MX2015001658A

MX2015001658A - Modelo animal de obesidad y metodos para hacerlo y utilizarlo.

Info

Publication number: MX2015001658A
Application number: MX2015001658A
Authority: MX
Inventors: Liping Zhao; Na Fei
Original assignee: Perfect China Co Ltd
Priority date: 2012-08-08
Filing date: 2013-08-01
Publication date: 2015-07-14
Also published as: ZA201500910B; RU2015108075A; AU2013302036A1; EP2882283A1; IL236980B; WO2014023178A1; CN102792919B; EP2882283A4; HK1208993A1; CA2880309C; RU2644204C2; CA2880309A1; US10130080B2; CN102792919A; KR20150040305A; AU2013302036B2; SG11201500785TA; BR112015002610A2; JP2015531593A; US20150208620A1

Abstract

La solicitud proporciona, entre cosas, métodos para construir el modelos de obesidad en animales, métodos para clasificar microorganismos o composiciones de microorganismos que pueden causar obesidad, métodos para clasificar objetivos terapéuticos para tratar trastornos metabólicos, y métodos para clasificar o evaluar microorganismos, compuestos, composiciones, alimentos, recetas, formulaciones, fármacos, suplementos alimenticios, productos para el cuidado de la salud, bebidas y otros artículos para la prevención y el tratamiento enfermedades metabólicas.

Description

MODELO ANIMAL DE OBESIDAD Y MÉTODOS PARA HACERLO Y UTILIZARLO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente solicitud se refiere a la bioteenología, particularmente se refiere a la elaboración de modelos animales, y la aplicación de tales modelos animales de obesidad en la clasificación de microorganismos, compuestos, composiciones, fármacos, alimentos, formulaciones o recetas, medicinas, complementos nutricionales, productos para el cuidado de la salud, o bebidas para su papel en la provocación, prevención o tratamiento de la obesidad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN A menos que se indique otra cosa en la presente, los materiales descritos en esta sección no son la técnica anterior para las reivindicaciones en esta solicitud y no se admiten como la técnica anterior por inclusión en esta sección.

Un gran número de microbios simbióticos viven dentro del cuerpo humano, su estado y función son equivalentes a un órgano importante adquirido después del nacimiento, contribuyen en con un papel indispensable en la salud humana. Dentro del cuerpo humano entero, las células eucariotas representan solamente el 10% del número total de células; mientras las células procariotas representan el 90% restante, de esta forma Lederberg laureado con el premio Ref.254172 Nobel propone que el cuerpo humano es un "super-organismo" que consiste tanto de células eucarióticas como se células procariotas simbióticas endocomensales. Los microbios simbióticos endocomensales exceden 1000 especies, pesan 1-2 kg, y en número están en el intervalo de 1014, más de 10 más que el número de células del cuerpo humano, y el número de genes codificantes es al menos 100 veces mayor que el de los genes humanos.

Es bien conocido que la obesidad se ha convertido en un severo problema de forma creciente de la salud pública en la sociedad moderna; sin embargo, a la fecha, el mecanismo permanece ambiguo de cómo la flora intestinal participa en el inicio y el desarrollo de la obesidad, resistencia a insulina y otras enfermedades metabólicas. Aún más, no es claro si la flora intestinal es la causa o el efecto de las enfermedades metabólicas; qué tipos de bacterias pueden llevar a la aparición de enfermedades metabólicas, y qué tipos de bacterias son capaces de mejorar los síntomas de la obesidad, resistencia a insulina y otras enfermedades metabólicas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La siguiente breve descripción es ilustrativa solamente y no pretende ser en ninguna forma limitante. Además de los aspectos ilustrativos, las modalidades, y características descritas anteriormente, otros aspectos, modalidades y características serán evidentes por referencia a las figuras y la siguiente descripción detallada.

En un aspecto, la presente solicitud se refiere a métodos para construir el modelo de obesidad animal. En una modalidad, el método incluye inocular animales con una bacteria productora de endotoxina (LPS) bajo una condición de dieta alta en grasa para producir un modelo de obesidad animal gnotobiótico. Después de que un microorganismo tal como una bacteria productora de endotoxina, o una composición que incluye una bacteria productora de endotoxina, se inocula en animales sin gérmenes alimentados con una dieta alta en grasa, el microorganismo se coloniza dentro de los intestinos de los animales sin gérmenes. Los animales pueden desplegar obesidad, resistencia a insulina, inflamación crónica, u otros síntomas del trastorno metabólico, trastorno del sistema inmunitario, u otros trastornos sistémicos.

En otro aspecto, la solicitud proporciona métodos para clasificar microorganismos o composiciones de microorganismos que pueden causar obesidad.

En otro aspecto, la solicitud proporciona métodos para clasificar objetivos terapéuticos para tratar trastornos metabólicos tal como la obesidad.

En otro aspecto, la solicitud proporciona métodos para clasificar o evaluar microorganismos, alimentos, recetas, formulaciones, composiciones, compuestos, fármacos, suplementos alimenticios, productos para el cuidado de la salud, bebidas, u otros artículos que pueden usarse para la prevención o tratamiento de enfermedades metabólicas tal como la obesidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las anteriores y otras características de esta descripción serán completamente evidentes a partir de la siguiente descripción y las reivindicaciones anexas, tomadas junto con las figuras anexas. Al entender que estas figuras describen solamente varias modalidades dispuestas de acuerdo con la descripción y por lo tanto no se consideran limitantes de su alcance, la descripción se describirá con especificidad y detalle adicional a través del uso de las figuras anexas, en donde: La Figura 1 ilustra la colonización de aislados B29 en los intestinos de ratones libres de gérmenes alimentados con una dieta alta en grasas mediante la comparación de los niveles de población de Enterobacter sp. B29 en el modelo de ratones obesos gnotobióticos asociados con Enterobacter con los ratones de control; Las Figuras 2A-2E ilustran los efectos de B29 en los síntomas de obesidad y resistencia a insulina de ratones libres de gérmenes alimentados con una dieta alta en grasas; la Figura 2A muestra el peso corporal del modelo de obesidad gnotobiótico asociado con Enterobacter y los controles; la Figura 2B muestra la masa de la almohadilla grasa del epidídimo, mesentérica, inguinal subcutánea y retroperitoneal del modelo de obesidad gnotobiótico asociado con Enterobacter g los controles; la Figura 2C muestra las fotografías del modelo gnotobiótico de obesidad asociado con Enterobacter y los controles; la Figura 2D muestra la prueba de tolerancia a glucosa oral (OGTT, por sus siglas en inglés) y un área bajo la curva (AUC, por sus siglas en inglés) del modelo de ratones obesos gnotobióticos asociado con Enterobacter y los controles; y la Figura 2E muestra los niveles de insulina en suero 2 horas después de la carga del modelo gnotobiótico asociado con Enterobacter y los controles/ y Figuras 3A-3F ilustran el efecto de B29 en el nivel de inflamación de ratones libres de gérmenes alimentados con una dieta alta en grasas; la Figura 3A muestra los niveles LBP en suero del modelo de obesidad gnotobiótico asociado con Enterobacter y los controles; la figura 3B muestra los niveles SAA en suero del modelo de obesidad gnotobiótico con Enterobacter y los controles; la Figura 3C muestra la adiponectina en suero corregida para los niveles del peso corporal del modelo de obesidad gnotobiótico asociado con Enterobacter y los controles; la Figura 3D muestra el análisis de transcripción inversa (RT)-PCR expresión cuantitativa de Tnfcx, I??b, 116, Mcpl, Ikk e y Tlr4 en el hígado del modelo de obesidad gnotobiótico asociado con Enterobacter y los controles; la Figura 3E muestra el análisis de transcripción inversa (RT)-PCR expresión cuantitativa de Tnfa, I??b, 116, Mcpl, Ikk e y Tlr4 en la almohadilla grasa del epidídimo del modelo de obesidad gnotobiótico asociado con Enterobacter y los controles; y la Figura 3F el análisis de transcripción inversa (RT)-PCR expresión cuantitativa de Tnfa, I??b, 116, Mcpl, Ikk e y Tlr4 en el íleo del modelo de obesidad gnotobiótico asociado con Enterobacter y los controles.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la siguiente descripción detallada, se hace referencia a las figuras anexas, que forman una parte de ésta. En las figuras, los símbolos similares típicamente identifican componentes similares, a menos que el contexto dicte lo contrario. Las modalidades ilustrativas descritas en la descripción detallada, figuras y reivindicaciones no pretenden ser limitantes. Otras modalidades pueden usarse, y otros cambios pueden hacerse, sin apartarse del espíritu o alcance del tema presentado en la presente. Se entenderá fácilmente que los aspectos de la presente descripción, como se describen en general en la presente, y se ilustran en las Figuras, pueden disponerse, sustituirse, combinarse, separarse y diseñarse en una amplia variedad de diferentes configuraciones, todas las cuales se contemplan explícitamente en la presente.

La solicitud en general proporciona, entre otras cosas, nuevos métodos para construir modelos de obesidad en animales, nuevos métodos para clasificar microorganismos o composiciones de microorganismos que pueden causar obesidad, nuevos métodos para clasificar objetivos terapéuticos para tratar trastornos metabólicos y nuevos métodos para clasificar o evaluar microorganismos, compuestos, composiciones, alimentos, recetas, formulaciones, fármacos, suplementos alimenticios, productos para el cuidado de la salud, bebidas y otros artículos para la prevención y el tratamiento de enfermedades metabólicas.

En un ejemplo, la presente solicitud provee un método para proporcionar un modelo de obesidad animal, en donde los animales libres de gérmenes se inoculan con un microorganismo mientras son alimentados con una dieta alta en grasas. El microorganismo puede ser un microorganismo individual o una combinación de microorganismos. La dieta alta en grasas puede contener al menos 5% de grasa. El microorganismo o la combinación pueden colonizar los intestinos de los animales libres de gérmenes y formar las bases de la población microbiota de los intestinos para los modelos animales resultantes. El modelo animal puede exhibir los síntomas de al menos un trastorno metabólico o trastorno del sistema inmunitario.

Lo síntomas del trastorno metabólico o del sistema inmunitario pueden ser cualquier síndrome metabólico o trastorno del sistema inmunitario incluyendo, sin limitación, obesidad, resistencia a insulina, inflamación crónica, o enfermedad hepática de grasa no alcohólica.

El animal libre de gérmenes puede ser mamífero o no mamífero. Los mamíferos de ejemplo pueden incluir, un ratón, una rata, un conejillo de Indias, un puerco, un conejo, o un mono.

El contenido de grasa de la dieta alta en grasas puede ser de al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, o al menos 25%.

El microorganismo puede ser una bacteria tal como una bacteria productora de endotoxina. La bacteria productora de endotoxina se refiere a una bacteria capaz de producir endotoxinas que tiene actividad de endotoxina. Los ejemplos de bacterias productoras de endotoxina pueden incluir, sin limitación, la cepa B29 de Enterobacter cloacae, Enterobacter cloacae, Enterobacter, enterobacteriaceae , g-Proteobacteria, Proteobacteria, o bacteria Gram-negativa. El microorganismo puede estar en una composición que incluye múltiples cepas de bacteria productora de endotoxina o incluir cepas de bacterias productoras de endotoxina y bacterias no productoras de endotoxina. En un ejemplo, el microorganismo puede contener un gen de la síntesis de endotoxina cuya secuencia es menos 15%, 20%, 30%, 50%, 75% o 95% similar a la cepa B29 de Enterobacter cloacae.

El modelo de obesidad animal provisto anteriormente puede incluir una bacteria de intestino que tiene un gen de ARNr 16S cuya secuencia es menos 15%, 20%, 30%, 50%, 75% o 95% similar a SEC ID N0.1.

El método de inoculación como se indica anteriormente puede ser cualquier método de inoculación o administración en los campos biológico, medicinal, o farmacéutico. Los métodos de inoculación de ejemplo pueden incluir, cebadura, adición de dietas, adición de agua para beber, y aplicación untada o tópica la piel o pelo. Después de la inoculación, los microorganismos inoculados como bacteria pueden colonizar el intestino del animal, y pueden detectarse en las heces del animal. En un ejemplo, la bacteria inoculada puede detectarse continuamente en las heces del animal. Los animales pueden exhibir, entre otros síndromes metabólicos relacionados, ganancia de peso, grasa aumentada, lípidos en sangre, resistencia a insulina, resistencia a proteína o leptina de unión de lipopolisacárido sérica, un aumentado nivel sérico de inflamación, o aumentados niveles de expresión del factor inflamatorio.

En otro aspecto, la presente solicitud provee métodos para clasificar un microorganismo causante de la obesidad o una de sus combinaciones. En un ejemplo, una bacteria de control positivo que es capaz de colonizar los intestinos de un animal libre de gérmenes se inocula en el animal, que es alimentado con una dieta alta en grasas. El animal resultante puede exhibir al menos un tipo del trastorno metabólico o del sistema inmunitario. La bacteria de control positivo se compara con al menos un microorganismo de prueba o una de sus combinaciones. Si el microorganismo de prueba o una de sus combinaciones exhibe efectos similares al control positivo, es indicativo de que el microorganismo de prueba o una de sus combinaciones puede causar obesidad.

En otro aspecto, la presente solicitud provee método para clasificar un microorganismo o una de sus combinaciones que tiene un efecto preventivo o terapéutico en el síntoma del trastorno metabólico o trastorno del sistema inmunitario. En un ejemplo, el método usa un modelo animal que exhibe al menos un síntoma del trastorno metabólico o del sistema inmunitario. Después de la administración del microorganismo de prueba o a una de sus combinaciones, si el animal exhibe mejoras en al menos un síntoma del trastorno metabólico o del sistema inmunitario, es indicativo de que tal microorganismo o una de sus combinaciones tiene un efecto preventivo o terapéutico sobre el síntoma del trastorno metabólico o del sistema inmunitario. En un ejemplo, la mejora en al menos un síntoma del trastorno metabólico o del sistema inmunitario puede incluir la mitigación del síntoma de obesidad, resistencia a insulina, o inflamación crónica.

Por ejemplo, después de la administración de un microorganismo de prueba o a una de sus combinaciones, si el animal exhibe uno o más de, pérdida de peso, reducción de grasa, reducción de lípidos en sangre, resistencia a insulina mejorada, reducción en el nivel de proteína de unión de lipopolisacárido en suero, reducción de resistencia a leptina, reducción en el nivel de inflamación en suero, o reducción en los niveles de expresión del factor inflamatorio, es indicativo de que el microorganismo de prueba o una de sus combinaciones pueden tener un efecto preventivo o terapéutico en el síntoma del trastorno metabólico o del sistema inmunitario.

El microorganismo de prueba puede ser cualquier microorganismo. En un ejemplo, el microorganismo de prueba puede incluir la bacteria de ácido láctico, Bifidobacteria, la bacteria productora de butirato, coco Grampositivo o probióticos.

En otro aspecto, la presente solicitud provee métodos para clasificar un material que puede tener un efecto preventivo o terapéutico en los síntomas del trastorno metabólico o del sistema inmunitario. En un ejemplo, el método utiliza un modelo animal que exhibe un síntoma del trastorno metabólico o del sistema inmunitario. Después de administrar el material, si el animal exhibe una mejora en al menos un síntoma del trastorno metabólico o del sistema inmunitario, es indicativo de que el material puede tener un efecto preventivo o terapéutico en los síntomas del trastorno metabólico o del sistema inmunitario. Por ejemplo, la mejora puede incluir la pérdida de peso, reducida resistencia a insulina, o reducida inflamación crónica. En un ejemplo, después de la administración del material, si el modelo de obesidad animal gnotobiótico exhibe uno o más de pérdida de peso, reducción de grasa, reducción de lípidos en sangre, resistencia a insulina mejorada, reducción en el nivel de proteína de unión de lipopolisacárido en suero, reducción de resistencia a leptina, reducción en el nivel de inflamación en suero, o reducción en los niveles de expresión del factor inflamatorio, es indicativo de que el material pueden tener un efecto preventivo o terapéutico en el síntoma del trastorno metabólico o del sistema inmunitario .

El material antes indicado puede ser comestible. Por ejemplo, el material puede incluir, sin limitación, alimentos, recetas, formulaciones, compuestos, composiciones, fármacos, suplementos nutricionales, un producto para el cuidado de la salud, o bebida.

Los siguientes ejemplos son para ilustrar la ejecución y propiedad del método representativo de la solicitud. Estos ejemplos no pretenden limitar el alcance de la solicitud.

EJEMPLO 1 Materiales y Modelos de Animal Se utilizaron ratones macho C57BL/6J (sin gérmenes) como un animal de ejemplo. Se utilizó B29 Enterobacter cloacae como un microorganismo de inoculación de ejemplo. El B29 Enterobacter cloacae se refiere a una cepa superior aislada de heces de pacientes voluntarios mórbidamente obesos. El análisis de secuencia del gen ARN 16s y los ensayos bioquímicos identificaron la bacteria como Enterobacter cloacae.

Se compraron 24 ratones machos sanos C57BL/6J (sin gérmenes) de Research Diets, Inc. (New Brunswick, NJ) y se alimentaron con ya sea dieta de comida normal (NCD, contenido de grasa 4.62%, 3.45 kcalorías/gramo) o dieta alta en grasas (HFD, contenido de grasa 34.9%, 5.21 kcalorías/gramo) Método en ratones: los ratones se mantuvieron en un ciclo de 12 horas de luz (luz empezando de las 6:30 AM) a 22±3°C. Los ratones de seis-diez semanas de edad se distribuyeron aleatoriamente en cuatro grupos (6 por grupo), y recibieron el siguiente tratamiento: (1), grupo NCD+LB: este grupo se inoculó por cebadura con 0.1 mi de medio LB estéril, y se le dio de comer un NCD; (2) grupo NCD+B29: el grupo se inoculó con una suspensión de cebadura B29 (102 células) en 0.1 mi de medio LB estéril y se le dio de comer un NCD; (3) grupo HFD+LB: este grupo se inoculó por cebadura con 0.1 mi de medio LB estéril y se le dio de comer un HFD; y (4) grupo HFD+B29: este grupo se inoculó por cebadura con suspensión de B29 (102 células) en 0.1 mi de medio LB estéril y se le dio de comer un HFD. El experimento duró 16 semanas. Los ratones se criaron en jaulas de 3 o 4 en los aisladores gnotobióticos, y cada peso corporal del ratón de midió cada semana. Cada grupo de animales se alojó en sus propios aisladores alimentados con dieta estéril y agua estéril hasta la eutanasia, y se realizó la vigilancia de la contaminación bacteriana por examen bacteriológico periódico de los aisladores gnotobióticos.

Durante el experimento, se monitorearon el peso corporal, el peso de la almohadilla grasa, la sensibilidad a insulina y los niveles de inflamación de los ratones.

EJEMPLO 2 Aislamiento y Caracterización de B29 de Enterobacter cloacae Un análisis de la población obesa reveló que la mayoría de los pacientes mórbidamente obesos sufrieron de grave desequilibrio en la microbiota de los intestinos. Por ejemplo, 35% del total de la bacteria de los intestinos se encontró como siendo Enterobacter (ensayada a través de la colección de ARNr 16S) en un voluntario mórbidamente obeso (hombre de 26 años, etnicidad Han, peso corporal de 174.9 kg, BMI 58.78 kg/m2). Mientras tanto, los exámenes físicos mostraron que el voluntario sufre de severo síndrome metabólico. El voluntario experimentó 23 semanas de intervención dietética (composición: granos enteros, medicina China tradicional, y prebióticos), cuando perdió 30.1 kg después de 9 semanas, 51.4 kg de 174.8 kg después de 23 semanas, y exhibió una mejora en todas las mediciones del síndrome metabólico. Un análisis de la población de bacterias en los intestinos reveló que la población de Enterobacter se redujo a 1.8% después de 9 semanas con la dieta, y se hizo indetectable al final del ensayo A de 23 semanas. Las cepas de Enterobacter se aislaron de las heces del voluntario vía un esquema de "aislamiento guiado por secuencia" utilizando medio LB (Luria-Bertani, receta acoplada más abajo) a 37°C, obtenida de los aislados más abundantes, y denominada B29. El análisis de secuenciación de longitud completa se realizó en ARNr 16S de B29, y se encontró que B29 es 99% homólogo a Enterobacter cloacae (No. de acceso de GenBank AB244457). Una prueba bioquímica con la tarjeta GN gram-negativa VITEK 2 (GN card, bioMérieux, Marcy l'Étoile, Francia) también indicó que B29 es 98% probable que pertenezca a Enterobacter cloacae (Tabla 1).

El lipopolisacárido (LPS) se aisló de B29 utilizando el kit de aislamiento LPS de iNtRON Biotechnology Co., Seúl, Corea, y el nivel de actividad de la endotoxina se midió utilizando un kit de ensayo de actividad de endotoxina LAL (ACC, USA). El resultado mostró que la actividad de la endotoxina de B29 es 4.45x106 EU mg-1 LPS, comparable con la cepa de E. coli 055:B5.

Con el fin de realizar la detección específica de B29 Enterobacter cloacae, se aisló una cepa B29 que es resistente a 500 mg/ml de Rifampicina utilizando el método de clasificación de cepas resistentes a Rifampicina. Esta cepa se inoculó en medio LB y agitó por 12 horas a 37°C, y el cultivo bacteriano resultante se utilizó para construir el modelo animal.

La fórmula para el medio LB (Luria-Bertani) es como sigue: triptona 10g/L, extracto de levadura 5g/L, NaCl lOg/L, Ph7.4. El medio sólido LB: 15 gramos de agarosa adicionados en 1L de medio líquido LB, disuelto con calor, y el medio se vertió en la placa antes del enfriamiento.

TABLA 1. Caracterización Bioquímica de B29 Enterobacter cloacae con el sistema VITEK 2 ID-GN EJEMPLO 3 Colonización de B29 estable en intestinos de ratón sin germenes Durante el experimento, se recolectaron muestras de heces frescas cada dos semanas, se pesaron inmediatamente, y diluyeron 1:10 en 0.01M de PBS estéril. El regulador de pH PBS se hizo de acuerdo con la siguiente fórmula: 135 mM de NaCl, 2.7 mM de KCl, 1.5 mM de KH2P04, y 8 mM de K2HP04, pH 7.2. Tomar 100 ml de suspensión y dispersarlos sobre placas LB, cultivar a 37°C por 16 horas antes del conteo de las colonias. Los resultados mostraron que, durante el período del experimento (0-16 semanas), los ratones del modelo (es decir, HDF+B29) y los ratones NCD+B29 produjeron heces que contuvieron B29 Enterobacter cloacae a la densidad de 1010- 1012 bacterias por gramo de heces húmedas. Este resultado mostró que B29 Enterobacter cloacae puede colonizarse establemente en los intestinos de ratones libres de gérmenes después de una sola inoculación (Figura 1).

EJEMPLO 4 La Cepa B29 Induce Obesidad y Resistencia a insulina en Ratnes con una Dieta Alta en Grasas Durante el experimento, se midió precisamente el peso corporal de cada ratón con una balanza electrónica (d = 0.01) una vez a la semana. En la semana 16, se administró oralmente al ratón glucosa (2 g/kg de peso corporal) después de 5 horas de ayuno. Inmediatamente antes de la administración de glucosa (0 minutos), y 15, 30, 60 y 120 minutos después de la administración de glucosa, la sangre se recolectó de la vena de la cola, y los niveles de glucosa en sangre se midieron inmediatamente por medio del medidor de glucosa en sangre Roche. Estos puntos de datos se utilizaron para calcular la prueba de tolerancia a glucosa en sangre. Ciento veinte minutos después de la administración de glucosa, se recolectaron 50 ml se sangre de la vena retro-orbital, se dejaron a temperatura ambiente por 15 minutos; y se midieron los niveles de insulina en sangre por ELISA (Mercodia, Uppsala, Suecia). Este punto de datos representa el nivel de insulina dos horas después de la dieta. Al final de la semana 16, los ratones se desecaron bajo los siguientes procedimientos. Primero, se tomaron fotografías del abdomen abierto con reglas como marcador en dos ratones representativos de cada grupo; posteriormente, se recolectaron y presaron exactamente las almohadillas grasas del epidídimo, las almohadillas grasas mesentéricas, las almohadillas grasas subcutáneas de la ingle y las almohadillas grasas peri-renales de los ratones de cada grupo. Los análisis estadísticos se realizaron y los resultados se expresaron como el promedio ± S.E.M, usando el análisis del factor de variación (post Hoc) para análisis de significancia estadística (prueba de comparación múltiple de Turkey, SPSS 17.0). Los resultados se muestran en la Figura 2.

Los resultados mostraron que, los ratones del modelo que se alimentaron con una dieta alta en grasas y recibieron inoculación de B29 Enterobacter cloacae exhibieron significativamente mayor peso corporal que los otros tres grupos de control. Al final de las 16 semanas, los ratones del modelo demostraron un fenotipo de obesidad muy obvio. Además, los resultados de las almohadillas grasas del epidídimo, las almohadillas grasas mesentéricas, las almohadillas grasas subcutáneas de la ingle, y las almohadillas grasas peri-renales demostraron que los ratones del modelo que recibieron una dieta alta en grasas e inoculación de B29 Enterobacter cloacae tuvieron aumentos en peso muy significativos en las almohadillas grasas principales. Las imágenes de disección abdominal demostraron que la masa corporal del grupo de los ratones del modelo y las acumulaciones de grasa abdominal son obviamente más grandes que las de los otros grupos. Finalmente, la tolerancia a glucosa de los ratones del grupo del modelo es marcadamente inferior significativamente que la de los otros grupos, mientras los niveles de insulina dos horas después de la dieta son significativamente más altos en el grupo de modelo comparado con el otro grupo de control.

EJEMPLO 4 Efecto de B29 Enterobacter cloacae en el Nivel de Inflamación de Ratones alimentados con una Dieta Alta en Grasas Con el fin de demostrar los efectos de B29 Enterobacter cloacae sobre el nivel de inflamaciones en ratones alimentados con una dieta alta en grasas, las concentraciones de la proteína de unión de lipopolisacárido en suero (LBP), la proteína amiloidea A serica (SAA) y la adiponectina se midieron. Los niveles de expresión del gen de factores inflamatorios en el hígado, la almohadilla grasa del epidídimo, y el tejido del ycyuno también se determinaron cuantitativamente. Los resultados se muestran en la Figura 3.

El nivel LBP en ratones del modelo de obesidad (HFD+B29) fue significativamente más malto que el de los otros grupos, a pesar de que los números de B29 en los intestinos de los ratones alimentados con una dieta normal excedieron en mucho los de los otros grupos. Debido a que B29 fue la única bacteria productora de LPS, el significativo aumento en el nivel de endotoxina en el suero de los ratones del modelo puede solamente derivarse de B29. El significativo aumento en el nivel de endotoxina en suero dará como resultado la inflamación sistémica, que a su vez lleva a la resistencia a insulina y otros síntomas de trastornos metabólicos. Los ratones del modelo de obesidad mostraron un aumento significativo en el nivel SAA y una reducción significativa en el nivel de adiponectina, confirmando el significativo aumento en la inflamación sistémica. El resultado de los niveles de expresión de los factores inflamatorios en el hígado, la almohadilla grasa del epidídimo, el tejido de ycyuno mostró que los ratones del modelo de obesidad tuvieron el nivel más alto de expresión de TNFa, IL-Ib, IL-6, IKK- e, y TLR4.

De esta forma, en los ratones del modelo de obesidad que se crea con base en esta solicitud, el nivel LBP en suero y el nivel de SAA en suero aumentaron significativamente comparados con los tres grupos de control, el nivel de adiponectina se redujo significativamente comparado con los tres grupos de control, y los niveles de expresión del tejido local de los genes pro-inflamatorios se redujeron significativamente, comparados con los tres grupos de control.

Como se utiliza en este documento, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente indique lo contrario. A menos que se defina de otra forma, todos los términos téenicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica. Nada en esta descripción deberá construirse como una admisión de que las modalidades descritas en esta descripción no tienen el derecho de antedatar tal descripción en virtud de la invención anterior. Como se utiliza en este documento, el término "que comprende" significa "que incluye, pero no se limita a esto".

Además, cuando las características o aspectos de la descripción se describen en términos de grupos Markush, los expertos en la téenica reconocerán que la descripción por lo tanto también se describe en términos de cualquier número individual o subgrupo de miembros del grupo Markush.

Como se entenderá por un experto en la técnica, para cualquiera y todos los propósitos, tal como en términos de proveer una descripción escrita, todos los intervalos descritos en la presente también abarcan cualquiera y todos los sub-intervalos posibles y combinaciones de sus sub intervalos. Cualquier intervalo enumerado puede fácilmente ser reconocido como describiendo suficientemente y permitiendo que el mismo intervalo se subdivida en al menos, mitades, tercios, cuartetos, quintos, décimos, etc., iguales. Como un ejemplo no limitante, cada intervalo explicado en la presente puede fácilmente subdividirse en un tercio inferior, tercio medio y tercio superior, etc. Como también se entenderá por un experto en la técnica, todo el lenguaje tal como "hasta", "al menos" y similar incluye el número mencionado y se refiere a intervalos que pueden posteriormente subdividirse en sub-intervalos como se explica anteriormente. Finalmente, como se entenderá por un experto en la téenica, un intervalo incluye cada miembro individual. De esta forma, por ejemplo, un grupo que tiene de 1-3 células se refiere a grupos que tienen 1, 2, o 3 células. Similarmente, un grupo que tiene 1-5 células se refiere a grupos que tienen 1, 2, 3, 4, o 5 células, etc.

De lo anterior, se apreciará que varias modalidades de la presente descripción se han descrito en la presente con el propósito de ilustración, y que pueden hacerse varias modificaciones sin apartarse del alcance y espíritu de la presente descripción. Por consiguiente, las varias modalidades descritas en la presente no pretenden ser limitantes, el verdadero alcance y espíritu de la invención se indica por las siguientes reivindicaciones.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un modelo animal de obesidad cuya población de microbiota en los intestinos comprende al menos una bacteria que contiene el gen ARNr 16S, caracterizado porque la secuencia del gen ARNr 16S es al menos 75% similar a SEC ID NO.1.

2. El modelo animal de obesidad no humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la bacteria es una bacteria productora de endotoxina.

3. El modelo animal de obesidad no humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la bacteria es Enterobacter .

4. El modelo animal de obesidad no humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la bacteria es Enterobacter cloacae.

5. El modelo animal de obesidad no humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen de ARNr 16S es al menos 95% similar a SEC ID N0.1.

6. El modelo animal de obesidad no humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen de ARNr 16S es al menos 85% similar a SEC ID N0.1.

7. El modelo animal de obesidad no humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un ratón, una rata, un conejillo de Indias, un puerco, un conejo, o un mono.

8. Un método para establecer un modelo animal de obesidad, caracterizado porque comprende, inocular un animal sin gérmenes con una bacteria que tiene un gen de ARNr 16S para proveer un animal inoculado, en donde la secuencia del gen de ARNr 16S es al menos 75% similar a SEC ID NO.1; and alimentar al animal inoculado con una dieta que tiene al menos 5% de contenido de grasa por un período de tiempo para proporcionar un modelo animal de obesidad.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque tiene una población microbiota en los intestinos que comprende al menos una bacteria con un gen de ARNr 16S, en donde la secuencia del gen de ARNr 16S es al menos 75% similar a SEC ID NO.l.

10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque manifiesta un síndrome metabólico.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el síndrome metabólico comprende obesidad, resistencia a insulina, inflamación crónica, o a una de sus combinaciones.

12. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la bacteria es una bacteria productora de endotoxina.

13. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la bacteria es Enterobacter.

14. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la bacteria es Enterobacter cloacae.

15. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la secuencia del gen de ARNr 16S es al menos 95% similar a SEC ID N0.1.

16. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el modelo animal de obesidad no humano es un ratón, una rata, un conejo, un mono, un puerco, o un conejillo de Indias.

17. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el período de tiempo es al menos 4 semanas.

18. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la inoculación del animal sin gérmenes comprende la administración intra-gástrica, la administración tópica, la administración oral o a una de sus combinaciones.

19. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la inoculación del animal sin gérmenes comprende inocular el animal sin gérmenes con al menos 102células de bacteria.

20. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la dieta tiene al menos 20% de contenido de grasa.

21. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la dieta tiene al menos 10% de contenido de grasa.

22. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la dieta comprende al menos 4.5 kcal por gramo.

23. Un método para establecer un modelo animal de obesidad, caracterizado porque comprende, inocular un animal sin gérmenes con una bacteria productora de endotoxina para proveer un animal inoculado; and alimentar al animal inoculado con una dieta que tiene al menos 5% de contenido de grasa por un período de tiempo para proporcionar un modelo animal de obesidad, en donde el modelo animal de obesidad manifiesta al menos un síndrome metabólico.

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la bacteria productora de endotoxina comprende una bacteria de Enterobacter cloacae.

25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la bacteria productora de endotoxina comprende una bacteria de Enterobacter.

26. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la bacteria productora de endotoxina comprende una bacteria de Enterobacteriaceae .

27. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la bacteria productora de endotoxina comprende una bacteria de g-Proteobacteria.

28. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la bacteria productora de endotoxina comprende una bacteria de Proteobacteria.

29. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la bacteria productora de endotoxina comprende una bacteria de bacteria Gram-negativa.

30. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la bacteria productora de endotoxina es capaz de colonizar los intestinos del animal sin gérmenes.

31. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la bacteria productora de endotoxina tiene un gen de ARNr 16S, y en donde la secuencia del gen de ARNr 16S es al menos 75% similar a SEC ID N0.1.

32. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el modelo animal de obesidad tiene una población microbiota en los intestinos que comprende al menos una bacteria con un gen de ARNr 16S, en donde la secuencia del gen de ARNr 16S es al menos 75% similar a SEC ID NO.1.

33. Un método para clasificar un compuesto, caracterizado porque comprende, proveer un modelo animal de obesidad de prueba y un modelo animal de obesidad de control, en donde tanto el modelo animal de obesidad de prueba como el modelo animal de obesidad de control tienen una población microbiota en los intestinos que comprende al menos una bacteria con un gen de ARNr 16S, and en donde la secuencia del gen de ARNr 16S es al menos 75% similar a SEC ID N0.1; proporciona un compuesto al modelo animal de obesidad de prueba durante un período de tiempo mientras se alimenta al animal con un dieta que tiene al menos 5% de contenido de grasa a ambos, el modelo animal de obesidad de prueba y el modelo animal de obesidad de control durante un período de tiempo; y medir la ganancia en peso, el cambio en el nivel sérico de un biomarcador de endotoxina, o ambos en el modelo animal de obesidad de prueba y en el modelo animal de obesidad de control, y en donde la ganancia en peso del modelo animal de obesidad de prueba de forma estadística significativamente menor que la ganancia en peso del modelo animal de obesidad de control, o el cambio en el nivel sérico del biomarcador de endotoxina en el modelo animal de obesidad de prueba de forma estadística insignificante a pesar del cambio en el nivel sérico del biomarcador de endotoxina en el modelo animal de obesidad de control de forma estadística significante, o ambos son indicativos de que el compuesto es efectivo en la prevención del síndrome metabólico.

34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el compuesto es un alimento o un fármaco.

35. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el biomarcador de endotoxina comprende una proteína de unión a lipopolisacárido (LBP), lipopolisacárido (LPS), o a una de sus combinaciones.

36. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el síndrome metabólico comprende ganancia de peso, obesidad, resistencia a insulina, inflamación crónica, o a una de sus combinaciones.

37. Un método para clasificar una bacteria que previene la obesidad, caracterizado porque comprende, proveer un modelo animal de obesidad de prueba y un modelo animal de obesidad de control, en donde ambos, modelo animal de obesidad de prueba y el modelo animal de obesidad de control tiene una población microbiota en los intestinos que comprende al menos una bacteria con un gen de ARNr 16S, y en donde la secuencia del gen de ARNr 16S es al menos 75% similar a SEC ID NO.l; inocular el modelo animal de obesidad de prueba con una bacteria de prueba para proveer un modelo animal de obesidad de prueba inoculado,- alimentar una dieta con al menos 5% de contenido de grasa a ambos, el modelo animal de obesidad de prueba inoculado y el modelo animal de obesidad de control durante un período de tiempo; y medir la ganancia en peso, el cambio en el nivel sérico de un biomarcador de endotoxina, o ambos en el modelo animal de obesidad de prueba inoculado y en el modelo animal de obesidad de control, en donde la ganancia en peso del modelo animal de obesidad de prueba inoculado de forma estadística significativamente es menor que la ganancia en peso del modelo animal de obesidad de control, o el cambio en el nivel sérico del biomarcador de endotoxina en el modelo animal de obesidad de prueba inoculado de forma estadística es insignificante mientras el cambio en el nivel sérico del biomarcador de endotoxina en el modelo animal de obesidad de no humano de control es de forma estadística significante, o ambos son indicativos de que la bacteria de prueba es efectiva en la prevención del síndrome metabólico.

38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el biomarcador de endotoxina comprende una proteína de unión a lipopolisacárido (LBP), lipopolisacárido (LPS), o a una de sus combinaciones.

39. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la bacteria comprende un aislado de la bacteria en los intestinos de un sujeto.

40. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el sujeto es un humano.

41. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el síndrome metabólico comprende ganancia de peso, obesidad, resistencia a insulina, inflamación crónica, o a una de sus combinaciones.

42. Un método para clasificar una bacteria causante de obesidad, caracterizado porque comprende, inocular un animal sin gérmenes con una bacteria de prueba para proporcionar un animal de prueba; alimentar con una dieta que tiene al menos 5% de contenido de grasa a ambos, el animal de prueba y el animal del modelo de obesidad de control durante un período de tiempo, en donde el animal del modelo de obesidad de control tiene una población microbiota en los intestinos que comprende al menos una bacteria con un gen de ARNr 16S, y en donde la secuencia del gen de ARNr 16S es al menos 75% similar a SEC ID NO.l; y medir la ganancia en peso, el cambio en el nivel sérico de un biomarcador de endotoxina, o ambos en el test animal y en el modelo animal de obesidad de control, en donde la ganancia en peso del modelo animal de prueba es al menos estadísticamente similar a la ganancia en peso del modelo animal de obesidad de control, o el cambio en el nivel sérico del biomarcador de endotoxina en el animal de prueba es al menos estadísticamente similar al cambio en el nivel sérico del biomarcador de endotoxina en el modelo animal de obesidad de control, o ambos son indicativos de que la batería de prueba aumenta la incidencia del síndrome metabólico.

43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el biomarcador de endotoxina comprende una proteína de unión a lipopolisacárido (LBP), lipopolisacárido (LPS), o a una de sus combinaciones.

44. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el síndrome metabólico comprende ganancia de peso, obesidad, resistencia a insulina, inflamación crónica, o a una de sus combinaciones.