，Boehringer公司，SephaglasesBandprep kit Phamacia公司。人生长激素放免试剂盒购自301医院内分泌室。

5、尼龙膜  购自Boehrnger公司。

6、质粒pBLGH62见附图1

大肠杆菌中间载体PA28具体构建过程如下：以牛基因组DNA为模板采用PCR法扩增牛BLG基因5’端1680个核苷酸长的一个片段，扩增时使用的引物是参照绵羊BLG基因序列而设计和合成的，其具体序列为：

引物1：ATCCCACGTGACTGCATTAGCC

引物2：CATTTCTGAAGCAGGATCTCCA

扩增出来的牛BLG 5’端1680个核苷酸的一段DNA含有带动连接其下游基因在乳腺中表达的功能元件。将这一段PCR扩增出的DNA插入质粒p^GEM72f(+)的SmaI位点，就构成了一个中间质粒，命名为P^A28。质粒pGEM72f(+)是一种商品载体，购自promaga公司。

大肠杆菌pGEMhGH载体的构建过程是将人生长激素编码DNA序列用BamH1从原克隆载体上切下，得到一个长度为2.2kb的DNA片段。此片段含有人生长激素基因(hGH)全部外显子(Exon)和内含子(Intron)，但不带有其本身的调控序列。将这一DNA片段插入商品质粒载体pGEM72f(+)的BamHI位点，就构建成中间载体pGEMhGH。

中间载体的构建，主要是便于将牛BLG基因的调控序列和人hGH基因的结构基因准确组合到一起，构建成适宜在动物乳腺组织中特异表达的融合基因bBLG/hGH。

二、方法

(一)主要试剂的配制：

1. 20×SSC，在800毫升水中溶种175.3克NaCL和88.2克柠檬酸钠，NaOH调pH至7.0，加水定容至1升，高压灭菌。

2、变性液  1.5M NaCL，0.5M N_aOH。

3、中和液  1M Tris.Cl(pH7.4)，1.5M NaCL

4.鼠尾DNA抽提缓冲液  50mM Tris Cl(pH7.4)，0.16mM EDTA，三蒸水配制，过滤除菌。

(二)M₂与M₁₅培养液的配制1、贮存液的配制配制M₂与M₁₅培养液的贮存液贮存液        成分          体积           克数与浓度                      (mL)A 10×                                               100

          NaCL                         5.534

          KCL                          0.356

          KH₂PO₄                     0.162

          MgSO₄.7H₂O                 0.293

          乳酸钠                       2.610

                                       或4.349克60％的浆

                                       1.000

          葡萄糖                       0.060

          链霉素                       0.050B 10×                                               100

          NaHCO₃                      2.101

          酚红                         0.101C 100×                                              10

          丙酮酸钠                     0.036D 100×       C_aCL₂.H₂O      10            0.252E 10×                                               100

                        HEPES          5.958

          酚红                         0.010上述贮存液均过滤除菌，A液-20℃保存二周，其余4℃保存一周。2.M₂与M₁₆的配制由贮存液配制M₂贮存液                     M₂工作液      (单位mL)

             10          50            100A(10×)          1.0         5.0           10.0B(10×)          0.16        0.8           1.6C(100×)         0.10        0.5           1.0D(100×)         0.10        0.5           1.0E(10×)          0.84        4.2           8.4BSA              40.0mg      200mg         400mg双蒸水           7.80        39.0          78.0由贮存液配制M₁₆贮存液                     M₁₆工作液     (单位mL)

             10          50            100A(10×)          1.0         5.0           10B(10×)          1.0         5.0           10C(100×)         0.1         0.5           1D(100×)         0.1         0.5           1BSA              40.0mg      200mg         400mg双蒸水           7.80        39.0          78.0

M₂和M₁₆均现用现配

(三)转基因用DNA的制备

1.质粒pBLGH62经EcoRI.HindIII和PvuII三酶切后，TAE琼脂糖凝胶电泳，回收3.0kb左右的片段，即为BLG/hGH融合基因，将所需分子量的DNA条带切下，再用Sephaglass Bandprep试剂盒纯化。纯化方法见试剂盒说明书。纯化的DNA一部分做酶切进一步鉴定，另一部分制备显微注射液。

2、用显微注射用DNA稀释液将纯化后的DNA稀释至2ug/ml，离心(12,00rpm，30分钟)，取上1/2体积，分装，即可用作显微注射。

(四)转基因实验方法

1、小鼠的准备：

转基因实验用的小鼠分为四种类型，即供体母鼠、受体母鼠、种公鼠和结扎公鼠。

①供体母鼠，8-10周龄的雌性昆明白鼠和杂交鼠，人工诱导发情后与结扎公鼠交配，作为超排卵供体母鼠。

②受体母鼠，8-10周龄的雌性昆明白鼠和杂交鼠。人工诱导发情后与结扎公鼠交配，获得假孕母鼠，可作为显微注射后受精卵的受体。

③种公鼠：8-10周龄雄性昆明白鼠，购回后单笼饲养，并标号。1-2周后与供体母鼠交配。

④结扎公鼠8-10周龄的雄性昆明白鼠，实验前三周作双侧输精管结扎。

2、公鼠的输精管结扎：麻醉：2.5％三溴乙醇，(0.017毫升/克体重)，腹腔注射。结扎：将小鼠仰卧定于手术板上，下腹部剪毛消毒，打开腹腔，分别找出并结扎左右侧输精管，还纳后闭合手术通路，关腹前切口处上少许磺胺粉以防感染。

3、超排卵

供体母鼠在明暗循环的动物房中饲养一周，即可作超排卵用。用生理盐水将PMSG及hCG稀释为100iu/mL，每只鼠腹腔注射0.1mL，注射时间为14.00PMSG，48小时后hCG，注射hCG后分别将每只供体母鼠放入一种公鼠笼内排卵时间一般为注射hCG后10-13小时。

4、取卵

将有阴栓的供体母鼠挑出，引颈处死，0.2％新洁尔灭浸泡全身，在下腹部打开腹腔，暴露两侧输卵管及卵巢，分别取出两侧输卵管，将之转移到盛有M₂的培养皿中。将培养皿置解剖镜下，用尖镊子将输卵管壶腹部撕开，将卵轻轻拨出，加入少许透明质酸酶(0.3mg/ml)，用移卵管轻轻的吹打，待卵分散后，将卵转入M₁₆液滴中，M₁₆洗4次后，放入二氧化碳孵箱中。

5、受精卵的显微注射

①持卵器的制备：取直径1mm的硬玻璃管，在微火上烤软，将其拉成80-150um直径的细管：在距颈部2cm处折断，用烧针仪烤平断口。

②注射针的制备：用拉针仪将直径1mm的玻璃管拉成针尖约1um直径的注射针。

③显微注射：在凹玻片上各滴上M₂培养液和上述得到的BLG/hGH融合基因的DNA注射液(两者不可混合)，无菌石腊油覆盖后置显微镜的载物台上。低倍镜下将注射针吸入适量的DNA注射液。取约10个受精卵注入M₂液滴中。用持卵器吸住一枚卵后转至高倍镜下。将注射针调至合适的角度，针尖刺入受精卵雄原核中，将DNA注射液注入约1pl，可见雄原核膨胀，迅速抽出注射针。待凹玻片上所有的卵注射完毕后，立即将卵转移至M₁₆培养基中，CO₂孵箱培养30分钟后即行移卵。

6、受精卵的输卵管移植

①移植用移卵管的制备：将细玻璃管在酒精喷灯上烧软，拉成150um直径左右，折断后将断端烤平。

②受精卵的准备：将受精卵从_M16培养液移至M₂培养液中，再吸入移卵管中备用。

③受精卵的输卵管移植

选择有阴栓的假孕母鼠，麻醉，方法同公鼠的输精管结扎术。将鼠背侧酒精消毒，在最后肋骨后约1cm处，沿脊柱作一长1.5cm的纵长切口，打开腹腔，用镊子夹住卵巢上的脂肪垫，将卵巢和输卵管轻轻拉出。在解剖镜下找到输卵管伞开口，用虹膜剪剪开外层被膜，将移卵管插入伞部后将卵吹入。两侧输卵部的移植同法，手术完毕后小夹子夹住切口，一周后除去夹子。

(五)鼠尾DNA的提取：

2周龄以上的小鼠，即可用于提取鼠尾DNA。

1、剪下2cm长的鼠尾，先用70％乙醇洗净。晾干后放入Ependorff管中。

2、加鼠尾DNA抽提液0.7ml，将鼠尾剪碎，再加70ul浓度为10mg/ml的蛋白酶K，混匀。

3、55℃水溶18小时，不时颠倒混匀。

4、冷却至室温后加RNAase使终浓度为20ug/ml，37℃水溶1小时。

5、加等体积苯酚，轻轻颠倒混合20分钟，离心，(4℃，5000rpm，10分钟)取上清，重复苯酚抽提两遍，酚/氯仿抽提一遍，24∶1的氯仿∶异戊醇抽提一遍。

6、转移水相至一新管中，加2倍体积的冷无水乙醇，混匀，沉淀立即出现。

7、将沉淀吸出，70％乙醇洗两次，晾干。

8、加500ulTE，室温溶解48小时，待DNA溶解后4℃保存。

转基因小鼠的PCR检测：

正常小鼠奶中没有BLG，所以推测其基因组DNA中没有BLG基因及其调控序列，这种调控序列只有BLG/hGH转基因阳性小鼠才会有。用PCR法扩增小鼠基因组DNA中的特异DNA片段是一种简便、迅速、有效的方法，所以本试验首先用PCR法检测，以上述115只小鼠的基因组DNA为模板，扩增转基因鼠特异的牛BLG基因片段，以确定哪些小鼠是转基因阳性的。

1、引物的设计

由于导入的融合基因包括牛BLG基因650bp的5’侧翼序列，因此使用的引物I的相应序列为：

ATCCCACGTGACTGCTTTAGCC

引物II的序列如下：

GCTTCGTCGACGAGGACAATAC

它是在引物I相应序列下游520bp左右的区域与编码链互补的22个碱基。根据上述引物设计，预计扩增产物是牛BLG基因5’调控序列的片段，长度为525bp。

2.PCR检测

从115只两周龄的小鼠剪尾2cm，提取基因组DNA作为PCR反应的模板，死胎从肌肉组织中提取DNA作为模板PCR反应条件为94℃2分钟，然后是3个温度(94℃1分钟，60℃1分钟和72℃2分钟)的30个循环，最后72℃30分钟。PCR反应体系为50ul，其中引物I 0.5uM，引物II 0.5uM，dNTP 125uM，10×Taq酶Buffer 5ul，Taq聚合酶5U，DNA模板1ug。

经PCR扩增，发现有5只小鼠的基因组DNA可扩增出525bp左右的特征条带，其余110只小鼠和阴性对照鼠则无此条带。见附图3，附图3是转基困小鼠的PCR检测结果，其中1是入DNA HindIII/EcoR 1 marker，2，小鼠死胎，3是未转基因鼠，4是3号鼠，5是6号鼠，6是8号鼠，7是10号鼠，由该图可知，5只小鼠可能是BLG/LGH转基因阳性小鼠。

(七)Southern杂交鉴定转基因阳性鼠

1、鼠尾DNA的酶切：

取鼠尾DNA20ug，BamHI酶切，酶切体系为

鼠尾DNA20ug

10×buffer E 20ul

BamHI酶50u

加双蒸水至200ugl

37℃酶切过夜

2、电泳：酶切后的DNA取小量电泳检查，酶切完全后，将样品用苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后溶于20uL，TE中，0.8％琼脂糖凝胶电泳，3-4V/cm，8小时。

3、转膜

①将转移槽用清水洗净，蒸馏水冲洗，铺上带窗口的塑料膜。

②剪一块比窗口稍大的尼龙膜，重蒸水浸泡2分钟后，盖于窗口上。

③把凝胶放置在尼龙膜上，放好后不再移动。

④装好真空装置，启动真空泵。调真空压强为40mbar保持2分钟。

⑤吸去胶上盐酸加变性液，使之覆盖胶面，保持30-60分钟。

⑥吸去胶上变性液，加中和液，使之覆盖胶面，保持20分钟。

⑦吸去中和液，加20×SSC调压至90mbar，保持60分钟。

⑧转膜完毕，关闭真空泵，吸去SSC溶液，除去凝胶，取下尼龙膜，整理好真空转移器及塑料膜。

⑨将尼龙膜用6×SSC漂洗后置滤纸上晾干，80℃干烤2小时，DNA即固定在尼龙膜上。

4、探针的标记，杂交均按Dig DNA标记和检测试剂盒说明书进行。

(I)DNA探针的制备

以BLG基因5’调控序列作为探针。

将质粒pBLGH62进行BamHI酶切，回收0.7kb片段。此片段含有牛BLG基因的5’调控序列，见附图1。将此DNA片段纯化后，用Dig标记，作为Southern杂交的探针。

(2)小鼠基因组DNA的酶切

根据附图1可知，显微注射所用的融合基因DNA序列含有两个BamHI位点。推测此基因整合入小鼠基因组DNA后，用BamHI酶切此鼠基因组DNA可能出现两种结果：一是如果整合的基因是单拷贝的，则酶切出2.2kb左右的hGH基因和未知分子量的牛BLG基因调控序列与其上游鼠基因组DNA形成的片段；二是如果整合的基因是首尾相连的多拷贝，则能切出2.2kb左右的hGH基因和0.7kb的牛BLG基因的调控序列。因为所用的探针是0.7kb的牛BLG基因的调控序列，所以推测Southern杂交的结果为，BLG/h GH基因的单拷贝整合会出现一条未知分子量的阳性带，BLG/hGH的首尾相连的多拷贝整合则出现一条0.7kb的阳性带。因此，本试脸用BamHI对小鼠基因组DNA进行酶切，再进行Southern杂交。

(3)Southern杂交

以Dig标记0.7kb的牛BLG基因5’调控序列为探针，对BamHI酶切后的56只鼠基因组DNA进行杂交，有5只小鼠出现阳性条带，见附图4。附图4是小鼠基因DNA的SouTHern杂交结果。其中图4A中的1是0.7kb DNA阳性对照，2是3号鼠，3是6号鼠，4是8号鼠，5是10号鼠。图4B中的1是0.7kb DNA探针阳性对照，2和9是阴性鼠对照，3-8和10-11为1、13、44、62、35、37、38、50号鼠，12是死胎鼠1号。

由附图4可知，5只鼠均出现0.7kb的杂交阳性带，说明这5只小鼠是BLG/hGH转基因阳性的，与PCR检测的结果一致。而且是以BLG/hGH基因头尾相连的多拷贝形式整合的。5只小鼠中一只为死胎，存活的4只鼠中一只为雄鼠(NO.6)，三只为雌鼠(NO.3，8，10)整合率为4.4％。

(八)鼠奶中表达产物的检测

1、小鼠奶样的制备：

产后第8天的母鼠先与仔鼠隔离3小时以上，腹腔注射0.3IU的催产素，10分钟后腹腔注射三溴乙醇。麻醉后，轻轻按摩乳腺，用缠胶布的镊子轻轻挤奶，用微量加样器将乳汁吸出。乳汁加无菌双蒸水5倍稀释，离心去乳脂，每200ul加4-5ul 1N HCI，混匀后离心。上清液即为乳清，可供检测用。

2、hGH放免测定：

301医院检测。

3、乳清蛋白的SDS PAGE电泳：5％三氯乙酸沉淀去脂乳蛋白，离心，去上清，丙酮洗沉淀一次，溶于电泳上样缓冲液中。6％的浓缩胶，1.5％的分离胶。15V/cm3小时。考马斯亮蓝染色。

4、小鼠血清的制备：

小鼠剪尾采血500ul4℃过夜，离心，取血清备检。

表达产物的检测；

BLG/hGH转基因小鼠作为一种乳腺生物反应器模型，其乳腺应当表达目的基因，未转基因的正常小鼠奶中是不含hGH的。采集乳汁样品后先去乳脂。去乳脂后的样品一部分除酪蛋白，即为乳清，一部分作为去脂乳备检。同时又做了血清的hGH检测。结果见表2

表2  BLG/hGH转基因小鼠的hGH放免检测结果(ug/ml)

鼠号	性别	去脂奶	乳清	血清
					10836未转基因鼠对照	♀♀♀♀♀	440-NANA	4200.016NANA	0.0510.009NANANA

NA：未检测出  -：未检测

对10号小鼠的去脂乳进行了SDS-PAGE电泳，见图7

从表2可以看出，10鼠表达了hGH基因，奶中的hGH含量是血清中的8000多倍，而且96％的hGH在乳清中，结果表明，本试验克隆的0.66kb的牛BLG基因5’调控序列能控制hGH基因在转基因小鼠乳腺中表达，而且能随乳汁分泌出来。hGH在10号鼠血清中含量远低于乳汁中的含量

实施例2；用绵羊乳房生产人的生长激素

利用乳房作为生物反应器生产人的生长激素的工作原理，是要用一种办法把编有体内合成人生长激素遗传密码的基因导入羊或其它可以泌乳的动物。导入时必须是在动物胚胎刚刚形成，只有一两个细胞时，只有这样，将来发育成的动物每个细胞都含有人生长激素基因。此外，人生长激素基因前边还要加上能控制基因在特  定组织和器官合成，而不会在不理想的部位合成。本实施例中，人生长激素基因之前装了能控制人生长激素基因在乳腺中发挥功能的生物元件，使人生长激素基因不会在其它任何组织和器官发挥功能，生产出人的生长激素。这一点与实施例一完全相同。

但是，在生产转基因绵羊时，使用的基因转移技术略有不同。在生产转基因小鼠时，采用了把单细胞阶段的胚胎冲出体外，通过向细胞核注射DNA之后又移植到小鼠体内，在本实施例中，等待绵羊将卵排到输卵管中之后，用手术切开绵羊腹部作一切口，拉出子宫和输卵管，将DNA和精子的混合物从输卵管近子宫端注入输卵管。精子和卵子在输卵管中相遇，发生受精作用，形成胚胎，在这个过程中，精子穿透卵子外膜时，将DNA带入卵子，精子的细胞核和卵子的细胞核发生融合时，外源基因(DNA分子)就插入到新生胚胎的染色体上。在新生的羊羔中，用分子检侧法查出其染色体上插入人生长激素基因的转基因羊，养到泌乳时(母羊)或养到其女儿泌乳时(公羊)，检查羊奶中人生长激素含量，用免疫化学法(抗体-抗原特异反应)确定羊奶中生产出人生长激素。本实施例共试验处理绵羊200只，生出小羊99只，其中含有人生长激素基因的转基因羊12只(7公、5母)，其中只有一只母羊活到产奶时，其奶中生长激素含量达到200毫克/升，已有工业开发价值。由于经费短缺，转基因公羊未保留到其女儿产奶。

本实施例说明，本发明的技术程序有通用性，不论什么动物，不管用什么方法转基因，只要将控制人生长激素基因在乳腺中特异表达的生物元件与该基因一块转入动物，使之插入该动物每一个细胞的染色体上，就生产出乳汁中含生长激素的动物，是一种成熟的工艺过程。

Claims (2)

1.一种生产人生长激素的方法，其特征在于：将表1所述基因的DNA插入牛乳球蛋白启动子，然后转移到动物中，在动物乳腺组织中表达并产生人的生长激素。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：采用显微注射方法将所述DNA注射到动物胚胎。

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