JP2015531593A - 肥満動物モデル、並びに、それの作製方法及び使用方法 - Google Patents

Abstract

本願は、特に、動物の肥満モデルを構築するための方法、肥満を引き起こす可能性のある微生物あるいは微生物の複合物をスクリーニングする方法、代謝性疾病を治療する治療ターゲットをスクリーニングする方法、及び、代謝性疾患の抑制あるいは治療のための、微生物、化合物、複合物、食品、処方書、形成物、薬品、栄養剤、ヘルスケア製品、飲料、及び他のアイテムを、スクリーニングあるいは評価する方法を提供するものである。

Description

発明の詳細な説明

〔技術分野〕
本発明は、バイオテクノロジーに関し、特に、肥満動物モデルの作製方法、そのような肥満動物モデルの、微生物、化合物、複合物、薬品、食品、形成物、あるいは、処方書のスクリーニングへの適用に関する。また、肥満を、引き起こす、抑制する、あるいは治療する、薬剤、栄養剤、ヘルスケア製品、あるいは飲料への適用に関する。

〔背景技術〕
本明細書にて指摘しない限り、本章に記載の物質は、本願の請求項に係る発明に対する従来技術ではなく、本章に含まれることにより従来技術として認められるものでもない。

非常に多くの共生微生物が人間の体内に生息しており、これらの状態及び機能は、出生後に獲得する重要な器官と等価であり、人間の健康に対して独立した役割を担っている。人間の体内において、真核細胞は、全細胞のたった１０％を占めているだけで、残り９０％を原核細胞が占めており、そのため、ノーベル賞受賞者であるレーダーバーグは、人間の体は、真核細胞と内部片利共生生物が共生する原核細胞との両方から成る超個体であると提言した。内部片利共生生物である共生の微生物は１０００種類を超え、重量は１〜２ｋｇであり、そして、１０^１４の程度の数であり、人間の体内の細胞の１０倍よりも多く、コード遺伝子の数は少なくとも人間の遺伝子の数の１００倍である。

肥満症が次第に近代社会の公衆衛生の顕著な問題となっていることはよく知られているが、現在まで、どのように、腸内細菌叢が肥満症の初期及び発達においてインスリン抵抗性疾患及び他の代謝性疾患に積極的関与しているのかについて、そのメカニズムは、明確にされていないままである。さらに、腸内細菌叢が代謝性疾患の原因あるいは結果であるか、どのような種類の細菌が代謝性疾患の発生を引き起こすのか、及びどのような種類の細菌が肥満の症状であるインスリン抵抗性疾患及び他の代謝性疾患を改善できるのか、は明確にされていない。

〔概要〕
以下の概要は、例示のみを挙げており、いかなる限定も意図するものではない。加えて、上記の例示の態様、実施の形態、及び特徴、さらなる態様、実施の形態、及び特徴は、図面及び以下の詳細な説明を参照することで、明白になる。

一態様において、本願は、動物の肥満モデルの作製（構築）方法に関連する。一態様において、当該方法は、高脂肪の食餌を与えた状態にて、動物にエンドトキシン（ＬＰＳ）産生菌を播種し、純粋隔離群動物の肥満モデルを作製する工程を含む。エンドトキシン産生菌あるいはエンドトキシン産生菌を含む複合物と言った微生物を、高脂肪食餌を与えた無菌動物に播種すると、当該微生物は無菌動物の腸管内でコロニーを形成する。この動物は、肥満症、インスリン抵抗性、慢性炎症、または代謝性疾病の他の症状、免疫系の疾病、あるいは他の系の疾病を現わし得る。

また、別の態様において、本願は、肥満症を引き起こす、微生物のあるいは微生物の複合物のスクリーニング方法を提供する。

また、別の態様において、本願発明は、肥満症のような代謝性疾病を処置するための治療ターゲットのスクリーニング方法を提供する。

さらに、別の態様において、本願は、肥満症のような代謝性疾患の抑制あるいは治療に使用が可能な、微生物、食品、処方書、形成物、複合物、化合物、薬品、栄養剤、ヘルスケア製品、飲料、あるいは、他のアイテム、のスクリーニング方法あるいは評価方法を提供する。

〔図面の簡単な説明〕
本開示の前記の及び他の特徴は、以下の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲から十分に明白になり、添付の図面と併せて理解される。これらの図面は、本開示と共に、いくつかの実施形態のみ表わしているが、その範囲に限定されると解釈されるべきではないということが理解された上で、本開示内容は、添付の図面の使用を通して、付加的な特異性と詳細とによって説明される。

図１は、高脂肪食餌を与えた無菌マウスの腸管にて単離されたＢ２９の細菌叢を表わしており、肥満マウスのエンテロバクター付随純粋隔離群モデルにおけるエンテロバクターｓｐ．Ｂ２９の集団レベルをコントロールマウスに対して比較している。

図２は、高脂肪食餌を与えた無菌マウスの肥満症及びインスリン抵抗性の症状に対するＢ２９の効果を示しており、図２のａは、肥満マウスのエンテロバクター付随純粋隔離群モデル及びコントロールマウスの体重を示しており、図２のｂは、肥満マウスのエンテロバクター付随純粋隔離群モデル及びコントロールマウスにおける精巣上体の、腸間膜の、皮下鼠径部の、及び後腹膜の脂肪パッドを示しており、図２のｃは、エンテロバクター付随純粋隔離群モデルの肥満マウス及びコントロールマウスの腹膜写真を示しており、図２のｄは、肥満マウスのエンテロバクター付随純粋隔離群モデル及びコントロールマウスにおける経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）及び曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。図２のｅは、肥満マウスのエンテロバクター付随純粋隔離群モデル及びコントロールマウスにおける負荷２時間経過後の血清インスリン濃度を示している。

図３は、高脂肪食餌を与えた無菌マウスの炎症のレベルにおけるＢ２９の効果を示しており、図３のａは、肥満マウスのエンテロバクター付随純粋隔離群モデル及びコントロールマウスにおける血清ＬＢＰのレベルを示し、図３のｂは、肥満マウスのエンテロバクター付随純粋隔離群モデル及びコントロールマウスにおける血清ＳＡＡのレベルを示し、図３のｃは、肥満マウスのエンテロバクター付随純粋隔離群モデル及びコントロールマウスにおける、体重当たりに直した血清アディポネクインのレベル、図３のｄは、肥満マウスのエンテロバクター付随純粋隔離群モデル及びコントロールマウスの肝臓におけるＴｎｆα、Ｉｌ１β、Ｉｌ６、Ｍｃｐ１、Ｉｋｋεの発現についての逆転写（ＲＴ）定量ＰＣＲ分析の結果を示し、図３のｅは、肥満マウスのエンテロバクター付随純粋隔離群モデル及びコントロールマウスの精巣上体の脂肪パッドにおけるＴｎｆα、Ｉｌ１β、Ｉｌ６、Ｍｃｐ１、Ｉｋｋεの発現についての逆転写（ＲＴ）定量ＰＣＲ分析の結果を示し、図３のｆは、肥満マウスのエンテロバクター付随純粋隔離群モデル及びコントロールマウスの回腸におけるＴｎｆα、Ｉｌ１β、Ｉｌ６、Ｍｃｐ１、Ｉｋｋεの発現についての逆転写（ＲＴ）定量ＰＣＲ分析の結果を示している。

〔発明の詳細な説明〕
以下の詳細な説明では、添付された図面（分図を形成している）について言及している。図面では、特に断わらない限り、通常、同じ要素を同じ符号にて識別している。詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲に開示された説明のための実施形態は、限定を意味するものではない。明細書に記載の主題の精神と範囲から逸脱しない限り、別の実施形態が利用されてもよいし、別の変更がなされてもよい。概ね本明細書に記載され、かつ図示されている本開示の態様は、多種多様の異なる構成におけるアレンジ、置き換え、組み合わせ、分離、及び設計が可能であり、これらの全てが本明細書にて明示的に考慮されることは、容易に理解できるものである。

本願は、特に、動物の肥満モデルを構築するための新規な方法、肥満を引き起こす可能性のある微生物あるいは微生物の複合物をスクリーニングする新規な方法、代謝性疾病を治療する治療ターゲットをスクリーニングする新規な方法、及び、代謝性疾患の抑制あるいは治療のための、微生物、化合物、複合物、食品、形成物、薬品、栄養剤、ヘルスケア製品、飲料、及び他のアイテムを、スクリーニングあるいは評価する新規な方法、を一般に提供するものである。

一例では、本願は、動物の肥満モデルを提供する方法、ここでは、高脂肪食餌を与えている期間に無菌動物に微生物を播種する方法を提供する。上記微生物は、単独の微生物であっても微生物の組み合わせであってもよい。上記高脂肪食餌は、少なくとも５％の脂肪を含有していてもよい。上記微生物または上記微生物の組み合わせは、無菌動物の腸管内にコロニー形成し、そして、腸管微生物叢集団のベースを形成し、結果として動物モデルを生じさせてもよい。上記動物モデルは、少なくとも１つの代謝性疾病あるいは免疫系疾病の症状を表わす可能性がある。

代謝性疾病あるいは免疫系疾病の症状は、肥満症、インスリン抵抗性、慢性炎症、あるいは非アルコール依存性脂肪肝（なお、これらには限定されない）、を含む任意のメタボリックシンドロームあるいは免疫系疾病であってもよい。

無菌動物は、哺乳類であっても非哺乳類であってもよい。例えば、哺乳類は、マウス、ラット、ギニーピッグ、ピッグ、ラビット、あるいはモンキーであってもよい。

上記高脂肪食餌の脂肪含有量は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、あるいは、少なくとも２５％であってもよい。

上記微生物は、エンドトキシン産生菌のような細菌であってもよい。当該エンドトキシン産生菌は、エンドトキシン活性を備えたエンドトキシンを産生することが可能な細菌について言及してもよい。エンドトキシン産生菌の例としては、エンテロバクター・クロアカエのＢ２９系統、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロバクター、エンテロバクテリアセエ、γ−プロテオバクテリア、プロテオバクテリア、あるいは、グラム陰性菌、が挙げられるが、これらに限定されない。微生物は、エンドトキシン産生菌の複数の系統を含んで、または、エンドトキシン産生菌あるいは非エンドトキシン産生菌の系統を含んで、構成されていてもよい。一例では、微生物は、エンドトキシン合成遺伝子を含んでもよく、この遺伝子の配列は、エンテロバクター・クロアカエのＢ２９系統に対して、少なくとも１５％、２０％、３０％、５０％、７５％、あるいは９５％一致する。

上記の動物の肥満モデルは、配列が配列番号１と少なくとも１５％、２０％、３０％、５０％、７５％、あるいは９５％一致する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する腸内細菌を有していてもよい。

上記の播種方法は、生物学の、薬学の、あるいは調剤学の分野における、任意の播種（接種）あるいは投与の方法であってもよい。播種方法の例として、強制飼養、食餌添加、飲料水添加、および塗抹、あるいは、皮膚または毛への局所適用が挙げられる。播種後、播種された細菌のような微生物は、動物の腸管内でコロニー形成してもよいし、あるいは、動物の糞便にて検出されてもよい。一例では、播種された細菌が、動物の糞便にて連続的に検出されてもよい。上記動物は、メタボリックシンドロームに関連する、例えば、体重増加、脂肪、血液脂質、インスリン抵抗性、血清リポ多糖結合タンパク質の濃度、またはレプチン抵抗性の増加、炎症の血清中濃度の増加、あるいは、炎症性因子の発現レベルの増加、を示してもよい。

他の態様では、本願は、肥満を引き起こす微生物あるいはその組み合わせをスクリーニングする方法を提供する。一例では、無菌動物の腸管にコロニー形成できるポジティブコントロール細菌を、上記動物に播種し、当該動物に高脂肪食餌を与える。結果としてもたらされた動物は、代謝性疾病あるいは免疫系疾病の少なくとも１つのタイプを示す可能性がある。上記ポジティブコントロール細菌を、テスト微生物あるいはその組み合わせと比較してもよい。テスト微生物あるいはその組み合わせがポジティブコントロールと同様の効果を示すならば、テスト微生物あるいはその組み合わせは肥満症を引き起こす可能性があることが示される。

別の態様において、本願は、代謝性疾病あるいは免疫系疾病の症状に対して予防上あるいは治療上の効果のある微生物あるいはその組み合わせをスクリーニングする方法を提供する。一例では、上記方法は、代謝性疾病あるいは免疫系疾病の１つの症状を示す動物モデルを使用する。テスト微生物あるいはその組み合わせを投与した後、動物に代謝性疾病あるいは免疫系疾病の少なくとも１つの症状の改善が見られるのであれば、上記テスト微生物あるいはその組み合わせには、代謝性疾病あるいは免疫系疾病の上記症状に対する予防上あるいは治療上の効果があることが示される。一例では、代謝性疾病あるいは免疫系疾病の少なくとも１つの症状の改善には、肥満症、インスリン抵抗性、あるいは慢性炎症の症状の回復が含まれる。例えば、テスト微生物あるいはその組み合わせを投与した後、動物に、体重減少、脂肪減少、血液脂質の減少、インスリン抵抗性の改善、血清リポ多糖結合タンパク質の濃度の減少、レプチン抵抗性の低下、炎症の血清中濃度の減少、あるいは炎症因子の発現レベルの減少、が１つ以上現れると、上記テスト微生物あるいはその組み合わせには、代謝性疾病あるいは免疫系疾病の上記症状に対する予防上あるいは治療上の効果があることが示される。

上記テスト微生物は、任意の微生物であってもよい。一例として、テスト微生物としては、乳酸菌、ビフィドバクテリア、酪酸塩産生菌、グラム陽性球菌、あるいはプロバイオティクスが挙げられる。

別の態様では、本願は、代謝性疾病あるいは免疫系疾病の症状に対する予防上のあるいは治療上の効果があると考えられる物質をスクリーニングする方法を提供する。一例では、上記方法は、代謝性疾病あるいは免疫系疾病の１つの症状を示す動物モデルを使用する。物質の投与後、動物に代謝性疾病あるいは免疫系疾病の少なくとも１つの症状の改善が見られるのであれば、上記物質には代謝性疾病あるいは免疫系疾病の上記症状に対する予防上あるいは治療上の効果があることが示される。例えば、上記改善には、体重減少、インスリン抵抗性の減少、あるいは慢性炎症の減少が含まれる。一例では、物質の投与後、純粋隔離群動物の肥満モデルに、体重減少、脂肪減少、血液脂質の減少、インスリン抵抗性の改善、血清リポ多糖結合タンパク質の濃度の減少、レプチン抵抗性の減少、炎症の血清中濃度の減少、あるいは炎症因子の発現レベルの減少、が１つ以上現れると、上記物質には、代謝性疾病あるいは免疫系疾病の上記症状に対する予防上あるいは治療上の効果があることが示される。

上記した物質は食用に適したものであってもよい。例えば、上記物質は、限定はされないが、食品、レシピ、形成物、化合物、複合物、薬品、栄養剤、ヘルスケア製品、あるいは飲料を含んでいてもよい。

以下の実施例は、本願の代表的方法についての実施及び特性を図示するものである。これらの実施例は、本願の範囲を限定することを意図するものではない。

（実施例１）
＜物質及び動物モデル＞
オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（無菌）を実施例の動物として使用した。エンテロバクター・クロアカエＢ２９を実施例の播種用微生物として使用した。エンテロバクター・クロアカエＢ２９は、病的肥満の患者ボランティアの糞便から単離された上位株に属する。１６ｓＲＮＡ遺伝子の配列の分析及びバイオケミカルアッセイは、上記バクテリアをエンテロバクター・クロアカエとして同定した。

２４匹の健康なオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（無菌）は、リサーチダイエット社（ニューブランズウイック、ニュージャージ州）から購入し、通常の食餌（ＮＣＤ、脂肪含有量４．６２％、３．４５ｋｃａｌ／ｇ）または高脂質の食餌（ＨＦＤ、脂肪含有量３４．９％、５．２１ｋｃａｌ／ｇ）を与えた。

マウスにおける処置手順は次の通りである。マウスは、２２±３℃にて１２時間の点灯周期（午前６時３０分に点灯開始）にて維持した。６〜１０週経過の無菌のマウスを、ランダムに４つのグループに分配し、以下の処置を行った。（１）ＮＣＤ＋ＬＢグループ：このグループには、０．１ｍｌの無菌ＬＢ培地を強制飼養により播種し、及びＮＣＤを与えた。（２）ＮＣＤ＋Ｂ２９グループ：このグループには、０．１ｍｌの無菌ＬＢ培地中にＢ２９（１０^２細胞）を懸濁したものを強制飼養により播種し、及びＮＣＤを与えた。（３）ＨＦＤ＋ＬＢグループ：このグループには、０．１ｍｌの無菌ＬＢ培地を強制飼養により播種し、及びＨＦＤを与えた。（４）ＨＦＤ＋Ｂ２９グループ：このグループには、０．１ｍｌの無菌ＬＢ培地中にＢ２９（１０^２細胞）を懸濁したものを強制飼養により播種し、及びＨＦＤを与えた。実験は１６週で終了した。マウスを、純粋隔離群・アイソレーター内の３または４のケージ内で飼育し、各マウスの体重を週毎に測定した。動物の各グループを、安楽死させるまで、殺菌した餌と殺菌した水をと与えた各々のアイソレーターに収容し、純粋隔離群・アイソレーターの定期的な細菌検査によって細菌汚染の監視を実施した。

実験中、マウスの、体重、脂肪パッドの重量、インスリン感度、及び炎症レベルを観測した。

（実施例２）
＜エンテロバクター・クロアカエＢ２９の単離及び特徴付け＞
肥満の集団の分析により、多数の肥満患者は腸管微生物叢における著しいアンバランスを被っていることが明らかになった。例えば、病的肥満のボランティア（２６歳、男性、漢民族、体重１７４．９ｋｇ、ＢＭＩ５８．７８％ｋｇ／ｍ^２）では、腸内細菌全体の３５％がエンテロバクターであることが判明した（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ライブラリを通じて検定した）。その間、物理的実験により、上記ボランティアは、重篤なメタボリックシンドロームを発症していることがわかった。上記ボランティアに対して２３週間の食事介入（組成：精白していない穀物、漢方薬、及びプレバイオティックス）を実施したところ、彼は、９週間後に３０．１ｋｇ体重が減少し、２３週間後には１７４．８ｋｇのうちの５１．４ｋｇ体重が減少し、メタボリックシンドロームの全ての測定において改善が見られた。腸内細菌集団の分析により、エンテロバクターの集団が上記治療食にて９週間後に１．８％まで減少し、２３週トライアルＡの終わりには検出されなくなる、ことが明らかになった。エンテロバクター系統を上記ボランティアの糞便から、３７℃にてＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ、製法は後述する）を用いた「シーケンス先導単離（sequence-guided-isolation）」によって単離し、この上なく十分な量の単離を得て、そしてそれをＢ２９と命名した。Ｂ２９の１６ＳｒＲＮＡについて全長シーケンス分析が実施され、Ｂ２９は、エンテロバクター・クロアカエ（ジーンバンク登録番号ＡＢ２４４４５７）の９９％相同であることが判明した。ＶＩＴＥＫ２グラム陰性コード（ＧＮコード、ビオメリュー、マーシーレトワール、フランス）を用いた生化学的テストも、Ｂ２９がエンテロバクター・クロアカエに属する可能性が９８％であることを示した（表１参照）。

Ｂ２９からリポ多糖（ＬＰＳ）を、ＬＰＳ単離キット（ｉＮｔＲＯＮバイオテクノロジー社、ソウル、韓国）を用いて単離し、エンドトキシン活性レベルを、エンドトキシン活性アッセイキットＬＡＬ（ＡＣＣ、米国）を用いて測定した。その結果、Ｂ２９のエンドトキシン活性は、４．４５×１０６ＥＵｍｇ−１ ＬＰＳであり、これは、大腸菌０５５系統：Ｂ５に匹敵するものである。

エンテロバクター・クロアカエＢ２９特異的検出を実施するため、５００μｇ／ｍｌのリファンピシンに耐性のあるＢ２９系統を、リファンピシン耐性系統スクリーニング方法を用いて、単離した。この系統をＬＢ培地に播種し、３７℃にて１２時間撹拌し、その後、結果として生じた細菌培地を動物モデルの作製に使用した。

上記ＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）の調合は次の通りである。トリプトンを１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物を５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌを１０ｇ／Ｌ用いて、Ｐｈ７．４とした。ＬＢ固形培地は、１５グラムのアガロースを１Ｌ液体のＬＢ培地に加え、加熱溶解し、その後、この培地を冷却前にプレートに注いだ。

表１は、ＶＩＴＥＫ２ＩＤ−ＧＮシステムを用いたエンクロバクター・クロアカエＢ２９の生化学的特徴を示すものである。

（実施例３）
＜無菌マウスの内臓におけるＢ２９の安定したコロニー形成（細菌叢）＞
実験の間、真新しい 糞便試料を２週間毎に採取し、即時に計量し、無菌の０．０１ＭのＰＢＳにて１：１０に希釈した。ＰＢＳバッファは、以下の調合である。１３５ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、及び８ｍＭのＫ２ＨＰＯ４を用い、ｐＨ７．２とした。１００μｌの懸濁液を用いて、ＢＬプレートに播き、１６時間３７℃にて培養し、コロニーをカウントした。その結果、実験期間（０〜１６週）では、モデルマウス（すなわち、ＨＤＦ＋Ｂ２９）及びＮＣＤ＋Ｂ２９マウスは全て、湿った糞便１グラムあたりエンテロバクター・クロアカエＢ２９を１０^１０〜１０^１２の密度で含む糞便を排出した。この結果から、エンテロバクター・クロアカエＢ２９は、１回の播種の後、無菌マウスの腸管に安定したコロニー形成が可能であることがわかる。

（実施例４）
＜高脂肪食餌を与えたマウスにおいて肥満症及びインスリン抵抗性を誘発する２９系統＞
実験の間、各マウスの体重を、電子天秤を用いて１週間に１回、正確に測定した。１６週において、マウスに５時間の絶食後にグルコース（２ｇ／ｋｇ体重）を経口投与した。グルコース投与の直前（０分）、グルコースを投与してから１５、３０、６０、及び１２０分後に、尾静脈から採血し、即座にロッシュ・ブラッド・グルコース・メータにより血糖値を測定した。これらのデータポイントを血糖負荷試験を見積もるのに用いた。グルコース投与の１２０分後、５０μｌの血液を眼窩後静脈から採取し、室温にて１時間安置し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して血清を収集した。その後、ＥＬＩＳＡ （Ｍｅｒｃｏｄｉａ、ウプサラ、スウェーデン）により血液インスリン濃度を測定した。このデータポイントは、食餌を与えた後の２時間のインスリン濃度を表わす。１６週の終わりに、以下の手順にてマウスを解剖した。まず、各グループの２匹の代表的なマウスにおいて、マーカーとしての定規と一緒に開腹の写真を撮り、続いて、各グループのマウスから、精巣上体の脂肪パッド、腸間膜の脂肪パッド、鼠径部の皮下脂肪パッド、及び腎周囲の脂肪パッドを採取し、正確に計量した。統計的学分析を実施し、結果を、統計学的に有意な分析のために分散のシングル因子分析法（ポストＨｏｃ）を用いて、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍにて示した（シチメンチョウの多重比較テスト、ＳＰＳＳ１７．０）。結果を図２に示す。

結果により、高脂肪食餌を与えられ、かつ、エンテロバクター・クロアカエＢ２９の播種を受けたモデルマウスは、他のコントロールグループと比較して体重が有意に大きいことが示された。１６週の終わりに、モデルマウスにより、極めて明らか肥満の表現型が実証された。さらに、精巣上体の脂肪パッド、腸間膜の脂肪パッド、鼠径部の皮下脂肪パッド、及び腎周囲の脂肪パッドによる結果により、高脂肪食餌を与えられ、かつ、エンテロバクター・クロアカエＢ２９の播種を受けたモデルマウスには、マウスのボディの主要な脂肪パッドにおいて極めて有意な重量増加があることが実証された。腹腔解剖写真により、モデルマウスのグループの体重及び腹腔の脂肪蓄積は、明らかに他のグループのものよりも大きいことが実証された。最後に、モデルグループのマウスの糖耐性は、他のグループのものよりも顕著に有意に低い。ところが、食餌を与えて２時間後のインスリンレベルについて、モデルグループは、他のコントロールグループと比較して有意に高い。

（実施例４）
＜高脂肪食餌を与えたマウスの炎症レベルにおけるエンテロバクター・クロアカエＢ２９の効果＞
高脂肪食餌を与えたマウスの炎症のレベルにおけるエンテロバクター・クロアカエＢ２９の効果を実証するために、血清リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）の、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）タンパク質の、及びアディポネクチンの濃度を測定した。肝臓、精巣上体の脂肪パッド、及び空腸組織における炎症性因子の遺伝子発現レベルを、定量的に決定した。その結果を図３に示す。

正常な食餌を与えたマウスの腸管内のＢ２９の数は全ての他のグループのものをはるかに超えるにもかかわらず、肥満モデルマウスの（ＨＦＤ＋Ｂ２９）のＬＢＰレベルは、他のグループのものよりも有意に高かった。ゆえに、Ｂ２９は、ＬＰＳ産生菌のみであり、モデルマウスの血清中のエンドトキシンレベルの有意な増加は、Ｂ２９に由来のみである可能性がある。血清におけるエンドトキシンレベルの有意な増加は、結果的に全身性炎症となる。言い換えると、インスリン抵抗性及び他の代謝性疾病の症状を引き起こす。肥満モデルマウスは、ＳＡＡレベルの有意な増加、及びアディポネクチンレベルの有意な減少を示し、全身性炎症の有意な増加が確認された。肝臓、精巣上体の脂肪パッド、空腸組織における炎症性因子の遺伝子発現レベルの結果により、肥満モデルマウスは、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＫＫ−ε、及びＴＬＲ４について、最も高い発現レベルを有していることが示された。

よって、本願に基づき作り出した肥満モデルマウスにおいて、血清ＬＢＰレベル及び血清ＳＡＡレベルが、３つのコントロールグループと比較して有意に増加し、アディポネクチンレベルが、３つのコントロールグループと比較して有意に減少し、炎症誘発性遺伝子の局所的組織発現レベルが、３つのコントロールグループと比較して有意に増加した。

本書での使用において、単数で記載していても、特別な断りがない限り、複数についての言及を含むものとする。定義されていない限り、本明細書で使用の全ての技術的及び科学的用語は、通常の当業者の誰もが一般に理解しているものと同じ意味である。本開示内容に記載された実施形態が、先行発明の効力によってこのような開示に先行する権利が無いということの導入として、本開示が解釈されるべきではない。本書での使用において、文言「構成する」は、「含む」を意味し、限定を意味するものではない。

さらに、本開示の特徴あるいは態様は、マーカッシュ群の表現にて記載されており、当業者であれば、本発明の開示内容が、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーあるいはメンバーのサブグループの表現によっても記載され得ることは、理解できるものである。

当業者には理解されていることであるが、任意の及び全ての目的のために、この様な明細書を提供するという観点から、明細書に開示の全ての範囲は、任意の及び全ての考え得る部分的範囲、及びそれらの部分的範囲の組み合わせをも包含する。記載の範囲はいずれも、同じ範囲の少なくとも等値、１／２、１／３、１／４、１／５、１／１０等への分割が、十分に記載され及び十分に可能になっているものとして、容易に認識され得る。非限定的例示のように、本明細書に記載の各範囲は、下の１／３、中間の１／３、上の１／３等に容易に分けることが可能である。また、当業者には理解されていることであるが、「最大」、「少なくとも」等と言った全ての文言は、列挙された数字を含み、また、上記のように後に部分的範囲に分割することが可能な範囲について言及するものである。最後に、当業者には理解されていることであるが、範囲は、個々の構成要素を含んでいる。従って、例えば、１〜３の細胞を有する１つのグループとは、１、２、または３の細胞を有するグループについて言及するものである。同様に、１〜５の細胞を有する１つのグループとは、１、２、３、４または５の細胞を有するグループについて言及するものでありで、以下同様である。

上記内容から、本開示の様々な実施形態が例示の目的で本明細書に記載されていること、さらに、様々な修正が本開示の範囲及び精神から逸脱することなく成されてもよいことが、正しく理解されるであろう。それゆえ、本明細書に開示された様々な実施形態は、限定の意図はなく、特許請求の範囲にて示唆される真の範囲と精神とを伴うものである。

高脂肪食餌を与えた無菌マウスの腸管にて単離されたＢ２９の細菌叢を表わすグラフであり、エンテロバクターｓｐ．Ｂ２９の集団レベルについて肥満マウスのエンテロバクター付随純粋隔離群モデルとコントロールマウスとを比較したものである。 ａ〜ｅは、それぞれ、高脂肪食餌を与えた無菌マウスの肥満症及びインスリン抵抗性の症状に対するＢ２９の効果を示す図である。 ａ〜ｆは、それぞれ、高脂肪食餌を与えた無菌マウスの炎症のレベルにおけるＢ２９の効果を示すグラフである。

Claims (44)

1. 非ヒト肥満動物モデルであり、その腸管微生物叢集団は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する少なくとも１つの細菌を含み、前記１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列は、配列番号１と７５％以上一致することを特徴とする非ヒト肥満動物モデル。
2. 前記細菌は、エンドトキシン産生菌であることを特徴とする請求項１に記載の非ヒト肥満動物モデル。
3. 前記細菌は、エンテロバクターであることを特徴とする請求項１に記載の非ヒト肥満動物モデル。
4. 前記細菌は、エンテロバクター・クロアカエであることを特徴とする請求項１に記載の非ヒト肥満動物モデル。
5. 前記１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列は、配列番号１と９５％以上一致することを特徴とする請求項１に記載の非ヒト肥満動物モデル。
6. 前記１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列は、配列番号１と８５％以上一致することを特徴とする請求項１に記載の非ヒト肥満動物モデル。
7. 前記非ヒト肥満動物モデルは、マウス、ラット、ギニーピッグ、ピッグ、ラビット、あるいはモンキーであることを特徴とする請求項１に記載の非ヒト肥満動物モデル。
8. 肥満動物モデルを作製する方法であって、
   無菌動物に配列番号１と７５％以上一致する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌を播種し、播種された動物を用意する工程と、
   前記播種された動物に５％以上の含有量の脂肪を含む食餌を一定期間与え、肥満動物モデルを用意する工程と、を含むことを特徴とする方法。
9. 前記肥満動物モデルは、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する少なくとも１つの細菌を含む腸管微生物叢集団を有し、当該１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列は、配列番号１と７５％以上一致することを特徴とする請求項８に記載の方法。
10. 前記肥満動物モデルは、メタボリックシンドロームを現すことを特徴とする請求項８に記載の方法。
11. 前記メタボリックシンドロームは、肥満症、インスリン抵抗性、慢性炎症、あるいは、それらの合併症であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
12. 前記細菌は、エンドトキシン産生菌であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
13. 前記細菌は、エンテロバクターであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
14. 前記細菌は、エンテロバクター・クロアカエであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
15. 前記１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列は、配列番号１と９５％以上一致することを特徴とする請求項８に記載の方法。
16. 前記非ヒト肥満動物モデルは、マウス、ラット、ギニーピッグ、ピッグ、ラビット、あるいはモンキーであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
17. 前記一定期間は、４週間であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
18. 前記無菌動物に、胃内投与、局所投与、経口投与、あるいはこれらの組み合わせにて、前記播種を実施することを特徴とする請求項８に記載の方法。
19. 無菌動物への前記播種は、無菌動物への少なくとも１０^２細菌細胞の播種を含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
20. 前記食餌は、脂肪含有量が２０％以上であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
21. 前記食餌は、脂肪含有量が１０％以上であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
22. 前記食餌は、１グラム当たり４．５ｋｃａｌ以上に構成されていることを特徴とする請求項８の方法。
23. 肥満動物モデルを作製する方法であって、
    無菌動物にエンドトキシン産生菌を播種し、播種された動物を用意する工程と、
    播種された動物に５％以上の含有量の脂肪を含む食餌を一定期間与え、肥満動物モデルを用意する工程と、を含み、前記肥満動物モデルは１以上のメタボリックシンドロームを現すことを特徴とする方法。
24. 前記エンドトキシン産生菌は、エンテロバクター・クロアカエの細菌を含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
25. 前記エンドトキシン産生菌は、エンテロバクターの細菌を含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
26. 前記エンドトキシン産生菌は、エンテロバクテリアセエの細菌を含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
27. 前記エンドトキシン産生菌は、γプロテオバクテリアの細菌を含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
28. 前記エンドトキシン産生菌は、プロテオバクテリアの細菌を含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
29. 前記エンドトキシン産生菌は、グラム陰性菌の細菌を含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
30. 前記エンドトキシン産生菌は、前記無菌動物の腸管にコロニー形成が可能なことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
31. 前記エンドトキシン産生菌は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を備え、当該１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列は、配列番号１と７５％以上一致することを特徴とする請求項２３に記載の方法。
32. 前記肥満動物モデルは、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する少なくとも１つの細菌を含む腸管微生物叢集団を有し、当該１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列は、配列番号１と７５％以上一致することを特徴とする請求項２３に記載の方法。
33. 化合物をスクリーニングする方法であって、
    テスト肥満動物モデル及びコントロール肥満動物モデルを用意する工程と、
    前記テスト肥満動物モデル及び前記コントロール肥満動物モデルの両方に５％以上の含有量の脂肪を含む食餌を一定期間与えながら、当該一定期間に前記テスト肥満動物モデルに化合物を与える工程と、
    前記テスト肥満動物モデル及び前記コントロール肥満動物モデルの、体重増加、エンドトキシン・バイオマーカーの血清中濃度の変化、あるいはその両方を測定する工程と、を含み、
    前記テスト肥満動物モデル及び前記コントロール肥満動物モデルは両方とも１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する少なくとも１つの細菌を含む腸管微生物叢集団を有し、当該１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列は、配列番号１と７５％以上一致し、
    前記テスト肥満動物モデルの体重増加は前記コントロール肥満動物モデルの体重増加よりも統計学的に有意に少ないことにより、あるいは、前記テスト肥満動物モデルのエンドトキシン・バイオマーカーの血清中濃度の変化は統計学的にわずかである一方、前記コントロール肥満動物モデルのエンドトキシン・バイオマーカーの血清中濃度の変化は統計学的に有意であることにより、あるいは、その両方により、前記化合物がメタボリックシンドロームの抑制に効果的であることが示される、ことを特徴とする方法。
34. 前記化合物は、食品または薬品であることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
35. エンドトキシン・バイオマーカーは、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、あるいはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする請求項３３に記載の方法。
36. 前記メタボリックシンドロームは、体重増加、肥満症、インスリン抵抗性、慢性炎症、あるいはこれらの合併症であることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
37. 肥満抑制菌をスクリーニングする方法であって、
    テスト肥満動物モデル及びコントロール肥満動物モデルを用意する工程と、
    前記テスト肥満動物モデルにテスト細菌を播種し、播種されたテスト肥満動物モデルを用意する工程と、
    前記播種されたテスト肥満動物モデル及び前記コントロール肥満動物モデルの両方に５％以上の含有量の脂肪を含む食餌を一定期間与える工程と、
    前記播種されたテスト肥満動物モデル及び前記コントロール肥満動物モデルの、体重増加、エンドトキシン・バイオマーカーの血清中濃度の変化、あるいはその両方を測定する工程と、を含み、
    前記テスト肥満動物モデル及び前記コントロール肥満動物モデルは両方とも１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する少なくとも１つの細菌を含む腸管微生物叢集団を有し、当該１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列は、配列番号１と７５％以上一致し、
    前記播種されたテスト肥満動物モデルの体重増加は前記コントロール肥満動物モデルの体重増加よりも統計学的に有意に少ないことにより、あるいは、前記播種されたテスト肥満動物モデルのエンドトキシン・バイオマーカーの血清中濃度の変化は統計学的にわずかである一方、前記コントロール肥満動物モデルのエンドトキシン・バイオマーカーの血清中濃度の変化は統計学的に有意であることにより、あるいは、その両方により、前記テスト細菌がメタボリックシンドロームの抑制に効果的であることが示される、ことを特徴とする方法。
38. 前記エンドトキシン・バイオマーカーは、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、あるいはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
39. 前記細菌は、被検体の腸内細菌から単離したものを含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
40. 前記被検体がヒトであることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
41. 前記メタボリックシンドロームは、体重増加、肥満症、インスリン抵抗性、慢性炎症、あるいはこれらの合併症であることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
42. 肥満原因菌をスクリーニングする方法であって、
    無菌動物にテスト細菌を播種しテスト動物を用意する工程と、
    前記テスト動物及びコントロール肥満動物モデルの両方に５％以上の含有量の脂肪を含む食餌を一定期間与える工程と、
    前記テスト動物及び前記コントロール肥満動物モデルの、体重増加、エンドトキシン・バイオマーカーの血清中濃度の変化、あるいはその両方を測定する工程と、を含み、
    前記コントロール肥満動物モデルは１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する少なくとも１つの細菌を含む腸管微生物叢集団を有し、前記１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列は、配列番号１と７５％以上一致し、
    前記テスト動物の体重増加は、前記コントロール肥満動物モデルの体重増加と少なくとも統計学的に同等であることにより、あるいは、前記テスト動物のエンドトキシン・バイオマーカーの血清中濃度の変化は、前記コントロール肥満動物モデルのエンドトキシン・バイオマーカーの血清中濃度の変化と少なくとも統計学的に同等であることにより、あるいは、その両方により、前記テスト細菌がメタボリックシンドロームの発生を助長していることが示される、ことを特徴とする方法。
43. 前記エンドトキシン・バイオマーカーは、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、あるいはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする請求項４２に記載の方法。
44. 前記メタボリックシンドロームは、体重増加、肥満症、インスリン抵抗性、慢性炎症、あるいはこれらの合併症であることを特徴とする請求項４２に記載の方法。

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