CN110302214A - 一种乳酸菌联合中链甘油三酯在修复肠道炎症中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种乳酸菌联合中链甘油三酯在修复肠道炎症中的应用,其特征在于,将乳酸菌联合中链甘油三酯用于肠道炎症的修复、用于制备肠道炎症修复药物或用于制备肠内营养制剂。本发明的有益效果在于:发明提供本发明提供的一种乳酸菌联合中链甘油三酯在修复肠道炎症中的应用可以显著增加肠道炎症实验组小鼠的体重,起到一定的营养补充作用;可以显著降低血清和小肠组织中TNF‑α、IL‑1β、IL‑6、MCP‑1水平,同时显著降低小肠组织中TLR4、MyD88、NF‑κB的mRNA表达水平;且通过小肠组织病理切片显示对小鼠小肠粘膜损伤有较好的修复作用;为开发用于重症感染患者的肠道炎症的修复营养制剂提供了一种很好的选择。
Description
技术领域
本发明属于肠道炎症修复药物研究技术领域,涉及一种乳酸菌联合中链甘油三酯的应用,具体涉及一种乳酸菌联合中链甘油三酯在修复肠道炎症中的应用。
背景技术
重症感染是以全身性感染导致器官功能损害为特征的复杂临床综合征,常引发多器官功能障碍综合征(Multi-organ dysfuntion syndrome,MODS),其中,肠道炎症是重症感染的主要表现。
肠道是维持人体正常生理活动的重要器官之一,参与机体物质代谢、防御屏障、细胞体液免疫、分泌活性物质等重要功能,是机体最强大的“消化工厂”与“免疫基地”。许多疾病状态的病理生理学改变均与肠黏膜屏障障碍有关。当机体出现重症感染,特别是胆道感染、肠道感染时,进入肠道的细菌和毒素可通过炎症反应直接造成肠黏膜损伤。重症感染后的应激反应或全身炎症反应还可导致全身血流重新分布,为了保障心、脑及其他重要脏器的血流供应,作为机体最大的消化及免疫器官,也被称为应激时“器官功能障碍中心”的肠道首当其冲发生系列病理生理改变,出现血管痉挛、氧供下降,导致肠屏障功能障碍(Intestine barrier functional disturbance,IBFD),引起肠黏膜通透性增加,发生肠道细菌、内毒素移位,进一步促进炎症介质的连锁反应,形成恶性循环。因此,改善与维持肠黏膜屏障功能是重症感染治疗中的关键。
近年来的指南中指出,EN是成人重症患者恢复胃肠功能的一线营养治疗手段。多项研究也表明,EN可有效改善肠黏膜屏障功能,修复肠黏膜损伤。适时和恰当地应用肠内营养制剂(Enteral nutrition,EN)不仅可以有效改善患者的营养状况,还可以加速缓解肠道炎症,有效改善肠粘膜损伤,从而促进机体康复。乳酸菌作为一种益生菌,可通过多种方式发挥抗肠炎作用,除了抑制肠道菌群中致病菌的生长和黏附外,还可通过调控肠上皮细胞产生的炎性因子从而发挥抗肠炎作用。
但是单纯利用乳酸菌作为肠内营养制剂的效果不是特别理想,而且其它的肠内营养制剂对肠道炎症的修复作用也不是很理想,所以开发一种新型的肠道炎症的修复营养制剂就显得尤为重要。
发明内容
为了弥补现有技术的不足,本发明提供了一种乳酸菌联合中链甘油三酯在修复肠道炎症中的应用,为开发一种新型的肠道炎症的修复营养制剂提供了一种很好的选择。
乳酸菌联合中链甘油三酯对LPS诱导的肠道炎症的修复作用机制可能为:在营养肠道的同时,抑制肠道TLR4信号传导途径相关因子表达,减少促炎细胞因子释放,从而减轻肠道炎症反应。
本发明提供了一种乳酸菌联合中链甘油三酯在修复肠道炎症中的应用。
优选的,所述乳酸菌联合中链甘油三酯用于制备肠道炎症修复药物。
优选的,所述乳酸菌联合中链甘油三酯用于制备肠内营养制剂。
优选的,所述乳酸菌联合中链甘油三酯中的乳酸菌与中链甘油三酯的质量比为3:11.4。
优选的,所述乳酸菌可以为青春双岐杆菌、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌的混合菌粉。
优选的,所述肠道炎症为脂多糖LPS诱导肠道急性炎症。
本发明的有益效果在于:本发明提供的一种乳酸菌联合中链甘油三酯在修复肠道炎症中的应用具有以下优势:
①本发明提供的一种乳酸菌联合中链甘油三酯在修复肠道炎症中的应用可以显著增加肠道炎症实验组小鼠的体重,起到一定的营养补充作用;
②本发明提供的一种乳酸菌联合中链甘油三酯在修复肠道炎症中的应用可以显著降低血清和小肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1水平,同时显著降低小肠组织中TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA表达水平。
③本发明提供的一种乳酸菌联合中链甘油三酯在修复肠道炎症中的应用效果通过小肠组织病理切片显示为:对小鼠小肠粘膜损伤有较好的修复作用。
④本发明提供的一种乳酸菌联合中链甘油三酯在修复肠道炎症中的应用显示对LPS诱导的肠道炎症具有一定的修复作用,且中链甘油三酯可以有效降低肥胖小鼠小肠组织炎症因子水平及Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)传导通路中相关蛋白的表达,为开发用于重症感染患者的肠道炎症的修复营养制剂提供了一种很好的选择。
附图说明
图1为本发明实施例1中实验小鼠体重变化趋势图;
图2为本发明实施例1中实验小鼠小肠组织中TLR4,MyD88,NF-κB的mRNA表达(n=6)水平示意图;
图3为本发明实施例1中实验小鼠小肠组织病理切片(×100)示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
1材料与方法
1.1实验动物模型的建立及分组
实验小鼠来源:SPF级健康12周龄雄性C57BL/6J小鼠,由中国医学科学院实验动物研究所提供,生产许可证号为SCXK(京)2014-0004,使用许可证号为SYXK(军)2012-0010。
实验小鼠药剂使用剂量确定:小鼠由普通饲料适应性喂养1周后,按5、4.5、4、3.5、3、2.5mg/kg的剂量腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)。每日测量体重,选择第2天体重下降>5%且3天内不死亡的最低剂量作为实验研究用剂量,为3.5mg/kg。
实验小鼠分组:另购买30只12周龄雄性C57BL/6J小鼠,测量空腹体重由小到大排号,按数字随机表法分5组,每组6只小鼠,具体为MCT组(乳酸菌+MCT)、GLU组(乳酸菌+葡萄糖)、LAB组(乳酸菌)、LPS组(LPS损伤对照)和EPT组(正常对照)。
实验小鼠分组后预处理:除EPT组腹腔注射生理盐水外,其余4组腹腔注射3.5mg/kg LPS,24小时后,5组小鼠分别灌胃:MCT组采用0.1ml生理盐水+0.03g乳酸菌+0.114gMCT粉经行灌胃;GLU组采用0.1ml生理盐水+0.03g乳酸菌+0.2g葡萄糖经行灌胃;LAB组采用0.1ml生理盐水+0.03g乳酸菌经行灌胃;LPS组采用0.1ml生理盐水经行灌胃;EPT组采用0.1ml生理盐水经行灌胃,连续灌胃8天,研究期间仍以普通饲料继续喂养。
1.2主要试剂及引物
乳酸菌:选用青春双岐杆菌、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌的混合菌粉(1010CFU/种),由北京孚曼生物技术有限公司提供;
MCT粉:由陕西海斯夫生物工程有限公司提供;
LPS(Escherichia coli 026:B6):购自美国Sigma公司;
BCA蛋白浓度检测试剂盒(Cat.No.23225):购自美国Pierce公司;
ELISA试剂盒(Cat.No.MCYTOMAG-70KPMX):包括肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosisfactor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)ELISA试剂盒,购自德国Merck公司;
试剂盒:包括核糖核酸(RNA)提取试剂盒、逆转录-PCR(RT-PCR)试剂盒,购自美国Promega公司;
抗体:包括TLR4抗体(ab13556)、髓样分化因子88(Myeloid differentiationfactor 88,MyD88)抗体(ab2064)、核转录因子κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)p65抗体(ab16502),均购自美国Abcam公司;
Trizol、M-MLV逆转录酶:购自美国Invitrogen公司;
其他试剂为分析纯试剂;
引物合成由北京奥科鼎盛生物科技有限公司提供,其中,TLR4引物序列为:上游5’-TGG CTGGTTTACACGTCCAT-3’,下游5’-TGCAGAAACATTCGCCAAGC-3’;MyD88引物序列为:上游5’-CTGGCCTTGTTAGACCGTGA-3’,下游5’-GTGGGACACTGCTTTCCACT-3’;NF-κB引物序列为:上游5’-GGAAAGGAACTCTGTCAGAT-3’,下游5’-TAGGCTGAGGGTACTCAATCA-3’;β-actin引物序列为:上游5’-AGGCCAACCGTGAAAAGATG-3’,下游5’-TGGCGTGAGGGAGAGCATAG-3’。
1.3检测指标和方法
1.3.1动物体重记录:研究期间每日固定时间点测量小鼠体重并记录。
1.3.2动物样品预处理
1.3.2.1动物血样制备
各组灌胃8天后处死小鼠,经腹主动脉采集血样,3000~4000r/min离心,取血清储存于-80℃,用于ELISA试剂盒检测相关炎症因子水平。
1.3.2.2小肠组织的处理
分离出各组灌胃8天后处死小鼠的全部小肠组织,共分3部分:第一部分立即放于液氮
中备检mRNA;第二部分用0.9%氯化钠注射液按10%浓度制成匀浆,700r/min离心15分钟,取上清液,冻存于液氮中,用于ELISA试剂盒检测炎症因子水平;第三部分小肠组织用蒸馏水漂洗后,浸泡于多聚甲醛中进行固定,用于进行病理切片观察。
1.3.3血和小肠组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1水平测定
取冻存的血清和小肠组织上清液,运用BCA法测定小肠组织蛋白浓度,再根据ELISA检测试剂盒说明分别检测血清和小肠组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1的水平。
1.3.4小肠组织中TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA表达测定
每个小肠组织样本约100mg,首先按Trizol试剂的操作说明进行RNA提取,以总RNA3μg为逆转录反应模板,采用TLR4引物序列、MyD88引物序列、NF-κB引物序列、β-actin引物序列,按照反转录试剂盒的操作步骤说明在普通PCR仪上进行逆转录,再以2μL逆转录反应产物为模板,按照荧光实时定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)试剂盒说明书,冰上配置50μL的PCR反应体系,进行小肠组织中mRNA表达测定。RT-PCR扩增条件为:95℃预变性120秒,95℃变性20秒,59℃退火25秒,72℃延伸30秒,45个循环。目的基因表达采用Ct(thresholdcycle,Ct)值法,以各样本基因的Ct值与其相应内参照β-actin基因的Ct值之差(ΔCt)来表示,表示方法为2-ΔΔCt,即为2ΔCt(actin)-ΔCt(target gene)。1.3.5小肠组织病理标本处理及染色
将固定的小肠组织进行常规石蜡包埋、切片,切片厚度为2μm,行HE染色后于光镜下观察组织病理学改变。
1.4统计分析
采用SPSS19.0统计软件进行数据处理,所有数据均采用表示。组间比较采用One-way ANOVA分析,多重比较采用LSD法。P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果与分析
2.1小鼠模型建立、分组及体重变化情况
实验开始时,除EPT组,其余4组小鼠体重为(28.29±0.55)g,腹腔注射3.5mg/kgLPS 24小时后体重为(26.31±0.54)g,体重下降百分比为7.0%,高于5%,模型建立。
经腹腔注射LPS的C57BL/6J小鼠分别进行灌胃干预,除了LPS组,MCT、GLU、LAB和EPT组小鼠体重均升高。其中,MCT组体重增长显著高于GLU、LAB和LPS组(P<0.05),而与EPT组差异则无统计学意义(P>0.05),具体结果见图1。
2.2乳酸菌联合中链甘油三酯对小鼠血清中炎症因子水平的影响
MCT组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1水平均显著低于GLU、LAB和LPS组(P<0.05)。同时,MCT组血清IL-1β和MCP-1水平显著高于EPT组(P<0.05),而TNF-α和IL-6水平则与EPT组差异无统计学意义(P>0.05),具体结果见表1。
表1 C57BL/6J小鼠血清中TNF-α,IL-1β,IL-6和MCP-1水平(n=6)
注:*与GLU组比较P<0.05;#与LAB组比较P<0.05;&与LPS组比较P<0.05;α与EPT组比较P<0.05
2.3乳酸菌联合中链甘油三酯对小鼠小肠组织中炎症因子水平以及TLR4、MyD88和NF-κB mRNA表达的影响
MCT组小鼠小肠组织中IL-1β、IL-6和MCP-1水平均显著低于GLU、LAB和LPS组,TNF-α水平显著低于LAB和LPS组(P<0.05),而IL-1β、IL-6和MCP-1水平与EPT组差异无统计学意义(P>0.05)。
同时,MCT组小鼠小肠组织中TLR4,MyD88和NF-κB mRNA表达均显著低于GLU、LAB和LPS组(P<0.05),而与EPT组差异无统计学意义(P>0.05),具体见表2和图2。
表2 C57BL/6J小鼠小肠组织中TNF-α,IL-1β,IL-6和MCP-1水平(n=6)
注:*与GLU组比较P<0.05;#与LAB组比较P<0.05;&与LPS组比较P<0.05;α与EPT组比较P<0.05
2.4乳酸菌联合中链甘油三酯对小鼠小肠组织病理切片影响
与EPT组相比,MCT组小鼠小肠黏膜厚度、绒毛高度降低不明显,上皮损伤指数较低,且绒毛较为完整;GLU组小鼠小肠黏膜厚度、绒毛高度降低不明显,但上皮损伤指数升高,部分绒毛破损、断裂;LAB组小鼠小肠黏膜厚度、绒毛高度均有降低,上皮损伤指数较高;LPS组小鼠小肠黏膜厚度、绒毛高度显著降低,上皮损伤指数显著升高,且部分绒毛顶端破损严重。可见,除EPT组,其余4组小鼠肠黏膜均有不同程度的损伤,以LPS组损伤最明显,LAB和GLU组次之,MCT组损伤较轻,具体结果见图3。
应当理解,以上所描述的具体实施例仅用于解释本发明,并不用于限定本发明。由本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (6)
1.一种乳酸菌联合中链甘油三酯在修复肠道炎症中的应用,其特征在于,将乳酸菌联合中链甘油三酯用于肠道炎症的修复。
2.根据权利要求1所述的一种乳酸菌联合中链甘油三酯在修复肠道炎症中的应用,其特征在于,所述乳酸菌联合中链甘油三酯用于制备肠道炎症修复药物。
3.根据权利要求1所述的一种乳酸菌联合中链甘油三酯在修复肠道炎症中的应用,其特征在于,所述乳酸菌联合中链甘油三酯用于制备肠内营养制剂。
4.根据权利要求3所述的一种乳酸菌联合中链甘油三酯在修复肠道炎症中的应用,其特征在于,所述乳酸菌联合中链甘油三酯中的乳酸菌与中链甘油三酯的质量比为3:11.4。
5.根据权利要求4所述的一种乳酸菌联合中链甘油三酯在修复肠道炎症中的应用,其特征在于,所述乳酸菌可以为青春双岐杆菌、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌的混合菌粉。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的一种乳酸菌联合中链甘油三酯在修复肠道炎症中的应用,其特征在于,所述肠道炎症为脂多糖LPS诱导肠道急性炎症。
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Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20191008 |