CN103555630B - 一种中华戈登氏菌及制备方法和应用 - Google Patents

一种中华戈登氏菌及制备方法和应用 Download PDF

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CN103555630B CN201310541487.XA CN201310541487A CN103555630B CN 103555630 B CN103555630 B CN 103555630B CN 201310541487 A CN201310541487 A CN 201310541487A CN 103555630 B CN103555630 B CN 103555630B
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Abstract

本发明公开了一种中华戈登氏菌及制备方法和应用,中华戈登氏菌(Gordonia sinensis)sq-15,CCTCC NO: M 2013065。该细菌在察氏培养基中可产生胞壁酰二肽和脂多糖、胡萝卜素及类胡萝卜素、黄酮和多种氨基酸,尤其是γ-氨基丁酸、维生素以及多种微量元素。它们有机和谐地在一个系统之中,充分加强了系统的生理功能。并且将其与其他菌剂相结合,也能起协同作用如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、或富硒酿酒酵母菌相组配制成不同的药物组合物,可有效地提高机体免疫力,达到抗氧化,调节肠道,调节心血管的目的。

Description

一种中华戈登氏菌及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医学工程领域,具体涉及一株中华戈登氏菌sq-15,还涉及一种中华戈登氏菌sq-15的制备方法,还涉及中华戈登氏菌sq-15的应用。
背景技术
众所周知,人体的神经系统,内分泌系统和免疫系统紧密地联系在一起,共同构成一个全身性调节网络即:神经—内分泌—免疫网络(NEI网络),这个网络支配着机体的各个功能,一旦网络的功能异常立即会引起不同程度或形式的全身性反应,也就会出现各类疾病的发生,而在许多感染性疾病的治疗过程中,细胞的免疫功能起重要作用,而一些亚健康和已发病的个体也是由于免疫力低下使得纯粹的化学药物预防和治疗的效果不佳。因此以生物调解剂(免疫调节剂)治疗生理性病变引起的多种疑难病症取得了很好的效果,成为21世纪免疫疗法和生态疗法的极为关注的热点。
许多研究发现:分枝杆菌,戈登氏菌的细胞壁有着特殊的结构,那就是胞壁酰二肽和分枝杆菌多糖(分别为MDP和MSP)。它们都具有明显的免疫调节功能,尤其调节细胞的免疫应答。更引人注目的是:MDP如果在脂质体中激活巨噬细胞的活性可增加10~100倍,它与胶原蛋白或白蛋白共价交联后的生理活动比单纯的MDP强2000倍。而MSP则是以乙酰氨基葡萄糖的磷酸链和阿拉伯糖、半乳糖以及长链(约50至90个C原子)不饱和脂肪酸,构成了脂多糖,免疫活性更强。另一方面,近年来该类菌的非甲基化磷酸胞苷酰基鸟苷的寡聚脱氧核苷酸序列(CPG)又称免疫液活序列,它能阻止Th2型免疫应答的启动并且使其向Th2型免疫应答转Th1型,而应激则是Th2型免疫应答提高。显而易见这对于由于应激而引起的感染、过敏和肿瘤的发生却起着重要治疗作用。
发明者自上世纪80年代中期开始致力于分支杆菌等低等放线菌的研究,相续进行EM菌的应用基础研究。并有三个中国专利:“生态平衡营养精活素及其生产方法”;“草分枝杆菌免疫液”;“一种草分枝杆菌sq-1及复合微生态制剂的制备方法”得到保护。同时在人和动物的保健与治疗中得以推广和应用。实现了多年来发明者用微生物技术提高人类生存质量的梦想。相继在上世纪末和本世纪初在环境的生态治理和生物修复的应用研究中,发现多种戈登氏菌,同样含有胞壁酰二肽、多糖等多种生理活性成分,更重要的是它们的脂多糖的不饱和脂肪酸的碳原子只有50个左右使其生理活性更强,赋予了该类菌的抗氧化、免疫调节等多种功能。尤其是本发明中的中华戈登氏菌sq-15,不同于世界上已有戈登氏菌中的任何一种。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中华戈登氏菌sq-15(Gordonia sinensis sq-15),该菌由发明者从空气中自行分离得到,该菌已于2013年3月5日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏。地址:中国武汉武汉大学;分类命名:中华戈登氏菌sq-15Gordonia sinensis sq-15,保藏编号:CCTCC NO:M2013065。该细菌在察氏培养基中产生胞壁酰二肽和脂多糖、胡萝卜素和类胡萝卜素、黄酮和多种氨基酸,尤其是γ-氨基丁酸、维生素以及多种微量元素。它们有机和谐地在一个系统之中,充分加强了系统的生理功能,有效地提高机体免疫力,达到抗氧化的目的。
本发明还有一个目的在于提供一种中华戈登氏菌sq-15的制备方法,制备方法简单,易行,适于大规模生产。
本发明还有一个目的在于提供了一种中华戈登氏菌sq-15的应用。该细菌可直接用于制备免疫调节剂,或动物饲料添加剂,或将其与益生菌配合使用协同调节机体功能,如:可与枯草芽孢杆菌;富硒酿酒酵母按不同的重量比进行混合,可制得不同的药物组合物,对肠道系统,心血管系统的病变均有明显预防与治疗的作用。
为了实现上述目的,本发明采取以下技术措施:
一种中华戈登氏菌sq-15,其筛选过程是:
用察氏培养基制成平板用自然沉降法在空气中暴露15分钟(湖北,武汉),盖好平皿放置于25~32℃恒温培养箱中培养2天左右,再选出单个菌落,经多次优化培养得到一株中华戈登氏菌sq-15。
该菌在1sp-2培养基中培养,温度30℃±1℃,液体培养在150~180rpm振培2-3天。将优良菌株的斜面保持在4℃的条件下。(所述的1sp-2培养基在中国农业菌种目录2012版附录1,培养基编号为0038)。长期保存可以在甘油中﹣40℃~﹣70℃保存,或用牛奶冻干4℃左右保存。
该株菌生理生化特点:革兰氏染色,抗酸染色皆为阳性;氧化酶阴性;H2O2酶阳性;脲酶阳性;乙酰胺酶阴性;硝酸盐还原阴性;亚锑酸盐还原阳性;在马糠凯培养基上不生长;在5%NaCl中生长;能使吐温80水解;不水解淀粉;能利用柠檬酸盐、苯甲酸盐为唯一碳源;能利用蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、甘露糖、肌醇。不能利用乳糖、木糖、山梨糖、山梨醇。能以谷氨酸和尿素为唯一N源;不能以乙酰胺为唯一N源。
该菌已于2013年3月5日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏。地址:中国武汉武汉大学;分类命名:中华戈登氏菌sq-15(Gordonia sinensis sq-15),保藏编号:CCTCC NO:M2013065。
一种中华戈登氏菌sq-15菌的制备方法,其步骤是:
1.接种:斜面种子用1sp-2培养基。将sq-15的种子接入茄子瓶斜面30℃±1℃培养3天,镜检无杂菌且生长健壮转入接种瓶。
2.种子罐培养:将接种瓶种子转入种子罐培养,温度29-31℃,通气量1:0.6~0.8,自动流加消泡剂,培养30~35h后进行取样镜检,菌体生长均匀无杂菌,停止发酵。
3.发酵罐培养:以5%~10%接种量将种子罐的种子液打入发酵罐,温度29-31℃,通气量1:0.8,自动流加消泡剂,培养48-52h镜检:菌体老化成球杆状,测菌数达108-109个/ml停止发酵。
4、发酵液离心,收集菌体,108~112℃烘干收集干菌体,得到一种戈登氏菌菌粉即免疫调节剂。发酵液灭活后可直接使用,也可按下分离后使用。
种子罐和发酵罐培养基如下表。
一种中华戈登氏菌sq-15的应用,其应用过程是:
1)一种中华戈登氏菌在制备动物免疫调节剂中的应用,将中华戈登氏菌sq-15添加到动物食物中,可提高动物的免疫力。
2).一种中华戈登氏菌在制备动物抗氧化剂中的应用,将中华戈登氏菌sq-15添加到动物食物中,可提高动物的抗氧化能力。
3).一种中华戈登氏菌在制备动物饲料添加剂中的应用,将中华戈登氏菌sq-15添加到动物食物中,可促进动物生长,并提高其免疫力。
4)一种中华戈登氏菌在制备调节肠道药物中的应用,将中华戈登氏菌sq-15与枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌以1:1重量比混合后,添加到动物食物中,可调节肠道微生态系统。
5).一种中华戈登氏菌sq-15在制备调节心血管系统的药物中的应用,将中华戈登氏菌sq-15与富硒酿酒酵母以2:1重量比混合后,添加到动物食物中,可调节动物的心血管功能。
以上所用除中华戈登氏菌sq-15以外的其他菌剂,目前市售的均能完成本发明。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
1.中华戈登氏菌由于它的细胞中含有胞壁酰二肽(MDP),它是细胞壁中最小的免疫活性单位,乃至它的衍生物都具有较强的非特异性的免疫调节作用。而壁的外层是酸性粘多糖,主要成分是阿拉伯糖和半乳糖以及含有50个左右C原子组成的植菌酸远比分枝杆菌80个左右C原子组成的不饱和植菌酸分子量小的得多的脂肪酸组成的脂多糖。研究表明阿拉伯糖和半乳糖以3:1形式连接而阿拉伯糖的呋喃糖残基则是免疫决定簇。由于这种特殊细胞壁结构使其戈登氏菌能非常有效地促进T细胞、B细胞活性,激活巨噬细胞(MN—MC)和自然杀伤细胞(NK)产生肿瘤坏死因子.NO.干扰素、白细胞介素等各种免疫活性因子。从而有效地调节机体免疫力,起到抗感染、抗应激和抗肿瘤的作用。
2.该菌的培养物中含有胡萝卜素、甲基萘醌、黄酮等天然抗氧化剂以及各种氨基酸维生素,尤其是产生一些参与重要生化反应的非蛋白质类的氨基酸,如γ-氨基丁酸,4-羟脯氨酸。而它含的多种D型氨基酸是植物中所没有的,赋予该免疫调节剂很好的抗氧化功能。
3.食品和药品营养价值或药用价值,不仅取决于它们的成分更取决于其养分的生物利用率。戈登氏菌多种生理活性因子有机和谐地在一个生命系统之中,且有的以微量或超微量形式存在更加有效的被人和动物机体吸收发挥其活性而无副作用。
4.它与植物乳杆菌芽孢杆菌等多种益生菌按不同需要组配的不同药物组合物以其他们的协同作用更深入,更广泛的用于各种免疫治疗药物。
5.原料来源广泛,工艺简单易操作。
附图说明
图1为一种猪服用中华戈登氏菌sq-15肠道调解剂后,肠绒毛长度和隐高深度示意图。
其中图1A为十二指肠;图1B为空肠;图1C为回肠。
具体实施方式
本发明实施例中的实验方法或条件,如未特别说明,均为常规方案。
实施例1:
一种中华戈登氏菌sq-15,其筛选过程为:
用察氏培养基制成平板用自然沉降法在空气中暴露15分钟(湖北,武汉),盖好平皿放置于25~32℃恒温培养箱中培养2天左右,再选出单个菌落,经多次优化培养得到一株中华戈登氏菌sq-15。其16Sr RNA的序列为SEQ ID NO.1所示。其16Sr RNA与多株戈登氏菌属的16Sr RNA的相似率为99%,多种生理生化特点与已知的戈登氏菌相差较大。
该菌在1sp-2培养基中培养,温度30℃±1℃,液体培养在150~180rpm振培2-3天。将优良菌株的斜面保持在4℃的条件下。(所述的1sp-2培养基在中国农业菌种目录2012版附录1,培养基编号为0038)。长期保存可以在甘油中﹣40℃~﹣70℃保存,或用牛奶冻干4℃左右保存。
该株菌生理生化特点:革兰氏染色,抗酸染色皆为阳性;氧化酶阴性;H2O2酶阳性;脲酶阳性;乙酰胺酶阴性;硝酸盐还原阴性;亚锑酸盐还原阳性;在马糠凯培养基上不生长;在5%NaCl中生长;能使吐温80水解;不水解淀粉;能利用柠檬酸盐、苯甲酸盐为唯一碳源;能利用蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、甘露糖、肌醇。不能利用乳糖、木糖、山梨糖、山梨醇。能以谷氨酸和尿素为唯一N源;不能以乙酰胺为唯一N源。
该菌已于2013年3月5日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏。地址:中国武汉武汉大学;分类命名:中华戈登氏菌sq-15Gordonia sinensis sq-15,保藏编号:CCTCC NO:M2013065。
实施例2:
一种中华戈登氏菌sq-15的制备方法,过程如下:
1)将其接种在斜面上(培养基为1sp-2)30℃±1℃,培养2-3天镜检无杂菌生长均匀。转入接种瓶。
2)将接种瓶的种子转入种子罐(培养基原料蔗糖10kg/T、蛋白胨2kg/T、K2HPO41.3kg/T、MgSO40.2kg/T、(NH4)2HPO41.5kg/T、水余量、PH7.0~7.2)30℃±1℃,通气量1:0.6自动流加消泡剂。达30~32h抽样镜检,无杂菌菌体健壮,停止发酵,。
3)打入发酵罐(培养基蔗糖20kg/T、蛋白胨2kg/T、K2HPO41.3kg/T、MgSO40.2kg/T、(NH4)2HPO42kg/T、水余量、pH7.0~7.2)培养温度30℃±1℃,通气量1:0.8自动流加消泡剂。达48-52左右镜检,菌体老化成短杆状,菌数达108~109个/ml停止发酵。
灭活后分装可得液态免疫调节剂(口服液),
离心收集菌体,112℃烘干,得免疫调节剂(粉剂)。
实施例3:
中华戈登氏菌sq-15免疫调节剂对小鼠免疫功能的影响,实验步骤是:
实验动物为昆明种雄性小鼠62只,体重为20±2g,随机分成四组,蒸馏水+饲料为CK(20只),分别饲料中加中华戈登氏菌粉0.0001g,0.001g,0.01g,各14只,连续喂养14天,于第15天进行脾淋巴细胞转化,诱导产生IL-2TNF及胸腺重量的实验,方法按常规方法进行,其结果见表1、表2。
表1中华戈登氏菌sq-15对小鼠脾淋巴细胞转化的影响
组别 小鼠个数N 生理盐水 conA诱导
CK 20 3860±477 11241±1722
0.0001g剂量 14 8373±422* 18277±3168*
0.001g剂量 14 11264±2329* 28465±4817*
0.01g剂量 14 12668±1332* 29665±2803*
*与对照组比P<0.01显著增加小鼠的脾淋巴细胞的转化。
表2中华戈登氏菌sq-15对小鼠IL-2TNF水平及胸腺重量影响
n IL-2(u/10细胞) TNF(u/10细胞) 胸腺/体重比(mg/g)
对照组 20 120±20 184±32 1.82±0.69
0.0001g 14 190±29 288±29 2.41±0.25
0.001g 14 238±35 354±63 2.98±0.56
0.01g 14 261±50 376±45 2.85±0.45
各剂量组与对照组的比P<0.01
该免疫调节剂明显提高脾淋巴细胞产生IL-2水平和腹腔巨噬细胞诱导TNF的能力,明显增加小鼠胸腺的重量,即提高小鼠的免疫功能。
实施例4:
中华戈登氏菌sq-15免疫调节剂抗氧化功能的实验,其步骤是:
实验动物:12月龄的昆明种雄性小鼠40只,体重为18-20g,对照组20只,实验组20只,CK组用蒸馏水灌胃,实验组用免疫调节粉剂0.01g/kg灌胃,连续喂养30日后用动物眼球取血分离血清,处死动物取肝脏作匀浆,制备1%肝匀浆作SOD酶和LPO含量的测定(每组有5个平行实验)前者采用羟胺法,后者采用共轭双键法(试剂盒为南京建成生物工程公司)。实验结果见表3、表4。
表3中华戈登氏菌sq-15显著增加小鼠血清及1%肝匀浆SOD酶活性
①血清SOD酶活性u/ml
②1%肝匀浆SOD酶活性u/ml
表4中华戈登氏菌sq-15减少小鼠血清和1%肝匀浆中LPO含量
①血清n mol
②1%肝匀浆MDA/ml
表3-4的结果表明该免疫调节剂有明显抗氧化的功能
实施例5:
中华戈登氏菌sq-15在制备猪饲料添加剂中的应用,其步骤是:
实验动物:选择健康日龄相近的体重平均8.64kg左右的三元杂交断奶仔猪96头,随机分成两组,每组48头分六栏分开,每栏8头。A组,每组料(日料)4吨基础口粮+抗生素全价料中常用填加量。B组基础口粮+0.4%中华戈登氏菌剂。27天喂养结果见表5
表5中华戈登氏菌sq-15用作猪的饲料填加剂效果
                                                 2011年10月29日—11月26日
实验表明,中华戈登氏菌比对照总体增加体重34.27kg,且发病率降低一半。
实施例6:
中华戈登氏菌sq-15在制备调节肠道药物中的应用,其步骤是:
1)枯草芽孢杆菌菌粉的制作:
A、培养基(重量份)
B、将枯草芽孢杆菌AS1.1398(广东省微生物种质资源库),或地衣芽孢杆菌AB93106(来源武汉大学中国典型培养物保藏中心)的种子接种于茄子瓶斜面30℃±1℃培养40h左右,用无菌水洗出斜面的种子接种于种子罐30℃±1℃,通气量1:0.8自动流加消泡剂。培养18~22h后镜检,菌体均匀、健壮、无杂菌,停止发酵,打入发酵罐,采用种子罐同样条件培养40~42h,镜检无杂菌,菌体变短杆,菌数达108~109个/ml停止发酵。将发酵液离心,收集菌体,真空减压60℃烘干制得到芽孢杆菌活菌体。或直接将发酵液装并得液体培养物。
将中华戈登氏菌免疫调节剂与制备的枯草芽孢杆菌AS1.1398菌粉或地衣芽孢杆菌AB93106重量比1:1混合,即得一种动物肠道调节药物。
实验方法:选28日龄的断奶三元杂交仔猪,体重8.64kg±0.30kg,每组8头×6(重复),试验期30天。
所用肠道调节菌粉为中华戈登氏菌sq-15与枯草芽孢杆菌按重量比1:1混合后得到。
CK组:喂养,基础日粮加全价料中常用抗生素:硫酸粘杆菌素20ppm、喹乙醇35ppm、维吉尼亚霉素25ppm
A组:喂养,基础日粮加0.2%肠道调节菌粉+0.25%全价料中常用抗生素
B组:喂养,基础日粮加0.4%肠道调节菌粉。
结果见表6和图1(图1为B组的实验结果)。
表明加0.4%肠道调节菌粉喂养仔猪十二指肠、空肠、回肠的绒毛长度大大加长隐高深度也加深。
表6、调节肠道的药物组合物对仔猪的使用效果
A(调节肠道微生态系统)
表6的结果表明加0.4%肠道调节菌粉喂养仔猪有益菌群明显增加
实施例7:
中华戈登氏菌sq-15在制备调节心血管系统的药物中的应用,其步骤是:
1)富硒酿酒酵母菌粉的制备:
菌株:选用酿酒硒酵母(Saccharomyces cerevisiae Ay92013);来源于武汉大学中国典型培养物保藏中心,保存编号CCTCC AY92013
培养基:
A、种子斜面培养基
麦芽汁琼脂培养基(中国农业菌种目录2012年版附录1,培养基中0434)+5mg/L的硒酸钠。
B、发酵培养基
培养方法:
将菌株接种于茄子瓶斜面,25℃~28℃培养45h左右,镜检,菌体生长均匀无杂菌,用无菌水(适量)将菌苔刮下来转入接种瓶摇均匀,转入种子罐,控制温度在25℃±1℃,通气量1:0.3-0.5,流加氨水控制PH6.0,自动流加消泡剂,并根据溶氧需求控制转速,发酵50~54h,停止发酵,离心收集菌体,<50℃减压真空干燥,制得菌剂。
将中华戈登氏菌sq-15与制得的富硒酿酒酵母菌粉以2:1(重量比)混合,即得一种调节心血管系统的药物。
2)实验方法:选28日龄的断奶三元杂交仔猪,体重8.64kg±0.30kg,每组8头×6(重复),试验期30天。
CK组:喂养,基础日粮加全价料中常用抗生素:硫酸粘杆菌素20ppm、喹乙醇35ppm、维吉尼亚霉素25ppm
A组:喂养,基础日粮加0.2%调节心血管系统的药物+0.25%全价料中常用抗生素
B组:喂养,基础日粮加0.4%调节心血管系统的药物该药物对仔猪的影响见表7
表7、调节心血管的药物组合物对仔猪使用效果
项目 CK A B
NOμmol/L 1.34±0.13 1.98±0.3 2.03±0.4
心脏指数 4.21±0.25Bbc 6.35±0.30bc 7.38±0.17Aa
表7说明:NO在免疫神经和内分泌的网络中起着信使作用。1998年诺贝尔医学奖获得者伊格纳罗教授揭开了硝酸甘油作用机理。发现血液中NO的缺失是导致心血管的元凶,实验A、B组血中NO的含量比对照组高48%,52%,而且心脏指数也大大提高。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  张素琴
 
<120>  一种中华戈登氏菌及制备方法和应用
 
<130>  一种中华戈登氏菌及制备方法和应用
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.1
 
<210>  1
<211>  1247
<212>  DNA
<213>  中华戈登氏菌sq-15
 
<400>  1
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agcaacgctg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccg                 1247
 
 

Claims (7)

1.一株戈登氏菌,其特征在于:Gordonia sinensis sq-15,CCTCC NO:M 2013065。
2.一种戈登氏菌的培养方法,其步骤如下:
1).接种:斜面种子用ISP-2培养基,将sq-15的种子接入茄子瓶斜面30℃±1℃培养3天,镜检无杂菌且生长健壮转入接种瓶;
2).种子罐培养:将接种瓶种子转入种子罐培养,温度29-31℃,通气量1:0.6~0.8,自动流加消泡剂,培养30~35h后进行取样镜检,菌体生长均匀无杂菌,停止发酵;
3).发酵罐培养:以5%~10%接种量将种子罐的种子液打入发酵罐,温度29-31℃,通气量1:0.8,自动流加消泡剂,培养48-52h镜检:菌体老化成球杆状,测菌数达108-109个/ml停止发酵;
所述的sq-15为Gordonia sinensissq-15,CCTCC NO:M 2013065;
种子罐和发酵罐培养基配方如下:
3.权利要求1所述的戈登氏菌在制备动物免疫调节剂中的应用。
4.权利要求1所述的戈登氏菌在制备动物抗氧化剂中的应用。
5.权利要求1所述的戈登氏菌在制备动物饲料添加剂中的应用。
6.权利要求1所述的戈登氏菌在制备调节肠道药物中的应用,所述的药物为戈登氏菌sq-15与枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌以1:1重量比混合得到。
7.权利要求1所述的戈登氏菌在制备调节心血管系统的药物中的应用,所述的药物为戈登氏菌sq-15与富硒酿酒酵母以2:1重量比混合而成。
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