CN104823693A - 虫草黄豆 - Google Patents

Abstract

以黄豆为培养基，采用冬虫夏草和蛹虫草进行双菌混合固态发酵，属于生物工程技术领域。本发明通过双菌生物转化得到的黄豆，具有养生保健之功效，具有良好的应用前景。

Description

虫草黄豆

技术领域

采用冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)和蛹虫草(Cordyceps militaris)，以黄豆为培养基，进行双菌混合固态发酵，属于生物工程技术领域。利用菌株Cordyceps militaris保藏号为CICC 14013，菌株Ophiocordyceps sinensis保藏号为CICC 14088，通过双菌混合固态发酵生产得到营养保健黄豆。

背景技术

虫草属(Cordyceps)隶属于真菌界(Fungi)、子囊菌门(Ascomycota)、子囊菌纲(Ascomycetes)、粪壳菌亚纲(Sordariomycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)。虫草属真菌大多数是药用真菌，其中冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)普遍为人们所熟知，应用历史也最为久远，而蛹虫草(Cordyceps militaris)的应用研究最为深入。

冬虫夏草据文献考证最早记载于公元710年《月王药诊》，以药记载始见于清代吴仪洛《本草从新》(公元1757年)，认为其“甘平，保肺益肾，止血化痰，已劳咳，治膈症皆良”。冬虫夏草为我国传统名贵中药，它与人参、鹿茸同被誉为中国中药三宝。其具有补而不峻、温而不火、滋而不腻的药效特点，更具有阴阳同补的独特功效，使它成为滋补圣药，被医学家誉为“百药之王”。

蛹虫草是我国非常珍贵的中药药材之一，它的药用价值在很早就有记载，李时珍(1518)在《本草纲目》中指出，蝉花能主治“小儿天吊惊痫，夜啼，心悸”。蛹虫草易于规模化人工培养，其活性成分和药理作用又与冬虫夏草相似。

当前将冬虫夏草或蛹虫草应用于粮食原料发酵已经被广泛报道。例如：专利200610117997.4采用蛹虫草工业化培养废弃物制成米粉产品；专利200710050135.9将虫草粉碎后与炒熟的草青稞混合做成保健品；专利200710166278.6采用小麦培养蛹虫草子实体；专利200810068734.8采用红曲协同发酵从而提高蛹虫草子实体及虫草菌素的产量；专利200910218363.1公开了一种通过茯苓与蛹虫草固体共发酵提高主要药用成分的方法；专利201110055425.9利用固态发酵生产蛹虫草发酵米；专利201110348239.4以莲子为基质，进行蛹虫草或冬草夏草的固态发酵；专利201110064459.4公开了一种蛹虫草稻谷食品的制备方法；专利201310150267.4和201310151228.6分别以黄豆和花生为基质，接种蛹虫草后进行固态发酵，但过程中需添加昆虫酶解液，导致成本和质量难以控制；专利201210064068.7公开了一种以灵芝、桑黄等能够高效产纤维素酶的菌子实体作为培养基主料、粮食原料为辅料，再接种入蛹虫草、冬虫夏草、香菇、猴头菌、金针姑等菌种进行混合培养，制成保健品或添加剂，但该工艺复杂，食药用菌子实体价格昂贵，而且经高压灭菌后破坏了食药用菌子实体的有效成分，再经其它菌种发酵后成分复杂而不可控，各种复杂的菌种组合也将导致最终产品质量的不稳定。

综上所述，当前蛹虫草或冬虫夏草的固态发酵过程均会添加无机盐、昆虫水解液或其它药用成分，以期提高虫草菌体或虫草素产量及药效。不同的添加物会导致成分复杂及导入外来的污染源，而且不容易建立质量指标体系。另外，蛹虫草的固态发酵过程经常将虫草素(Cordycepin)作为重要的质量指标。虫草素，也被称为3’-脱氧腺苷(3-deoxyadenosine)，自发现以来，其药理作用不断被揭晓。经研究人员们研究发现，虫草素具有免疫调节、抗肿瘤、抗白细胞、抗真菌、抗病毒等多种药理作用。有趣的是，虫草素主要存于蛹虫草中，而在冬虫夏草中的含量极微，但虫草素的缺失并未影响冬虫夏草的显著功效。因此，冬虫夏草和蛹虫草这两种功效相似，但成分不完全相同的菌种具有互补性。

发明内容

基于当前的情况，本发明以黄豆为培养基，在不添加任何其它添加物的情况下，仅将黄豆进行膨化处理，灭菌后同时接种冬虫夏草和蛹虫草进行混合培养，最终得到高虫草素含量和高生物活性的养生保健黄豆。该方法实施简单，质量可控，具有广阔的应用开发前景。

本发明所用的冬虫夏草菌株Ophiocordyceps sinensis保藏号为CICC14088，蛹虫草菌株Cordyceps militari保藏号为CICC 14013。

本发明的技术方案如下：

(1)部分黄豆采用含有三个区段的双螺杆挤压膨化机进行处理。第1区段为预热区，使用温度为40-60℃，第2区为运输区，温度为120-160℃，第3区为熟化区，温度为140-180℃。膨化前黄豆的含水量为10％-20％。

(2)部份黄豆机械粉碎至粒径为0.1-2mm。

(3)将挤压膨化的黄豆与机械粉碎的黄豆以一定比例混合，挤压膨化的黄豆所占比例为1-100％。混合后补充水分使含水量达20％-70％，121℃保温20分钟灭菌。冷却后，接入冬虫夏草，接种量为1-10％。同时，接入蛹虫草，接种量为1-10％。起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度为15-28℃，环境相对湿度为60％-100％，发酵周期为5-25天。最终虫草素的含量最高可达7.5％。

本发明所用的冬虫夏草和蛹虫草菌种保存用斜面培养基配方均为：葡萄糖20g/l，马铃薯汁200g/l，琼脂20g/l，pH自然。

本发明的冬虫夏草和蛹虫草的种子培养基配方均为：葡萄糖20g/l，马铃薯汁200g/l，pH自然。将斜面菌种接种到装有种子培养基的三角瓶后，种子的培养时间为96小时，种子的培养温度为25℃。

虫草素含量采用液相色谱法测定。测定方法详见：韦会平，叶小莉，张华英，李学刚，钟运俊，用蛹虫草固体发酵法高效生产虫草素的研究，中国中药杂志，1998，33(19)，2159-2162。

本发明的有益效果：通过膨化，在短时间内使黄豆淀粉糊化和黄豆蛋白质变性。膨化黄豆与机械粉碎黄豆混合后进行发酵，一方面使得菌体可以快速利用膨化过程所产生的营养物质，另一方面机械粉碎黄豆相当于是固态发酵载体使发酵基质保持疏松有利菌体生长，当菌体生长旺盛时菌体产生大量胞外酶又可以进一步分解利用机械粉碎黄豆。该过程无需添加其它物质，保证发酵产品的质量高度可控。冬虫夏草和蛹虫草两种性质类似菌种的共发酵，一方面相似性质菌种的发酵产物不会改变总体的药理药学性状，另一方面可以调和两种菌种发酵产物各自的缺陷。该方法简单可行，易于实现规模化生产，具有广泛的应用前景。

具体实施方式

实施例1

采用济南聚贤机械设备有限公司生产的DS56-Ⅲ型双螺杆挤压膨化机处理黄豆，所用的黄豆为市售，经水分测定仪测定其含水率为13.6％。设定进料速度为120kg/h。表1列出了三个区段的温度组合及膨化度。由表1可以看出当预热区、运输区、熟化区的温度分别为60、160、190℃时黄豆的膨化度最高，在此温度条件下进一步往黄豆中补充少量无菌水或者将黄豆进一步烘干，考察不同含水量时的膨化度。由表2可以看出，含水率为在14-18％左右时膨化效果良好，因此可以直接用市售黄豆进行膨化。

表1：挤压膨化机不同各区段不同温度组合得到膨化黄豆的膨化度

表2：不同含水率黄豆膨化后的膨化度

含水率％	10.0	12.5	13.6	15.1	16.9	17.2	19.1
								膨化度	1.4	2.3	2.3	2.3	2.2	2.1	2.1

实施例2

将冬虫夏草菌种接种到装有50ml培养基的250ml三角瓶中，培养基组成为：葡萄糖20g/l，马铃薯汁200g/l，pH自然，25℃，摇床转速150转/min，培养96小时，作为接种用种子。

将蛹虫草菌种接种到装有50ml培养基的250ml三角瓶中，培养基组成为：葡萄糖20g/l，马铃薯汁200g/l，pH自然，25℃，摇床转速150转/min，培养96小时，作为接种用种子。

取膨化度为2.3的膨化黄豆与机械粉碎度为1mm的黄豆混合，共计50g，再加蒸馏水40g，放入500ml三角瓶中，121℃灭菌20min，冷却后接种入冬虫夏草和蛹虫草种子液各5ml，在恒温恒湿培养箱中控制环境湿度90％，温度为25℃，发酵15天后测定虫草素含量。不同条件组合下的虫草素产量如表3所示。由表3可以看出当膨化黄豆与机械粉碎黄豆比例为3:2时虫草素产最高，可达6.6％。

表3：膨化黄豆与机械粉碎度不同比例下固态发酵虫草素含量

膨化黄豆重量(g)	机械粉碎黄豆重量(g)	虫草素含量(％)
			50	0	3.2
1	49	3.1
			25	25	4.2
10	40	3.7
			40	10	3.1
20	30	5.1
			30	20	6.6

实施例3

取膨化度为2.3的膨化黄豆30g与机械粉碎度为2mm的黄豆20g混合，再加蒸馏水40g，放入500ml三角瓶中，121℃灭菌20min，冷却后接种入培养好的冬虫夏草和蛹虫草种子液各5ml，在恒温恒湿培养箱中控制环境湿度80％，温度为15℃，发酵20天后测定虫草素含量为4.2％。

实施例4

取膨化度为2.3的膨化黄豆30g与机械粉碎度为0.5mm的黄豆20g混合，再加蒸馏水50g，放入500ml三角瓶中，121℃灭菌20min，冷却后接种入培养好的冬虫夏草和蛹虫草种子液各6ml，在恒温恒湿培养箱中控制环境湿度90％，温度为20℃，发酵5天后测定虫草素含量为2.3％。

实施例5

取膨化度为2.3的膨化黄豆30g与机械粉碎度为1mm的黄豆20g混合，再加蒸馏水45g，放入500ml三角瓶中，121℃灭菌20min，冷却后接种入培养好的冬虫夏草种子液5ml，在恒温恒湿培养箱中控制环境湿度90％，温度为20℃，发酵25天后测定虫草素含量为0.04％。该过程得到的发酵物记为样品1。

取膨化度为2.3的膨化黄豆30g与机械粉碎度为1mm的黄豆20g混合，再加蒸馏水45g，放入500ml三角瓶中，121℃灭菌20min，冷却后接种入培养好的蛹虫草种子液5ml，在恒温恒湿培养箱中控制环境湿度90％，温度为20℃，发酵25天后测定虫草素含量为6.3％。该过程得到的发酵物记为样品2。

取膨化度为2.3的膨化黄豆30g与机械粉碎度为1mm的黄豆20g混合，再加蒸馏水40g，放入500ml三角瓶中，121℃灭菌20min，冷却后接种入培养好的冬虫夏草和蛹虫草种子液5ml，在恒温恒湿培养箱中控制环境湿度90％，温度为20℃，发酵25天后测定虫草素含量为7.5％。该过程得到的发酵物记为样品3。

取购自上海斯莱克实验动物有限责任公司的昆明种小鼠40只，个体质量18-22g，雌雄各半。随机分为4组，每组10只，分别为样品1、2、3给药组和空白对照组。于实验前7天，每天灌胃给予不同的固态发酵样品，每只老鼠灌胃的样品量为0.5g。空白对照组灌胃为未发酵的膨化度为2.3的0.5g黄豆。第7天，每只小鼠腹腔注射2％淀粉2ml，24h后，每只小鼠腹腔注射2％鸡红细胞1ml，30min后，断头，腹腔注入0.2ml肝素，取腹腔液涂片，瑞氏-姬姆萨染色1min，盐水梯度冲洗，油镜观察吞噬百分数、吞噬指数，取脾脏、胸腺称重，计算脾指数、胸腺指数。

脾指数＝脾脏平均质量(mg)/平均体质量(g)。

胸腺指数＝胸腺平均质量(mg)/平均体质量(g)。

吞噬指数＝吞噬的数量/发生吞噬的细胞数。

吞噬率＝发生吞噬的细胞数/总的吞噬细胞数。

表4中列出了脾指数，胸腺指数，吞噬指数和吞噬率。

表4：不同发酵样品对小鼠脾脏、胸腺质量、腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

组别	胸腺指数	脾指数	吞噬率(％)	吞噬指数
					空白对照组	1.78±0.22	3.11±0.21	48.1±9.83	1.8±0.3
样品1组	2.12±0.43	3.91±0.22	59.0±11.3	2.1±0.3
					样品2组	2.43±0.34	3.84±0.32	61.2±11.2	2.3±0.2
样品3组	3.51±0.35	5.92±0.42	87.4±10.4	3.5±0.1

脾脏指数与胸腺指数是直接反映机体免疫状况的重要参数，由表4可以看出样品1-3组相对于空白对照组均可显著促进小鼠脾脏和胸腺的生长，免疫水平有明显的提高作用。冬虫夏虫和蛹虫草进行混合发酵的样品3组的效果显著好于冬虫夏草单菌种发酵的样品1组和蛹虫草单菌种发酵的样品2组。

由表4可以看出冬虫夏虫和蛹虫草进行混合发酵的样品3组相较于单菌发酵的样品1组和样品2组更能显著促进小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，可提高机体的抗感染和抗肿瘤能力，增强机体的免疫功能，保持健康稳定状态。

Claims (2)

1.本发明采用黄豆为基质，进行冬虫夏草和蛹虫草混合固态发酵。

2.根据权利要求1所述的混合固态发酵，其特征在于部分黄豆需进行膨化处理。