JP4128625B2 - チキンインターロイキン−１５及びその使用 - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明はトリインターロイキン-15をコードする遺伝子の単離及びインターロイキン-15ポリペプチドの精製に関する。
発明の背景
消費及び産卵のために先進国で生産されるほとんどのチキンが（少なくとも年当たり100億）マレック病に対してそれらを保護するためにワクチン接種されている。産卵チキン及び繁殖家畜はまたニューカッスル病ウイルス、感染性嚢炎ウイルス、感染性気管支炎ウイルス、鶏痘ウイルスを用いたワクチン接種、及びコクシジウムワクチンを受けている。最適な保護のために、マレックのワクチン接種は孵化時または孵化前のいずれかに実施されている。効力のある孵化前及び孵化時ワクチン接種摂生の発達の障害は、胎児の及び孵化したてのトリの免疫系は十分に発達しておらず、孵化後2-3週間のものほど免疫原に対する免疫応答が有効に開始できないことである。それゆえ孵化前及び孵化後のトリワクチン接種の有効性を増大する試薬及び組成物に対する本分野での必要性が存在する。
インターロイキン-2及びインターロイキン-15は哺乳動物におけるT細胞の活性及び増殖を刺激するサイトカインに関する。IL-2及びIL-5の両者はIL-2受容体のβ及びγ鎖と相互作用し、四次構造のいくつかのエレメントを共有するであろうが、該2のポリペプチドは相同ではなく、別個の遺伝子産物を代表する。
いくつかの異なる哺乳動物種由来のIL-15をコードする遺伝子は、高程度のホモロジーを有する。例えばヒト及びサルのIL-15は97%のアミノ酸同一性を有する。対照的に本発明の目的物たるチキンIL-15は哺乳動物IL-15と25%のアミノ酸同一性しか共有しない。チキンIL-15のもう一つの区別される性質は、マイトジェン活性化脾臓細胞によってそれは生産される（哺乳動物形態ではそうではない）ことである。したがってチキンIL-15の発見及びそれがT細胞刺激活性を持っているという発見は、トリ種におけるワクチン添加物に対する新たな試薬を提供する。いかなる理論と結び付けられることをも期待しないが、骨格筋発達を刺激する哺乳動物IL-15の生活性は、トリIL-15もまたトリ種における成長を刺激するのに有用であることを示唆する。
発明の概要
本発明はトリインターロイキン-15（IL-15）をコードする単離され精製されたDNAを提供し、同様にIL-15を含むクローニング及び発現ベクターそしてIL-15コードベクターでトランスフォームされた細胞を提供する。IL-15が由来するトリ種はチキン、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラ及びキジを制限することなく含む。
本発明はまた単離され精製されたトリIL-15ポリペプチドを提供し、その天然の分泌形態または成熟形態は約14kDaの分子量をもち、等電点は約6.57であり、2の実効電荷をもち、0.278の親水性指標をもち、マイトジェン活性化トリT細胞を刺激し他の細胞タイプの増殖を促進する能力をもつ。本発明にしたがったIL-15は天然のソース及び組換えソースから得られるであろう。
トリIL-15DNA及びトリIL-15ポリペプチドの配列保存変異体および機能保存変異体もまた本発明に包含され、例えば精製配列にインフレームで融合された生活性IL-15配列またはサブ断片も含まれる。
もう一つの面として本発明は、免疫原に対するトリにおける免疫応答を増大するための方法を提供し、それは免疫応答を増大するのに有効量のトリIL-15を投与する前、後、または実質的に同時に免疫原を投与することによって達成される。
さらにもう一つの面として本発明は、免疫原及び免疫応答増大のために有効量のトリインターロイキン-15を含む、免疫原に対するトリにおける免疫応答を誘発するためのワクチンを提供する。免疫原は例えばマレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、感染性嚢炎ウイルス、感染性気管支炎ウイルス等のようなトリ病原体から由来するであろう。
【図面の簡単な説明】
図1はチキンインターロイキン-15（IL-15）をコードする747ntのcDNA配列を含む845nt配列の説明である。
図2はチキンインターロイキン-15前駆体ポリペプチドに相当する143アミノ酸配列の説明である。
発明の詳細な説明
本明細書で引用されている全ての特許出願、特許及び文献はここで全体として参考として取り込まれる。矛盾のある場合には定義を含む本記述が優先するであろう。
本発明はトリ種由来のインターロイキン-15（IL-15）を包含する。本発明はトリIL-15をコードする単離され精製された核酸を提供し、同様に天然ソースまたは組換えソースのいずれかから精製されたIL-15ポリペプチドを提供する。本発明にしたがって生産されたトリIL-15は、成長を促進しトリワクチンの効力を増大するために商業的なトリの養殖において用いられるであろう。
核酸、ベクター、トランスフォーマント
チキンIL-15をコードするcDNAの配列が図1（SEQ ID NO:1）に示され、チキンIL-15の予想されるアミノ酸配列が図2（SEQ ID NO:2）に示されている。このトリポリペプチドがIL-15である証拠は、哺乳動物IL-15に対する部分的なアミノ酸配列ホモロジー及びマイトジェン活性化T細胞を刺激する該ポリペプチドの能力に基づいている（以下参照）。さらにいかなる理論と結び付けられることも期待しないが、トリIL-15はまた一つ以上の以下の生活性を示すことが予想される:NK（ナチュラルキラー）細胞の活性化、B細胞成熟の刺激、マスト細胞の増殖及びIL-2受容体のβ及びγサブユニットとの相互作用。
遺伝学的コードの縮重（すなわち複数のコドンが特定のアミノ酸をコードする）のため、図1に示されている以外のDNA配列もまた図2に示されているチキンIL-15アミノ酸をコードし得る。該他のDNAには、与えられたコドンにおける一つ以上のヌクレオチドの変化がその位置でコードされるアミノ酸の改変を引き起こさない「配列保存」変異体を含むものが含まれる。さらにポリペプチドにおける与えられたアミノ酸は、しばしば天然のポリペプチドの全体の構造及び機能を改変しないで変化され得る。該「機能保存」変異体には、例えば酸性、塩基性、疎水性等のような同様の物理化学的性質を持つもので一つのアミノ酸を置換することが制限することなく含まれる（例えばアルギニンでのリシンの置換、グルタミン酸でのアスパラギン酸の置換またはアラニンでのグリシンの置換）。加えてアミノ酸配列は分子の生活性を破壊することなく付加または欠失し得る。例えば付加的なアミノ酸配列が、精製タグとして機能するためにアミノ末端またはカルボキシ末端で付加され得る（すなわちタンパク質の単一工程精製を許容し、その後でそれらは化学的または酵素的に除去され得る）。代わりに付加的な配列は付加的な細胞表面結合部位を与えることができ、またはそうではなくIL-15のターゲット細胞特異性を改変し得る。
本発明の範囲にあるチキンIL-15cDNAは、図1のもの、配列保存変異体DNA、機能保存変異体ポリペプチドをコードするDNA配列及びそれらの組み合わせである。本発明は単独でまたは他の配列または組成物と組み合わせてのいずれでも、有用な程度の生活性を示すトリインターロイキン-15の断片を包含する。いかに説明するようにIL-15の配列を予想されるように操作すること、及び与えられたトリIL-15変異体が与えられた実用性に対する適当な安定性及び生活性をもつかどうかを確立することは、当業者の十分な範囲にある。これは組換え系において変異体IL-15ポリペプチドを発現し精製し、細胞カルチャーおよび動物においてT細胞刺激活性及び/または増殖促進活性をアッセイし、引き続き実用性をテストすることによって達成され得る。
本発明はまたアヒル、七面鳥、キジ、ウズラ及びガチョウを制限することなく含む、他のトリ種由来のIL-15DNA（及びポリペプチド）を包含する。図1に示されているチキン配列のトリIL-15ホモローグは、図1の配列の全部または一部を含むプローブにハイブリダイズするクローンを同定するために、cDNAまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって容易に同定される。代わりに発現ライブラリーをチキンIL-15を認識する抗体を用いてスクリーニングしてもよい。いかなる理論に結び付けられることをも期待しないが、他のトリ種由来のIL-15遺伝子はチキンIL-15遺伝子と少なくとも約70%のホモロジーを共有するであろうと予想される。IL-15のチキンホモローグをコードするDNAもまた発明の範囲に包含され、それはチキンIL-15と少なくとも約25%のアミノ酸同一性を共有するポリペプチドをコードするDNAと定義される。
一般的に本発明にしたがった核酸操作は、例えばMolecular Cloning,A Laboratory Manual（第2版，Sambrook,Fritsch及びManiatis,Cold Spring Harbor）、またはCurrent Protocols in Molecular Biology（編者、Aufubel,Brent,Kingston,More,Feidman,Smith及びStuhl,Greene Publ.Assoc.,Wiley-Interscience,NY,NY,1992）に開示されているもののような、本分野でよく知られている方法を用いる。
本発明はcDNA及びRNA配列そしてセンス及びアンチセンス配列を包含する。本発明はまた調節配列を制限することなく含む、ゲノムトリIL-15ポリペプチドDNA配列及びフランキング配列を包含する。トリIL-15ポリペプチド（類）をコードする核酸配列はまた、プロモーター、エンハンサー、レスポンスエレメント、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、5’-及び3’-非コード領域等を含む異種配列と関連する。トリIL-15ポリペプチドDNA配列（類）と実施可能にリンクしているであろう転写調節エレメントは、原核生物細胞、真核生物細胞、原核生物細胞のウイルス、真核生物細胞のウイルス、及びそれらのいかなる組み合わせ由来の遺伝子の発現に向ける能力を持つものを制限することなく含む。他の有用な異種配列も当業者には知られている。
本発明の核酸をその安定性、溶解性、結合アフィニティーおよび特異性を改変するために当業者に既知の方法で修飾することが可能である。例えば該配列を選択的にメチル化し得る。本発明の核酸配列はまた直接的にまたは間接的にのそれぞれで検出可能なシグナルを提供することができるラベルを用いて修飾し得る。例示的なレベルにはラジオアイソトープ、蛍光分子、ビオチン等が含まれる。
本発明はまたトリIL-15ポリペプチド（類）をコードする核酸を含むベクターを提供する。該ベクターには例えば様々な真核生物及び原核生物ホストで発現するためのプラスミドベクターが含まれる。好ましくはベクターはまた、部分をコードするトリIL-15ポリペプチドに実施可能にリンクしたプロモーターを含む。コードされるトリIL-15ポリペプチド（類）は、ここで説明されるような、さもなければ当業者に既知ないかなる適したベクター及びホスト細胞を用いることによっても発現され得る。
ベクターはしばしば、例えば抗生物質耐性及び一つ以上の発現カセットのようなホストにおけるクローニングまたは発現のための一つ以上の複製系、選択のための一つ以上のマーカーを含む。該インサートされたコード配列は合成されてもよいし、天然のソースから単離してもよいし、ハイブリッドのように調製してもよいし、その他も考え得る。転写調節配列に対するコード配列のライゲーションは、当業者に既知の方法で達成されるであろう。適したホスト細胞は、エレクトロポレーション、CaCl2-またはリポソーム介在性DNA取り込み、カビ感染、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクティル等を含むいかなる適した方法によっても、トランスフォーム/トランスフェクト/感染し得る。
本発明の実施の使用に適したベクターには、YEp352,pcDNA1(In Vitrogen,San Diego,CA),pRc/CMV(In Vitrogen)及びpSFV1(GIBCO/BRL,Gaitherburg,MD）が制限されることなく含まれる。本発明の使用に対する一つの好ましいものはpSFV1である。適したホスト細胞には大腸菌、酵母、COS細胞、PC12細胞、CHO細胞、GH4C1細胞、BHK-21細胞及び両生類黒色素胞細胞が含まれる。BHK-21細胞は本発明の実施における使用に対して好ましいホスト細胞系である。
トリIL-15ポリペプチド（類）をコードする核酸もまた組換え操作により細胞内に導入され得る。例えば該配列を細胞内にマイクロインジェクションし得、ポリペプチドそれの類似体またはシュードジーン、またはトリIL-15ポリペプチドコード遺伝子に対して実質的に同一の配列をコードする内因性遺伝子の部位で相同的組換えさせ得る。非相同的組換え、および特に多能性細胞における相同的組換えによる内因性遺伝子の欠失のような他の組換えベースの方法もまた用いられ得る。
IL-15ポリペプチド
チキンIL-15遺伝子（図1に示されているcDNA）は、143アミノ酸（図2）のポリペプチドをコードする。いかなる理論と結びつくことをも期待しないが、サルIL-15との比較により、及び予想されるシグナルペプチダーゼ切断部位（Von Heijne,Nuc.Acids Res.,14:4683,1986）に対する一般的な方法の使用により、約22アミノ酸のアミノ末端リーダー配列（分泌シグナルペプチド）が成熟IL-15を生産するため一次翻訳産物から切断されることが予想される。121アミノ酸の予想される成熟配列は、13,971の予想される分子量;6.57の等電点;ヒト、マウス及びサルIL-15で共通に保存されている4のシステインに相当し、分子内ジスルフィド結合に関与すると考えられる4のシステイン残基（図2に示されている前駆体IL-15におけるアミノ酸番号63,70,116及び119で）;ヒトIL-15におけるのと同じ部位に相当するN結合型グリコシル化（図2に示されている配列のアスパラギン110で）に対する1のコンセンサス部位によってさらに特性指摘される。
天然ソースまたは組換えソースからのIL-15の精製は、イオン交換クロマトグラフィー、C4カラムでの逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、等電点電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィー等を制限することなく含む本分野で既知の方法によって達成される。好ましい実施態様としては、生活性IL-15の大容量が、pSEV1レプリコン（GIBCO/BRL）において6のC末端ヒスチジン残基をコードする配列にフレーム内で融合したIL-15に対するコード領域を含む組換えDNA配列を構築することによって得られ得る。本プラスミドによってコードされるmRNAは、当業者によく知られた方法を用いて合成され、エレクトロポレーションによってBHK-21細胞内に導入される。細胞は6のC末端ヒスチジンを含む成熟グリコシル化IL-15ポリペプチドを合成し分泌する。修飾IL-15ポリペプチドはヒスチジン結合樹脂（His-bind,Novagen,Madison,WI）を用いてアフィニティークロマトグラフィーによって細胞上清から容易に精製される。
いかなるソースから単離されたトリIL-15ポリペプチドも、本分野で既知の方法によって修飾され得る。例えばトリIL-15はリン酸化または脱リン酸化し得、グリコシル化または脱グリコシル化し得、その他もなし得る。トリIL-15の溶解性、安定性及び結合特異性とアフィニティーを改変する修飾は特に有用である。
抗IL-15抗体
本発明は上述のように同定されたトリIL-15ポリペプチドに対して特異的な抗体を包含する。抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよく、異なる種からトリIL-15を識別し、機能的なドメインを同定し、その他のこともする。該抗体はしばしばここで引用されるHarlowとLane,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988に開示されている方法と組成物を用いて作製され、同様に本分野で既知の免疫学的方法及びハイブリドーマ法を用いて作製される。天然のまたは合成トリIL-15由来ペプチドがトリIL-15特異的免疫応答を誘導するために用いられた場合、該ペプチドはKLHのような適したキャリアーに簡便に結び付けられ、フロイントのような適したアジュバントにおいて投与される。好ましくは選択されたペプチドはTam(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5409-5413の方法にしたがってリシンコアキャリアーと実質的に結合される。結果として生じた抗体は例えばFab,FAB’またはFV等の一価形態に修飾し得る。抗イディオタイプ抗体、特に内部の像を検出可能な抗イディオタイプ抗体もまた既知の方法を用いて調製し得る。
一つの実施態様として、本分野で標準的な方法にしたがって、精製されたトリIL-15をマウスを免疫化するために用い、その後にその脾臓を摘出し、抗体分泌細胞のクローンを得るためにメラノーマ細胞を用いて細胞ハイブリッドを形成するのに脾臓細胞を用いる。該細胞によって分泌される結果として生じたモノクローナル抗体を、以下の活性のためのin vitroアッセイで用いるためにスクリーニングする:トリIL-15に対する結合、IL-15の受容体結合活性の阻害、及びIL-15のT細胞刺激活性の阻害。
抗トリIL-15抗体をELISA、RIA等のような免疫アッセイを用いてトリIL-15を同定し定量するために用い得る。抗トリIL-15抗体はまたトリIL-15の免疫欠失抽出物にも用い得る。加えてこれらの抗体を異なるソースからトリIL-15を同定し、単離しそして精製するために、及び細胞内局在研究及び組織化学的局在研究を実施するために用い得る。
実施法
本発明にしたがって生産されたトリIL-15を、例えば活性化T細胞（Grabstein等,Science,264:965,1994）及びB細胞（Armitage等,J.Immunol.,154:483,1995）を刺激するため、及び/またはたとえば筋肉細胞（Quinn等,Endocrinol.136:3669,1995）のような非免疫細胞の増殖を促進するため、同種または異種のトリ種において有益に用い得る。
ワクチン
本発明はトリ種における免疫応答の効力を増大するための方法及び組成物を包含する。本実施態様において、トリIL-15を免疫応答を除去するのに望ましい免疫原と接合して用いる。たとえばマレック病、ニューカッスル病ウイルス及び感染性嚢炎ウイルスあるいは感染性気管支炎ウイルスのような他の病原体に対するもののようなトリワクチンにおいて、免疫応答の大きさと質を増大するためにワクチンにトリIL-15を含ませることは望ましい。この目的のために、上述したように天然のまたは組換えソースから精製されたIL-15を、チキン当たりのワクチン当たり約0.01μgから約1.0μgの範囲の濃度でワクチン処方に含ませる。
IL-15を生きた（すなわち複製可能な）ワクチンまたは非複製可能ワクチンと接合して投与し得る。複製可能ワクチンの非限定的な例として、殺傷したまたは不活性化ウイルスか他の微生物、または例えばコクシジウムワクチンのような非精製のあるいは精製した天然ソース、組換えソースまたは合成ソース由来の抗原が含まれる。トリワクチンの商業的なソースとしては、以下のものが制限されることなく含まれる:Rhone Merieux Laboratoire-IFFA(Lyon,France);Intervet International BV(Boxmeer,The Netherlands);Mallinckrodt Veterinary;Solvay Animal Health(Mendota Heights,MN);Hoechst-Roussel(Knoxville,TN);及びNippon Zeon Co.,Ltd.(Kawasaki-kiu,Japan)。
一つの実施態様として、IL-15をコードする遺伝子を組換えウイルス内に取り込ませ、それから生ワクチン内に処方する。IL-15遺伝子を発現が適したプロモーターでコントロールされるようウイルス内に取り込ませる。ワクチンの投与は望ましい免疫応答に対する時間的場所的に非常に近接して、生活性IL-15の発現を引き起こす。IL-15を米国特許第5,034,513号及び第5,028,421号に記述されているような本分野で既知の方法を用いて、孵化前または後のそれぞれで、好ましくは孵化前に、ワクチン処方の一部としてトリに投与し得る。
成長促進
本発明は医療上の及び/または商業上の目的のためトリ種の成長を促進するための方法及び組成物を提供する。この実施態様においては、IL-15をいかなる適した投与形態を用いてでもトリに投与する。成長促進のためにIL-15を約0.25μg/kg/日から約25μg/kg/日の範囲の量で投与する。必要とされるIL-15の量は、投与量と頻度の組み合わせを確立し、組み合わせの各点で実験ユニットまたは患者のグループを比較することによるように、本分野でよく知られた日々の実験によって決定され得る。
本発明にしたがって天然のまたは組換えトリIL-15を、例えばリン酸緩衝生理食塩水または脱イオン水のような生理学的に許容できるキャリアーを用いて処方し得る。処方にはまた、潤滑剤（類）、可塑剤（類）、着色料（類）、吸収促進剤（類）、殺菌剤（類）等を含む本分野でよく知られた賦形剤も含まれる。本発明のIL-15ポリペプチドを、静脈内、皮下、筋肉内、粘膜通過、局所的または経口の各経路を限定することなく含むいかなる効果的な手段によっても投与し得る。皮下投与に対しては、例えば投与形態は滅菌生理食塩水におけるIL-15より成るであろう。経口投与に対しては、賦形剤の存在下でも不存在下でもIL-15は、例えばリポソーム及びマイクロスフェアー内にミクロまたはマクロカプセル化していよう。皮膚パッチ（または他の持続放出投与形態）もまた用いられよう。
以下の実施例は本発明の範囲を限定することなく、本発明をさらに説明するよう企図されている。
実施例1:チキンIL-15遺伝子のクローニング
チキンIL-15をクローニングするために、コンカナバリンAを用いて活性化した脾臓細胞由来のチキン脾臓細胞cDNAライブラリーを用いた（Kaplan,J.Immunol,151:628,1993）。5000コロニーを30μg/mlのアンピシリン及び10μg/mlのテトラサイクリンを含むLBアガープレート上で35℃オーバーナイトで成育させた。15-20コロニーをプールし、10mlのTerrific Broth（同じ抗生物質を含む）にトランスファーし、オーバーナイトで成育させた。それから各プール由来のプラスミドDNAを出版物の方法（Maniatis,Section 1.28）にしたがって単離し、RNAアーゼで処理し、TEバッファーに貯蔵した。
プラスミドDNAをLipofectamine(GIBCO/BRL,Gaithersburg,MD)を用いてCOS-7(ATCC）細胞にトランスフェクトした。それから1μgの各プラスミドプールを100μlのOpti-MEM培地(GIBCO/BRL)において3μlのLipofectamineと混ぜ、30分インキュベートし、それから12穴プレートに80-90%の飽和状態に成育したCOS-7細胞上に置き、血清フリー培地でリンスした。細胞とDNAを血清と抗生物質の不存在下でダルベッコMEMを用いて37℃で5時間インキュベートし、それから10％胎児ウシ血清を含む同じ培地を用いて補い、37℃でオーバーナイトでインキュベートした。翌日培地を10％胎児ウシ血清、ペニシリン及びストレプトマイシンを含むダルベッコMEMに取り替えた。さらに24時間のインキュベーション後、培地を回収し、-20度で貯蔵した。
以下の実施例2に記述されているように、IL-15活性のため細胞上清を試験した。最高刺激指標（1.6から2.1）を持つ5のプールが、残りの278プールの平均由来の2の標準偏差より大きい活性のレベルを示した。5のプールのうち3は第二のスクリーニングにおいてもポジティブのままであり、6のプールに細分割した。第二のプールから抽出されたプラスミドDNAをCOS-7細胞をトランスフェクトするために用い、上清をIL-2様活性のため試験した。以下の実施例2に記述されているように、3のポジティブプールを同定し、個々のクローンを生ずるために細分割した:各プールから少なくとも1のポジティブクローンが単離された。
全ての3のポジティブクローンの完全なcDNA挿入物を、自動Applied Biosystems Model 373Aシークエンスシステムを用いてシークエンスした。pcDNA1ベクターに含まれたブランキングT7及びSP6プライマーを、シークエンス反応のプライマーとして用いた。2のクローン、B1.16.2及びM2.12.1を同定し、それらは図1に示されたcDNA配列に対してコードしていた。クローンF19.84は2のクローンと同様であるが、5’末端で20ntを欠いており（すなわちコード領域の第一のATGで開始する）、また3’末端で少なくとも100ntのpolyTテールを含む。
完全な747nt配列（図1、SEQ ID NO:1）をBLASTサーチを用いて分析した（それは主要な国際的核酸データバンクの全てにアクセスする）。いかなる既知の配列とも有意なホモロジーは検出されなかった。配列をまたMac II ciコンピューターで、Mac Vectorソフトウエアープログラム（Mac Vector 4.0;International Biotechnologies,Inc.,New Haven,CT）を用いて分析した。この分析により、翻訳開始のためのKozakコンセンサス配列によってその5’末端で位置するオープンリーディングフレームが明らかにされた。このオープンリーディングフレームの予想されるアミノ酸配列は図2に示されている（SEQ ID NO:2）。このアミノ酸配列をBLASTPサーチを用いて分析し（それは主要な国際的タンパク質データバンクの全てにアクセスする）、サルおよびヒト前駆体IL-15と有意なホモロジーが明らかにされた。
チキンIL-15の予想されるアミノ酸配列は、予想される16,305の分子量と6.37の等電点を持つ143アミノ酸のポリペプチドより成る。そのアミノ末端の疎水性質に基づき、及び既知のシグナルペプチド切断部位との比較により（von Heijne,Nucleic Acids Res.14:4683,1986）、グリシン22とアラニン23の間での切断が成熟IL-15を生産するために、一次産物から約22アミノ酸のアミノ末端リーダー配列（分泌シグナルペプチド）の除去を引き起こすことが予想される。
121アミノ酸の予想される成熟IL-15配列は、13,971の予想される分子量、6.57の等電点、及び潜在的なN結合型グリコシル化部位（図2のアスパラギン110で）を持つ。サル、ヒト、マウス及びチキン由来のIL-15の予想されるアミノ酸配列間の比較、及びサルIL-15の四次構造の分析（Grabstein,Science,264:965,1994）の分析により、チキンIL-15の4のシステイン（前駆体IL-15の63,70,116,119位)が保存されており分子内ジスルフィド結合を形成していることが示唆された。
実施例2:チキンIL-15の生活性アッセイ
IL-15に対する生活性アッセイを以下のように実施した:コンカナバリンA(ConA)活性化脾臓T細胞を、2mg/mlBSA、抗生物質及びグルタミンを含むRPMI1640培地（Sigma）において、ConA(10μg/ml)(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）を用いて40℃で24時間チキン脾臓細胞（107細胞/ml）をインキュベートすることによって調製した。それから該培地を2％通常チキン血清（Sigma)及び0.05Mアルファ-メチルピランノシド（Sigma)を含むIscoves’培地（Sigma）にさらに2-4日間置換し、必要とされるような付加的な培地で細胞を希釈した。芽細胞をHistopaque密度勾配(Sigma)上でそれらを緩やかに層状にしてこの混合物から精製し、製品の説明書にしたがってそれらを遠心分離した。それから細胞を3回洗浄し、最終的にアッセイ培地（2％通常チキン血清(Sigma)を含むIscoves’）に再懸濁した。
該アッセイのために2×104芽細胞を、IL-15（例えばトランスフェクトされたCOS-7細胞由来の上清の希釈物のような）及び適したコントロールを含むアッセイ培地において、丸底96穴プレートに置いた。40℃でオーバーナイトでのインキュべーション後、細胞を6時間3H-チミジン（0.5μCi)(New England Nuclear,Boston,MA)+フルオロデオキシウリジン（10-6M)(Sigma)を用いて6時間パルスした。それから細胞をガラスファイバーフィルター（Wharman,Clifton,NJ）で回収し、放射性活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。IL-15を刺激指標として表し、該指標は実験サンプルにおける放射性活性-コントロール（非トランスフェクトCOS-7上清）における放射性活性である。典型的な結果を表1に示す。
Figure 0004128625
実施例3:IL-15の発現と精製
哺乳動物細胞におけるチキンIL-15の高レベル発現を得るために、pSFV1真核生物発現ベクター（セムリキ森林ウイルスレプリコンを含む）を用いた（GIBCO/BRL,Gaitherburg,MD）。該ベクターの使用はシグナルペプチド切断、グリコシル化及び成熟活性タンパク質の分泌を可能にした。一つの実施態様として、組換えベクターは天然のIL-15配列のカルボキシ末端に付加的な6のヒスチジン残基をコードし、ニッケルカラム(Novagen,Madison,WI）上で分泌タンパク質の能率的な単一工程精製を可能にする。
IL-15cDNAのコード領域の横に位置する5’及び3’配列を含むプライマーを構築した。3’プライマーはまた6のヒスチジンに対してコードする核酸を含む。これらのプライマーを、pcDNA1プラスミド内に含まれる完全なIL-2cDNAをテンプレートとして用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で用いた。ヒスチジンコード配列を含む結果として生じた増幅されたcDNAを、pSFV1プラスミド（GIBCO/BRL）内にライゲートした。該プラスミドを、DH5大腸菌(GIBCO/BRL）をトランスフォームし、アガープレートとアンピシリンを含む肉汁上でトランスフォーマントを選択することによって得た。
プラスミドを製品のプロトコールを用いてin vitroでmRNAを生産するためにテンプレートとして用いる。mRNAを107細胞当たり10μgのRNAを用いて、エレクトロポレーションによりBHK-21細胞内にトランスフェクトした。細胞上清を回収し、適したバッファー系（His-bindバッファーキット;Novagen）を用いて樹脂マトリックス（His-Bind樹脂、Novagen,Madison,WI）を通過させた。タグを付したタンパク質の20mgまで単一2.5mlカラム上で精製した。IL-15をキットに溶出バッファーを提供してカラムから溶出した。50ml培地で成育するBHK-21細胞は、組換え的に発現され分泌されたタンパク質を5％まで含む約25mgのトータルタンパク質を合成すると見積もられる。これはおよそ1.25mgのcIL-15に相当する。
実施例4:ワクチンにおけるトリIL-15の使用
以下の実験はチキンワクチンにおけるチキンIL-15の免疫増大活性を評価するために実施される。
チキンIL-15cDNAをチキンにおける組換えタンパク質の発現のために用いられる2のウイルスベクター（それぞれ七面鳥ヘルペスウイルス及び鶏頭ウイルス）内に挿入する(Morgan等,Avian Diseases,36:858,1992;Yanagida等,J.Virol.,66:1402,1992;Nazerian等,J.Virol.,66:1409,1992）。これらのIL-15修飾生きたウイルスベクターを、現在用いられている様々なワクチンの投与と同時に、新生チキンに投与する。6日後チキンを相当する悪性ウイルスを用いてチャレンジし、疾患の発達を8週間観察する。これらのチキンにおける疾患の発病率を、IL-15修飾生きたウイルスベクターを受け取っていないコントロールと比較する。サンプルプロトコール（期待値を含む）を表2に示す。
Figure 0004128625
代わりの方法としては、新生チキンを、Ulmer,J.B.Science,259:1745-1749,1993に記述された方法を用いて、チキンIL-15に対するcDNAを含む100μgのプラスミドを用いて筋肉内に注射する。これらのチキン及びIL-15cDNAを欠いたコントロールベクターを受け取ったコントロールチキンを、チキンワクチンを用いて2日にワクチン接種し、それから相当する悪性ウイルスを用いて7日にチャレンジする。それらを疾患の徴候のため8週間観察する。IL-15cDNAを含むpcDNA1ベクターを用いて注射されたチキンは、コントロールと比較して減少した疾患発病率を示すことが期待される。
最後に実施例3に記述された方法によって精製されたIL-15タンパク質を、孵化時にチキンに筋肉内に投与し、引き続き更なる4日間のそれぞれで単一の毎日の投与をする。チキンを3のグループにわけ、毎日の注射当たり0.01,0.1または1.0μgを受け取る。第四のグループは偽薬の注射を受け取る。孵化時に全てのチキンにチキンウイルスを用いてワクチン接種し、それから相当する悪性ウイルスを用いて7日にチャレンジする。それからそれらを疾患の徴候に対して8週間観察する。IL-15を用いて注射されたチキンはコントロールと比較して減少した疾患発病率を示すことが期待される。
実施例5:成長促進におけるトリIL-15の使用
哺乳動物IL-15は筋肉成長を刺激し（Quinn,L.S.,Endocrin.,136:3669,1995）、半精製IL-2はチキン体重を刺激し食物の肉への変換を増大する（米国特許第5,028,421号）。トリIL-15の成長促進活性を評価するために、上述の実施例4に記述された方法を、ウイルスまたはプラスミドベクターにおけるIL-15cDNA及び組換えIL-15タンパク質を投与するために用い得る。実験チキンとコントロールチキンを6週間の期間体重増と食物の肉への変換をモニターする。一つ以上のこれらのプロトコールがコントロールに対するチキン成長を増大することが期待される。
配列表
Figure 0004128625
Figure 0004128625

Claims (26)

  1. （ａ）SEQ ID NO:2の残基23-143に示されたアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:2の残基23-143に示されたアミノ酸配列の一つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、若しくは欠失を有する配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含み；
    及び
    （ｂ）マイトジェン活性化トリT細胞においてチミジン取り込みを刺激することが可能なポリペプチドをコードする
    単離された核酸。
  2. 核酸がチキンから単離されたトリ核酸である、請求項１に記載の単離された核酸。
  3. SEQ ID NO:2の残基23-143に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸。
  4. SEQ ID NO:1のヌクレオチド21-449に示された配列を含む、単離された核酸。
  5. 請求項１、３、または４に記載の核酸を含むベクター構築物。
  6. 上記核酸が、宿主細胞において上記核酸を発現可能なプロモーターと機能的に連結している、請求項５に記載のベクター構築物。
  7. 上記構築物が組換えウイルスである、請求項５に記載のベクター構築物。
  8. 上記組換えウイルスが、七面鳥ヘルペスウイルスまたは鶏頭ウイルスである、請求項７に記載のベクター構築物。
  9. （ａ）SEQ ID NO:2の残基23-143に示されたアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:2の残基23-143に示されたアミノ酸配列の一つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、若しくは欠失を有する配列を含み；及び
    （ｂ）マイトジェン活性化トリT細胞においてチミジン取り込みを刺激する
    組換えポリペプチド。
  10. SEQ ID NO:1のヌクレオチド21-449に示された配列を有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む、組換えポリペプチド。
  11. SEQ ID NO:2の残基23-143に示されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド。
  12. 免疫原に対するトリ種における免疫応答を増大する方法であって、請求項１、３、または４に記載の核酸、あるいは請求項９、１０、または１１に記載の組換えポリペプチドを、上記免疫原の投与の前、後または実質的に同時に投与することを含む方法。
  13. 上記トリ種がチキンである、請求項１２に記載の方法。
  14. 請求項９、１０、または１１に記載の組換えポリペプチドを、投与当たり0.01μgから1.0μgの範囲にある量で投与する、請求項１２に記載の方法。
  15. 上記免疫原が非生ワクチンである、請求項１２に記載の方法。
  16. 上記免疫原が生ワクチンである、請求項１２に記載の方法。
  17. 請求項１、３、または４に記載の核酸が組換えウイルスを含む非生ワクチンとして提供され、上記組換えウイルスが上記核酸を含む、請求項１２に記載の方法。
  18. 請求項１、３、または４に記載の核酸が組換えウイルスを含む生ワクチンとして提供され、上記組換えウイルスが上記核酸を含む、請求項１２に記載の方法。
  19. 上記免疫原がマレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、感染性嚢炎ウイルス及び感染性気管支炎ウイルスから成るグループより選択された病原性試薬から由来する、請求項１２に記載の方法。
  20. 免疫原に対するトリ種における免疫応答を誘導するためのワクチンであって、
    （ａ）免疫原；及び
    （ｂ）請求項１、３、または４に記載の核酸、あるいは請求項９、１０、または１１に記載の組換えポリペプチド
    を含むワクチン。
  21. 請求項９、１０、または１１に記載の組換えポリペプチドが、投与当たり0.01μgから1.0μgの範囲にある量で存在する、請求項２０に記載のワクチン。
  22. 請求項１、３、または４に記載の核酸が組換えウイルスを含む非生ワクチンとして提供され、上記組換えウイルスが上記核酸を含む、請求項２０に記載のワクチン。
  23. 請求項１、３、または４に記載の核酸が組換えウイルスを含む生ワクチンとして提供され、上記組換えウイルスが上記核酸を含む、請求項２０に記載のワクチン。
  24. 上記免疫原が非生ワクチンである、請求項２０に記載のワクチン。
  25. 上記免疫原が生ワクチンである、請求項２０に記載のワクチン。
  26. 上記免疫原がマレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、感染性嚢炎ウイルス及び感染性気管支炎ウイルスから成るグループより選択された病原性試薬から由来する、請求項２０に記載のワクチン。
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