CN107190033A - 一种重组干扰素的基因工程菌的高密度发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种重组干扰素的基因工程菌的高密度发酵方法，属于发酵工程领域，具体方法是将构建重组后保存在液氮中的基因工程种子，经过活化，摇瓶培养，扩大转至发酵罐中通气搅拌培养，当菌体OD600生长至5之间加入诱导剂，然后在发酵罐中根据菌种生长曲线、营养需求和PH变化调整补料和搅拌速度，通气量等，待菌体停止生长进入衰亡期时下罐，经过粗纯提取和浓缩复性得到粗酶体。本发明通过优化溶氧量、发酵培养基、补料培养基及补料方法，保证了菌体快速生长代谢所需要的营养条件及外部环境，大大提高了下罐时的菌体含量及产物产量，使菌体含量由现有的25g/L提高到了45g/L。

Description

一种重组干扰素的基因工程菌的高密度发酵方法
技术领域
本发明属于发酵过程技术领域，主要涉及一种重组干扰素的基因工程菌的高密度发酵方法。
背景技术
干扰素(Interferon，IFN)，是由英国科学家Isaacs于1957年利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时首先发现的，是一种细胞因子，具有抑制细胞分裂、调节免疫、抗病毒、抗肿瘤等多种作用。其本质是蛋白质，类型可分为α、β、γ、ω等几种。IFN能诱导细胞对病毒感染产生抗性，它通过干扰病毒基因转录或病毒蛋白组分的翻译，从而阻止或限制病毒感染，是目前最主要的抗病毒感染和抗肿瘤生物制品。
干扰素是一种很时髦的新药。据报道，干扰素越来越神奇了，开始还只是治愈一些流感、肝炎、水痘之类的小毛病，有点小家子气的味道。现在对付许多肿瘤、癌症还有白血病都用上了干扰素，不再是小打小闹。不但如此，由于它的越来越现代的生产方式，基因工程干扰素也已上市多年了。
但是，要使干扰素成为药品，进入实际应用当中，必须有足够的量。那么，如何获得大量的干扰素呢？人们首先想到，用病毒刺激老鼠，让它们产生干扰素，再提取出来供人使用，但是这种方法失败了。原因是干扰素的活动场所很专一，老鼠体内产生的干扰素对人不管用。所以最理想的办法是用人自身产生的干扰素。
人们最初想到的是，通过血液制取干扰素。可惜，干扰素在血液中的含量实在是太少了，用大量的血液才能制得微量的干扰素，这种生产方式产量低得可怜，自然价格也就十分昂贵。治疗一个病人的费用高达几万美元，一般百姓只能望“药”兴叹，是名副其实的“贵族药”，干扰素无法得到普及、推广。
其实，我们生活的环境是被微生物包围着的，时时刻刻都要接触到许多微生物，其中病毒的侵染刺激也不少。科学家猜测，人的血液细胞里本身就存在干扰素。后来研究证明，这种猜测是有道理的，通过精密的血液分析，在人和许多动物的细胞中都找到了干扰素。
既然蛋白质是干扰素的本质，那么把制造成这种蛋白质的遗传基因找出来，转入大肠杆菌体内，让它们代劳进行大量生产，也许能行。经过科学家的试验，干扰素的批量生产便成为可能。1980年，终于实现了干扰素的批量生产，这是美国科学家的杰作，他们利用DNA重组技术构建了生产干扰素的基因工程。
如今，运用基因工程技术的国家有：美国、日本、法国、比利时、德国、英国以及中国等。通过DNA重组、大肠杆菌发酵等方法，大量获取各种干扰素。经过试验明，这样制得的干扰素对乙型肝炎、狂犬病、呼吸道发炎、脑炎等多种传染病的病毒都有一定疗效。干扰素能减缓癌细胞的生长，是很有希望的防癌治癌药物，具有非常诱人的前景。
根据近几年来我国禽病发生、发展的规律来看，部分疾病已经显现出其强大的毁灭性，如禽流感、新城疫等疾病的不断流行，给养殖业造成了较大的经济损失。而干扰素在临床当中用于控制疾病起到了其不可替代的作用。
总的来说，目前干扰素在基础理论和实践应用上仍需要进行大量的研究，但相信随着干扰素进入分子生态学研究阶段，动物干扰素的分子结构、理化特性、生物学特性、产生和作用机理不断得到阐明，各种动物干扰素基因得到克隆和表达，基因工程产品的问世，将给目前严重危害畜牧业生产的疾病，特别是病毒性和肿瘤性疾病的防治带来新的希望。此外，由于γ干扰素具有较强的免疫调节功能，可以开发用于体质弱、免疫功能低下的病畜。目前应用干扰素诱生剂和人工干扰素产品治疗病毒性疾病取得了一定进展，今后一段时间内要加快基因工程干扰素产品的商品化研制，制剂类型、途径、剂量、毒副作用等。相对而言，由中草药等诱生剂诱导产生IFN，因纯化工艺复杂，产量少、作用缓和等诸多因素影响而极大限制了在临床和科研上的应用。如在规模化生产中推广使用干扰素，必须建立高效生产干扰素体系，利用基因工程技术生产重组干扰素是一条有效的途径。目前，基于延长干扰素在体内的代谢半衰期的长效干扰素研究已经获得了初步成功，干扰素的聚乙二醇化Pegylated Interferon和干扰素与载体脂质体Liposome-IFN的结合被认为是两种很好的延长干扰素在体内的半衰期、增加其稳定性、降低免疫源性的有效手段，这扩大了干扰素的应用范围，同时减少了刺激和毒副反应的发生。
发明内容
本发明优化了发酵、补料培养基及补料方法，保证了菌体快速生长代谢所需要的营养条件及外部环境，大大提高了下罐时的菌体含量及产物产量，菌体含量由现有的25g/L提高到了45g/L。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种重组干扰素基因工程菌的高密度发酵方法，包括以下步骤：
(1)种子菌活化：将液氮中保存的工作种子菌于37℃水浴解冻，然后KaNa/菌以1∶1000比例接种于15ml离心管中，使用回转恒温调速摇床进行培养；控制转速220rpm/min，培养温度37℃，培养时间8-9h；
(2)种子菌培养：将活化好的菌种扩大转接至500ml三角摇瓶中，继续使用回转恒温调速摇床进行培养；控制转速220rpm/min，培养温度3737℃，培养时间16-17h；
(3)发酵：将培养好的种子液按1∶1000接入发酵罐进行发酵，发酵培养基是3L，向罐中通入无菌空气通气量为9L/min，设定培养温度为37℃，机械搅拌转速为400rpm/min，控制PH为6.8-7.2；
(4)诱导：发酵2.5-4小时之间，紫外分光光度计测定OD600在4-6之间，以1∶500加入IPTG 10ml；
(5)补料：上罐时补料200ml，诱导后一小时补料500ml，诱导后5小时补料400ml，诱导后21小时补料200ml；
(6)添加消泡剂：不定时查看罐内状态，有泡沫产生加入几滴消泡剂，诱导后5小时加入100ml；
(7)查看生长状态：自诱导后每隔一小时取样测定OD600，培养24-27小时，待OD值开始下降便下罐；
(8)湿菌收集：8500rpm/min，4℃，离心15min，弃上清流沉淀，称出湿菌重量，正常45---50g/L；
(9)破碎菌体：湿菌中加入破碎液，体积为菌重总数的六倍，匀质完全后超声机破碎，工作7s，停5s，55％，工作25min，然后8500rpm/min离心30min，弃上清留沉淀；
(10)湿菌中加入洗液，体积为菌重总数的五倍，匀质完全后超声机破碎，工作7s，停5s，55％，工作25min，然后8500rpm/min离心30min，弃上清留沉淀；
(11)湿菌中加入溶液，体积为菌重总数的五倍，匀质完全后超声清洗机洗涤，工作20min，静置隔夜，然后8500rpm/min离心30min，弃沉淀留上清；
(12)超滤复性浓缩：将最后一次离心留下的上清液使用0.22um孔径的膜包进行超滤复性收集未通过膜包的上游液体并加入上清液五倍的复性液，待复性液复完，浓缩为1.5L，即为基因工程菌的粗制品；自此完成。
进一步地，所述种子培养基的组成为：工业胰化蛋白胨10g/L，工业酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L。
进一步地，所述发酵培养基的组成为：工业胰化蛋白胨15g/L，工业酵母提取物10g/L，NaCl 4g/L，无水葡萄糖4g/L，超纯水3L。
进一步地，所述补料培养基的组成为：胰化蛋白胨40g/L，磷酸二氢钠10g/L，酵母提取物20g/L，磷酸氢二钠200g/L，葡萄糖200g/L，超纯水1.5L，NaOH 4Mol/L，消泡剂1ml/L。
进一步地，所述破碎液的组成为：Tris 50mMol，甘氨酸0.15Mol。
进一步地，所述洗液的组成为：Tris 50mMol，甘氨酸0.15Mol，尿素2Mol。
进一步地，所述溶液的组成为：Tris 50mMol，甘氨酸0.15Mol，尿素8Mol。
进一步地，所述复性液的组成为：Tris 50mMol，甘氨酸0.15Mol。
本发明的优点是：本发明在现有的基础上优化了发酵工艺、补料培养基及补料方法，保证了菌体快速生长代谢所需要的营养条件及外部环境，大大提高了下罐时的菌体含量及产物产量，菌体含量由现有的25g/L提高到了45g/L，使得生产更加稳定，批次之间的时间和可重复性好，有利于工业化生产控制。
附图说明
图1：本发明的步骤示意图。
图2：本发明步骤S3发酵结束后的工程菌菌液跑胶结果图。
图3：本发明步骤S9破碎菌体中菌液加入破碎液破碎离心后废弃上清的跑胶结果图。
图4：本发明步骤S10湿菌中加入洗液破碎离心后废弃上清的跑胶结果图。
图5：本发明步骤S11湿菌中加入溶液破碎离心后留用上清的跑胶结果。
图6：本发明步骤S12复性完粗酶体的跑胶结果图。
具体实施方式
如图1所示，一种重组干扰素基因工程菌的高密度发酵方法，包括以下步骤：
S1：种子菌活化，将液氮中保存的工作种子菌于37℃水浴解冻，然后KaNa/菌以1∶1000比例接种于15ml离心管中，使用回转恒温调速摇床进行培养；控制转速220rpm/min，培养温度37℃，培养时间8-9h；
S2：种子菌培养：将活化好的菌种扩大转接至500ml三角摇瓶中，继续使用回转恒温调速摇床进行培养；控制转速220rpm/min，培养温度3737℃，培养时间16-17h；
S3发酵：将培养好的种子液按1∶1000接入发酵罐进行发酵，发酵培养基是3L，向罐中通入无菌空气通气量为9L/min，设定培养温度为37℃，机械搅拌转速为400rpm/min，控制PH为6.8-7.2，发酵结束后的工程菌菌液跑胶结果如图2所示。
S4诱导：发酵2.5-4小时之间，紫外分光光度计测定OD600在4-6之间，以1∶500加入IPTG 10ml；
S5补料：上罐时补料200ml，诱导后一小时补料500ml，诱导后5小时补料400ml，诱导后21小时补料200ml；
S6添加消泡剂：不定时查看罐内状态，有泡沫产生加入几滴消泡剂，诱导后5小时加入100ml；
S7查看生长状态：自诱导后每隔一小时取样测定OD600，培养24-27小时，待OD值开始下降便下罐；
S8湿菌收集：8500rpm/min，4℃，离心15min，弃上清流沉淀，称出湿菌重量，正常大概45---50g/L；
S9破碎菌体：湿菌中加入破碎液，体积为菌重总数的六倍，匀质完全后超声机破碎，工作7s，停5s，55％，工作25min，然后8500rpm/min离心30min，弃上清留沉淀，离心后废弃上清的跑胶结果如图3所示。
S10湿菌中加入洗液，体积为菌重总数的五倍，匀质完全后超声机破碎，工作7s，停5s，55％，工作25min，然后8500rpm/min离心30min，弃上清留沉淀；离心后废弃上清的跑胶结果如图4所示。
S11湿菌中加入溶液，体积为菌重总数的五倍，匀质完全后超声清洗机洗涤，工作20min，静置隔夜，然后8500rpm/min离心30min，弃沉淀留上清，菌液加入溶液破碎离心后留用上清的跑胶结果如图5所示。
S12超滤复性浓缩：将最后一次离心留下的上清液使用0.22um孔径的膜包进行超滤复性收集未通过膜包的上游液体并加入上清液五倍的复性液，待复性液复完，浓缩为1.5L，即为基因工程菌的粗制品；复性完粗酶体的跑胶结果如图6所示，自此完成。
优选地，所述种子培养基的组成为：工业胰化蛋白胨10g/L，工业酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L。
优选地，所述发酵培养基的组成为：工业胰化蛋白胨15g/L，工业酵母提取物10g/L，NaCl 4g/L，无水葡萄糖4g/L，超纯水3L。
优选地，所述补料培养基的组成为：胰化蛋白胨40g/L，磷酸二氢钠10g/L，酵母提取物20g/L，磷酸氢二钠200g/L，葡萄糖200g/L，超纯水1.5L，NaOH 4Mol/L，消泡剂1ml/L。
优选地，所述破碎液的组成为：Tris 50mMol，甘氨酸0.15Mol。
优选地，所述洗液的组成为：Tris 50mMol，甘氨酸0.15Mol，尿素2Mol。
优选地，所述溶液的组成为：Tris 50mMol，甘氨酸0.15Mol，尿素8Mol。
优选地，所述复性液的组成为：Tris 50mMol，甘氨酸0.15Mol。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (8)

1.一种重组干扰素的基因工程菌的高密度发酵方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)种子菌活化：将液氮中保存的工作种子菌于37°水浴解冻，然后KaNa/菌以1∶1000比例接种于15ml离心管中，使用回转恒温调速摇床进行培养；控制转速220rpm/min，培养温度为30°，培养时间为8-9h；
(2)种子菌培养：将活化好的菌种扩大转接至500ml三角摇瓶中，继续使用回转恒温调速摇床进行培养；控制转速220rpm/min，培养温度为30°，培养时间为16-17h；
(3)发酵：将培养好的种子液按1∶1000接入发酵罐进行发酵，发酵培养基是3L，通气量为9L/min，设定培养温度为37°，机械搅拌转速为400rpm/min，控制PH为6.8-7.2；
(4)诱导：在步骤(3)发酵2.5-4小时之间，紫外分光光度计测定OD600，在4-6之间，以1∶500加入IPTG 10ml；
(5)补料：上罐时补料200ml，诱导后一小时补料500ml，诱导后5小时补料400ml，诱导后21小时补料200ml；
(6)消泡剂：不定时查看罐内状态，有泡沫产生加入几滴消泡剂，诱导后5小时加入100ml；
(7)生长状态：自诱导后每隔一小时取样测定OD600，培养24～27小时，待0D值开始下降便下罐；
(8)湿菌收集：8500rpm/min，4°离心15min，弃上清流沉淀，称出湿菌重量，正常大概45g/L左右；
(9)破碎菌体：湿菌中加入破碎液，体积为菌重总数的六倍，匀质完全后超声机破碎，工作7s，停5s，55％，工作25min，然后8500rpm/min离心30min，弃上清留沉淀；
(10)湿菌中加入洗液，体积为菌重总数的五倍，匀质完全后超声机破碎，工作7s，停5s，55％，工作25min，然后8500rpm/min离心30min，弃上清留沉淀；
(11)湿菌中加入溶液，体积为菌重总数的五倍，匀质完全后超声清洗机洗涤，工作20min，静置隔夜，然后8500rpm/min离心30min，弃沉淀留上清；
(12)超滤复性浓缩：将最后一次离心留下的上清液使用0.22um孔径的膜包进行超滤复性收集未通过膜包的上游液体并加入上清液五倍的复性液，待复性液复完，浓缩为1.5L，即为基因工程菌的粗制品。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌的高密度发酵方法，其特征在于所述种子培养基的组成为：工业胰化蛋白胨10g/L，工业酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L。
3.根据权利要求1所述的重组干扰素的基因工程菌的高密度发酵方法，其特征在于：所述发酵培养基的组成为：工业胰化蛋白胨15g/L，工业酵母提取物10g/L，NaCl 4g/L，无水葡萄糖4g/L，超纯水3L。
4.根据权利要求1所述的重组干扰素的基因工程菌的高密度发酵方法，其特征在于：所述补料培养基的组成为：胰化蛋白胨40g/L，磷酸二氢钠10g/L，酵母提取物20g/L，磷酸氢二钠200g/L，葡萄糖200g/L，超纯水1.5L，NaOH 4Mol/L，消泡剂1ml/L。
5.根据权利要求1所述的重组干扰素的基因工程菌的高密度发酵方法，其特征在于：所述破碎液的组成为：Tris 50mMol，甘氨酸0.15Mol。
6.根据权利要求1所述的重组干扰素的基因工程菌的高密度发酵方法，其特征在于：所述洗液的组成为：Tris 50mMol，甘氨酸0.15Mol，尿素2Mol。
7.根据权利要求1所述的重组干扰素的基因工程菌的高密度发酵方法，其特征在于：所述溶液的组成为：Tris 50mMol，甘氨酸0.15Mol，尿素8Mol。
8.根据权利要求1所述的重组干扰素的基因工程菌的高密度发酵方法，其特征在于：所述复性液的组成为：Tris 50mMol，甘氨酸0.15Mol。
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