JP4376783B2 - p40サブユニットおよび/またはp35サブユニットを含む、IL−12のような鳥類のサイトカイン - Google Patents
p40サブユニットおよび/またはp35サブユニットを含む、IL−12のような鳥類のサイトカイン Download PDFInfo
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Description
−配列番号1に表されるようなアミノ酸配列と少なくとも80%の類似性を示すアミノ酸配列を有するサブユニット、
−配列番号2に表されるようなアミノ酸配列と少なくとも80%の類似性を示すアミノ酸配列を有するサブユニット
を少なくとも一つを含むタンパク質を提供する。
−配列番号1に表されるようなアミノ酸配列と少なくとも80%の類似性を示すアミノ酸配列を有するサブユニット、および
−配列番号2に表されるようなアミノ酸配列と少なくとも80%の類似性を示すアミノ酸配列を有するサブユニット
の少なくとも一つをコード化した、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
ギャップペナルティー:8
ギャップ長ペナルティー:2
末端のギャップについてのペナルティーはなし。
アルゴリズム:ニードルマンおよびブンシュ(上掲)。
すべての実施例についての材料および方法。
ChIL−12 p35。全長ChIL−12 p35(クローンpat. pk0055. c11)−−もともとはpcDNA3(商標)(Invitrogen)(チルナガル・ブイジー(Tirunagaru, VG)ら、Genomics 2000, 66: 144)にクローン化されていたもの−−を、EcoRIおよびNotIを用いてpcDNA3から切り出し、そして真核細胞性発現ベクターpcDNA3.1(+)(商標)(Invitrogen)の対応する制限部位内にクローン化した。EcoRI/NotIのChIL−12 p35断片も、pcDNA3.1(−)(商標)(Invitrogen)の対応する制限部位内にクローン化して、アンチセンスのコントロール構築物を得た。
(製造メーカーによって記載されたように)Invitrogen Life Technologies Lipofectamine(商標)試薬を用いて、1.5μgのそれぞれのcDNA構築物でCOS−7細胞を形質移入し、そして(FCSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを含まない)DMEMと共に3cmの皿の中で培養した。8時間後、形質移入された細胞を洗浄し、そしてペニシリン/ストレプトマイシンと10%のFCSを含むDMEMで培養した。37℃/5%のCO2で72時間のインキュベーションの後、細胞培養の上清を集め、そして4℃にて13,000rpmで10分間の遠心分離処理に付して、細胞の残骸を除去した。この上清を、ウェスタンブロットを介して分析し、そして直ちに用いるか、または−70℃で保存した。
形質移入されたCOS−7細胞からの細胞培養の上清を、4から12%のNu−PAGE(商標)(Invitrogen)を用いてサイズ分画し、そしてニトロセルロースフィルタ上にブロットした(シュライヒャーおよびシュエル(Schleicher and Schuell))。PBS中の3%のスキムミルク(MPBS)でウェスタンブロットをブロックし、続いて、MPBSで1:300に希釈したFeIL−12 p40ペプチドによって惹起されたポリクローナル抗体と共にインキュベーションを行った。ブロッキングおよび抗体のインキュベーションをそれぞれ1時間、室温で行った。十二分に洗浄(5分間を3回)した後、MPBSで1:1000に希釈したアルカリペルオキシダーゼ(AP)結合ヤギの抗ウサギIgG抗体(Sanbio)と共に、ブロットのインキュベーションを1時間室温で行った。洗浄(5分間を3回)後、結合したAP標識化二次抗体を染色して可視化した。
ChIL−12による脾臓のChIFN−γの誘導についてのNOアッセイ。単離したてのニワトリの脾臓細胞を、100μL中に0.5×106細胞/ウェルの密度にて、96ウェルプレート内に三組播種し、そして、ChIL−12 p40、ChIL−12 p35が混合したChIL−12 p40、ChFlexi−IL−12、FeFlexi−IL−12をコード化したcDNAクローンを形質移入したCOS−7細胞からの、または空のpcDNA3.1プラスミド(mock)を形質移入したその細胞からの細胞培養の上清の50μLの一連の希釈物と共に、インキュベーションを行った。タンパク質を添加してから48時間後に、上清(75μL)を集め、そして生物活性を持つChIFN−γの存在について分析した。このために、75μLの集めた上清と共に、100μLの1.5×106/mLのHD−11細胞のインキュベーションを、37℃で24時間/5%のCO2にて、96ウェルプレート内で行った。グリースアッセイ法(ディング・エイエイチ(Ding, AH)ら、J. Immunol. 1988, 141: 2407;スチュア・ディージェイおよびシーエフ・ナータン(Stuehr, DJ, and CF Nathan)、J. Exp. Med. 1989, 169: 1543)を利用して、ChIFN−γによるHD−11細胞の活性化を培地上清中の亜硝酸塩の蓄積量の関数として測定した。
NO産生の平均間の違いの有意性、または細胞の増殖の平均間の有意性を、スチューデントのt−検定を利用して分析した。信頼性のレベルが95%(P<0.05)なので、違いは有意であるとみなされた。
Con Aで刺激されたニワトリのT細胞cDNAライブラリー(チルナガルら、上掲)の高処理能力の配列決定プロジェクトから単離されたcDNAクローンpat. pk0055. c11(図1を参照すること)のオープンリーディングフレーム(ヌクレオチド1〜618)の分析から、ヒトのIL−12 p35のcDNA配列(全体のホモロジーが43%、EMBL/GenbankのM65271)、ヒツジの配列(全体のホモロジーが45%、EMBL/GenbankのAF173557)、ウマの配列(全体のホモロジーが48%、EMBL/GenbankのY11130)、ネコの配列(全体のホモロジーが43%、EMBL/GenbankのY07761)、ウシの配列(全体のホモロジーが45%、EMBL/GenbankのU14416)、マウスの配列(全体のホモロジーが42%;EMBL/GenbankのM86672)およびマーモットの配列(全体のホモロジーが45%、EMBL/GenbankのX970189)に対する相同性が示された(図2を参照すること)。ヒト、ヒツジ、ウマ、ネコ、ウシ、マウスおよびマーモットのIL−12 p35タンパク質に対する、pat. pk0055. c11をコード化するChIL−12 p35タンパク質の複数のアラインメントから、それぞれ27%、25%、30%、24%、25%、29%および21%というアミノ酸の全体のホモロジーが与えられる(図3を参照すること)。pat. pk0055. c11の最初の64aa(1〜64残基)を除去した場合、ヒト、ヒツジ、ウマ、ネコ、ウシ、マウスおよびマーモットのIL−12 p35タンパク質に対するホモロジーは、それぞれ33%、32%、37%、25%、32%、34%および28%に向上し(図4を参照すること)、このことは、pat. pk0055. c11のN末端の断片の保存性がタンパク質の残りの部分ほど高くないことを示唆する。これらの配列のホモロジーに基づいて、本発明者らはクローンpat. pk0055. c11はニワトリのIL−12 p35サブユニットをコード化していると結論付ける。
クローンpND89の配列を広範囲に決定した。これによって、(開始から終止までの)cDNAクローンが948ヌクレオチドの長さであり、そして315 aaのタンパク質をコード化していることが明らかになった(図8を参照すること)。オープンリーディングフレーム(ヌクレオチド1〜948)を含むpND89のcDNA配列の分析から、ヒトのIL−12 p40のcDNA配列(全体のホモロジーが57%、EMBL/GenbankのM65272)、ヒツジの配列(全体のホモロジーが56%、EMBL/GenbankのAF004024)、ウマの配列(全体のホモロジーが57%、EMBL/GenbankのY11129)、ネコの配列(全体のホモロジーが55%、EMBL/GenbankのY07762)、ウシの配列(全体のホモロジーが56%、EMBL/GenbankのU11815)、マウスの配列(全体のホモロジーが55%;EMBL/GenbankのM86671)およびマーモットの配列(全体のホモロジーが57%、EMBL/GenbankのX97019)に対する相同性が示された(図9を参照すること)。ヒト、ヒツジ、ウマ、ネコ、ウシ、マウスおよびマーモットのIL−12 p40タンパク質に対する、pND89をコード化するChIL−12 p40タンパク質の複数のアラインメントから、それぞれ41%、40%、40%、42%、39%、36%および41%のアミノ酸のホモロジーが与えられる(図10を参照すること)。配列分析からは、aa 20〜21の間に切断部位を有するシグナルペプチドが存在する結果、20 aaのシグナルペプチドと295 aaの成熟タンパク質が生じることが、さらに明らかになった。WSXWSボックス(aa 305〜311)、Ig様C2型ドメイン(aa残基41〜94)およびフィブロネクチンIII型ドメイン(aa残基228〜308)−−これらは両者ともIL−12 p40の特徴である−−の存在が、類似性によって確認された。これらの配列のホモロジーから、クローンpND89がニワトリのIL−12 p40サブユニットをコード化していることが分かる。
COS−7細胞の形質移入後(と同時)に分泌されるChIL−12 p40サブユニットおよびChIL−12 p35サブユニットを検出するために、ウェスタンブロット分析を用いた。このために、ネコ(Fe)のIL−12 p40サブユニットのペプチドに対して惹起されたポリクローナル抗体を用いた。この抗FeIL−12 p40ペプチド抗体を用いて、形質移入されたCOS−7細胞の上清中にChIL−12 p40およびChIL−12 p40ホモ二量体:ChIL−12 p80(Ch(p40)2)を検出することができた(図15、レーン1)。ChIL−12 p35およびChIL−12 p40の両者によって形質移入されたCOS−7細胞からの上清中に、ヘテロ二量体ChIL−12 p70タンパク質(ChIL−12)(図15、レーン4)を検出することができた。このことから、p40鎖およびp35鎖が互いに作用してヘテロ二量体IL−12 p70分子となることが示唆された。ChIL−12 p80は全く検出されなかったか、または極めて少量しか検出されなかったので、ChIL−12 p70の形成は、ホモ二量体のChIL−12 p80の形成よりも効率的であった。さらに、アンチセンスChIL−12 p35のcDNAまたは無関係のウイルスタンパク質(IBV−N)をコード化したcDNA構築物とChIL−12 p40とのcDNA同時形質移入の結果、ヘテロ二量体が形成されなかったので、ChIL−12 p70の形成は特異的である(図15、レーン5〜6)。
哺乳動物におけるIL−12活性の顕著な特徴は、Tリンパ球によるIFN−γの誘導である。したがって、COS−7細胞で一時的に共発現した後に単離した種々のタンパク質の希釈物によってインキュベーションを行ったニワトリの脾臓細胞の、分離したての培地における、IFN−γのレベルを評価した。HD−11細胞とグリースアッセイ法を用いて、亜硝酸塩の蓄積量の関数として、ChIFN−γを測定した。図16に示されるように、わずかにヘテロ二量体ChIL−12 p70(ChIL−12 p40とChIL−12 p35とが同時形質移入したもの)が、ニワトリの脾臓細胞において、濃度に依存する様式でIFN−γを産生することができる。mockベクターの形質移入またはChIL−12 p40単独の形質移入では、ヘテロ二量体ChIL−12 p70によるレベルにおおよそ匹敵するレベルに、ChIFN−γの分泌を誘導することはできなかった。この次に、FeFlexi−IL−12は有意な量のChIFN−γを誘導しなかったので、ニワトリの脾臓細胞において、IL−12に特異的な種だけがIFN−γを誘導することが明らかである。ChIL−12 p40およびChIL−12 p70(ChIL−12 p40とChIL−12 p35とが同時形質移入したもの)の間のNO産生の違い、ならびにChIL−12 p70とFeFlexi−IL−12との間のその違いは有意であった(P<0.05)。総合すれば、これらの結果から、ChIL−12が生物活性を持ち、そしてニワトリの脾臓細胞を介するIFN−γの誘導はChIL−12に依存することが示唆される。
IL−12の別の特性−−いくつかのその他のサイトカインと共有する特性−−は、T細胞の増殖を誘導することである。単離したてのニワトリの脾臓細胞の種々のタンパク質に対する成長応答−−COS−7細胞で一時的に(同時)発現した後に単離したもの−−を、細胞増殖のアッセイによって測定した。わずかにヘテロ二量体ChIL−12 p70(ChIL−12 p40とChIL−12 p35とが同時形質移入したもの)が、ニワトリの脾臓細胞の増殖を誘導することができた(図17)。最初の希釈物について観察された、相対的に増殖が少ないデータを、このパラメータについての過剰摂取の影響によって説明できるかもしれない。ChIL−12 p40単独であっても、FeFlexi−IL−12であっても、同様の増殖応答を誘導することはできなかった。1/6の希釈物から、ChlL−12 p40とChIL−12 p70(ChIL−12 p40とChIL−12 p35とが同時形質移入したもの)との間の増殖の違い、およびChIL−12 p70とFeFlexi−IL−12とのその違いは有意となった(P<0.05)。総合すれば、これらの結果から、ChIL−12が生物活性を持ち、そしてこの分子がニワトリの脾臓細胞の増殖を誘導する能力を有することが分かる。
一本鎖のChIL−12 p40と一本鎖のChIL−12 p35との同時形質移入の結果として、生物活性を持つChIL−12 ヘテロ二量体(図16および17)の形成が示された後、一本鎖のIL−12分子(ChFlexi−IL−12)が構築された。ChFlexi−IL−12は一本鎖のp40−p35ヘテロ二量体構築物であり、その中でChIL−12 p40鎖は、インフレームの状態にある「ヒンジ」領域とも呼ばれる(Gly4Ser)3−リンカーによって、ChIL−12 p35鎖と結合している。ウェスタンブロット分析によって、COS−7細胞中の形質移入後のChFlexi−IL−12の発現プロフィールがFeFlexi−IL−12のそれと匹敵することを示すことができた。単離したてのニワトリの脾臓細胞をChFlexi−IL−12と一緒にインキュベーションした後、両方のIFN−γの放出ならびに細胞の増殖が観察された(図18および図19)。これらの実験の結果から、ニワトリのIL−12 flexi構築物も生物活性を有することが分かる。
Claims (12)
- 次のポリペプチドサブユニット:
−配列番号1に表されるアミノ酸配列と少なくとも95%の類似性を示すアミノ酸配列を有するサブユニット、および
−配列番号2に表されるアミノ酸配列と少なくとも95%の類似性を示すアミノ酸配列を有するサブユニット
を含む鳥類IL12タンパク質。 - 40kDの見かけの分子量を有し、配列番号1、配列番号5、または配列番号7に表されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドサブユニットを含む、請求項1に記載のタンパク質。
- −40kDの見かけの分子量および配列番号1に表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドサブユニット、および
−35kDの見かけの分子量および配列番号2に表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドサブユニット、
からなり、該サブユニットが結合している、請求項2に記載のタンパク質。 - 次のポリペプチドサブユニット:
−配列番号1に表されるアミノ酸配列と少なくとも95%の類似性を示すアミノ酸配列を有するサブユニット、および
−配列番号2に表されるアミノ酸配列と少なくとも95%の類似性を示すアミノ酸配列を有するサブユニット
の少なくとも一つをコードする、単離された鳥類IL12ポリヌクレオチド。 - −配列番号3に表される配列と少なくとも95%の同一性を示すポリヌクレオチド配列
−配列番号4に表される配列と少なくとも95%の同一性を示すポリヌクレオチド配列からなる群より選択される核酸配列の少なくとも一つを含む、単離された鳥類IL12ポリヌクレオチド。 - 請求項4または5に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
- 請求項4若しくは5に記載のポリヌクレオチドまたは請求項6に記載のベクターを含む細胞。
- 請求項1から3のいずれか一項に記載のタンパク質および医薬適合性の担体を含有するアジュバント組成物。
- 医薬適合性の担体とともに、鳥類の病原体に由来する活性物質および請求項1から3のいずれか一項に記載のタンパク質を含有するワクチン組成物。
- 免疫賦活剤としての請求項1から3のいずれか一項に記載のタンパク質の使用。
- ワクチンアジュバントにおける請求項1から3のいずれか一項に記載のタンパク質の使用。
- 医薬適合性の担体とともに請求項1に記載のタンパク質を含有する医薬組成物。
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