CN112056272A - 一种评价甜味剂摄入对小鼠影响的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品添加剂领域，提供了一种评价甜味剂摄入对小鼠影响的方法，具体方法：选择小鼠喜好的甜味剂种类及浓度，小鼠分组编号后自由饮用甜味剂溶液，定期检测体重、摄食量和溶液饮用量；饮用结束后，检测血清中生化指标（丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化氢酶）、瘦素水平和胰岛素水平；再检测全脑中单胺类神经递质含量（多巴胺、5‑羟色胺、去甲肾上腺素、肾上腺素）。本发明能充分反映小鼠经甜味剂暴露后各方面的变化，提供了一种完整的评估方法，对甜味剂的使用具有一定的指导作用。

Description

一种评价甜味剂摄入对小鼠影响的方法

技术领域

本发明属于食品添加剂技术领域，具体涉及一种评价甜味剂摄入对小鼠影响的方法。

背景技术

甜味剂主要是指能够赋予食品或饲料甜味，提高食品品质，从而来满足人们对食品需求的一类食品添加剂。目前，不管是人们日常的生活，还是工业化生产，甜味剂都发挥着重要的作用。甜味剂的分类方法多种多样，主要是有按来源不同和所含能量不同两种。根据甜味剂的来源不同，可以将其分为天然甜味剂和人工合成甜味剂。天然甜味剂主要有葡萄糖、蔗糖、甜菊糖苷、麦芽糖和木糖醇等，而人工合成甜味剂主要有糖精、安赛蜜、三氯蔗糖和甜蜜素等。根据甜味剂所含能量的不同，可以将其分为能量型甜味剂和非能量型甜味剂。能量型甜味剂主要包括糖类(如葡萄糖、麦芽糖、蔗糖等)和糖醇类(如山梨糖醇、麦芽糖醇、木糖醇等)；非能量型甜味剂主要有糖精、安赛蜜、三氯蔗糖和阿斯巴甜等。

麦芽糖是淀粉、糖原、糊精等大分子多糖类物质在β-淀粉酶催化下的主要水解产物，再经麦芽糖酶催化后水解而得到的一种二糖，是一种天然甜味剂。因为麦芽糖不能被微生物利用，所以可以用作防龋齿的甜味剂使用，适量食用具有润肺止咳、补脾益气的功效。甜菊糖苷是从甜叶菊的叶子中提取出来的一种天然甜味剂。它的甜度很高，约为蔗糖的250至300倍。甜菊糖苷的感官和功能特性优于许多其他高效甜味剂，并有可能成为食品市场天然甜味的主要来源。目前，甜叶菊产品已作为天然且低热量的甜味剂销售，并已经应用于饮料生产中。此外，甜叶菊还含有其他对健康有益的植物成分，比如可以作为降压和降糖药。三氯蔗糖是一种非营养型甜味剂，与其他人工合成的甜味剂不同，它衍生自蔗糖并在结构上与蔗糖相似，并且具有与蔗糖非常相似的口感，甜度比蔗糖高约600倍，是糖尿病患者的安全糖替代品。糖精是一种低热量的人工合成甜味剂，通常被认为是替代蔗糖甜味的一种有效工具，但是它是无法取代蔗糖的味感。有研究者称，即使筛选出大鼠最为喜好的糖精浓度，也仅仅有与低浓度的蔗糖一样的吸引力。现有的证据表明，大鼠对三氯蔗糖的感觉在本质上与对糖精的感觉相似，在较高浓度下偏好降低或厌恶增加。

近年来肥胖与糖尿病等代谢相关疾病已经成为影响人类健康的全球性疾病，且变得日益严重，造成此类代谢疾病的重要原因归结于能量的过多摄入和代谢失衡。糖类物质一般富含营养，是机体的能量来源，食用糖分和能量高的食品和饮料与许多不良健康影响有关，包括体重增加、肥胖、2型糖尿病、代谢综合征和心血管疾病。因此，非营养型甜味剂已成为全球食品和饮料市场上流行的糖替代品。它们被用在零热量食品和低热量饮料中，其价格的可接受性以及低热量的特点都促进了它们的普及。

发明内容

本发明的目的是为了探讨天然甜味剂和人工甜味剂对小鼠产生影响的具体情况，提供一种比较完整的评价方法。该方法包括检测行为学指标(体重、摄食量、溶液饮用量)，生化指标(丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化氢酶)，瘦素，胰岛素和单胺类神经递质(多巴胺、5-羟色胺、去甲肾上腺素、肾上腺素)。通过实验研究表明，这些检测指标能充分反映小鼠经甜味剂暴露后各方面的变化，提供了一种完整的评估方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种评价甜味剂摄入对小鼠影响的方法，包括以下步骤：

(1)配制不同浓度和不同种类的甜味剂，以水作为空白对照，小鼠分组编号后自由饮用甜味剂溶液；

(2)定期检测小鼠体重、摄食量和甜味剂溶液饮用量；

(3)实验结束后，检测血清生化指标、血清瘦素、血清胰岛素和全脑中单胺类神经递质含量。

进一步地，所述的血清生化指标包括丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化氢酶。

进一步地，所述的单胺类神经递质包括多巴胺、5-羟色胺、去甲肾上腺素以及肾上腺素。

进一步地，所述的甜味剂包括天然甜味剂(葡萄糖、蔗糖、甜菊糖苷、麦芽糖和木糖醇等)和人工合成甜味剂(糖精、安赛蜜、三氯蔗糖和甜蜜素等)。

本发明具有以下优点：国内涉及到评价甜味剂对人体健康影响的研究很少。本发明详细研究了甜味剂暴露对小鼠各方面的影响情况，确定了一种完整的评价甜味剂摄入对小鼠影响的方法。

附图说明

图1为实施例中四种甜味剂短期饮用对小鼠食物摄入量的影响。数值表示为平均值±标准差(Mean±S.D.)，n＝2。

图2为实施例中四种甜味剂短期饮用对小鼠溶液饮用量的影响。数值表示为平均值±标准差(Mean±S.D.)，n＝7；*表示该组别跟对照组相比有显著性差异(P<0.05)，**表示该组别跟对照组相比有极显著性差异(P<0.01)。

图3为实施例中四种甜味剂短期饮用对小鼠血清中丙二醛水平的影响。数值表示为平均值±标准差(Mean±S.D.)，n＝7；不同小写字母表示不同处理间存在显著性差异(P<0.05)。

图4为实施例中四种甜味剂短期饮用对小鼠血清中超氧化物歧化酶活性的影响。数值表示为平均值±标准差(Mean±S.D.)(n＝7)；不同小写字母表示不同处理间存在显著性差异(P<0.05)。

图5为实施例中四种甜味剂短期饮用对小鼠血清中谷胱甘肽过氧化氢酶的影响。数值表示为平均值±标准差(Mean±S.D.)(n＝7)；不同小写字母表示不同处理间存在显著性差异(P<0.05)。

图6为实施例中四种甜味剂短期饮用对小鼠血清中瘦素的影响。数值表示为平均值±标准差(Mean±S.D.)(n＝7)；不同小写字母表示不同处理间存在显著性差异(P<0.05)。

图7为实施例中四种甜味剂短期饮用对小鼠血清中胰岛素的影响。数值表示为平均值±标准差(Mean±S.D.)(n＝7)；不同小写字母表示不同处理间存在显著性差异(P<0.05)。

图8为实施例中四种甜味剂短期饮用对小鼠大脑中单胺类神经递质释放的影响。A：多巴胺；B：5-羟色胺；C：去甲肾上腺素；D：肾上腺素。数值表示为平均值±标准差(Mean±S.D.)(n＝7)；不同小写字母表示不同处理间存在显著性差异(P<0.05)。

具体实施方式

一种评价甜味剂摄入对小鼠影响的方法，其步骤如下：

(1)50只3周大的昆明小鼠，随机分为空白对照组、三氯蔗糖组、麦芽糖组、糖精组和甜菊糖苷组，每组2笼小鼠，每笼5只，共10只。

采用0.5％中性红溶液对小鼠毛发进行染色编号。空白对照组：自由饮用清水；三氯蔗糖组：自由饮用三氯蔗糖溶液(10mM)；麦芽糖组：自由饮用麦芽糖溶液(100mM)；糖精组：自由饮用糖精溶液(3mM)；甜菊糖苷组：自由饮用甜菊糖苷溶液(0.3％)。各组的处理均持续32d。在小鼠处死之前，对其进行12h断粮不断水的处理，以便于对其血液及脑组织的收集。

(2)分别配制10mM的三氯蔗糖溶液、100mM的麦芽糖溶液、3mM的糖精溶液和0.3％的甜菊糖苷溶液。

准确称取3.98g三氯蔗糖，先在烧杯中加适量蒸馏水溶解，然后转移至1L容量瓶中加蒸馏水定容至刻度线，混匀后即得到10mM的三氯蔗糖溶液。准确称取34.23g麦芽糖，先在烧杯中加适量蒸馏水溶解，然后转移至1L容量瓶中加蒸馏水定容至刻度线，混匀后即得到浓度为100mM的麦芽糖溶液。准确称取0.55g糖精，先在烧杯中加适量蒸馏水溶解，然后转移至1L容量瓶中加蒸馏水定容至刻度线，混匀即得到浓度为3mM的糖精溶液。准确称取3g甜菊糖苷，先在烧杯中加适量蒸馏水溶解，然后转移至1L容量瓶中加蒸馏水定容至刻度线，混匀即得到质量浓度为0.3％的甜菊糖苷溶液。

(3)将配制4种甜味剂溶液分别转移至1L的锥形瓶中，用封口膜及橡皮筋密封，经立式高压蒸汽灭菌器灭菌后，冷却至室温，将其灌装至鼠笼上端的饮水瓶中。

(4)每4d称量一次小鼠的体重，将一洁净的塑料带手把的烧杯放置在电子天平上，去皮清零后，将小鼠轻轻地放置于烧杯中，待电子天平的读数稳定后，读取小鼠的体重。

每2d记录各组小鼠的食物摄入量，第1d早上10:00称取各笼小鼠的饲料添加量，第3d早上10:00称取各笼小鼠的饲料剩余量，计算出2d内每笼小鼠的饲料摄食量。

每2d记录各组小鼠的溶液饮用量，第1d早上10:00称取各笼小鼠的溶液饮用量，第3d早上10:00称取各笼小鼠的溶液饮用量，计算出2d内每笼小鼠的溶液饮用量。

(5)32d实验结束后，开始进行各组小鼠的取血。首先用剪刀清理小鼠头部两侧的胡须，避免血液在流动过程中沾到胡须上，摘除小鼠右眼球后，用灭过菌的2mL离心管收集适量小鼠全血。取得小鼠全血后，使血液样本在4℃下自然析出2h,使用2mL离心机在4℃下以3000r/min的转速离心10min来分离血清,然后于80℃的超低温冰箱内保存，检测时取出，避免反复冻融。严格按照试剂盒的说明方法来测定小鼠血清中胰岛素(Insulin，INS)和瘦素(Leptin，LEP)的含量。

(6)32d的实验结束后，小鼠以摘眼球取血的方法获得全血，用镊子将其脱颈处死，之后将小鼠四肢固定在纸板上，用剪刀将头部的皮毛剪开，使小鼠全脑暴露出来。左手用钩镊在眼眶处固定小鼠颅骨，右手持组织剪将头盖骨中间剪开并将其掀开，小心用镊子将全脑夹取出来。取小鼠全脑后，液氮速冻后置于-80℃的超低温冰箱中储存。每组随机选取7只小鼠用于检测脑部的神经递质含量，实验时先将样本自然解冻，称取重量后，以质量体积为1:9的比例将其溶于0.9％的生理盐水中，然后用匀浆器将其匀成均一溶液，将匀浆液置于4℃条件下3500r/min离心10min，收集上清液，严格按照ELISA试剂盒的说明方法检测小鼠全脑中的多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、肾上腺素(EPI)和去甲肾上腺素(NE)的含量。

(7)实验结果

①四种甜味剂溶液短期饮用对小鼠体重的影响

表1小鼠体重变化

注：数值表示为平均值±标准差(Mean±S.D.)(n＝10)；相同字母表示不同组间无显著性差异(P>0.05)。

小鼠经32d不同种类的甜味剂持续饮用后，体重变化结果如表1所示。可以看出，每组小鼠的初始体重是相近的，无显著性差异(P>0.05)，可排除初始体重对实验结果的影响。此外，小鼠体重的发展趋势也是相似的，这可以从每组小鼠体重每4d的增长量而观察出来，而且各实验组的最终体重也与空白组的较为接近。因此，可以得出结论，10mM的三氯蔗糖溶液、100mM的麦芽糖溶液、3mM的糖精溶液和0.3％甜菊糖苷溶液持续32d的自由饮用不会影响小鼠体重的正常发展，与空白组小鼠的体重相比没有显著性差异(P>0.05)。

②四种甜味剂溶液短期饮用对小鼠食物摄入量的影响

各组小鼠食物摄入量的变化趋势如图1所示。从图中可以观察到，前10d，5组小鼠的食物摄入量均逐渐上升，可能是因为小鼠前期生长发育的变化影响的；10d后，各组小鼠的食物摄入量均保持平稳，虽然略有波动，但总体的发展趋势是相似的；在各个记录的时间点，各实验组与对照组相比均无显著性差异(P>0.05)。这种结果说明，10mM的三氯蔗糖溶液、100mM的麦芽糖溶液、3mM的糖精溶液和0.3％甜菊糖苷溶液持续32d的自由饮用不会对小鼠食物摄入量产生影响。

③四种甜味剂溶液短期饮用对小鼠溶液饮用量的影响

各组小鼠的溶液饮用量变化趋势如图2所示，前8d各组小鼠的溶液饮用量均逐渐上升且较为接近。与空白组小鼠相比，麦芽糖组小鼠的溶液饮用量在整个实验过程中一直高于空白组，从第10d开始出现显著性差异(P<0.05)；而在第12d和第14d，虽然高于其他四个组，但并无显著性差异(P>0.05)；第16d，麦芽糖组较对照组出现显著性差异(P<0.05)，并且在第16d后的所有时间点差异均极显著(P<0.01)。三氯蔗糖组、糖精组和甜菊糖苷组在前14d的溶液饮用量逐渐上升，之后的各个时间点趋于平稳，虽略有波动，但并无明显的变化，整体发展趋势均与对照组相似，并无显著性差异(P>0.05)。这种结果说明，10mM的三氯蔗糖溶液、3mM的糖精溶液和0.3％甜菊糖苷溶液持续32d的自由饮用不会对小鼠溶液饮用量产生影响。而100mM的麦芽糖溶液，由于其优越的甜味和感官特性，会诱导小鼠对其大量摄入，激发脑部愉悦信号的产生，会导致该组小鼠的溶液饮用量大幅上升。

④小鼠血清中生化指标的测定

如图3所示，与对照组小鼠相比，麦芽糖和糖精组血清中MDA的含量显著升高(P<0.05)，增长幅度分别达到了32.66％和43.20％,因此可以看出糖精组小鼠的增长幅度最高；而三氯蔗糖组和甜菊糖苷组的MDA水平并无明显增加或减少，与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。如图4所示，与对照组小鼠相比，麦芽糖和糖精组血清中SOD的活性显著性降低(P<0.05)，抑制率分别为39.30％和53.53％，同样是糖精组小鼠的SOD活力下降幅度最大；三氯蔗糖组和甜菊糖苷组的SOD活性与对照组相比没有显著性差异(P>0.05)。由图5可以观察到，GSH-Px的实验结果与图4所呈现的SOD相似，依然是麦芽糖和糖精组血清中GSH-Px的活性与对照组相比显著性降低(P<0.05)，抑制率分别为31.08％和50.14％；与对照组小鼠相比，三氯蔗糖组和甜菊糖苷组的GSH-Px活性没有显著性差异(P>0.05)。从上述指标的检测结果可以看出，麦芽糖和糖精会对血清中MDA、SOD、GSH-Px造成不同程度的影响，使小鼠体内的氧化防御能力下降，从而导致体内出现氧化损伤的现象，而三氯蔗糖和甜菊糖苷不会对这些生化指标造成影响。

⑤瘦素

从图6可以看出，与对照组小鼠相比，三氯蔗糖组、麦芽糖组、糖精组、甜菊糖苷组小鼠血清中瘦素水平均显著性提高(P<0.05)；其中麦芽糖组和糖精组的增长水平相近，两组无显著性差异(P>0.05)；而甜菊糖苷组的瘦素增长水平最高，三氯蔗糖组的瘦素增长水平最低。从上述结果可以看出，甜味剂的摄入会不同程度地影响小鼠血清中瘦素水平，但并没有对食物摄入量产生影响，可能是因为饮用时间长短、甜味剂种类、小鼠品种等多种因素造成的。

⑥胰岛素

从图7可以看出，与对照组小鼠相比，三氯蔗糖组、麦芽糖组、糖精组、甜菊糖苷组小鼠血清中的胰岛素含量均有显著性差异(P<0.05)，并且呈现逐步递增的趋势；其中三氯蔗糖组与麦芽糖组无显著性差异(P>0.05)，麦芽糖组和糖精组无显著性差异(P>0.05)，糖精组和甜菊糖苷组无显著性差异(P>0.05)，而三氯蔗糖组和甜菊糖苷组有显著性差异(P<0.05)。以上结果说明三氯蔗糖、麦芽糖、糖精、甜菊糖苷溶液持续32d的短期摄入会造成小鼠血清中胰岛素的水平高于正常小鼠，从而导致胰岛素抵抗的发生。

⑦小鼠脑部神经递质测定

如图8(A)所示，与空白组小鼠相比，麦芽糖组小鼠全脑中DA的含量显著性升高(P<0.05)，这与图2中麦芽糖组的溶液饮用量显著性提高相对应，说明麦芽糖的摄入诱导了小鼠脑部DA的合成与释放，刺激其持续性摄取麦芽糖，激发摄入后效应的奖励作用。三氯蔗糖组、糖精组、甜菊糖苷组小鼠的DA水平与空白组无显著性差异(P>0.05)。如图8(B)所示，与空白组小鼠相比，麦芽糖组、糖精组、甜菊糖苷组小鼠全脑中5-HT水平显著性升高(P<0.05)，其中糖精组和甜菊糖苷组两者之间无显著性差异(P>0.05)，而麦芽糖组与这两者均有显著性差异(P<0.05)；三氯蔗糖组小鼠的5-HT水平与空白组无显著性差异(P>0.05)。5-HT与DA一样，同样属于单胺类神经递质，它的释放能够刺激愉悦情绪的产生，增强兴奋感。以上结果说明，除了天然甜味剂麦芽糖和甜菊糖苷外，人工甜味剂糖精的摄入也能激发小鼠的奖励作用，诱导单胺类神经递质5-HT的分泌，对其的喜好作用较为强烈。如图8(C)所示，三氯蔗糖组、麦芽糖组、糖精组、甜菊糖苷组小鼠全脑中NE的含量与空白组相比没有显著性差异(P>0.05)。如图8(D)所示，与空白组小鼠相比，麦芽糖组、糖精组、甜菊糖苷组小鼠全脑中EPI的含量显著性提高(P<0.05)，其中甜菊糖苷组的表达水平最高，麦芽糖组和糖精组无显著性差异(P>0.05)，仅有三氯蔗糖组与空白组相比无显著性差异(P>0.05)。

Claims (4)

1.一种评价甜味剂摄入对小鼠影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配制不同浓度和不同种类的甜味剂，以水作为空白对照，小鼠分组编号后自由饮用甜味剂溶液；

(2)定期检测小鼠体重、摄食量和甜味剂溶液饮用量；

(3)实验结束后，检测血清生化指标、血清瘦素、血清胰岛素和全脑中单胺类神经递质含量。

2.根据权利要求1所述的评价甜味剂摄入对小鼠影响的方法，其特征在于，所述的血清生化指标包括丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化氢酶。

3.根据权利要求1所述的评价甜味剂摄入对小鼠影响的方法，其特征在于，所述的单胺类神经递质包括多巴胺、5-羟色胺、去甲肾上腺素以及肾上腺素。

4.根据权利要求1所述的评价甜味剂摄入对小鼠影响的方法，其特征在于，所述的甜味剂包括天然甜味剂和人工合成甜味剂。

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