CN108112776A - 一种用于畜禽肠道损伤修复的微生物制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于畜禽肠道损伤修复的微生物制剂及其制备方法，涉及发酵技术领域。一种用于畜禽肠道损伤修复的微生物制剂的制备方法，包括：将产朊假丝酵母于菌种培养基中培养后，接入乳酸菌培养得到复合菌，乳酸菌选自发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜热双歧乳杆菌、青春双歧杆菌中的一种或多种。将复合菌添加到混合原料中，在28～32℃条件下密闭发酵12～15d得到复合发酵物，混合原料包括可溶淀粉、覆盆子、金银花、藤茶、蛋白胨、糖蜜、水。通过微生物复合发酵技术对多种原料的有效成分进行转化，使其具有更易吸收利用，效果显著等特点，是一种能够对畜禽肠道损伤进行生态修复的天然生物制剂。

Description

一种用于畜禽肠道损伤修复的微生物制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种发酵技术领域，且特别涉及一种用于畜禽肠道损伤修复的微生物制剂及其制备方法。
背景技术
正常动物的肠黏膜屏障由机械屏障、生物膜屏障以及免疫屏障组成。正是由于肠黏膜防御体系的完善，有效阻止肠道内的有害物质进入体循环。肠道不仅是动物营养物质消化和吸收的主要场所，而且是多脏器功能障碍综合征、全身炎症反应综合征最易受损的靶器官。
动物机体在应激状态下其肠道会产生大量自由基，从而导致肠道损伤。在使用抗生素、营养不均衡、环境应激、不同生理周期等情况下均有可能出现肠黏膜屏障损伤的临床表现。大量研究证明抗氧化剂可调控氧化应激动物的自由基代谢。
现有技术中，对于肠道损伤的修复通常是通过添加益生菌或其他营养物质，改变肠道健康。专利CN103349153A公开了一种具有动物肠道修复功能的菌体复合物及其生产方法。益生菌可改变肠道菌群比例及转化某些肠内物质，阻止致病菌定植，调节抗炎与性炎因子之间的平衡，促进损伤上皮修复以及增强上皮紧密睦接，加强肠黏膜屏障保护作用，阻止细菌移位等。但是益生菌群可以对胃肠道进行保护，但是针对抗氧化应激损伤所造成的肠道修复还没有很好的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于畜禽肠道损伤修复的微生物制剂，此微生物制剂能够有效调节畜禽肠道损伤、减少肠道的抗氧化应激损伤。
本发明的另一目的在于提供一种用于畜禽肠道损伤修复的微生物制剂的制备方法，以复合菌对多种原料进行复合发酵得到微生物制剂。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出一种用于畜禽肠道损伤修复的微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
菌种复合培养：将20～30重量份的产朊假丝酵母于菌种培养基中培养20～30h后，接入50～80重量份的乳酸菌，培养至pH值小于预设pH值后，继续培养12～15d得到复合菌，其中，所述乳酸菌选自发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜热双歧乳杆菌、青春双歧杆菌中的一种或多种；
原料复合发酵：将所述复合菌添加到混合原料中，在28～32℃条件下密闭发酵12～15d得到复合发酵物，所述混合原料包括可溶淀粉、覆盆子、金银花、藤茶、蛋白胨、糖蜜、水。
本发明提出一种用于畜禽肠道损伤修复的微生物制剂，其根据上述的制备方法制备得到。
本发明实施例的用于畜禽肠道损伤修复的微生物制剂及其制备方法的有益效果是：
通过多种菌种，包括产朊假丝酵母和乳酸菌，对多种特定的原料进行复合发酵制备得到天然的微生物制剂。微生物复合发酵技术对多种原料的有效成分进行转化，使其具有更易吸收利用，肠道损伤修复效果显著。此外，在发酵过程中，能够实现微生物菌体的富集以及产生多种代谢产物，制得的微生物制剂中具有黄酮类、氨基酸、谷胱甘肽、维生素C、维生素E、SOD、花青素等多种营养因子，能够进一步增强产品的肠道损伤修复功能。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的用于畜禽肠道损伤修复的微生物制剂及其制备方法进行具体说明。
本发明实施例提供的一种用于畜禽肠道损伤修复的微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
菌种复合培养：将20～30重量份的产朊假丝酵母于菌种培养基中培养20～30h后，接入50～80重量份的乳酸菌，培养至pH值小于预设pH值后，继续培养12～15d得到复合菌，其中，乳酸菌选自发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜热双歧乳杆菌、青春双歧杆菌中的一种或多种。
原料复合发酵：将复合菌添加到混合原料中，在28～32℃条件下密闭发酵12～15d得到复合发酵物，混合原料包括可溶淀粉、覆盆子、金银花、藤茶、蛋白胨、糖蜜、水。
在本实施例中，上述菌种从中国农业微生物菌种保藏管理中心或中国普通微生物菌种保藏管理中心购买得到，其中，产朊假丝酵母(Candida utilis)为保藏编号CGMCC2.2066的菌种；发酵乳杆菌 (Lactobacillus fermentim)为保藏编号为ACCC10531的菌种，瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)为保藏编号为ACCC10532的菌种，嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)为保藏编号为CGMCC 1.2235的菌种，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)为保藏编号为CGMCC 1.2190的菌种。
进一步地，在菌种复合培养步骤之前，还包括菌种的生产的步骤，其包括：
将产朊假丝酵母转接入马铃薯液体培养基的锥形瓶中，在 28-32℃，180-220rpm振荡培养48-72小时，待培养基浑浊后取出。
将发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜热双歧杆菌以及青春双歧杆菌，分别接入MRS液体培养基的锥形瓶中，在35-39℃培养48-72小时，待培养基浑浊后取出，然后放入2-4℃冰箱保存待用。
进一步地，在本发明较佳实施例中，按照重量份数计，菌种培养基包括糖蜜4～10份、水90～98份。该菌种培养基用于培养复合菌，成本低廉，且能够保证菌种的良好增殖。
进一步地，在本发明较佳实施例中，所述产朊假丝酵母与所述菌种培养基的质量比为1:90～110。该比例适中，保证复合菌生长过程中具有足够的营养成分。
进一步地，菌种复合培养步骤中，菌种在29～32℃条件下密闭培养。该条件适合产朊假丝酵母以及多种乳酸菌复合培养的条件，能够加快菌种的增殖以及代谢产物的积累。
进一步地，菌种复合培养步骤中，预设pH值为3.6～4.0，即接入乳酸菌后，待pH小于3.6～4.0后，再继续培养12～15d得到复合菌。更进一步地，预设pH值为3.8。通过对菌种复合培养过程中pH值的调控，能够更好地把控复合菌培养过程，避免培养时间过长，保证菌种的活性和发酵能力。
进一步地，在本发明较佳实施例中，按照重量份数计，所述乳杆菌包括发酵乳杆菌10～20份、瑞士乳杆菌20-30份、嗜热双歧杆菌 20～30份。
发酵乳杆菌和瑞士乳杆菌均为乳酸菌，耐受畜禽动物肠道低酸、高胆盐的环境。在发酵过程中，能够产生丰富的代谢产物，赋予产品更好的风味，改善动物的适口性。其对于胃肠道环境适应能力强，能消除肠道内的多种有害菌，且具有良好的免疫调节和抗氧化能力，保护畜禽动物肠道细胞不受氧化损伤。嗜热双歧杆菌是一种益生菌，其能够维护畜禽动物肠道菌群平衡，抑制病原菌的生长，能够合成维生素、氨基酸等活性成分。使用上述多种乳酸菌，在适宜的比例下，能够形成良好的协同增效作用。
进一步地，在本发明较佳实施例中，原料复合发酵步骤中，复合菌和混合原料的质量比为1:15～25。在该配比下，能够最大限度的发挥菌种的发酵作用，有效积累发酵产物。
进一步地，在本发明较佳实施例中，原料复合发酵步骤中，按照重量份数计，混合原料包括可溶性淀粉20～30份、覆盆子5～10份、金银花3～7份、藤茶3～9份、蛋白胨5～8份、糖蜜2～5份、水40～60 份。
可溶性淀粉、蛋白胨、糖蜜等能够为复合菌提供充足的氮源、碳源等，保证复合菌的生长繁殖。覆盆子富含有机酸、糖类等，是最好的花青素、SOD和鞣花酸来源之一，具有显著的抗氧化功能。金银花含有绿原酸、新绿原酸、木犀草素苷等药理活性成分，具有抑菌、抗炎、解热等多种作用。藤茶中含有大量的黄酮类化合物，特别是含有对自由基清除率极高的二氢杨梅素，能够有效减轻肠道氧化损伤。此外，藤茶还富含膳食纤维、胡萝卜素和维生素E等。在特定的比例下，覆盆子、金银花和藤茶同时作用，营养物质和活性成分形成相互作用和补充，特别是能够相互激活各自含有的活性物质，更有利于肠道的吸收和转化。例如，藤茶中的黄酮类物质等能够使得覆盆子中的有机酸、SOD等更活跃，金银花中的绿原酸能够和藤茶中的二氢杨梅素形成更优良的抗氧化效果。
进一步地，在本发明较佳实施例中，还包括对所述复合发酵物进行分离、成型的步骤，具体地，包括以下步骤：。
S1，浓缩液的制备：将复合发酵物过滤得到发酵液，发酵液经浓缩、杀菌得到浓缩液。优选地，发酵液在40～50℃条件下浓缩至发酵液质体积的20～30％，然后在60～70℃条件下杀菌10～30min后得到浓缩液。
S2，制剂的制备：将浓缩液制成制剂。
在本发明较佳实施例中，将浓缩液制备成固态制剂，具体地，按照重量份数计，备取浓缩液15-30份、赤藓糖醇15-30份、乳糖30-60 份、保护剂3-5份，先将赤藓糖醇和乳糖依次加入喷雾干燥一步制粒机，然后开始喷入浓缩液，流量10-20mL/min，最后喷入溶解于适量水中的保护剂，制粒机的进风温度60-80℃，出风温度40-60℃，待喷雾器内温度降到25-35℃时出料，即得。
在在本发明其他较佳实施例中，可以将浓缩液制备成液体制剂，具体地，按照重量份数计，备取浓缩液45-50份、赤藓糖醇45-50份、保护剂5-10份，先将赤藓糖醇和保护剂加入适量热蒸馏水搅拌溶解，冷却至25-35℃后加入浓缩液，搅拌使溶液澄清后即得。
产朊假丝酵母是一种可食用酵母，能够利用廉价的糖蜜生产出可食用的蛋白质，其发酵密度高，蛋白质和维生素B的含量均较高。
本发明实施例中，产朊假丝酵母先培养一段时间后，再加入发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜热双歧杆菌等乳酸菌进行培养。该过程中，产朊假丝酵母能够产生蛋白质等营养因子，为后续多种乳酸菌的培养提供更为有利的生长环境，保证复合菌的质量。
制得的微生物制剂进入到畜禽动物肠道中后，产朊假丝酵母能够消耗肠道中的氧气，给予有益菌适宜的生长环境并避免氧化损伤，发酵乳酸菌、嗜热双歧杆菌能够抑制肠道有害菌的增殖，促进有益菌的繁殖，更好地维护肠道健康。在肠道出现氧化应激损失后，复合发酵产生活性成分，例如黄酮类、谷胱甘肽、维生素C等，能够及时对肠道进行修复，加强肠道黏膜屏障保护作用。
通过多种菌种和发酵产生的多种活性成分相互协同作用，基于肠道免疫、肠道微生态以及氧化应激修复的基础原理，能够更加有效修复畜禽动物肠道损伤，促进畜禽动物的健康和免疫力，从而提高畜禽动物的存活率和生长速度。
本发明实施例还提供一种用于畜禽肠道损伤修复的微生物制剂，根据上述的制备方法制备得到。经过检测，本发明实施例制备的微生物制剂含有大量的可食用菌种以及抗氧化组分，例如：总黄酮(6.15％)、二氢杨梅素(432mg/100g)、氨基酸(6.21％)、肌醇(23.2mg/100g)、谷胱甘肽(1006mg/100g)、维生素C(465μg/100g)、维生素E(911μg/100g)、SOD(273000U/100g)、花青素(394mg/100g) 等。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的一种用于畜禽肠道损伤修复的微生物制剂的制备方法，其包括以下步骤。
第一步：菌种复合培养
(1)按重量份数称取：产朊假丝酵母25份、发酵乳杆菌15份、瑞士乳杆菌30份、嗜热双歧杆菌30份；
(2)将以上称取的菌种中的产朊假丝酵母按1：100比例放入以下配比的原料中：糖蜜5％、纯净水95％，放入发酵罐搅拌均匀后 30℃密闭培养24小时，然后再将称取的发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜热双歧杆菌接入，待pH小于3.80后培养14天得到复合菌；
第二步：原料复合发酵
(1)原料粉碎：将筛选的覆盆子、金银花、藤茶通过粉碎机粉碎成50目；
(2)复合发酵：将以上的复合菌按1：20比例放入以下配比的原料中：可溶淀粉25份、覆盆子5份、金银花5份、藤茶6份、蛋白胨5份、糖蜜4份、纯净水40份，放入发酵罐搅拌均匀后30℃密闭培养15天；
第三步：浓缩液制备
(1)将发酵罐内液体通过板框过滤，固液分离，得到发酵液。
(2)发酵液在45℃进行浓缩至20％。
(3)浓缩后的复合天然产物的浓缩液，在60℃下杀菌20分钟后4℃贮藏待用。
第四步：固态剂型制备
将物料按以下重量比称取：复合天然产物的浓缩液20份、赤藓糖醇20份、乳糖55份、保护剂5份，先将赤藓糖醇和乳糖依次加入喷雾干燥一步制粒机，然后开始喷入复合天然产物浓缩液，流量 10ml/分钟，最后喷入溶解于适量水中的保护剂，制粒机的进风温度60℃，出风温度45℃，待喷雾器内温度降到30℃时出料，即得。
实施例2
本实施例提供的一种用于畜禽肠道损伤修复的微生物制剂的制备方法，其包括以下步骤。
第一步：菌种复合培养
(1)按重量份数称取：产朊假丝酵母30份、发酵乳杆菌20份、瑞士乳杆菌30份、嗜热双歧杆菌30份；
(2)将以上称取的菌种中的产朊假丝酵母按1：100比例放入以下配比的原料中：糖蜜5份、纯净水95份，放入发酵罐搅拌均匀后30℃密闭培养24小时，然后再将称取的发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜热双歧杆菌接入，待pH小于3.60后培养14天得到复合菌；
第二步：原料复合发酵
(1)原料粉碎：将筛选的覆盆子、金银花、藤茶通过粉碎机粉碎成50目；
(2)复合发酵：将以上的复合菌按1：15比例放入以下配比的原料中：可溶淀粉20份、覆盆子6份、金银花4份、藤茶6份、蛋白胨7份、糖蜜5份、纯净水52份，放入发酵罐搅拌均匀后32℃密闭培养14天。
第三步：浓缩液制备
(1)将发酵罐内液体通过板框过滤，固液分离，得到发酵液。
(2)发酵液在50℃进行浓缩至20％。
(3)浓缩后的复合天然产物的浓缩液，在65℃下杀菌10分钟后4℃贮藏待用。
第四步：固态剂型制备
将物料按以下重量比称取：复合天然产物的浓缩液45份、赤藓糖醇45份、保护剂5-10份，先将赤藓糖醇和保护剂加入适量热蒸馏水搅拌溶解，冷却至35℃后加入复合天然产物浓缩液，搅拌使溶液澄清后即得。
对比例1
本对比例提供的一种用于畜禽肠道损伤修复的微生物制剂的制备方法，其包括以下步骤。
第一步：菌种复合培养
(1)按重量份数称取：酿酒酵母35份、嗜酸乳杆菌30份、植物乳杆菌35份，混合得到混合菌；
(2)将上述混合菌按1：100比例放入以下配比的原料中：红糖水5％、纯净水95％，放入发酵罐搅拌均匀后30℃密闭至pH小于 3后，继续培养25天得到复合菌。
第二步：原料复合发酵
(1)原料粉碎：将筛选的葛根、沙棘、葡萄籽通过粉碎机粉碎成40目；
(2)复合发酵：将以上的复合菌按1：20比例放入以下配比的原料中：葛根25份、沙棘20份、葡萄籽20份、红糖3份、纯净水 45份，放入发酵罐搅拌均匀后30℃密闭培养15天.
第三步：浓缩液制备
(1)将发酵罐内液体通过板框过滤，固液分离，得到发酵液。
(2)发酵液在45℃进行浓缩至20％。
(3)浓缩后的复合天然产物的浓缩液，在60℃下杀菌20分钟后4℃贮藏待用。
第四步：固态剂型制备
将物料按以下重量比称取：复合天然产物的浓缩液20份、赤藓糖醇20份、乳糖55份、保护剂5份，先将赤藓糖醇和乳糖依次加入喷雾干燥一步制粒机，然后开始喷入复合天然产物浓缩液，流量 10ml/分钟，最后喷入溶解于适量水中的保护剂，制粒机的进风温度60℃，出风温度45℃，待喷雾器内温度降到30℃时出料，即得。
试验例
动物分组：试验选用30日龄断奶的体重相近(约8.7kg)的外三元断奶仔猪80头，采用单因子设计，随机分为4个处理组，每个处理4个重复，每个重复5头仔猪。3个处理组分别为空白组、对照组、试验组1和试验组2。对照组为每吨饲料添加250g对比例1制得的微生物制剂，试验组1为每吨饲料添加250g实施例1制得的微生物制剂，试验组2为每吨饲料添加500g实施例2制得的微生物制剂。试验期共30d。
指标检测方法：试验结束时,每组随机抽宰4头，公母比例一致。分别在十二指肠，空肠，回肠中段取1cm肠壁，小心用镊子夹取用生理盐水冲洗，贴于滤纸展平修剪，放入10％中性福尔马林于4℃固定；常规方法脱水、浸蜡包埋，5μm厚组织切片，进行常规HE染色。每肠段做1张切片，用Leica专用万能显微镜数码拍照，应用Qwin 软件测量绒毛高度、隐窝深度。绒毛高度：从绒毛基部(肠腺与绒毛联接处)到绒毛顶端的距离；隐窝深度：从肠腺基部到肠腺开口 (肠腺与绒毛联接处)的距离。
表1 断奶仔猪小肠绒毛高度的影响(μm)
小肠部位 空白组 对照组 试验组1 试验组2
十二指肠 390.88±10.37 423.78±5.86* 516.77±10.03* 499.57±7.97*
空肠 375.76±6.36 392.54±9.04* 451.39±13.49* 465.93±7.98*
回肠 291.56±7.29 295.77±6.44 305.1±6.05 316.29±6.33*
表2 断奶仔猪隐窝深度的影响(μm)
小肠部位 空白组 对照组 试验组1 试验组2
十二指肠 297.61±8.38 281.36±6.27 263.09±10.50* 278.26±8.39*
空肠 246.46±5.28 234.82±8.29* 210.26±7.73* 228.53±7.48*
回肠 216±6.87 210.63±5.76 199.89±4.58* 205.52±5.91*
表3 断奶仔猪体重及腹泻情况表
指标 空白组 对照组 试验组1 试验组2
初重(kg) 8.72 8.69 8.74 8.68
末重(kg) 17.21 17.90 19.48 19.21
日增重(g/d) 283 307 358 351
腹泻次数 7 2 0 0
如表1-2可见，肠道组织形态方面，与空白对照组相比，对照组虽然能够在一定程度上修复肠道损伤，但效果较差。试验组仔猪十二指肠、空肠和回肠隐窝深度几乎均显著低于空白组仔猪隐窝深度 (P＜0.05)，肠绒毛高度均高于空白组仔猪(P＜0.05)。添加本发明实施例的微生物制剂在维持肠道正常结构方面，具有良好的效果。此外，如表3所见，本发明实施例的微生物制剂能够有效减少仔猪的腹泻，提高仔猪的营养吸收，日增重量显著高于空白组和对照组，且试验组的仔猪在试验期间均未发生腹泻。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种用于畜禽肠道损伤修复的微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
菌种复合培养：将20～30重量份的产朊假丝酵母于菌种培养基中培养20～30h后，接入50～80重量份的乳酸菌，培养至pH值小于预设pH值后，继续培养12～15d得到复合菌，其中，所述乳酸菌选自发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜热双歧乳杆菌、青春双歧杆菌中的一种或多种；
原料复合发酵：将所述复合菌添加到混合原料中，在28～32℃条件下密闭发酵12～15d得到复合发酵物，所述混合原料包括可溶淀粉、覆盆子、金银花、藤茶、蛋白胨、糖蜜、水。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括对所述复合发酵物进行分离、成型的步骤。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，菌种复合培养步骤中，按照重量份数计，所述乳杆菌包括发酵乳杆菌10～20份、瑞士乳杆菌20-30份、嗜热双歧杆菌20～30份。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，原料复合发酵步骤中，所述复合菌和所述混合原料的质量比为1:15～25。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，原料复合发酵步骤中，按照重量份数计，所述混合原料包括可溶性淀粉20～30份、覆盆子5～10份、金银花3～7份、藤茶3～9份、蛋白胨5～8份、糖蜜2～5份、水40～60份。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，按照重量份数计，所述菌种培养基包括糖蜜4～10份、水90～98份。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，菌种复合培养步骤中，所述产朊假丝酵母与所述菌种培养基的质量比为1:90～110。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述预设pH值为3.6～4.0。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentim)为保藏编号为ACCC10531的菌种，所述瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)为保藏编号为ACCC10532的菌种，所述嗜热双歧杆菌(Bifidobacteriumthermophilum)为保藏编号为CGMCC 1.2235的菌种。
10.一种用于畜禽肠道损伤修复的微生物制剂，其特征在于，根据权利要求1～9任意一项所述的制备方法制备得到。
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