MXPA04012750A - Citocinas avicolas, tales como il-12, que comprenden una subunidad (es) p40 y/o p35. - Google Patents
Citocinas avicolas, tales como il-12, que comprenden una subunidad (es) p40 y/o p35.Info
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Abstract
La invencion proporciona citocinas avicolas novedosas que comprenden una subunidad del polipeptido p40, tal como IL-12 de pollo. Tambien se describen acidos nucleicos que codifican dichos polipeptidos, asi como auxiliares y vacunas que comprenden las citocinas o polipeptidos de la invencion.
Description
¾BiirisiaiB^i¡B§¾Bi iii¾ §¾iM3 2004/003017 AI iiiiiiiiiiiiiiiiiiiB _i.iiiii .iiiii .i - Fortwo-letter codes and olher abbreviations, referió the "Guid- ance Notes on Codes and Abbreviations" appearing at the begin- ning of each regular issue of the PCT Gazette.
1 CITOCINAS AVICOLAS, TALES COMO 1L-12, QUE COMPRENDEN UNA SUBUNIDAD(ES) P40 Y/O P35
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION
La presente invención se refiere a citocinas avícolas novedosas, a secuencias de AD que codifican estas citocinas novedosas y a su uso en auxiliares para propósitos de vacuna. El grupo de moléculas secretadas solubles, colectivamente denominadas citocinas, representan señales de comunicación críticas entre las células del sistema inmunológico y entre las células del sistema inmunológico y no inmunológico. Algunas de estas citocinas tienen que formar homod ímeros, tales como interferón-gama (IFNy), u homotrímeros, tales como las moléculas de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF), con el fin de ejercer actividad biológica. Las formas monoméricas muestran una bioactividad mínima o ninguna bioactividad. Las citocinas en la actualidad se utilizan en fármacos en terapia de cáncer y en el combate contra infecciones microbianas crónicas. Las citocinas también son evaluadas por su uso como estimulantes inmunológicos en auxiliares para mejorar vacunas. En mamíferos, un grupo de citocinas heterodiméricas mixtas ha sido identificado basándose en los complejos de una subunidad de proteína p40. El elemento p40 de mamífero comprende una proteína de 40 kD, la cual se enlaza covalentemente, a través de un enlace de 2 disulfuro, con una subunidad p35 para formar interleucina-12 (IL-12) p70 (Gubler U, y otros, PNSA USA 1991, 88:4143-4147; Wolf SF, y otros, J. Immunol. 1991, 46:3047-3081; Trinchieri G . , Blood 1994, 12:4008-4027). Además, la p40 puede formar la IL-23 de citosina mixta, después de combinarse con p19 (Wiekowski MT, y otros, J. Immunol. 2001 66:7563-7570), una molécula estructuralmente relacionada con IL-6, p35 y el factor estimulante de colonia de granulocito (G-CSF) (Oppmann B, y otros, Immunity 2000, 13:715-725). Además, el p40 puede formar homodímeros que han mostrado ya sea competir para unión con IL-12 p70 con el receptor de alta afinidad de IL-12 e inhiben la bioactividad de IL-12 (Heinzel FP, y otros, J. Immunol., 1997, 158:4381-4388), o para mejorar, en lugar de disminuir, la producción de IFN-y a través de células T de CD8+ y desarrollo de Th1 (Piccotti J , y otros, J. Immunol. 1997, 158:643-648). La importancia de p40 in vivo en varias especies de mamífero ha sido demostrada utilizando p40 recombinante. Las características antagonísticas de IL-12 de (p40)2 homodimérico de 80 kDa han sido demostradas claramente en modelos de choque letal dependientes de IFN-? inducidos por lipopolisacárido (LPS) (Mattner F, y otros, Infecí. Immun. 1997, '11:4734-4737). La producción de p40 humano, en ausencia de IL-12 p70 bioactivo, ha sido demostrada para células microgliales de cerebro (De Goer-de Herve MG, y otros, Cytokine 2001, 14:88-96). Además, el papel fisiológico de las citocinas mixtas de p40 de mamífero ha sido delineado con detalle utilizando 3 aspectos in vivo de objetivo de gen. Se ha probado que después de la infección por Salmonella enteritidis, los ratones genéticamente deficientes de la proteína p40 (p40-/-) mostraron un régimen de mortalidad más alto y un ataque de órgano bacteriano más alto que los ratones capaces de producir p40, pero que carecen del gen p35 (IL-12 p35-/-) (Lehmann J, y otros, J. Immunol. 2001, 167:5304-5315). Los ratones normales (de tipo silvestre) y de IL-12 p35-/-eliminaron una infección con Mycobacterium bovis Calmette-Guerin (BCG) o infección de tuberculosis pulmonar, mientras que los ratones doblemente deficientes de IL-12 (p35-/- + p40-/-) mostraron una alta susceptibilidad a M. bovis BCG y a infección de tuberculosis (Holscher C, y otros, J. Immunol. 2001, 167:6957-6566). La susceptibilidad fue asociada con respuestas reducidas de Th1 de antígeno específico y de célula T citotóxica. En forma interesante, la terapia in vivo con homodímeros p40 recombinantes invirtió a los ratones carentes doblemente infectados con M. bovis BCG (p35-/- + p40-/-) a un fenotipo resistente. Esto demuestra un papel protectorial agonístico de p40 endógeno y exógeno en infección microbiana que es independiente de IL-12 p70 (Holscher y otros, 2001). Similarmente, los ratones p40-/- infectados con Crytococcus neoformans murieron rápidamente y desarrollaron cargas de órgano más altas que los ratones p35-/-, lo cual sugiere otra vez un papel protector para la subunidad p40 independiente del heterodímero de IL-12 (Decjen K., y otros, Infecí. Immunity 1998, 66:4994-5000). También, los ratones p40-/- sobrevivieron a grandes dosis de la 4 bacteria intraceluiar Franscisella tularensis (LVS), pero nunca eliminaron la bacteria y desarrollaron infección crónica. En un contraste más fuerte, los ratones p35-/- fácilmente sobrevivieron a grandes dosis de infección de LVS sub-letal. Este estudio sugiere que la eliminación de LVS es independiente de p40 pero no de IL-12 p70 (Elkins KL, y otros, Infecí. Immun. 2002, 70:1936-1946). También durante la infección de .citomegalovirus de murino (MCMV), los ratones p35-/- mostraron un fenotipo alterado comparado con los ratones p40-/-, indicando que p40 puede tener una actividad independiente de y adicional al antagonismo de IL-1 in vivo (Carr JA, y otros, J. Inferieron Cytokina Res. 1999, 19:1145-1152). En conjunto, estos estudios experimentales ilustran el papel crucial en mamíferos de citocinas a base de p40 tales como IL-12, IL-23 y (p40)2 en la regulación de respuestas inmunes de célula auxiliar T de tipo 1 característica de IF-?, esenciales en el control de la mayor parte de las infecciones intracelulares de naturaleza bacteriana, parásita, fúngica o viral. La presente invención se refiere a equivalentes avícolas de las citocinas a base de p40 de mamífero. La clonación y secuenciación de citocinas avícolas se queda rezagado atrás del trabajo similar realizado en mamíferos. Solamente muy pocas citocinas avícolas han sido identificadas. IFN-? y IL-18, así como un número de citocinas pro-inflamatorias han sido clonadas, demostrando la existencia de una red de citosina de tipo Th1 en pollos. Debido a la baja homología de secuencia para 5 citocinas de mamífero, usualmente un poco alrededor de 30 a 40%, los aspectos clásicos para identificar homólogos avícolas de citosina de mamífero usualmente no son exitosos. La identificación a través de amplificación de PCR utilizando iniciadores basándose en secuencias de mamíferos es muy difícil y sin pronóstico. (Hilton L. S., y otros, J. Interferon Cytokine Res. 2001, 21:993-1010). Cuando algunas citocinas avícolas se hacen disponibles, el trabajo empieza a investigar su uso potencial como moduladores inmunológicos o como auxiliares inmunológicos para mejorar la eficiencia de vacunas. La mayoría de los pollos producidos en países desarrollados, tanto para consumo como para poner huevos, son vacunados. Estos son vacunados contra la enfermedad de Marek, y también contra el virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la enfermedad de Bursal infeccionasa, virus de bronquitis infecciosa, virus de viruela avícola, y vacunas Coccidias. La vacunación puede ser realizada ya sea antes o después de empollar. Los sistemas inmunes de embriones y aves recientemente empolladas aún no se han desarrollado totalmente y no pueden dar surgimiento a una respuesta inmunológica que sea tan efectiva como la de 2-3 semanas después de empollar. Para el desarrollo de vacunas que utilizan pre-empollar o en empollar, por lo tanto, existe la necesidad de agentes para mejorar la respuesta inmunológica en aves después de la vacunación. Los inventores de la presente han tenido éxito al identificar y determinar tanto el aminoácido como la secuencia de gen de 6 codificación para citocinas avícolas novedosas. Estas proteínas son útiles para los propósitos antes mencionados conocidos por las contrapartes de mamíferos, especialmente para mejorar la efectividad de vacunas avícolas. La presente invención proporciona una proteína que comprende por lo menos una de las siguientes subunidades de polipéptido: una subunidad que tiene una secuencia de aminoácido que muestra por lo menos 80% de similitud con la secuencia de aminoácido como se ilustra en SEC ID NO 1, - una subunidad que tiene una secuencia de aminoácido que muestra por lo menos 80% de similitud con la secuencia de aminoácido como se ilustra en SEC ID NO 2. La secuencia ilustrada en SEC ID NO 1 representa un polipéptido que tiene un peso molecular de aproximadamente 40 kD. La secuencia ilustrada en SEC ID NO 2 representa un polipéptido que tiene un peso molecular de aproximadamente 35 kD. La subunidad de polipéptido que tiene un peso molecular de 40 kD será denominada como "p40", mientras que la subunidad de 35 kD será denominada como "p35". Ambas secuencias como se ilustra en SEC ID NO 1 y 2 son derivadas de ADN de pollo (p40 de pollo y p35 de pollo). Como se explicó anteriormente para las citocinas de mamífero, pueden existir varios complejos que contienen p40. El p40 puede aparecer como una molécula monomérica, como homod ímeros, o como moléculas heterodiméricas. La subunidad p40 puede ser 7 enlazada covalentemente, a través de unión de disulfuro, con la subunidad p35 para formar i nterleuci na- 12 (IL-12). Además, la subunidad p40 puede formar la IL-23 de citosina mixta, después de combinarse con p19. La unión promiscua de p40 a otras cadenas de péptido de citosina sugiere la existencia de otras citocinas que forman complejo con P40 no identificadas. Las proteínas de acuerdo con la invención, por lo tanto, pueden ser proteínas que consiste de una copia de una de las subunidades, ésta puede ser homodímeros de una de las subunidades, especialmente p40, o un heterodímero que consiste de una de las subunidades (p40 o p35) junto con otra subunidad de péptido, o puede comprender ambas subunidades (p40 y p35). La invención también abarca proteínas quiméricas que comprenden, por ejemplo, una subunidad de p40 o p35 de pollo en combinación con una subunidad p35 o p40 derivada de otra especie. Las quimeras pueden ser, por ejemplo, proteínas en donde la subunidad p35 de pollo está combinada con p40 derivada de otra ave o aún de otra especie que no sea ave. En conjunto p40 y p35, cuando se enlazan, por ejemplo, a través de enlaces de disulfuro, formarán una interleucina-12 (IL-12) avícola, la cual es asimismo parte de la presente invención. Las proteínas de la invención en principio son citocinas avícolas que pueden ser utilizadas para diferentes propósitos, análogos a las contrapartes de mamífero. Las citocinas de acuerdo con la invención, especialmente la IL-12 avícola, en particular la IL- 8 12 de pollo, pueden ser utilizadas como un auxiliar en vacunas avícolas para mejorar la respuesta inmunológica. Ya que es obvio que igualmente son exitosas modificaciones menores en la secuencia de la proteína, la invención también proporciona una proteína que comprende una subunidad de polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido, la cual tiene por lo menos 80%, o preferiblemente por lo menos 90%, de preferencia 95%, preferiblemente por lo menos 99%, y muy preferiblemente 100% de similitud con la secuencia en SEC ID NO 1 y SEC ID NO 2. El término "similitud" se refiere a un grado de similitud entre proteínas en vista de las diferencias en aminoácidos, pero dichos diferentes aminoácidos son funcionalmente similares en vista del tamaño casi igual, lipofilicidad, acidez, etc. Un porcentaje de similitud puede ser calculado a través de alineación óptima de las secuencias utilizando una matriz de clasificación de similitud tal como la matriz de Blosum62 descrita por Henikiff S. Y Heníkoff JP., P. N. A. S. USA 1992, 89: 10915-10919. El cálculo del porcentaje de similitud y la alineación óptima de dos secuencias utilizando la matriz de similitud Blosum62 y el algoritmo de Needlemann y Wunsch (J. Mol. Biol. 1970, 48: 443-453) pueden realizarse utilizando el programa GAP del grupo Genetics Computer Group (GCG, Madison, Wl, USA) utilizando los parámetros por omisión del programa. Es un aspecto más de la invención proporcionar una proteína que comprenda una variante de existencia natural de una o ambas de las subunidades que tienen la secuencia como en SEC ID NO 1 y 9 SEC ID NO 2. Dichas proteínas, que comprenden una sub-unidad que tiene una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos un 80% de similitud, de preferencia por lo menos un 90%, preferiblemente por lo menos 95%, de preferencia por lo menos 99%, y muy preferiblemente 100% de similitud con los polipéptidos definidos en SEC ID NO 1 o SEC ID NO 2, se derivan de especies avícolas tales como pollos, patos, gansos, pavos y palomas. Dichas .secuencias están representadas en SEC ID NO 5 y 7, las cuales representan el equivalente de pavos y patos respectivamente de la secuencia de aminoácido de p40 de pollos ilustrada en SEC ID NO 1. Dichas formas polimórficas y homólogos de especies avícolas se incluyen en la clase de proteínas que están disponibles a través de esta invención. Las variantes de las proteínas que asimismo son parte de la presente invención pueden ser variantes naturales que pueden contener variaciones en la secuencia de aminoácido debido a eliminaciones, sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de (un) aminoácido(s) en dicha secuencia. Las sustituciones de aminoácido que se espera que no alteren esencialmente las actividades biológicas e inmunológicas han sido descritas. Los reemplazos de aminoácido entre aminoácidos relacionados o reemplazos que han ocurrido frecuentemente durante la evolución son, entre otros, Inter. Alia Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, lie/Val (ver Dayhof, M. D., Atlas of protein seqúense and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D. C, 1978, 5:suppl. 3).
10 Basándose en esta información, Lipman y Pearson desarrollaron un método para la rápida y sensible comparación de proteína y de terminación de la similitud funcional entre polipéptidos homólogos (Science 1985, 227:1435-1441). Otras variantes pueden ser, por ejemplo, variantes funcionales como sales, amidas, ésteres, y ésteres específicamente C-terminales, y derivados de N-acilo. También se incluyen péptidos que son modificados in vivo o in vitro, por ejemplo, a través de glicosilación , amidación, carboxilación o fosforilación. Las proteínas que comprenden solamente un fragmento funcional de la subunidad p40 o p35 (o ambas) son asimismo consideradas como parte de la presente invención. Un fragmento funcional del polipéptido es un fragmento que por lo menos representa la parte(s) de la subunidad(es) del polipéptido, que es esencial para que la proteína pueda servir como una citosina, y pueda llenar esta función, por ejemplo, cuando se utiliza sola o se fusiona a secuencias heterólogas. De esta manera, dichos fragmentos funcionales pueden ser polipéptidos que son funcionales per. se, o los fragmentos pueden ser funcionales cuando se enlazan a otros polipéptidos para obtener proteínas quiméricas. Estos fragmentos funcionales se entiende que caen dentro de la definición de las subunidades. Los fragmentos pueden ser, entre otros, producidos a través de escisión enzimática de moléculas de precursor, utilizando endonucleasas de restricción para el ADN y proteasas para los 11 polipéptídos. Otros métodos incluyen síntesis química de los fragmentos o la expresión de fragmentos de péptido a través de fragmentos de ADN. Las subunidades de polipéptido tienen un peso molecular aparente de 40 o 35 kD, respectivamente, basándose en la longitud de la secuencia de aminoácido (aa). El exacto peso molecular puede ser determinado en SDS-PAGE utilizando condiciones de reducción.
Las proteínas preferidas de acuerdo con la invención son aquellas proteínas que comprende una subunidad de polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que muestra por lo menos un 80% de similitud, de preferencia por lo menos 90%, preferiblemente por lo menos 95%, de preferencia por lo menos 99%, y muy preferiblemente 100% de similitud con la proteína definida en SEC ID NO 1. Dichas proteínas preferidas de acuerdo con la invención pueden comprender una o dos subunidades p40 (es decir, ser un mono o dímero de p40). Dentro de esta modalidad preferida, son muy preferidas las proteínas que comprenden una subunidad p40 derivada de pollos. Ejemplo de subunidades que tienen más de 99% de similitud con la secuencias de pollos de SEC ID NO 1 son las secuencias de p40 de patos y pavos ilustradas en Sec ID NO 5 y 7, respectivamente. Especialmente útiles son aquellas proteínas en donde la subunidad p40 está enlazada a una subunidad p35 (a través de un enlace de bisulfuro, de manera que se obtiene una 1L-12 avícola. En una modalidad especialmente preferida, la invención proporciona la IL-12 de pollo, que consiste de una subunidad p40 12 que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO 1 y una subunidad de p35 que tiene la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO 2, enlazada conjuntamente, por ejemplo, a través de un enlace de disulfuro. El enlace de las subunidades p35 y p40 puede ser establecido en varias formas. La IL-12 de pollo puede ser generada a través de vectores de expresión conteniendo los ADNcs tanto de p35 como de p40 separados, por ejemplo, a través de un elemento IRES (segmento de entrada de ribosoma interno) o directamente enlazado a través de una región de codificación rica en glicina/serina ("gozne") para formar un marco de lectura abierto individual. Además, los vectores de expresión que contienen la secuencia de ADN ya sea de p35 o p40 bajo el control de promotores separados pueden ser utilizados para generar IL-12 de pollo. La preparación de las proteínas, subunidades o sus fragmentos funcionales de acuerdo con la invención se efectúa a través de uno de los métodos químicos orgánicos conocidos para la síntesis de péptido o con la ayuda de técnicas de ADN recombinante. Este último método implica la preparación del péptido deseado a través de expresión utilizando un polinucleótido recombinante con una secuencia de nucleótido, la cual está codificada para uno o más de los péptidos en cuestión en un microorganismo adecuado como huésped. Estos polinucleótidos asimismo son parte de la presente invención.
13 De esta manera, la presente invención además proporciona un polinucleótido que codifica por lo menos una de las siguientes subunidades de polipéptido: una subunidad que tiene una secuencia de aminoácido que muestra por lo menos 80% de similitud con la secuencia de aminoácido como se ilustra en SEC ID NO 1, y una subunidad que tiene una secuencia de aminoácido que muestra por lo menos 80% de similitud con la secuencia de aminoácido como se ilustra en SEC ID NO 2. Un polipéptido que codifica una IL-12 avícola puede comprender ambas secuencias, por ejemplo, enlazadas a través de una secuencia que codifica un gozne. Los fragmentos de la secuencia de ácido nucleico (na) provistas que codifican un fragmento funcional del polipéptido son asimismo parte de la presente invención. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica dicho fragmento funcional del polipéptido puede ser fusionado a polinucleótidos que codifican regiones de transmembrana y/o secuencias de señal. Los polinucleótidos como se define con la presente invención también incluyen polinucleótidos que tienen variaciones en las secuencia de ácido nucleico cuando se comparan con la secuencia de ácido nucleico identificada obtienen sitios polimórficos. Con polinucleótidos "variables" se quiere dar a entender que difieren de la secuencia de ácido nucleico identificada pero siguen codificando un polipéptido que tiene una actividad biológica, por ejemplo, una 14 citosina, similar a la actividad de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido como se ilustra en SEC ID NO 1 y/o 2. Las variantes pueden ser variantes naturales o no naturales. Las variantes naturales incluirán homólogos en varias especies avícolas. La variante de existencia no natural puede ser introducida a través del mutagénesis. Las variantes naturales también pueden ser variantes alélicas. Una variante alélica es una de las varias formas alternas de un gen que ocupa un sitio sobre un cromosoma de un organismo. Algunas veces, un gen es expresado en cierto tejido como una variante de separación, dando como resultado un ARNm de 5' o 3' alterado o la inclusión o exclusión de una o más secuencias de exón. Estas secuencias, así como las proteínas codificadas por estas secuencias, todas se espera que realicen las mismas funciones o funciones similares y forman también parte de la invención. Una secuencia de ADNc aislado puede ser incompleta debido a una transcripción incompleta a partir del ARNm correspondiente, o se pueden obtener clones conteniendo fragmentos del ADNc completo. Se conocen varias técnicas en el arte para completar dichas secuencias de ADNc, tales como RACE (Rápida Amplificación de Extremos de ADNc). Los polinucleótidos que tienen una secuencia de ácido nucleico que es una variante de la secuencia de ácido nucleico identificada pueden aislados a través de un método que comprende los pasos de: a) hibridizar un ADN que comprende toda o parte de la secuencia identificada según reflejada en SEC ID NO 3 o 4, bajo condiciones 15 severas contra ácidos nucleicos que son ADN (genómico) o ADNc aislado de células avícolas que altamente expresan el polinucleótido de interés; y b) aislar dichos ácidos nucleicos a través de métodos conocidos por algún experto en la técnica. Las condiciones de hibridación preferiblemente son altamente severas. De acuerdo con la presente invención, el término "severo" significa condiciones de lavado de 1 x SSC, SDS al 0.1% a una temperatura de 65°C; las condiciones altamente severas se refieren a una reducción en SSC hacia 0.3 x SSC, o preferiblemente a 0.1 x SSC. Preferiblemente, los dos primeros lavados son subsecuentemente realizados por duplicado, cada uno durante 15-30 minutos. Si existe la necesidad de lavar bajo condiciones altamente severas, se realiza un lavado adicional con 0.1 x SSC una vez durante 15 minutos. La hibridación puede ser realizada, por ejemplo, durante la noche en 0.5 M de regulador de pH de fosfato, pH 7.5, con SDS al 7% a 65°C. Dichos métodos de hibridación se describen en cualquier libro de texto estándar sobre clonación molecular, por ejemplo, Molecular Clonig: a laboratory Manual, 3o. Edición; eds: Sambrook y otros, CSHL press, 2001. Como una alternativa, el método de aislamiento puede comprender metodología de amplificación de ácido nucleico utilizando iniciadores y/o sondas derivadas de la secuencia de ácido nucleico provistas con la presente invención. Dichos iniciadores y/o sondas son oligonucleótidos que tienen una longitud de por lo menos 16 15 nucleótidos; los oligo preferidos tienen aproximadamente 25-50 nucleótidos. También se pueden identificar variantes u otros homólogos avícolas de las secuencias ilustradas en SEC ID NO 3 y 4 comparando la secuencia in silico con otras secuencias avícolas que pueden estar comprendidas en una base de datos de computadora. Las secuencias pueden ser comparadas con secuencias en bases de datos utilizando un programa BLAST (BLAST 2.1.2 [Oct-19-2000J) (Altschul, SF, TL Madden, AA Schaffer, J Zhang, Z Zhang, W Miller, y DJ. Lipman, "Gapped BLAST y PSI-BLAST: a new generation of protein datábase search programs", Nucieic Acids Res. 1997, 25:3389-3402). La bioactividad de las proteínas de acuerdo con la invención puede ser medida in vitro utilizando un ensayo de proliferación, de la siguiente manera: Se pueden sembrar células COS-7 o células de pollo, por ejemplo, CEF, HD-11, DT40, etc., en platos con un diámetro de 35 mm a 5 x 105 células/cavidad. Después de un periodo de cultivo de
16 horas, las células pueden ser transfectadas con 1 pg de ADN de plásmido que codifica IL-12 de pollo utilizando Lipofectamin Plus™
(Gibco BRL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los medios de cultivo conteniendo la IL-12 de pollo pudieron ser recogidos 72 horas después de la transfección . Para verificar la bioactividad de IL-12 de pollo, se necesitó desarrollar un bioensayo basándose en la proliferación de linfocitos de sangre periférica 17 (PBLs). Para esto, la actividad de citosina, codificada por el plásmido(s) transfectado, es decir liberado hacia el medio de cultivo, puede ser analizada utilizando un protocolo adaptado de un bionesayo previamente descrito (Gately, M. K., Chizzonite, R. & Presky, D. H., "Measurement of human and mouse interleukin-12", in: Current Protocolos in Immunology, 1997, págs. 6.16.1-6.16. 5, editada por J. E. Coligan y otros, ed: John Wiley & Sons). En este bioensayo que fue desarrollado específicamente para PBLs de ratón y de IL-12 humana, y humanos, aislados utilizado Lymphoprep™ (Nycomed), se cultivaron durante 2 días en un medio de Iscoves conteniendo 5 pg/ml de Concavalina A (ConA). Para estimular la formación de reticulositos, se agregó interleucina-2 humana recombinante (50 unidades/mi) y las células se cultivaron durante 3 días más. Las células se lavaron, se sembraron en placas de 96 cavidades (2 x 04 células/cavidad) y se cultivaron en presencia del medio de cultivo de células transfectadas. Después de 48 horas se agregó 3H-t¡midina (Amersham) y la incubación se continuó durante 4 horas, después las células se cosecharon a través de un cosechador de célula automático. La radioactividad incorporada, la cual es una medida para la proliferación de célula y, por lo tanto, la bioactividad de IL-12, será cuantificada a través de conteo de cintilación de líquido. En un aspecto más, la presente invención proporciona polinucleótidos que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una subunidad de polipéptido, que comprende una secuencia 18 de aminoácido que tiene por lo menos 80% de similitud con la secuencia de aminoácido ilustrada en SEC ID NO 1 o 2, respectivamente. Se prefieren los polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen por lo menos 95% de identidad con SEC ID NO 1 o 2 y muy preferidos son aquellos polinucleótidos que codifican poliproteínas que tienen por lo menos un 97% de identidad con SEC ID NO 1 o 2, en donde esos polipéptidos de codificación que tienen por lo menos un 98 o 99% son muy preferidos. Son muy preferidos los polinucleótidos que codifican el polipéptido de SEC ID NO 1 o 2. Debido a la degeneración del código genético, los polinucleótidos que codifican una secuencia de aminoácido idéntica o sustancialmente idéntica pueden utilizar diferentes codones específicos. Todos los polinucleótidos que codifican los polipéptidos definidos anteriormente, se consideran parte de la invención. En particular, los polinucleótidos preferidos de acuerdo con la invención son polinucleótidos aislados que tienen por lo menos un 80% de identidad con la secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO 3 o 4. Muy preferidos son aquellos polinucleótidos que tienen por lo menos un 90% de identidad, aún muy preferido por lo menos 95%, de preferencia 99% de identidad, y muy preferiblemente 100% de identidad con toda la secuencia de SEC ID NO 3 o 4. Dichos polinucleótidos incluyen polinucleótidos que comprenden la secuencia de ácido nucleico ilustrada en SEC ID NO 3 y/o 4. Un polinucleótido que codifica un polipéptido con una secuencia como la ilustrada en SEC ID NO 1 y/o 2 puede comprender 19 la secuencia de ácido nucleico ilustrada en SEC ID NO 3 y/o 4. En una modalidad más preferida de la invención, el polinucleótido consiste de la secuencia de ácido nucleico como se ilustra en SEC ID NO 3 y/o 4. Ejemplos de polinucleótidos que muestran más de un 99% de homología con la secuencia de nucleótido ilustrada en SEC ID NO 3, son las secuencias ilustradas en SEC ID NO 6 y 8, las cuales son las secuencias de codificación para p40 de pato y pavo, respectivamente. Los polinucleótidos de acuerdo con la invención pueden ser
ADN o ARN, preferiblemente ADN. El ADN de acuerdo con la invención puede ser obtenido a partir de ADNc. Alternativamente, la secuencia de codificación puede ser ADN genómico, o se prepara utilizando técnicas de síntesis de ADN. Si el polinucleótido es ADN, éste puede estar en la forma de estructura de cadena individual o estructura de cadena doble. La estructura de cadena individual puede ser la estructura de codificación o la estructura de no codificación (antisentido). También incluidos dentro de la definición de polinucleótido se encuentran los ARNs o ADNs. Se pueden hacer modificaciones en las bases del ácido nucleico, y se pueden incorporar bases tales como inosina. Otras modificaciones pueden involucrar, por ejemplo, modificaciones de la estructura de base. Por "aislado" se quiere dar a entender que el polinucleótido está aislado del estado natural, es decir, ha sido cambiado o movido de su ambiente natural, o ambos. La molécula se separa y es discreta de todo el organismo con el cual la molécula se encuentra por naturaleza. "% de identidad" define la relación entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos basándose en una comparación entre sus secuencias alineadas. La identidad puede ser calculada a través de métodos conocidos. Los porcentajes de identidad u homología como se menciona aquí, son aquellos que pueden ser calculados con el programa de GAP, que corre bajo GCG (Genetics Computer Group Inc., Madison, Wl, USA). Los parámetros para la comparación de secuencia de polipéptído incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 1970, 48: 443-453. Como una matriz de comparación para las alineaciones de aminoácido, se utilizó la matriz Blosum62 (Henikoff and Henikoff, supra) utilizando los siguientes parámetros: Penalidad de hueco: 8 Penalidad de longitud de hueco: 2 Ninguna penalidad para huecos extremos. Los parámetros para comparación de nucleótido que pueden ser utilizados son: Algoritmo: Needleman y Winsch (supra). Matriz de comparación: igualdades = +10, desigualdad = 0. Penalidad de hueco: 50.
21 Penalidad de longitud de hueco: 3. El ADN de acuerdo con la invención será muy útil para la expresión in vivo o in vitro del polipéptido codificado en cantidades suficientes y sustancialmente en forma pura. Cuando los polinucleótidos de acuerdo con la invención se utilizan para la expresión del polipéptido codificado, los polinucleótidos puede incluir, además de la secuencia de codificación para el polipéptido o su fragmento funcional otras secuencias de codificación, por ejemplo, secuencias libres o porciones de fusión, tales como secuencias marcadoras, y similares. La aplicación de citocinas mixtas a base de p40, tales como IL-12, IL-23, y (p40)2, puede aumentar las respuestas ¡nmunológicas inducidas por microorganismos o las respuestas ¡nmunológicas inducidas por vacunación, basándose tanto en inmunidad celular como humoral. Además, la intervención en la cascada inmunológica activada por estas citocinas utilizando, por ejemplo, dosis antagonísticas de (p40)2, puede evitar reacciones ¡nmunológicas patológicas no deseadas después de la sobreproducción desregulada de las moléculas a base de p40. Los polinucleótidos de acuerdo con la invención pueden ser utilizados en la producción de proteínas recombinantes de acuerdo con la invención. Los polinucleótidos también pueden ser utilizados en vacunas de ADN o vector, junto con otras secuencias de ácido nucleico que codifican, por ejemplo, proteínas inmunogénicas derivadas de patógenos avícolas.
22 Los polinucleótidos de acuerdo con la invención serán muy útiles para la expresión in vivo o in vitro del polipéptido codificado en cantidades suficientes y sustancialmente en forma pura. Cuando los polinucleótidos de acuerdo con la invención se utilizan para la expresión del polipéptido codificado, los polinucleótidos pueden incluir, además de la secuencia de codificación para el polipéptido o su fragmento funcional, otras secuencias de codificación, por ejemplo, secuencias libres o porciones de fusión, tales como secuencias marcadoras y similares. Una amplia variedad de combinaciones de célula huésped y de vehículo de clonación puede ser útilmente empleada en la clonación de la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Un polinucleótido de acuerdo con la invención puede ser clonado a un sistema de expresión apropiado, tal como un sistema de expresión bacteriana (por ejemplo, Escherichia coli DH5a), un sistema de expresión viral (por ejemplo, Baculovirus), un sistema de levadura (por ejemplo, Sacharomyces cerevisiae, Pichia), o células eucarióticas (por ejemplo, células Cos, BHK, HeLa, HD-11, DT40 o CEF). En todos los sistemas, el polinucleótido primero es clonado a un vector apropiado bajo el control de un promotor constitutivo o de inducción adecuado. En otro aspecto, la presente invención, por lo tanto se refiere a un vector recombinante que comprende un polinucleótido de acuerdo con la invención. Los vectores adecuados son, por ejemplo, cósmidos, plásmidos bacterianos o de levadura, plásmidos de amplia 23 escala de huésped y vectores derivados de combinaciones de plásmido y fago o ADN de virus. Los vectores derivados de ADN cromosómico ' también son incluidos. Además, un origen de replicación y/o un marcador de selección dominante puede estar presente en el vector de acuerdo con la invención. Los vectores de acuerdo con la invención son adecuados para transformar una célula huésped. Ejemplos de vectores de clonación adecuados son vectores de plásmido tales como pBR322, los varios plásmidos pUC, PEMBL y Bluescript, o vectores virales tales como HVT (virus de herpes de pavo), MDV (virus de la enfermedad de Marek), y LT (virus laringotraqueal infeccioso), FAV (adenovirus de ave de corral), FPV (virus de viruela avícola), o NDV (virus de enfermedad de Ne castle). Cuando se utiliza en la expresión del polipéptido o sus fragmentos funcionales, un vector recombinante de acuerdo con la presente invención además puede comprender una secuencia de control de expresión operablemente enlazada a la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína. "Operablemente enlazada" se refiere a una disposición en donde las secuencias de control" están configuradas con el fin de realizar su función usual, para efectuar la expresión del polinucleótido. Dichas secuencias de control de expresión generalmente comprenden una secuencia promotora y secuencias que regulan la transcripción y traducción y/o mejoran los niveles de expresión. No 24 todas estas secuencias de control necesitan estar presentes en un vector recombinante, siempre que el polinucleótido deseado sea capaz de ser transcrito y traducido. Claro que, las secuencias de control de expresión y otras secuencias pueden variar dependiendo de la célula huésped seleccionada o pueden hacerse por inducción. Dichas secuencias de control de expresión son bien conocidas en la técnica y se extienden a cualquier promotor eucariótico, procariótico o viral o señal de poli-A capaz de dirigir la transcripción de genes. Ejemplos de promotores útiles son el promotor SV-40 (Science 1983, 222:524-527), ei promotor de metalotioneina (Nature 1982, 296:39-42), el promotor de choque de calor (Voellmy y otros, P. N. A. S. USA 1985, 82:4949-4953), el promotor PRV gX (Mettenleiter and Rauh, J. Virol. Methods 1990, 30:55-56), el promotor CMV IE humano (E. U. A. 5,168,062), el promotor LTR del virus de sarcoma de Rous (Gorman y otros, P. N. A. S. USA 1982,.79:6777-6781) o el promotor de alfa o ubiquitina del factor 1 de elongación humano, etc. Después de que el polinucleótido ha sido clonado aun vector apropiado, la construcción puede ser transferida a la célula, bacteria o levadura solo a través de un método apropiado, tal como electroporación, transfección de CaCI2 o lipofectinas. Cuando se utiliza un sistema de expresión de baculovirus, el vector de transferencia que contiene el polinucleótido puede ser transfectado junto con un báculo genoma completo. Todas estas técnicas son bien conocidas en el campo y extensamente se describen en protocolos provistos por los 25 fabricantes de materiales biológicos moleculares (tales como Promega, Stratagene, Clontech, y/o Invitrogen) y en la literatura o libros de texto de referencia, por ejemplo, Rodríguez, R. L. Y D. Y. Denhardt, ed., "Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses", Butterworths, 1988; Current protocols in Molecular Biology, eds.: F. M. Ausubel y otros, Wiley N. Y., 1995; Molecular Cloning: a laboratory manual, supra; and DNA Cloning, Vol. 1-4, 2o. Edición 1995, eds.: Glover and Hames, Oxford University Press). Las células transformadas con un polinucieótido o un vector de acuerdo con la invención asimismo son parte de la presente invención. De esta manera, en otro aspecto, la presente invención proporciona una célula capaz de expresar un polipéptido recombinante, en donde la célula comprende un polipéptido de acuerdo con la invención que codifica el polipéptido recombinante expresado. El término "recombinante" en este contexto se refiere a un polipéptido que no es expresado en la célula por naturaleza. De esta manera, una célula huésped que comprende el ADN o vector de expresión de acuerdo con la invención, también está dentro del alcance de la invención. Las células huésped diseñadas por ingeniería pueden ser cultivadas en medios nutrientes convencionales, los cuales pueden ser modificados, por ejemplo, para una selección apropiada, amplificación o inducción de trascripción. Las conducciones de cultivo tales como temperatura, pH, nutrientes, etc., son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica.
26 Las células que son transformadas con un vector de acuerdo con la invención pueden ser de origen procariótico o eucariótico, preferiblemente las células son de origen eucariótico. Las células eucarióticas de acuerdo con la invención pueden ser de origen avícola o no avícola. Las células que son de origen no avícola pueden ser, por ejemplo, células BHK, células de insecto, células de HeLa o COS. Preferiblemente, las células son células avícolas tales como células CEF, HD-11 o DT-40. Una célula transformada de acuerdo con la invención pueden comprender un polinucleótido de acuerdo con la invención establemente integrado en el material genómico o como parte de un vector autónomamente de replicación. Un cultivo de célula que comprende una multitud de células de acuerdo con la invención es asimismo parte de la presente invención. Las células de acuerdo con la invención pueden ser utilizadas para expresar la sub-unidades de polipéptido o la proteína completa y pueden ser aisladas del cultivo de células. La clonación de las secuencias de nucleótido que codifican las subunidades p40 y p35, respectivamente, permite la producción de proteínas puras, libres de otras citocinas. Esto es especialmente útil en el caso de la producción de anticuerpos específicos para las proteínas de la invención. Estos anticuerpos específicos pueden ser generados a través de técnicas generalmente disponibles. De preferencia, los anticuerpos específicos son anticuerpos monoclonales. De esta manera, la presente invención además 27 proporciona anticuerpos específicos para las subunidades p40 y/o p35 o para la IL-12 de pollo. Los anticuerpos de acuerdo con la invención son adecuados para utilizarse en el diagnóstico o para el aislamiento y purificación de proteínas tales como la IL-12 de pollo a partir de preparaciones crudas. Además, los anticuerpos pueden ser utilizados para desarrollar ensayos para análisis cuantitativo de la producción de la proteína in vitro o para mediciones cuantitativas de niveles de proteína in vivo. Como ya se mencionó anteriormente, las proteínas y polinucleótidos de acuerdo con la invención son especialmente útiles para mejorar la respuesta inmunológicas a vacunas avícolas (es decir, pueden ser utilizados como tales o en auxiliares). La vacunación contra enfermedad infecciosa produce una respuesta inmunológica que limita los síntomas clínicos asociados con la infección a través de un patógeno. Es importante que el tipo correcto de reacción inmunológica sea activado, ya que muchos tipos de mecanismos inmunológicos que pueden ser activados son inadecuados para el control del patógeno particular. La baja sensibilidad a antígénos de vacuna puede ser superada administrados los antígénos en combinación con auxiliares. Los auxiliares son definidos como aquellos componentes de una formulación de vacuna distintos al antígeno que contribuyen a una sensibilidad inmunológica mejorada al antígeno, por ejemplo, sales de aluminio, emulsiones oleosas, derivados de péptido de muramilo, lípido A de monofosforilo, liposomas, QS21™, MS-59™, Iscoms™, y 28 similares. Los mecanismos celulares y moleculares que son activados después de la vacunación se ven enormemente influenciados por la elección del auxiliar que es administrado junto con el antígeno de vacuna. Por lo tanto, la sección de auxiliares puede ser tan crítica como la elección de los mismos antígenos de vacuna para proporcionar eficacia óptima. Las proteínas de acuerdo con la invención, en particular la IL-12 de pollo, puede tener un efecto auxiliar potente sobre la respuesta inmunológica del sujeto a una vacuna. De esta manera, en otra modalidad, la invención proporciona una composición auxiliar que comprende la cantidad auxiliar efectiva de una proteína de acuerdo con la invención, en particular IL-12 de pollo. La composición auxiliar puede ser administrada concomitante o secuencialmente con una formulación de vacuna. La proteína(s) de acuerdo con la invención puede ser incluida en la formulación de vacuna. De esta manera, en otra modalidad, la presente invención proporciona una vacuna que comprende por lo menos un agente activo, una cantidad auxiliar efectiva de una proteína de acuerdo con la invención, preferiblemente IL-12 de pollo y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Una proteína de acuerdo con la invención puede ser una molécula que comprende todas las subunidades de p40 y/o p35 o sus fragmentos, siempre que dichos fragmentos tengan retenida su habilidad para actuar como una citosina (por ejemplo, cuando se 29 utilizan en una vacuna, para retener su habilidad auxiliar). Una composición auxiliar de acuerdo con la presente invención comprende una proteína de acuerdo con la invención, preferiblemente IL-12 de pollo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichos vehículos farmacéuticos son agua, salina, y similares. Además, la composición auxiliar puede comprender uno o más de otros auxiliares tales como emulsiones oleosas, sales de aluminio, derivados de dipéptido de muramilo, lípido A de monofosforilo, liposomas, QS21™, MF-59™, Iscoms™, y similares. Las proteínas de acuerdo con la invención también pueden ser utilizadas junto con otras citocinas. La composición auxiliar de acuerdo con la invención puede, en una alternativa, comprender un plásmido de ADN capaz de expresar una proteína de acuerdo con la invención. Dicho plásmido de ADN comprende secuencias de ADN que codifican una proteína de acuerdo con la invención, preferiblemente IL-12 de pollo, operablemente enlazadas a secuencias reguladoras transcripcionales. Las secuencias de nucleótido que codifican para otras citocinas que se utilizan junto con una proteína de acuerdo con la invención, pueden ser presentadas en el mismo plásmido de ADN o en un plásmido separado. Después de la administración de dicha composición auxiliar de ADN a un sujeto, las células huésped toman y expresan genes codificados en el ADN inoculado, dando como resultado la expresión in vivo de las proteínas de acuerdo con la invención, por ejemplo, IL-12 de pollo.
30 Una vacuna de acuerdo con la invención comprende por lo menos un agente activo y una cantidad auxiliar efectiva de una proteína de acuerdo con la invención, es decir, en una cantidad que ocasionará que el sujeto vacunado produzca una respuesta inmunológica mejorada según comparado con la vacuna sin dicha proteína. La cantidad efectiva requerida en una composición auxiliar o vacuna de acuerdo con la invención depende del tipo de agente activo usado, el tipo de patógeno contra el que se inmuniza, así como el tipo de sujeto vacunado. La determinación de la cantidad efectiva está dentro de la experiencia rutinaria de los practicantes, y generalmente estará en la cantidad de 0.001 a 500 pg/dosis. Preferiblemente, la cantidad estará entre 0.01 y 50 pg/dosis, muy preferiblemente de 0.1 a 5 pg/dosis. El agente activo para utilizarse en una vacuna de la invención puede ser de origen viral, bacteriano o parásito. El agente activo puede ser ya sea el patógeno entero que ocasiona la enfermedad, o puede consistir de componentes derivados de dicho patógeno. En el caso en que el agente activo sea un patógeno entero, dicho patógeno puede ser un patógeno vivo o un patógeno inactivado. Los patógenos vivos se considera que son cepas ya sea atenuadas o moderadas de existencia natural de dicho patógeno. Los patógenos inactivados son patógenos aniquilados a través de medios químicos físicos, es decir, el patógeno inactivado o "aniquilado" ya no es más capaz de replicación. Los medios adecuados de inactivación química son 31 formaldehído, glutaraldehído, ß-propi'olactona, etilenimina y derivados, y similares. Los medios adecuados para inactivación física son radiación UV, radiación ?, "choque térmico", radiación X, y similares. Alternativamente, el agente activo puede constituir uno o más componente derivados de dicho patógeno que causa la enfermedad, por ejemplo, proteína purificada, polisacárido, proteína-lipopolisacáridos, lipopolisacáridos, y similares. El agente activo puede ser un plásmido de ADN capaz de expresión in vivo de un patógeno o componente seleccionados derivados de dicho patógeno. Además, la vacuna puede comprender un plásmido de ADN capaz de expresar una proteína de acuerdo con la invención in vivo. El ADN que codifica dicho auxiliar de proteína y el ADN que codifica dicho patógeno o componente seleccionados puede estar presente en uno y en el mismo plásmido, o puede estar presente en plásmidos separados. Después de la administración de la vacuna de ADN a un sujeto, las células huésped tomarán y expresaran in vivo dicho agente activo así como la proteína de acuerdo con la invención. Las vacunas de ADN, por ejemplo, se describen en la patente de E. U. A. 5,580,859. Los vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados para formular una composición auxiliar o una composición de vacuna de acuerdo con la invención estériles y fisiológicamente compatibles, tal, por ejemplo, un regulador de pH acuoso, una solución salina, y similares. Además, se pueden agregar a estas composiciones estabilizadores, conservadores, y similares.
32 Las composiciones de ia presente invención pueden tener cualquier forma que sea adecuada para administración oral o parenteral. Para uso oral, las composiciones auxiliares o de vacuna de acuerdo con la invención pueden ser formuladas como soluciones, jarabes, suspensiones, tabletas, cápsulas y similares. Para uso parenteral, las composiciones de acuerdo con la presente invención pueden ser formuladas en una forma adecuada para inyección, tales como suspensiones, soluciones, dispersiones, emulsiones, y similares. La preparación de las composiciones de acuerdo con la presente invención se realiza a través de medios convencionales para aquellos expertos en la técnica. Las rutas de administración preferidas son rutas parenterales, por ejemplo, inyección intramuscular, inyección intravenosa, inyección intradérmica, inyección subcutánea, y rutas de mucosa, por ejemplo, gotas nasales, gotas para los ojos, aspersiones (en aerosol), y similares. Los siguientes ejemplos ilustraran la invención sin limitar la invención a esto.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Figura 1: secuencia de ADN y proteína del clon pat.pk0055.c11 ( = ChlL-12 p35). Figura 2: homología de ADN de secuencias p35 a p35 de pollo de humano, cabra, caballo, gato, bovino, ratón y marmota.
33 Figura 3: homología de proteína de secuencias p35 a p35 de pollo de humano, cabra, caballo, gato, bovino, ratón y marmota. Figura 4: homología de proteína de un fragmento p35 de pollo (aa 65-205) a secuencias p35 de humano, cabra, caballo, gato, bovino, ratón y marmota. Figura 5: secuencia del clon ChEST582p2; iniciadores 5' y 3' (SEC ID NO 18 y 17, respectivamente) están subrayados. Figura 6: homología de proteína de secuencias ChEST582p2 a p40 de humano, cabra, caballo, gato, bovino, ratón y marmota. Figura 7: iniciadores de PCR de p40 de IL-12 de 5' de degeneración; SEC ID NO 13-16. Figura 8: secuencia de ADN y de proteína del clon pND89 ( = ChlL-12 p40). Figura 9: homología de ADN de secuencias de p40 a p40 de pollo de humano, cabra, caballo, gato, bovino, ratón y marmota. Figura 10: homología de proteína de secuencias de p40 a p40 de pollo de humano, cabra, caballo, gato, bovino, ratón y marmota. Figura 11: secuencia de ADN y de proteína del clon pND115 ( = Pato IL-12 p40). „ Figura 12: secuencia de ADN y proteína del clon pND117
( = Pavo IL-12 p40). Figura 13: homología de ADN de secuencias de p40 a p40 de pollo, de pato y pavo. Figura 14: homología de proteína de secuencias p40 a p40 de pollo, de pato y pavo.
34 Figura 15: análisis de tinción Western de sobrenadantes de cultivo de célula COS-7 después de transfección con IL-12 de pollo y otras moléculas de ADNc (mock = control de vector vacío). Figura 16: Inducción dependiente de IL-12 heterodimérico de pollo de IFN-? (Fe - felino; mock = control de vector vacío). Figura 17: proliferación dependiente de IL-12 heterodimérica de pollo de células del bazo de pollo (Fe = felino; mock = control de vector vacío). Figura 18: inducción dependiente de Flexi-iL-12 de pollo de IFN-? (Fe = felino; mock = control de vector vacío). Figura 19: proliferación dependiente de FIexi-12 de pollo de células del bazo de pollo (Fe = felino; mock = control de vector vacío).
EJEMPLOS
Materiales y Métodos para todos los Ejemplos
Cultivo de célula y tratamiento de LPS Las líneas de célula de pollo HD-11 (de origen macrófago) y
DT-40 (de origen de célula B) se desarrollaron como suspensiones de célula en RPMl (suplementado con suero de bovino fetal al 10%, 100 yg/ml de estreptomicina, 100 unidades/ml de penicilina, 2 mM de glutamina y 1 mM de piruvato) y DMEM (suplementado con suero de bovino fetal al 8%, suero de pollo al 2%, 2 mM de glutamina, 100 35 pg/ml de estreptomicina, 100 unidades/de penicilina y 1 m de piruvato), respectivamente. El tratamiento lipopolisacárido (LPS) incluyó la incubación de células con 5 pg/ml de LPS durante 5 horas. Después del tratamiento, las células se lavaron dos veces con salina regulada en su pH con fosfato y subsecuentemente se utilizaron para aislamiento de ARN o se almacenaron a -70°C. Las células se mantuvieron en una atmósfera humedecida de C02 al 5% a 37°C. La línea de célula de mamífero COS-7 (células de riñon de mono verde Africano) se desarrollaron en DMEM (suplementado con FCS al 10%, 2 mM de glutamina, 100 pg/ml de estreptomicina, 100 U/ml de penicilina y 1 mM de piruvato).
Organos de pollo, pato y pavo y tratamiento con LPS Se derivaron pollos libres de patógeno específico de Leghom blancos normales de 3 semanas de edad (SPF) de las instalaciones de animales Intervet y se alojaron bajo condiciones de SPF. Los animales recibieron agua y alimento libitum. Se amasaron órganos recientemente aislados de pollo, pato o pavo, es decir bazo y riñon, utilizando un tamiz y regulador de pH de Hanks. Las células se formaron en pellas a 1500 rpm durante 3 minutos a temperatura ambiente y se lavaron dos veces utilizando el mismo procedimiento. Las células de pato y pavo se utilizaron subsecuentemente para aislamiento de ARN. Las células de pollo se volvieron a suspender en RPMl suplementado con suero de pollo al 10%, 100 pg/ml de estreptomicina y 100 unidades/ml de penicilina, y 36 se desarrollaron durante 16 horas. Algunas células de incubaron con 5 µ g/m I de LPS durante 5 horas. Después del tratamiento, las células se lavaron dos veces con salina regulada en su pH con fosfato y subsecuentemente se utilizaron para aislamiento de ARN o se almacenaron a -70°C. Las células de mantuvieron en una atmósfera humedecida de COz al 5% a 41°C.
Aislamiento de ARN Se aisló el ARN total utilizando el reactivo Trizo! reagent™ (Gibco-lnvitrogen) como se describe por el fabricante. La calidad del ARN se verificó en un gel de agarosa al 1%.
RT-PCR, PCR y reacciones de secuencia Se transcribieron en forma inversa 2 pg de ARN total a ADNc utilizando el protocolo Superscript II RT™ (Gibco-lnvitrogen). Este ADNc recientemente hecho subsecuentemente se utilizó como plantilla para amplificación de PCR. Para esto, se mezcló 1 µ? de la reacción de RT-ADNc (10-20 ng de plantilla de ADNc de piásmido) con 0.5 µ? de una unidad/µ? de Supertaq™ (HT Biotechnology Ltd), 1 pl de 10 ng/µ? de cada iniciador, 1.6 µ? de 2 mM de dNTPs, y 2 µ? de 10x ST de regulador de pH de PCR (HT Biotechnology Ltd) en un volumen final de 20 µ?. Las condiciones de ciclización de reacción fueron 94°C durante 2 minutos, después 30 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 1 minuto, 72°C durante 1 minuto y 30 segundos, después 72°C durante 2 minutos para una extensión final.
37 Los productos de PCR fueron purificados en gel utilizando el equipo de extracción Qiaquick Gel Extraction kit™ (Qiagen), se clonaron en el vector pDrive™ (Qiagen PCR Clonlng kit, Qiagen) o en el vector pCR2.1-TOPO™ (TA Clonlng kit, Invitrogen). El ADN de plásmldo fue purificado utilizando el equipo Qiagen
Plasmld Midi kit™ (Qiagen). Para reacciones de PCR generales, en donde se utilizan 10 ng de una plantilla de plásmido, se utilizaron las mismas condiciones de ciclización como las anteriormente descritas. Todos los clones fueron extensamente secuenciados en direcciones tanto 5' como 3' utilizando un equipo de secuención de ADN (BigDye Terminator v3.0 Cycles Sequencing Ready Reaction™, Applied Biosystems). Las secuencias fueron analizados con el software Sequencher™ 4.0 software (Gene Codes Corporation).
Análisis de secuencia El análisis de secuencia, incluyó el uso de búsquedas Blast (a través de un servidor interno, InterBLAST, de Intervet Innovation, Schwabenheim, Alemania), la versión 10.2 del paquete Wlsconsin Package™ Versión 10.2 (Genetics Computer Group; GCG), Sequencher™ 4.0 (Gene Codes Corporation), OMIGA™ 2.0 (Oxford Molecular Ltd.) y de GeneDoc™ 2.6 (www.psc.edu/biomed/genedoc).
38 p35 de 1L-12 de pollo (Ch). p40 de 1L-12 de CH. ChFlexi-IL-12 v construcciones de expresión eucarióticas de Flexi-1L-12 de felino (Fe) ChlL-12 p35. ChlL-12 p35 de longitud completa (clon pat.pk0055.c11), originalmente clonado en pcDNA3™ (Invitrogen) (Tirunagaru, VG y otros, Genomics 2000, 66:144), fue separado de pcADN3 utilizando EcoRI y Notl y se clonó en los sitios de restricción correspondientes del vector de expresión eucariótico pcDNA3.1 ( + ) ™ (Invitrogen). El fragmento de EcoRI/Notl ChlL-12 p35 también se clonó en los sitios de restricción correspondientes de pcDNA3.1(-)™ (Invitrogen) para obtener una construcción de control antisentido.
ChlL-12 p40. ChlL-12 p40 de longitud completa presente en una colección de ADNc construido a partir de células T y B combinadas, aisladas de pollos vacunados y reclonadas en pDrive™ (Qiagen), se separó de pDrive utilizando Notl y Hindi y se clonó a los sitios de restricción correspondientes del vector de expresión eucariótico pcDNA3.1(-) (Invitrogen).
ChFlexi-lL-12. Se generó una molécula de IL-12 de pollo de cadena individual a través de una estrategia descrita por (Equine Vet. J. 2001, 33:693). Se utilizaron los siguientes iniciadores para amplificar ChlL-12 p35 sin la secuencia de péptido de señal de 35 aminoácidos putativa (según determinado por el programa SPScan del paquete Wisconsin Package (supra) y que introdujo un sitio de restricción 5'-BamHI y un 3 -Hind i [ I : 5'-TTGGATCCGGTGGCGGCGGATCTCTGCCACCTCCTGCCCA-3' (SEC ID NO 9), y 5'-CCAAGCTTTTACATCTCTGCAGTGAGGGCACTCAGGTAGC-3' (SEC ID NO 10). Para p40 de IL-12 de Ch se utilizaron los siguientes iniciadores que introdujeron un sitio de restricción 5'-Notl y un 3'-BamHI: 5'-TTGCGGCCGCCATGTCTCAACCTGCTATTTGCCTTACTTTC-3' (SEC ID NO 11) y 5'-TGGATCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTCTGCAAAGCGTG G-3' (SEC ID NO 12). Ambos fragmentos de PCR fueron separadamente clonados en pCR2.1-TOPO™ (Invitrogen) y extensamente secuenciados. El p40 de IL-12 de Ch se separó de pCR2.1-TOPO como un fragmento de Notl/BamHI y se clonó a los sitios de restricción correspondientes del vector pcDNA3.1(-) (Invitrogen). El p35 de IL-12 de Ch se separó de pCR2.1-TOPO como un fragmento de BamHI/Hindi y se clonó a los sitios de restricción correspondientes de la construcción [ChlL-12 p40]-[pcADN3.1 (-)] corriente abajo del fragmento p40. Esto dio como resultado una construcción heterodimérica de p40-p35 de cadena individual, en donde la cadena p40 está enlazada a la cadena p35 a través de un enlazador (Gly4Ser)3 en marco; esta molécula fue designada como flexi-IL-12 de Ch.
40 Fe-Flex¡-IL-12. Se clonó IL-12 de felino al vector eucariótico pCI-neo™ (Promega) (Dr. L. Nicolson, Univ. of Glasgow Veterinary School, UK) produciendo una construcción similar a la de Flexi-IL-12 de Ch.
Expresión pasajera de clones de ADNc en células COS-7 Se transfectaron células COS-7 con 1.5 [ig de cada construcción de ADNc utilizando el reactivo Invitrogen Life Technologies Lipofectamina™ (como se describe por el fabricante) y se cultivó en platos de 3 cm con DMEM (sin FCS y penicilina/estreptomicina). Después de 8 horas, las células transfectadas se lavaron y se cultivaron el DMEM con penicilina/estreptomicina y FCS al 10%. Después de 72 horas de incubación a 37°C/C02 al 5%, los sobrenadantes del cultivo de células se cosecharon y se centrifugaron a 13,000 rpm durante 10 minutos a 4°C para remover el desperdicio de células. Los sobrenadantes fueron analizados a través de tinción Western y se utilizaron inmediatamente o se almacenaron a -70°C.
Análisis de tinción Western Los sobrenadantes del cultivo de células de las células COS-7 transfectadas fueron fraccionados por tamaño utilizando Nu-PAGE™ al 4-12% (Invitrogen) y se tiñeron sobre filtros de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell). Las tinciones Western fueron bloqueadas en leche descremada al 3% (MPBS) en PBS, y subsecuentemente se 41 incubaron con anticuerpo poüclonal que surgió contra un péptido p40 de Fiel- 12 diluido 1:300 en PBS. El bloqueo y la incubación del anticuerpo se realizaron cada uno durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado extenso (3 veces 5 minutos), las tinciones fueron incubadas con anticuerpos de IgG de anti-conejo de cabra conjugados con peroxidasa alcalina (AP) (Sanbio) diluidos 1:1000 en MPBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado (3 veces 5 minutos), los anticuerpos secundarios marcados con AP unidos fueron visualizados a través de tinción.
Ensayos de bioactividad para IL-12 de pollo (Ch) Ensayo NO para la inducción de ChlFN-? esplénico a través de IL-12 de pollo. Se aislaron recientemente células del bazo del pollo y se sembraron por triplicado en una placa de 96 cavidades a una densidad de 0.5 x 106 células/cavidad en 100 µ? y se incubaron con 50 µ? de diluciones en serie de sobrenadantes del cultivo de célula a partir de las células COS-7 transfectadas con clones de ADNc que codifican p40 de IL-12 de pollo, el p40 de IL-12 de pollo se mezcló con p35 de IL-12 de Ch, Flexi-IL-12 de Ch, Clexi-IL-12 de felino o con un plásmido de pcDNA3.1 vacío (mock). Después de 48 horas de la adición de proteínas, los sobrenadantes (75 µ?) se recogieron y se analizaron para la presencia de lFN-? de CH biológicamente activo. Para esto, 100 µ? de 1.5 x 106/ml de células HD-11 se incubaron con 75 µ? de los sobrenadantes recogidos durante 24 horas a 37°C/C02 al 5% en placas de 96 cavidades. La 42
activación de células HD-11 a través de IFN-? de CH se midió como una función de acumulación de nitrito en los sobrenadantes de cultivo utilizando el ensayo de Griess (Ding, AH y otros, J. Immunol. 1988, 141:2407; Stuehr, DJ, y CF Nathan, J. Exp. Med. 1989, 169:1543).
Ensayo para la proliferación de célula de bazo a través de IL-12 de Ch. Después de remover 75 pl de los sobrenadantes (ver el ensayo NO para la inducción de IFN-? de CH esplénico a través de la sección de IL-12 de Ch), 50 pl del medio y 18.5 kBq de metil-3H-timidina (25 µ? por cavidad) se agregaron a los 75 µ? restantes en la placa de 96 cavidades y se incubaron durante 18-20 horas a 41°C/C02 al 5%. Después de la incubación, la radioactividad incorporada se contó utilizando un contador ß LKB Betaplate™.
Análisis estadístico La importancia de las diferencias entre los nombres de producción NO o entre los medios de proliferación de células se analizó utilizando la prueba t de Student. Las diferencias se consideraron importantes a un nivel de confidencia de 95% (P<0.5)
EJEMPLO 1 Aislamiento y análisis de secuencia del clon pat.pk0055.c11 que codifica la subunidad p35 de IL-12 de pollo (ChlL-12 p35) El análisis del marco de lectura abierto (nucleótidos 1-618) del 43 clon de ADNc pat.pk0055.c11 (ver Figura 1), el cual se aisló de un proyecto de secuenciación altamente productivo de la colección de ADNc de célula T estimulada con Con A de pollo (Tirunagaru y otros, supra), mostró que es homólogo a las secuencias de ADNc de p35 de IL-12 de humano (43% de homología total, M65271 en EMBL/Genbank), oveja (45% de homología total, AF173557 en EMBL/Genbank), caballo (48% de homología total, Y11130 en EMBL/Genbank), gato (43% de homología total, Y07761 en EMBL/Genbank), Bovino (45% de homología total, U14416 en EMBL/Genbank), ratón (42% de homología total, M86672 en EMBL/Genbank) y marmota (45% de homología total, X970189 en EMBL/Genbank), (ver Figura 2). Una alineación múltiple de la proteína Ch IL-12 p35 codificada por pat.pk0055.c11 para proteínas de p35 de IL-12 de humano, oveja, caballo, gato, bovino, ratón y marmota produjo una homología de aminoácido total de 27%, 25%, 30%, 24%, 25%, 29% y 21%, respectivamente (ver Figura 3). Cuando se removieron los primeros 64 aa (residuos 1-64) de pat.pk0055.c11, las homologías a las proteínas de p35 de IL-12 de humano, oveja, caballo, gato, bovino, ratón y marmota se incrementó a 33%, 32%, 37%, 25%, 32%, 34% y 28%, respectivamente (ver Figura 4), indicando que el fragmento N-terminal de pat.pk0055.c11 no está tan altamente conservado como el resto de la proteína. Basándose en estas homología de secuencia, se concluye que el clon pat.pk0055.c11 codifica la subunidad p35 de IL-12 de pollo.
44 EJEMPLO 2 Aislamiento del clon pND89 que codifica la subunidad p40 de 1L- 12 de pollo (ChlL-12 p40)
La secuencia de codificación, es decir, los nucleótidos 35- 1042, de la subunidad p40 de interleucina 12 de ratón (MulL-12 p40; EMBL/Genbank, Número de Acceso M86671) se utilizó para buscar la base de datos de depósito UMIST/Nottingham/Dundee Chiken EST Re pósito ry Datábase (http://www.chick.umist.ac.uk/cgi-bin/Chiken datábase. cgi), utilizando el programa tBIastX. Una secuencia de EST de pollo (ID de clon ChEST582p2; nombre de EST 603603708F1; derivada de riñon de adulto) se recuperó y mostró un 51% de identidad con aa 251-279 y una identidad de 66% con aa 310-327 de la secuencia de p40 de MulL-12. No se asignó ningún número de acceso a Genbank para este clon ChEST582p2 y no se hicieron ningún de anotaciones señalando la dirección de IL-12 por los propietarios de esta base de datos de EST de pollo. Una búsqueda de base de datos en la misma base de datos de EST de pollo con este clon ChEST582p2 no dio como resultado un clon de longitud más larga o completa. Una búsqueda de base de datos similar en ia base de datos de U.D. Chick EST datábase (http://www.chickest.udel.edu/) con la secuencia de codificación, es decir, los nucleótidos 35-1042, de p40 de MulL-12 (EMBL/Genbank M86671) no dio como resultado un aspecto válido utilizando el programa BlastN ni una búsqueda con el clon ChEST582p2 dando como resultado un clon de longitud más larga o completa. El clon ChEST582p2 identificado tiene una longitud de 848 nucleótidos de los cuales los nucieótidos 3-233 (que incluyen un común de detención) codifican un polipéptido de longitud de 76 aminoácidos (ver Figura 5). Una alineación múltiple de la secuencia de proteína ChEST582p2 pronosticada mostró que se alinea a la parte más c-terminal de p40 de MulL-12 (35% de homología total; M86671 en EMBL/Genbank), y a la parte C-terminal de p40 de IL-12 de varias otras especies, incluyendo humano (43% de homología total, M65272 en EMBL/Genbank), oveja (43% de homología total AF004024 en EMBL/Genbank), caballo (43% de homología total, Y11129 en EMBL/Genbank), gato (43% de homología total, Y07762 en EMBL/Genbank), bovino (42% de homología total, U 11815 en EMBL/Genbank) y marmota (51% de homología total, X97019 en EMBL/Genbank) (ver Figura 6). Estas altas homologías prueban que el clon ChEST582p2 codifica la parte C-terminal de la subunidad p40 de IL-12 de pollo. Para clonar la unidad de proteína de p40 de IL-12 de pollo de longitud completa (ChlL-12 p40), se han utilizado tres aspectos. En el primer aspecto, 3 iniciadores degenerados: 5'-ATGTGTCACCAGYRGTTGGTCMTCTCYTG-3' (SEC ID NO 13), 5'-ATGTGTCYTCAGMAGYTRRYCATCTCCTG-3' (SEC ID NO 14), y 5'-ATGTGTCWYCAGYRGTTGGTCMTCTCCTG-3' (SEC ID NO 15), y un iniciador 5'- extremo específico 5'-ATGCACCCTCAGCAGTTGGTCGTTTCCTG-3' (SEC ID NO 16), 46 basándose en el extremo 5' de humano (M65272 en EMBL/Genbank), alce (U57752 en EMBL/Genbank), caballo (Y11129 en EMBL/Genbank), oveja (AF004024 en EMBL/Genbank), ratón (M86671 en EMBL/Genbank) y marmota (X97019 en EMBL/Genbank) fueron designados (ver Figura 7). En combinación con un iniciador 3'-ChESTp582p2 5'-TTATCTGCAAAGCGTGGACCACTCACTCCAGGAT-3' (SEC ID NO 17) (complementaria a las posiciones de nucleótido 233-200 en la Figura 5) y se realizó una reacción de RT-PCR en ARN total aislado de células HD-11 de pollo (macrófago), células DT-40 (B) de pollo, células de riñon de pollo y células del bazo de pollo tratadas con o sin 5 Mg/ml de lipopolisacárido (LPS). Sorprendentemente, ninguna de las combinaciones de iniciador dio como resultado un producto de PCR. Como un control, se realizó una reacción de RT-PCR simultáneamente utilizando un iniciador ChESTp582p2 de extremo 5', 5'-ACCTGGACATATCCCAAGACCTGGAGCACA-3' (SEC ID NO 18) (posiciones de nucleótido 12-41 en la Figura 5) y el iniciador ChESTp582p2 de extremo 3' (SEC ID NO 17, supra). Esta combinación de iniciador dio como resultado un fragmento de PCR de aproximadamente 200 nucleótidos. Estos resultados indican que no es posible obtener una molécula de p40 de IL-12 de pollo de latitud completa utilizando un aspecto de RT-PCR basándose en las secuencias de p40 de IL-12 de extremo 5' de humano, alce, caballo, ratón o marmota, con iniciadores degenerados en combinación con 47 un iniciador de extremo 3' específico. En el segundo aspecto, se utilizaron combinaciones de plásmido aisladas de una colección de ADNc de HD-11 que se construyó a partir de células HD-11 de pollo (macrófago) estimuladas durante 5 horas con 5 pg/ml de LPS (Sick C, Schneider K, Staeheli P, Weining KC. Novel chicken CXC and CC chemokines. Cytokine 2000, 12:181-186). En esta colección, las moléculas de ADNc se clonaron u nid ireccionalmente entre los sitios EcoRI y Xhol del vector de expresión eucariótico pcADNI. En una reacción de PCR con iniciador de vector de pcADNI de extremo 5' 116 corriente arriba nt del sitio de restricción EcoRI, 5'-CTGGCTAACTAG AGAACCCACTGCTTACTGGCTT-3' (SEC ID NO 19) (posiciones de nucleótido 2918-2951 del vector pcADNI) y el iniciador ChESTp582p2 (SEC ID NO 17, supra), se obtuvo un fragmento de PCR de aproximadamente 1000 nucleótidas que se clonó a pDrive™ (Qiagen). En el tercer aspecto, se utilizaron combinaciones de plásmido aisladas de una colección de ADNc que se construyó a partir de células T y B combinadas aisladas de pollos vacunados. En esta colección, las moléculas de ADNc se clonaron unidireccionalmente entre los sitios Notl y EcoRI del vector de expresión eucariótico pBlueScript™ (Stratagene). En una reacción de PCR con un iniciador de vector pBlueScript de extremo 5', aproximadamente 120 nucieótidos corriente arriba del sitio de restricción Notl y el iniciador 48 3' ChESTp582p2 (SEC ID NO 17, supra), se obtuvo un fragmento de PCR de aproximadamente 1000 nucleótidos que se clonó a pDrive. Para investigar si este clon, designado como pND89, contiene aproximadamente 200 nt del fragmento p40 de IL-12 en el extremo 3', se realizó una reacción de PCR utilizando pND89 como plantilla en combinación con 5' ChESTp582p2 (SEC ID NO 18, supra) y el iniciador 3' ChESTp582p2 (SEC ID NO 17, supra). Los resultados mostraron un fragmento de PCR de aproximadamente 200 nucleótidos, indicando que el clon de ADNc pND89 de longitud de aproximadamente 1000 nt contiene el fragmento de p40 de IL-12 con una longitud de 222 nt.
EJEMPLO 3 Análisis de secuencia de un clon pND89 de ADNc
El clon pND89 se secuenció extensamente, lo cual revelo que el clon de ADNc (del inicio al fin) tiene una longitud de 948 nucleótidos y codifica una proteína de 315 aminoácidos (ver Figura 8). El análisis de la secuencia de ADNc de pND89, conteniendo el marco de lectura abierto (nucleótidos 1-948), mostró que es homólogo a la secuencias de ADNc de p40 de IL-12 de humano (57% de homología total, M65272 en EMBL/Genbank), oveja (56% de homología total, AF004023 en EMBL/Genbank), caballo (57% de homología total, Y 11129 en EMBL/Genbank), gato (5% de homología total, Y07762 en EMBL/Genbank), bovino (56% de homología total, 49 U 1815 en EMBL/Genbank),. ratón (55% de homología total, M86671 en EMBL/Genbank) y marmota (57% de homología total, X97019 en EMBL/Genbank), (ver Figura 9). Una alineación múltiple de la proteína Ch IL-12 p40 codificada por pND89 para proteínas de p40 de IL-12 de humano, oveja, caballo, gato, bovino, ratón y marmota produjo una homología de aminoácido total de 41%, 40%, 40%, 42%, 39%, 36% y 41%) respectivamente (ver Figura 10). El análisis de secuencia además reveló la presencia de un péptido de señal con el sitio de escisión entre 20-21 aminoácidos dando como resultado un péptido de señal de 20 aminoácidos y una proteína madura de 295 aminoácidos. La presencia de una caja WSXWS (aminoácidos 305-311), un dominio de tipo C2 similar a Ig (residuos de aminoácido 41-94) y dominio de tipo III de fibronectina (residuos de aminoácidos 228-308), ios cuales ambos son característicos para p40 de IL-12, se realizaron por similitud. Estas homologías de secuencia probaron que el clon pND89 codifica la subunidad p40 de IL-12 de pollo.
EJEMPLO 4 Aislamiento y análisis de secuencia de los clones pND115 y pND117 que codifican las subunidades p40 de IL-12 de pato y pavo, respectivamente
Al utilizar la secuencia de p40 de IL-12 de pollo y la alta homología existente entre pollos y patos/pavos, se intentó clonar las subunidades p40 de IL-12 de pato y pavo. En combinación con un 50 iniciador de p40 de IL-12 de pollo de extremo 5' 5'-ATGTCTCACCTGCCTATTTGC-3' (SEC ID NO 20) (posiciones de nucleótido 1-20 en la Figura 1-20) y un iniciador de p40 de IL-12 de pollo de extremo 3' 5'-TTATCTGCAAAGCGTGGACCACT-3' (SEC ID NO 21) (complementario a las posiciones de nucleótido 948-926 en la Figura 8), se realizó una reacción de RT-PCR en el ARN total aislado ya sea de células de bazo y de riñón de pato o pavo. A partir de las reacciones RT-PCR, se obtuvieron fragmentos de PCR de aproximadamente 1000 nt que subsecuentemente fueron clonados al vector pCR2.1™ (Invitrogen). El clon de pato se designó como pND115 y el clon de pavo como pND117. Los clones pND115 y pND117 fueron extensamente secuenciados, lo cual reveló que ambos clones de ADNc (desde el inicio hasta el fin) tienen una longitud de 948 nucleótidos y codifican proteínas de 315 aminoácidos (ver Figuras 11 y 12). El análisis de la secuencias de ADNc pND115 y pND117 que contienen el marco de lectura abierto (nucleótidos 1-948) mostró que ambas son >99% idénticas a la secuencia de ADNc de p40 de IL-12 de pollo (ver Figura 13). Una alineación múltiples de las proteínas pND115 y pND117 pronosticadas mostró que pND 115 es idéntico a p40 de IL-12 de pollo y que pND117 es >99% idéntico con la proteína de p40 de IL-12 de pollo (ver Figura 14). Las pequeñas diferencias en homología entre pND115, pND117 y p40 de IL-12 de pollo son el resultado de pequeñas sustituciones en la secuencia de ADNc que da como resultado mutaciones de residuo de 51 aminoácido silenciosas tanto para pND115 como para pND117, y un cambio de residuo de aminoácido para pND117 (ver Figura 14). Basándose en estas homologías de alta secuencia, se concluye que el clon pND115 codifica la subunidad p40 de IL-12 de pato y que el clon pND117 codifica la subunidad p40 de IL-12 de pavo.
EJEMPLO 5 Caracterización de IL-12 de pollo (Ch) recombinante
Para detectar subunidades ChlL-12 p40 y ChlL-12 p35 secretadas después de (co-) transfección de células COS-7, se aplicó un análisis de tinción Western sin desnaturalización. Para esto, un anticuerpo policlonal que surgió contra un péptido de la subunidad (Fe) IL-12 p40 de felino fue utilizado. Con este anticuerpo de p40-péptido de anti-Fel L-12, se pudieron detectar ChlL-12 p40 y el homodímero de ChlL-12 p40: ChlL-12 p80 (Ch (p40)2) en los sobrenadantes de células COS-7 transfectadas (Figura 15, carril 1). En los sobrenadantes de las células COS-7 transfectadas tanto con ChlL-12 p35 como ChlL-12 p40, la proteína heterod imérica ChlL-12 p70 (ChlL-12) (Figura 15, carril 4) pudo ser detectada indicando que la cadena p40 y p35 interactúa entre sí en la molécula de p70 de IL-12 heterodimérica. La formación de ChlL-12 p70 fue más eficiente que la formación de ChlL-12 p80 homodimérico ya que no se pudo detectar nada de ChlL-12 p80 p se detectaron muy pequeñas cantidades. También, la formación de ChlL-12 p70 es específica 52 como la co-transfección de ADC de ChlL-12 p40 con ADNc de ChlL-12 p35 antisentido o con una construcción de ADNc que codifica una proteína viral y relevante (IBV-N) que no dio como resultado la heterodimerización (Figura 15, carriles 5-6).
EJEMPLO 6 Bioactividad de 1L-12 de pollo: inducción de ChIFN y dependiente de ?1 ChlL-12
Un sello distintivo de la actividad de IL-12 en mamíferos es su inducción de IFN-? a través de linfocitos T. Por lo tanto, los niveles de lFN-? fueron analizados en el medio de cultivo de células de bazo de pollo recientemente aisladas, incubadas con diluciones de varias proteínas aisladas después de la (co-)expresión pasajera en células COS-7. Se midió ChlFN-? como una función de acumulación de nitrito utilizando células HD-11 y el ensayo de Griess. Como se muestra en la Figura 16, solamente el ChlL-12 p70 heterodimérico (una co-transfección de ChlL-12 p40 con ChlL-12 p35) es capaz de inducir la producción de IFN-? en células de bazo de pollo en una forma dependiente de concentración. La transfeccion del vector mock o de ChlL-12 p40 solo, no pudo inducir la secreción de ChlFN-? a un nivel comparable con el ChlL-12 p70 heterodimérico. Después de esto, es evidente que solamente especies específicas de IL-12 inducen IFN-y en células de bazo de pollo como FeFlexi-IL-12, que no indujo ninguna cantidad importante de ChlFN-?. Las diferencias en la 53 producción NO entre ChlL-12 p40 y ChlL-12 p70 (una co-transfección de ChlL-12 p40 con ChlL-12 p35), y entre ChlL-12 p70 y FeFlexi-IL-12, fueron importantes (P<0.05). En conjunto, estos resultados indican que ChlL-12 es bioactivo y que la inducción de IFN-? a través de células de bazo de pollo es dependiente de ChlL-12.
EJEMPLO 7 Bioactividad de IL-12 de pollo: proliferación de células de bazo de pollo, dependiente de \2] ChlL-12
Otra característica de IL-12, compartida con varias otras citocinas, es su inducción de proliferación de célula T. La respuesta de crecimiento de esplenocitos de pollo recientemente aislados a varias proteínas, aisladas después de la (co-)expresión pasajera en células COS-7, se midió a través de un ensayo de proliferación de células. Solamente ChlL-12 p70 heterodimérico (una co-transfección de ChlL-12 p40 con ChlL-12 p35) fue capaz de inducir la proliferación de células de bazo de pollo (Figura 17). Los datos de proliferación relativamente baja observados para las primeras diluciones posiblemente son explicados por efectos de sobredosis para este parámetro. Ni ChlL-12 p40 solo ni FeClexi-IL-12 fueron capaces de inducir respuestas proliferativas similares. A partir de una dilución de 1/6 en las diferencias en proliferación entre ChlL-12 p40 y ChlL-12 p70 (una co-transfección de ChlL-12 p40 con ChlL-12 p35), y entre ChlL-12 p70 y FeFlexi-IL-12 fueron importantes 54 (P<0.05). en conjunto, estos resultados prueban que ChlL-12 es bioactivo y que la molécula es capaz de inducir proliferación de células de bazo de pollo.
EJEMPLO 8 Bioactividad de IL-12 de pollo: G31 bioactividad de ChFlexi-IL-12 de cadena individual
Después de mostrar que la co-transfección de ChlL-12 p40 de cadena individual con ChlL-12 p35 de cadena individual dio como resultado la formación de un heterodímero ChlL-12 bioactivo (Figuras 16 y 17), una molécula de IL-12 de cadena individual (ChFlexi-IL-12), fue construida. La ChFlexi-IL-12 es una construcción heterodimérica de p40-p35 de cadena individual, en donde la cadena ChlL-12 p40 está enlazada a la cadena ChlL-12 p35 a través de un enlazador (Gly4Ser)3 de marco interno, también denominada como una región de "gozne". A través del análisis de tinción Western, se pudo mostrar que el perfil de expresión de ChFlexi-IL-12 después de la transfección en células COS-7 se compara con aquel de FeClexi-IL-12. Después de la incubación de células de bazo de pollo recientemente aisladas con ChFlexi-IL-12, la liberación de IFN-? así como la proliferación de células fueron observadas (Figura 18 y Figura 19). Los resultados de estos experimentos prueban que la construcción flexible IL-12 de pollo también es bioactiva.
Claims (13)
1. - Una proteína aislada que comprende por lo menos una de las siguientes subunidades de polipéptido: una subunidad que tiene una secuencia de aminoácido que muestra por lo menos 80% de similitud con la secuencia de aminoácido como se ilustra en SEC ID NO 1, una subunidad que tiene una secuencia de aminoácido que muestra por lo menos 80% de similitud con la secuencia de aminoácido como se ilustra en SEC ID NO
2. 2. - La proteína de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una subunidad que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 40 kD y que tiene una secuencia de aminoácido como se ilustra en SEC ID NO 1, SEC ID NO 5, o SEC ID NO 7.
3. - La proteína de acuerdo con la reivindicación 2, que está compuesta de: una subunidad que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 40 kD y que tiene una secuencia de aminoácido como se ilustra en SEC ID NO 1, y una subunidad que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 35 kD y que tiene una secuencia de aminoácido como se ilustra en SEC ID NO 2, dichas subunidades estando enlazadas.
4. - El polinucleótido aislado que codifica por lo menos una de las siguientes subunidades de polipéptido: 56 una subunidad que tiene una secuencia de aminoácido que muestra por lo menos 80% de similitud con la secuencia de aminoácido como se ilustra en SEC ID NO 1, y una subunidad que tiene una secuencia de aminoácido que muestra por lo menos 80% de similitud con la secuencia de aminoácido como se ilustra en SEC ID NO 2.
5. - El polinucleótido aislado que comprende por lo menos una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de: una secuencia de polinucleótido que muestra por lo menos 80% de identidad con la secuencia ilustrada en SEC ID NO 3, una secuencia de polinucleótido que muestra por lo menos 80% de identidad con la secuencia ilustrada en SEC ID NO 4.
6. - Un vector recombinante que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4 o 5.
7. - Una célula que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4 o 5 o un vector de acuerdo con la reivindicación 6.
8. - Una composición auxiliar que comprende una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o uno o más polinucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-5, o un vector de acuerdo con la reivindicación 6, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
9. - Una composición de vacuna que comprende un agente 57 activo derivado de un patógeno avícola y una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
10. - Una composición de vacuna que comprende un agente activo derivado de un patógeno avícola y uno o más polinucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-5, o un vector de acuerdo con la reivindicación 6, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
11. - El uso de una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, como un estimulante ¡nmunológico.
12. - El uso de una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en un auxiliar de vacuna.
13. - Una composición farmacéutica que comprende una proteína de acuerdo con la reivindicación 1, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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