KR101889753B1 - 지방이상증 동물모델과 그 제작방법 및 이를 이용한 지방이상증 치료제의 스크리닝 방법 - Google Patents

지방이상증 동물모델과 그 제작방법 및 이를 이용한 지방이상증 치료제의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 지방이상증의 진행 및 병리학적 기전의 연구에 유용한 동물모델; 상기 동물 모델의 제조방법; 및 상기 동물 모델을 이용한 지방이상증 예방 및 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 동물모델을 이용하여 지방이상증 조절물질을 선별함으로써, 그 치료효과를 검증하는 스크리닝에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

지방이상증 동물모델과 그 제작방법 및 이를 이용한 지방이상증 치료제의 스크리닝 방법{Animal model for lipodystrophy, preparation method thereof, and screening method for lipodystrophy therapeutic agent using the same}
본 발명은 지방이상증 동물모델과 그 제조방법에 관한 것이며, 더 나아가 상기 동물모델을 이용하여 지방이상증 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
스핑고지질은 다른 지질대사체와는 달리 염증과 여러 사이토카인에 의해 생합성이 조절되며 비만 및 당뇨병 동물모델의 여러 조직에서 증가되는 것이 보고되고 있다(비특허문헌 1). 또한 스핑고 지질의 생합성 기질인 지방산의 농도에 의해 세포내 농도가 조절되기 때문에 비만에 의해 증가된 혈중 지방산의 농도에 민감하게 조절된다(비특허문헌 2). 특히 스핑고지질의 역할은 비만에 유발되는 대사질환 병리에 관한 연구에서 규명되고 있으며 동맥경화, 당뇨병, 심근병증의 발병에 관여함이 알려져 있다. 유전적 변이동물 모델과 스핑고 생합성 저해제를 사용한 약리학적 연구로 그 치료효능과 그 기전이 규명되고 있다.
스핑고지질의 생합성은 세린 팔미토일트랜스페라제(serine palmitoyltransferase, SPT)에 의해 전구체인 지방산 CoA 중 하나인 팔미토일 CoA(palmitoyl CoA, C16:0)와 세린(serine)의 축합과정으로 3-키토스핑가닌(3-ketosphinganine)의 생성으로부터 시작한다. SPT는 SPTLC1과 SPTLC2의 단위체(subunit)로 구성되며 스핑고 지질 생합성을 조절하는 주요단계의 효소로 알려져 있다(비특허문헌 3).
세라마이드 생합성을 억제하기 위한 약리적인 연구로, 세라마이드 생합성과 관련한 효소인 스핑고마이엘리나제(sphingomyelinase), 세린 팔미토일트랜스페라제, 3-케토스핑가닌 환원효소(3-ketosphinganine reductase), 세라마이드 합성효소(ceramide synthase) 및 다이하이드로세라마이드 불포화효소(dihydroceramide desaturase) 중에서 최소한 하나의 효소를 억제하는 화합물에 대한 연구가 진행되었다(특허문헌 1-2).
미국 특허공개 제2005-0182020호(2005.08.18) 미국 특허공개 제2010-0086543호(2010.04.08)
Merrill, A.H.,Jr.(2002) De novo sphingolipid biosynthesis: a necessary, but dangerous, pathway. J Bio Chem. 277, 25843-25846 Kuller, L.H. (2006) Nutrition, lipids, and cardiovascular disease, Nutr Rev. 64, S15-26 Hanada, K. (2003) serine palmitoyltransferase, a key enzyme of sphingolipid metabolism. Biochem Biophys Acta. 1632, 16-30. The Journal of Biological Chemistry, 280, 10284-10289.March 18, 2005. Xian-Cheng Jiang
본 발명은 지방이상증의 진행 및 병리학적 기전의 연구에 유용한 동물모델을 제공하고자 하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 상기 동물 모델의 제조방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 동물 모델을 이용한 지방이상증 예방 및 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 태양에 따라, 지방세포 특이적 SPTLC2 유전자가 결손(knock-out)된 마우스인 것을 특징으로 하는 지방이상증 동물모델이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 마우스가 동형접합체(homozygote)인 것을 특징으로 하는 지방이상증 동물모델일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 지방이상증이 지방간, 전신성 인슐린저항성 및 고중성지방증으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 지방이상증 동물모델일 수 있다.
본 발명의 일 태양에 따라, (a) 플록스트(floxed) SPTLC2 마우스 및 아디포넥틴-Cre 이식유전자를 가진 마우스를 준비하는 단계; (b) 플록스트 SPTLC2 마우스 및 아디포넥틴-Cre 이식유전자를 가진 마우스를 교배하여 2세대 마우스를 얻는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 얻은 상기 2세대 마우스로부터 지방세포 특이적 SPTLC2 유전자 결손 마우스를 선별하는 단계를 포함하는 SPTLC2 exon1이 제거된 지방이상증 동물모델의 제작방법이 제공된다.
본 발명의 일 태양에 따라, (i) 지방이상증 동물모델에 시료를 투여하는 단계; (ii) 시료 투여 후 상기 동물모델의 지방이상증의 증상을 측정하는 단계; 및 (iii) 상기 시료를 투여하지 않은 대조군과 비교하여 지방이상증의 증상을 개선시키는 시료를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 지방이상증 예방 및 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 단계 (ii)의 지방이상증의 증상이 부고환 WAT의 세라마이드, 스핑고마이엘린, 스핑고이드 염기 및 다이아실글리세롤의 함량; 혈장의 세라마이드, 다이하이드로 세라마이드, 스핑고마이엘린 및 스핑고이드염기 함량; 간 콜레스테롤 또는 간 트리글리세라이드(TG)의 함량, TG 생합성 유전자 또는 지방산 산화 유전자의 발현; 간의 세라마이드, 스핑고마이엘린, 스핑고이드 염기 및 다이아실글리세라이드의 함량; 및 골격근의 지방 합성 유전자의 발현으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법일 수 있다.
본 발명에 따른 동물모델은 지방세포 특이적인 SPTLC2 유전자 결손으로 동형접합체(homozygote)인 것을 특징으로 하며, 지방간, 전신성 인슐린저항성 및 고중성지방증으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 지방이상증 동물모델이다. 본 발명의 동물모델은 부고환 WAT에서 지방세포화유전자의 하향조절, C18:1 스핑고마이엘린의 감소, C16:0 및 C24:1 세라마이드의 상승, 스핑가닌 상승, 스핑고신 상승, S1P 감소; 간에서 지방 합성 유전자의 상향조절, C24:0 및 C24:1 세라마이드의 감소, DAG 레벨 상승; 혈장 포도당 레벨 상승, 콜레스테롤 레벨 상승, HMG CoR의 상향조절, 비에스테르화된 FA 레벨 감소, 베타-하이드록시 부틸레이트로 대표되는 케톤체 증가라는 지방이상증의 증상을 나타냄을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 동물모델은 지방이상증의 진행 경과와 병리학적 기전 연구의 동물모델로 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 지방이상증 동물모델을 이용하여 지방이상증 조절물질을 선별함으로써, 그 치료효과를 검증하는 스크리닝에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 분화의 일수(Day of differentiation)에 따른 '고지방혈증 상태는 고지방식이(HFD)를 섭식시킨 마우스의 지방조직에서 및 분화하는 3T3-L1 지방세포에서 스핑고리피드 신생합성을 전사시에 활성화시킨다'는 것을 나타낸다. 야생형(WT) C57BL/6 마우스에게 고지방식이(HFD)(60 kcal % 지방)를 8주 동안 섭취시켰고, 부고환의 백색지방조직(white adipose tissue, WAT)을 분리하였다. qRT-PCR 분석을 위해서 mRNA를 추출하였고(A), 조직 용해물들은 SPTLC1, SPTLC2 및 SPHK1에 대해 면역블로팅법으로 분석하였다(B). 데이타는 평균±SEM(*p < 0.05, n=6)로 나타냈다. 3T3-L1 세포를 7일 동안 분화시켰고 정해진 날(D0, D2, D4, D5 및 D7)에 수확하였다. 스핑고리피드 생합성 유전자의 발현을 측정하기 위해서 qRT-PCR을 하였다(C, E). 세포 용해물들은 SPTLC1, SPTLC2, 및 SPHK1에 대해 면역블로팅법으로 분석하였다(E)(평균±SEM, *p < 0.05 [3T3-L1 대조군의 D0 대비], n=3).
도 2는 분화의 일수(Day of differentiation)에 따른 aCer1/2/3(alkaline ceramidase1/2/3)(A-C), AcCer(acid ceramidase)(D) 및 nCer(neutral ceramidase)(E)의 발현을 나타낸다. 3T3-L1 세포를 7일 동안 분화시켰고 지정된 날(D0, D2, D4, D5 및 D7)에 수확했다. mRNA 발현을 측정하기 위해서 qRT-PCR를 수행하였다(평균±SEM, *p < 0.05 [3T3-L1 대조군의 D0 대비], n=3).
도 3은 'SPTLC2의 억제는 지방 축적을 감소시키고 비만유전자를 하향조절한다' 는 것을 나타낸다. SPTLC2가 특이적으로 제거된 안정적인 3T3-L1 균주(shRNA-SPTLC2)를 렌티바이러스를 사용하여 제작하였다. shRNA-SPTLC2 세포는 SPTLC2 단백질 및 mRNA를 감소시켰다(A). 3T3-L1 세포가 분화하는 동안, SPTLC2의 발현은 대조군 및 SPTLC2-억제된 세포에서 감소되었다(B). 지방 축적은 실시예에 기재된 바와 같이 아디포레드 어세이(AdipoRed Assay)를 사용하여 측정하였다(C). 3T3-L1 대조군 세포 및 SPTLC2를 억제시킨 세포를 분화시켜, 분화의 일수(Day of differentiation)에 따른 SPHK1/2, aP2, C/EBPα, PPARγ, PEPCK, SREBP-1c 및 GLUT4의 발현을 측정하기 위하여 qRT-PCR 분석을 수행하였다(D, E)(평균±SEM, *p < 0.05 [대조군의 D0 대비], #p < 0.05 [각 날짜의 대조군 대비], §p < 0.05 [shRNA-SPTLC2 세포의 D0 대비], n=3).
도 4는 '지방 세포 특이적인 SPTLC2를 제거한(aSPTLC2 KO) 마우스에서는 지방이상증이 발생했다' 는 것을 나타낸다. 다수 조직들을 aSPTLC2 KO 마우스로부터 분리하였고, SPTLC2의 발현을 면역블로팅법으로 검사하였다(A). 마우스는 고지방식이(HFD)(45 kcal % 지방, 8 주 동안)를 섭식시켰고 지방 조직 크기를 측정하였다(B). 기준자는 1 cm를 나타낸다. 부고환의 WAT(white adipose tissue) 조직 단면을 헤마톡실린과 에오신(H&E) 또는 F4/80 항체로 염색하였다(C). 부고환의 WAT(white adipose tissue)를 분리하여 지방생성유전자의 발현을 qRT-PCR로 측정하였다(D) (평균±SEM, *p < 0.05 [플록스트 마우스 대비], n=5). 세라마이드, 스핑고마이엘린(SM)(E), 스핑고이드 염기 및 다이아실글리세롤(diacylglycerol, DAG)(F)에 대한 분석은 LC-MS/MS로 수행하였다(평균±SEM, *p < 0.05 [플록스트 마우스 대비], n=5-6).
도 5는 '혈장 스핑고리피드 프로파일'을 나타낸다. 마우스에 정상 음식식이(NCD) 또는 고지방식이(HFD, 45 kcal % 지방)를 8주 동안 섭식시킨 후, 혈장 샘플을 채취하였다. 세라마이드(Ceramide, A), 다이하이드로 세라마이드(dihydroceramide, B), 스핑고마이엘린(sphingomyelin, C), 스핑고이드염기(sphingoid bases, D)를 LC/MS/MS를 사용하여 분석하였다(평균±SEM. *p < 0.05 [정상 음식식이를 섭취시킨 플록스트 마우스 대비], #p < 0.05 [고지방식이를 섭취시킨 플록스트 마우스 대비], n=5-6).
도 6은 'aSPTLC2 KO 마우스에서는 지방간이 발생했다' 는 것을 나타낸다. 플록스트 마우스와 aSPTLC2 KO 마우스에게 8주 동안 정상 음식식이(NCD) 또는 고지방식이(HFD)(45 kcal % 지방)를 섭식시켰다. 마우스의 간을 분리하여, 간에서 지방 적을 확인하기 위해서 얼린 단면을 오일 레드 오(Oil Red O, ORO)로 염색하였다(A). 기준자는 100 μm를 나타낸다. 간 콜레스테롤 및 트리글리세라이드(triglyceride, TG)(B)를 측정하였다. TG(triglyceride) 생합성 유전자(C) 및 지방산(fatty acid, FA) 산화 유전자(D)의 발현을 qRT-PCR로 측정하였다. 세라마이드, SM(E), 스핑고이드 염기 및 다이아실글리세라이드 (diacylglycerol, DAG)(F)에 대한 분석은 LC-MS/MS로 수행하였다(평균±SEM, *p < 0.05 [정상 음식식이(NCD)를 섭식시킨 플록스트 마우스 대비], #p < 0.05 [고지방식이(HFD)를 섭식시킨 플록스트 마우스 대비], n=5-6).
도 7은 정상 음식식이(NCD) 또는 고지방식이(HFD)를 섭취시킨 후 쥐의 골격근에서 지방을 합성시키는 유전자의 발현을 나타낸다. 플록스트 및 aSPTLC2 KO 마우스에게 고지방식이(45 kcal % fat)를 8주 동안 섭취시킨 후 근육조직을 분리하였다. 지방 생합성 유전자의 발현을 조사하기 위하여 정량적 RT-PCR 분석을 수행하였다(평균±SEM, *p < 0.05 [정상 음식식이를 섭취시킨 플록스트 마우스 대비], n=5-6).
도 8은 'aSPTLC2 KO 마우스는 고지방식이(HFD)로 유발되는 비만에 저항성을 가지지만 인슐린저항성을 발생시킨다' 는 것을 나타낸다. 플록스트 및 aSPTLC2 KO 마우스는 정상 음식식이(NCD)와 고지방식이(HFD)(60 kcal % 지방) 를 6 주 동안 섭식시켰다. 4 주 동안, 플록스트 및 aSPTLC2 KO 마우스의 체중(A) 및 체지방조성(B)을 매주 1H NMR을 이용하여 분석하였다(평균±SEM, *p < 0.05 [정상 음식식이(NCD)를 섭식시킨 플록스트 마우스 대비], #p < 0.05 [정상 음식식이(NCD)를 섭식시킨 aSPTLC2 KO 마우스 대비], n=10-14). 포도당 주입속도(GIR), 간 포도당 생성(HGP) 억제(C), 기저 간 포도당 생성(BHGP), 및 클램프하는 동안의 간 포도당 생성(CHGP)(D)을 측정하기 위해서 고인슐린혈증 정상혈당 클램프를 수행하였다. 독립적으로, 플록스트 및 aSPTLC2 KO 마우스에게 인슐린을 복강내로 투여하였다(0.5 unit/kg 체중). 간(E) 및 피하 지방조직(F)을 인슐린 주사 10 분 후에 분리하였고, pAKT 레벨을 측정하기 위해서 면역블랏(immunoblot) 분석을 수행하였다(평균±SEM, *p < 0.05 [고지방식이를 섭식시킨 플록스트 마우스 대비], n=10-14, 체중[Body weight], 지방량[Fat mass], 지방제외체질량[Lean body mass]).
도 9는 플록스트 및 aSPTLC2 KO 마우스의 음식 섭취량을 나타낸다. 정상 음식식이(NCD) 또는 고지방식이(HFD, 60 kcal % fat)를 섭취시키는 동안, 4주 동안 매주 음식 섭취량을 측정하였다(평균±SEM, n=10-14, 음식 섭취량[Food intake]).
도 10은 플록스트 및 aSPTLC2 KO 마우스에서의 대사성 변화를 나타낸다. 정상 음식식이(NCD) 및 고지방식이(HFD, 60 kcal % fat)를 한 후 4주 뒤에 종합적 실험동물 모니터링 시스템(Comprehensive Laboratory Animal Monitoring System)을 사용하여 산소 소비(VO2)(A), 이산화탄소 생성속도(VCO2)(B), 호흡비(C), 에너지소비(D), 음식섭취(E) 및 활동(F)을 포함하는 기본적 에너지 균형을 측정하였다(평균±SEM, *p < 0.05 [정상 음식식이를 섭취시킨 플록스트 마우스 대비], n=10).
도 11은 부가적인 고인슐린혈증 정상혈당 클램프 및 포도당 흐름에 대한 결과를 나타낸다. 고지방식이를 6주 동안 섭취시키고 하루 밤을 절식시킨 후, 공복 혈당을 측정하였고(A), 전체 몸의 포도당 흡수(B), 당분해(C) 및 글라이코겐 합성 속도(D)를 측정하였다(평균±SEM, *p < 0.05 [고지방식이를 섭취시킨 플록스트 마우스 대비], n=10-14, 공복 혈당[Fasting glucose], 포도당 흡수[Glucose uptake], 당분해[Glycolysis], 글라이코겐 합성 속도[Glycogen synthesis rate]).
도 12는 '혈액순환 중의 스핑고신-1-포스페이트(S1P)의 상승은 지방세포 비대를 유발하였다' 는 것을 나타낸다. 8주된 플록스트와 aSPTLC2 KO 마우스에게 고지방식이(HFD)(60 kcal % 지방)를 2 주 동안 섭취시켰고, GFP 또는 SPHK2(1 X 109 PFU) 포함 아데노바이러스를 꼬리 정맥에 주입하였다. 주사 후 2 주 뒤에, 체지방 조성을 1H NMR(A)으로 측정하였고, 지방조직을 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색하였다(B)(평균±SEM, *p < 0.05 [아데노바이러스 주사 전(0 주) 대비], n=5). S1P 수용체의 발현을 측정하였다(C)(평균±SEM, *p < 0.05 [고지방식이(HFD)를 섭식시킨 플록스트 마우스 대비], n=5-6). 대조군 또는 SPTLC2-shRNA 3T3-L1 세포가 분화 하는 동안, S1P 수용체의 발현을 측정하기 위해서 qRT-PCR 분석을 실시하였다(D-F)(평균±SEM, *p < 0.05 [콘트롤의 D0 대비], #p < 0.05 [각 날짜의 콘트롤 대비], n=3, 분화의 일수[Day of differentiation]).
도 13은 '스핑고신-1-포스페이트(S1P)는 PPARγ와 3T3-L1 전-지방세포의 증식을 활성화시킨다' 는 것을 나타낸다. 3T3-L1 전-지방세포에 대해서 S1P가 있는 상태로 또는 S1P가 없는 상태로 24시간 동안 처리하였고, 긁혀진 영역으로의 이동 패턴을 다양한 S1P 조건에서 관찰하였다(A). 세포 이동을 운드-힐링 어세이(wound-healing assay)로 측정하였고, 0시간에서와 24시간에서의 간극(gap distances) 비율로 정량화하였다(B). 간극은 세 개의 무작위 지점을 잡은 후에 값을 표준화시켰다. 3T3-L1 세포 생존율은 24시간 동안 S1P를 농도 증가시키면서 처리한 후에 XTT 어세이로 평가하였다(C). PPRE-x3-TK-luc 구조체를 포함하는 벡터로 AML-12 세포를 일시적으로 감염시켰고, 세포를 5μM S1P 또는 10μM 로지글리타존(rosiglitazone)으로 6시간 동안 처리하였다. 그 후에, 루미노미터(luminometer)를 사용하여 루시페라제(luciferase) 활성을 측정하였다(D)(평균±SEM, *p < 0.05 [대조군 대비], n=5-6).
도 14는 동형접합 마우스와 이형접합 마우스를 구분하는 비교 데이터를 나타내는 것으로서, LoxP 삽입을 확인하기 위해서 마우스 꼬리를 0.5 cm 정도 절단한 후 프로테이나제 케이(proteinase K)로 조직을 분해하고, 이를 이용해 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행한 결과 LoxP가 삽입된 경우 366 bp에 생산물이 나타나며, 야생종의 경우 205 bp에 생산물이 나타나는 것으로 동형접합 마우스와 이형접합 마우스를 구분하였으며, 아디포넥틴-Cre의 존재도 중합효소 연쇄반응을 통해 확인하여 지방조직 특이 SPTLC2 마우스와 플록스트 마우스를 구분하였다.
본 명세서에서 'SPTLC2'란 스핑고 지질 생합성을 조절하는 주요단계의 효소로 알려져 있는 세린 팔미토일트랜스페라제(serine palmitoyltransferase, SPT)를 구성하는 단위체(subunit) 중의 하나를 의미한다. SPT를 구성하는 단위체는 SPTLC1과 SPTLC2이다(박태식, 스핑고 지질과 대사성질환, 생화학분자생물학회소식, 2010년 12월호).
본 명세서에서 '프록스트 마우스'란 두 개의 재조합 효소 결합 염기서열인 lox P 사이트 사이에 SPTLC2 유전자의 exon1이 샌드위치된 마우스이다.
본 발명은 지방세포 특이적 SPTLC2 유전자가 결손(knock-out)된 마우스인 것을 특징으로 하는 지방이상증 동물모델을 제공한다. 본 발명은 동형접합체(homozygote)인 것을 특징으로 하는 지방이상증 동물모델로, 상기 지방이상증은 지방간, 전신성 인슐린저항성 및 고중성지방증으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 지방이상증 동물모델이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 선행기술인 US 2008-0249174 A1(JIANG, Xian-cheng)에서는 SPTLC1과 SPTLC2 전체 반결핍 이형접합 마우스(whole-body heterozygous SPTLC2 knock-out mice(-/+))에 대하여 개시한 바 있으나, 지방이상증에 대해서는 연구된 바가 없으나, 본 발명은 지방세포 특이적 SPTLC2 결핍 동형접합 마우스(adipocyte-specific SPTLC2 knock-out mice(-/-))라는 점에서 차별화되어 있다.
본 발명은 (a) 플록스트(floxed) SPTLC2 마우스 및 아디포넥틴-Cre 이식유전자를 가진 마우스를 제작하는 단계; (b) 플록스트 SPTLC2 마우스를 아디포넥틴-Cre 이식유전자를 가진 마우스와 교배하여, 2세대인 마우스를 얻는 단계; 및 (c) 상기 2세대 마우스로부터 지방세포 특이적 SPTLC2 유전자 결손 마우스를 선별하는 단계 를 포함하는 SPTLC2 exon1이 제거된 지방이상증 동물모델의 제작방법을 제공한다.
본 발명은 (i) 지방이상증 동물모델에 시료를 투여하는 단계; (ii) 시료 투여 후 상기 동물모델의 지방이상증의 증상을 측정하는 단계; 및 (iii) 상기 시료를 투여하지 않은 대조군과 비교하여 지방이상증의 증상을 개선시키는 시료를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 지방이상증 예방 및 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 구현예에서, 단계(e)의 상기 측정은 부고환 WAT의 세라마이드, 스핑고마이엘린, 스핑고이드 염기 및 다이아실글리세롤을 측정; 혈장의 세라마이드, 다이하이드로 세라마이드, 스핑고마이엘린 및 스핑고이드염기를 측정; 간 콜레스테롤 및 간 트리글리세라이드(TG) 측정, TG 생합성 유전자 및 지방산 산화 유전자의 발현 측정; 간의 세라마이드, 스핑고마이엘린, 스핑고이드 염기 및 다이아실글리세라이드 측정; 골격근에서 지방을 합성시키는 유전자의 발현 측정을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 동물모델은 지방세포 특이적인 SPTLC2 유전자 결손으로 지방간, 전신성 인슐린저항성 및 고중성지방증 등의 지방이상증을 일으키므로 지방이상증의 진행 경과와 병리학적 기전 연구의 동물모델로 유용하게 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 동물모델은 지방이상증 조절물질을 선별하고, 그 치료효과를 검증하는 스크리닝에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
1. 실험재료 및 방법
(1) 고인슐린혈증 정상혈당 클램프와 포도당 플럭스 계산
클램프 실험의 8 일 전, 우측 경정맥 내에 카테터를 내재하도록 위치시켰다. 정상혈당(약 130 mg/dl)을 유지하기 위해서 인간 인슐린의 기본적/연속적 주입(기본적 주입의 경우는 21.4 mU/kg로, 연속적 주입의 경우는 3 mU/kg/분으로 주입함, Eli Lilly)과 동시에 20% 덱스트로스를 가변적으로 주입하면서 고인슐린혈증 정상혈당 클램프 실험을 120분 동안 수행하였다.
(2) 세포 배양
마우스 3T3-L1 세포는 한국생명공학연구원(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, KRIBB, Korea)에서 얻었다. 세포를 10% 우아혈청(Bovine Calf Serum, BCS), 10 units/ml 페니실린, 10 μg/ml 스트렙토마이신(P/S)을 넣은 동물세포배양배지인 DMEM에서 배양했고, 37 ℃와 5% CO2 에서 배양했다.
(3) 일시적인 형질주입 및 리포터 유전자 어세이
리포펙타민(Lipofectamine) 2000(Invitrogen)을 사용하여 PPRE-x3-TK-luc(plasmid 1015; Addgene) 구조체 포함 벡터를 AML-12 세포에 일시적 형질주입하였다. 형질주입 효율을 표준화하기 위해서 레닐라 루시퍼라제(Renilla luciferase)에 대한 발현벡터인 pTK-RL를 사용하였다.
(4) RNA 준비 및 정량적인 RT- PCR
총 RNA를 3T3-L1 세포 또는 간 조직에서 분리하였고, 이로부터 합성된 상보적인 DNA를 분석하여 유전자 발현을 결정하였다. 이 실험에서 사용된 프라이머 염기서열을 하기 표 1에 제시하였다.
유전자 프라이머 염기서열
β-actin F GAC GTT GAC ATC CGT AAA G (서열번호 1)
R CAG TAA CAG TCC GCC T (서열번호 2)
GAPDH F CAA GGT CAT CCA TGA CAA CTT TG (서열번호 3)
R GGC CAT CCA CAG TCT TCT GG (서열번호 4)
SPTLC1 F AGT GGT GGG AGA GTC CCT TT (서열번호 5)
R CAG TGA CCA CAA CCC TGA TG (서열번호 6)
SPTLC2 F GGA TAC ATC GGA GGC AAG AA (서열번호 7)
R ACC TGG TGT TCT CAG CCA AC (서열번호 8)
SPHK1 F TGT GAA CCA CTA TGC TGG GTA (서열번호 9)
R CAG CCC AGA AGC AGT GTG (서열번호 10)
SPHK2 F AGA CGG GCT GCT TTA CGA G (서열번호 11)
R CCT GCT CAA ACC CGC CAT (서열번호 12)
aP2 F GAA CCT GGA AGC TTG TCT TCG (서열번호 13)
R ACC AGC TTG TCA CCA TCT CG (서열번호 14)
C/EBPα F GAA CAG CAA CGA GTA CCG GGT A (서열번호 15)
R GCC ATG GCC TTG ACC AAG GAG (서열번호 16)
PPARγ F GAG TGT GAC GAC AAG ATT TG (서열번호 17)
R GGT GGG CCA GAA TGG CAT CT (서열번호 18)
PEPCK F CCC CTT GTC TAT GAA GCC CTC A (서열번호 19)
R GCC CTT GTG TTC TGC AG (서열번호 20)
SREBP-1c F CGG AAG CTG TCG GGG TAG (서열번호 21)
R GGC CAG AGA AGC AGA AGA GA (서열번호 22)
GLUT4 F AGA GTC TAA AGC GCC T (서열번호 23)
R CCG AGA CCA ACG TGA A (서열번호 24)
FAS F CAG ATG ATG ACA GGA GAT GGA A (서열번호 25)
R CAC TCA CAC CCA CCC AGA (서열번호 26)
DGAT1 F GTG CCA TCG TCT GCA AGA TTC (서열번호 27)
R GCA TCA CCA CAC ACC AAT TCA G (서열번호 28)
DGAT2 F CTG TCA CCT GGC TCA ACA GA (서열번호 29)
R TAT CAG CCA GCA GTC TGT GC (서열번호 30)
HMG CoR F GGG AAC TAT TGC ACC G (서열번호 31)
R GTA GCC GCC TAT GCT C (서열번호 32)
LpL F TCT GTA CGG CAC AGT GG (서열번호 33)
R CCT CTC GAT GAC GAA GC (서열번호 34)
CPT1α F CCA TCC TGT CCT GAC AAG GTT TAG (서열번호 35)
R CCT CAC TTC TGT TAC AGC TAG CAC (서열번호 36)
CPT1β F GGT CCC ATA AGA AAC AAG ACC TCC (서열번호 37)
R CAG AAA GTA CCT CAG CCA GGA AAG (서열번호 38)
ACOX1 F ACG CCA CTT CCT TGC TCT TC (서열번호 39)
R AGA TTG GTA GAA ATT GCT GCA AA (서열번호 40)
LCAD F TTT CCT CGG AGC ATG ACA TTT T (서열번호 41)
R GCC AGC TTT TTC CCA GAC CT (서열번호 42)
MCAD F AAC ACT TAC TAT GCC TCG ATT GCA (서열번호 43)
R CCA TAG CCT CCG AAA ATC TGA A (서열번호 44)
S1P1 F ATG GTG TCC ACT AGC ATC CC (서열번호 45)
R CGA TGT TCA ACT TGC CTG TGT AG (서열번호 46)
S1P2 F ACA GCA AGT TCC ACT CAG CAA (서열번호 47)
R CTG CAC GGG AGT TAA GGA CAG (서열번호 48)
S1P3 F ACT CTC CGG GAA CAT TAC GAT (서열번호 49)
R CCA AGA CGA TGA AGC TAC AGG (서열번호 50)
CD36 F ATT GGT CAA GCC AGC T (서열번호 51)
R TGT AGG CTC ATC CAC TAC (서열번호 52)
ACC F CGC CAA CAA TGG TAT TGC AGC (서열번호 53)
R TCG GAT TGC ACG TTC ATT TCG (서열번호 54)
(5) 면역블랏 ( Immunoblot ) 분석
조직 또는 세포를 세포용해 완충액에서 균질화시켰다. 단백질 30 μg을 선행문헌에 기재된 바에 따라 면역블랏법에 사용하였다(Lee SY, Hong IK, Kim BR, Shim SM, Sung Lee J, Lee HY, et al., Hepatology, 2015, 62, 135-146). 블랏(blot)을 강화된 화학발광 기질(Millipore, Bilerica, MA)로 현상시켰고, 퓨전 솔로 화학발광 영상화 분석기(FUSION SOLO chemiluminescent imaging analyzer, Vilber Lourmat, Germany)를 사용하여 검출하였다.
(6) 대사체의 측정
혈액 포도당 레벨, 혈장 및 간 TG(triglyceride), 콜레스테롤, HDL, LDL 및 비에스터화지방산을 측정하였다. 혈장 및 조직에서의 스핑고리피드 레벨을 액체크로마토그래피 / 탠덤 매스 분광광도법(liquid chromatography/tandem mass spectrometry, LC/MS/MS)으로 선행문헌에 기재된 바에 따라 측정하였다(Lee SY, Hong IK, Kim BR, Shim SM, Sung Lee J, Lee HY, et al., Hepatology, 2015, 62, 135-146).
(7) 조직학
간을 분리하여 OCT를 넣은 매체(medium)에서 냉동시켰다. 지방조직을 분리하여 10% 완충된 포르말린에서 24 시간 동안 고정시켰다. 파라핀으로 고정된 조직 또는 냉동된 조직의 5 μm 단면을 헤마톡실린과 에오신(H&E, Sigma-Aldrich)으로 염색하거나 오일 레드 오(Oil Red O, ORO)로 염색하였다. 마크로파지를 F4/80 항체로 검출하였다.
(8) 통계적 분석
결과를 평균±표준오차(SEM)로 나타내었다. 그룹 간 차이를 양측 독립적 스튜던트 티 테스트(two-tailed unpaired Student t test)로 결정하였다. P < 0.05를 통계적으로 유의하다고 판단했다.
2. 결과
(1) 스핑고리피드 신생합성은 비만 조건하에서 지방세포가 분화하는 동안에 지방조직에서 상향조절된다.
WAT(white adipose tissue) 비대는 비만에 의한 FA(fatty acid)의 WAT로의 증가된 전달 및 활성화된 TG(triglyceride) 합성으로 인해 발생한다. FA는 스핑고리피드 생합성에 대한 기질이기 때문에, 본 발명의 발명자는 고지방식이(HFD)를 섭취한 마우스에서 유래된 부고환의 WAT에서 스핑고리피드 대사가 변화되는지 조사하였다.
8주 동안의 60% 고지방식이(HFD) 결과, WAT의 SPTLC2, SPHK1, aCer2(alkaline ceramidase2), aCer3, CerS2(ceramide synthase2) 및 DES1(dihydroceramide desaturase 1)이 상향조절되었다(도 1A). 특히, 상승된 SPTLC2 mRNA와 단백질의 상승은 스핑고리피드 신생합성의 활성화를 나타낸다. 그리고 DES1, CerS2, aCer2/3와 SPHK1의 상향조절은 SPT 촉매 단계로부터 시작하는 전체적인 대사 흐름(flux)이 비만 조건에서는 세라마이드를 통한 S1P(sphingosine 1-phosphate)의 합성쪽으로 이동함을 시사한다(도 1A, B).
3T3-L1 세포가 분화하는 동안, SPTLC2, SPHK1, aCer1/2/3, AcCer(acid ceramidase) 및 nCer(neutral ceramidase)는 시간 의존적인 방식으로 상향조절되었다(도 1C, E 및 도 2). 반면에, SPTLC2 단백질 레벨은 감소되었고, SPTLC1 단백질 레벨은 변화가 없었다(도 1D). 스핑고리피드 생합성 지류(branch)에서 이러한 상향조절의 종점인 SPHK1는 선행문헌에 보고된 바와 같이 지방세포 분화의 후반 단계에서 상향조절되었다(Hashimoto T, Igarashi J, Kosaka H., J Lipid Res, 2009, 50, 602-610). 이러한 결과는 지방조직에서의 스핑고리피드 신생합성은 비만 조건 하에서 지방세포가 분화하는 동안에 전사시에 상향조절됨을 나타낸다.
(2) SPTLC2의 억제는 지질생성을 감소시키고 지방세포화유전자를 하향조절한다.
비만지방조직 및 분화된 3T3-L1 세포에서 SPTLC2가 전사시에 상향조절되었다는 관찰은, WAT 분화에 스핑고리피드 신생합성이 필요할 수도 있다는 것을 추정하게 한다. 이 가설을 확인하기 위해서, 본 발명의 발명자는 a SPTLC2 shRNA(short hairpin RNA)를 갖는 렌티바이러스(lentivirus)를 제작하였고, SPTLC2 발현을 억제하기 위해서 3T3-L1 세포를 감염시켰다. shRNA(short hairpin RNA) 중재 SPTLC2 하향조절은 mRNA와 단백질을 측정하여 확인하였다(도 3A, B). 분화하는 동안, SPTLC2 발현이 억제된 3T3-L1 세포는 대조군 3T3-L1 세포보다 적은 지방을 축적했다(도 3C).
다음으로, 본 발명의 발명자는 지방생성 동안의 지방세포화 인자(adipogenic factors)의 mRNA 레벨을 측정했다. 비록 SPHK1 레벨에서 거의 변화가 없었지만, 지방세포화유전자 SPHK2, aP2, C/EBPα, PPARγ, PEPCK, SREBP-1c 및 GLUT4는 하향조절되었고(도 3D, E), 이것은 교란된 지방생성의 원인일 수 있다. 이러한 결과는 스핑고리피드 신생합성이 비만유전자의 발현을 조절함으로써 3T3-L1 지방세포의 분화에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
(3) 지방세포 특이적인 SPTLC2 결핍은 지방이상증을 일으킨다.
다음으로, 본 발명의 발명자는 지방세포 특이적인 SPTLC2 결핍(aSPTLC2 KO)이 마우스에서 지방조직의 발달을 변화시키는지 여부를 조사하였다. 본 발명의 발명자는 플록스트(floxed) SPTLC2 마우스를 아디포넥틴-Cre 이식유전자를 가진 마우스와 교배함으로써, aSPTLC2 KO 마우스를 만들었다. aSPTLC2 KO 마우스로부터 유래된 다수 조직에서 SPTLC2 발현을 검사했을 때, 부고환 및 피하 WAT에서 SPTLC2는 검출되지 않았다(도 4A).
특히, 정상 음식식이(NCD)를 섭식시킨 수컷 aSPTLC2 KO 마우스에서 지방 패드는 발견되지 않았고, 8주 동안 45% 고지방식이(HFD)를 섭식시킨 경우에도, 플록스트 마우스의 부고환 및 피하지방의 패드와 비교했을 때, 수컷 aSPTLC2 KO 마우스에서 부고환 및 피하지방의 패드는 거의 관찰되지 않았다(도 4B).
aSPTLC2 KO 마우스의 부고환의 WAT의 지방세포 크기는 플록스트 마우스의 것보다 더 작았다(도 4C).
또한, aSPTCL2 KO 마우스의 부고환의 WAT에서 심한 마크로파지 침윤이 있었다. aSPTCL2 KO 마우스의 경우 WAT에서 SPHK2는 상향조절되는 반면에, SPTLC2-억제된 3T3-L1 세포에서 발견되는 것처럼, SPHK1, aP2, C/EBPα, PPARγ, PEPCK 및 SREBP-1c를 포함하는 대부분의 지방세포화유전자는 하향조절되거나 검출되지 않았다(도 4D).
WAT 스핑고리피드 프로파일에서 aSPTLC2 결핍의 효과를 검사한 결과, C18:1 스핑코마이엘린(SM)은 감소된 반면에, C16:0 와 C24:1 세라마이드는 상승한 것으로 확인하였다(도 4E).
또한, 스핑가닌(SA) 및 스핑고신(SO)은 상승된 반면에, S1P는 급격히 감소하였다(도 4F). 또한, C18:1/C18:1 DAG(diacylglycerol)에서의 작은 증가를 제외하고는 DAG 레벨의 변화는 없었다. 혈장 스핑고리피드 프로파일은 aSPTLC2 결핍에 의해서 의미있게 변하지 않았고, 고지방식이(HFD)를 섭식한 플록스트 마우스에서만 상승된 세라마이드, 다이하이드로세라마이드 및 SM이 나타났다(도 5). 이러한 결과는, 스핑고리피드 신생합성의 결함은 지방 스핑고리피드 조성을 변화시키고 지방 조직의 발달을 막는다는 것을 시사한다.
(4) 지방조직에 축적되지 않은 지방산은 간에 축적되고, 마우스에서 지방간이 발생한다.
aSPTLC2 KO 마우스는 확연히 감소된 지방 저장고와 아주 작은 지방조직을 가지므로, 본 발명의 발명자는 초과 지방이 간과 같은 말초조직에 재분포되었는지를 조사하였다. 고지방식이(HFD)는 플록스트 및 aSPTLC2 KO 마우스 모두에서 간에서의 지방축적을 일으킨 반면에, 정상 음식식이(NCD)를 섭식시킨 군에서는 aSPTLC2 KO 마우스의 간이 심한 지방 축적을 보였다(도 6A).
aSPTLC2 결핍은 간 콜레스테롤 레벨을 변화시키지 않았으며, 고지방식이(HFD) 그룹이 정상 음식식이 (NCD) 그룹과 비교시 플록스트와 aSPTLC2 KO 마우스에서 간 콜레스테롤 레벨이 감소된 것으로 나타났다(도 6B). 고지방식이(HFD)를 섭식시킨 aSPTLC2 KO 마우스에서 간 TG 레벨은 변화되지 않았다는 것은 주목할 만하다(도 6B).
이런 현상이 활성화된 지방 생합성 또는 억제된 FA 산화 때문인지를 결정하기 위해서, 지방 대사 유전자의 발현을 조사하였다. 그 결과, 스테롤 리스판스 엘레먼트 바인딩 단백질(sterol response element binding protein, SREBP)-1c, 지방산 생성효소(fatty acid synthase, FAS), 다이아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(diacylglycerol acyltransferase, DGAT) 및 HMG CoA 리덕타제(HMG CoR)를 포함한 지방 합성 유전자가 정상 음식식이(NCD)를 섭식시킨 aSPTLC2 KO 마우스의 간에서 상향조절되었음을 발견했다(도 6C). 고지방식이(HFD)를 섭식시킨 aSPTLC2 KO 마우스의 간이 증가된 발현 경향을 보였다. 특히, aSPTLC2 KO 마우스의 간에서 FA-트랜스포터(FA-transporter) CD36의 급격한 상향조절은 혈장에서 간으로의 증가된 FA 흡수를 시사한다. 대조적으로, FA 산화 유전자는 aSPTLC2 KO 마우스의 간에서 크게 변화되지 않았다(그림 6D).
상기 마우스의 간에서 스핑고리피드 프로파일에 대한 aSPTLC2 결핍의 효과를 검사한 결과, 정상 음식식이(NCD)와 고지방식이(HFD)를 섭식시킨 aSPTLC2 KO 마우스에서 C24:0 및 C24:1 세라마이드만이 감소되었다(도 6E). 고지방식이(HFD)를 한 플록스트 및 aSPTLC2 KO 마우스 모두의 간에서 C18:0 SM은 상승되었다(도 6E).
고지방식이(HFD)를 섭식시킨 aSPTLC2 KO 마우스의 간에서 스핑가닌(SA) 및 스핑고신(SO) 레벨은 감소되었으나, 정상 음식식이(NCD)를 섭식시킨 마우스의 간에서는 변화가 없었다(도 6F). 한편, S1P은 고지방식이(HFD)를 섭식시킨 플록스트 마우스의 간에서만 상승되었다. 정상 음식식이(NCD)를 섭식시킨 aSPTLC2 KO 마우스의 간에서 DAG 레벨은 상승하였고, 반면에 고지방식이(HFD)는 플록스트 마우스의 간에서 증가된 DAG를 발생시켰다(도 6F).
그에 반해서, 골격근에서의 TG 생합성 유전자의 발현은 aSPTLC2 결핍에 의해서 변화되지 않았다(도 7). 이러한 결과는 지방조직에서의 스핑고리피드 신생합성의 결함 및 결과적으로 나타나는 지방이상증은 간의 TG 생합성을 활성화시키고 지방간을 일으킨다는 것을 시사한다.
(5) aSPTLC2 KO마우스는 고혈당증을 유발한다.
aSPTLC2 KO 마우스의 몸무게는 뚜렷한 변화가 나타나지 않은 반면에, aSPTLC2 KO 마우스의 혈장 포도당 레벨은 식이와 상관없이 플록스트 마우스와 비교시 상승되었다(표 2).
NCD HFD
SPT Flox(n=6) aSPTLC2 KO(n=6) SPT Flox(n=5) aSPTLC2 KO(n=6)
Body weight (g) 24.1 ± 0.2 25.6 ± 0.5* 26.2 ± 0.6# 26.2 ± 0.5
Plasma glucose (mg/dL) 100.6 ± 2.7 152.7 ± 7.3* 95.8 ± 9.5 145.6 ± 11.8*
ALT (U/L) 38.8 ± 10.2 19.3 ± 7.4 33.9 ± 7.7 92.3 ± 26.8*
AST (U/L) 156.1 ± 52.1 141.9 ± 32.4 135.3 ± 31.4 206 ± 57.9
T-CHO (mg/dl) 95.8 ± 4.3 117.3 ± 4.4* 170.7 ± 18.9 156.1 ± 28.5
TG (mg/dl) 117.8 ± 11.2 115.7 ± 13.6 86.4 ± 9.5 88.2 ± 18.4
HDL (mg/dl) 64.6 ± 3.2 81.4 ± 2.9* 113.7 ± 12.8 103.6 ± 15.4
LDL (mg/dl) 12.1 ± 0.8 12.3 ± 0.8 23.5 ± 3.6 20.5 ± 5.7
NEFA (mEq/L) 12.8 ± 0.5 9.8 ± 1.0* 10.5 ± 1.3 9.5 ± 0.3*
β-OH butyrate (μM) 100.6 ± 19 188.3 ± 32* 102.5 ± 28 137.5 ± 10
알라닌 트랜스아미나제(Alanine transaminase, ALT) 활성은 고지방식이(HFD)를 섭식시킨 aSPTLC2 KO 마우스에서 증가하였고, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(aspartate aminotransferase, AST) 활성에는 변화가 없었다. 정상 음식식이(NCD)를 섭식시킨 aSPTLC2 KO 마우스에서 혈장 콜레스테롤 레벨은 증가하였고, 이러한 결과는 상향조절된 HMG CoR과 일치한다(도 6C).
놀랍게도, 정상 음식식이(NCD) 또는 고지방식이(HFD)를 섭식시킨 지방이상증의 aSPTLC2 KO 마우스에서 혈장 비에스테르화된 FA(non-esterified fatty acid, NEFA) 레벨은 감소하였다(표 2). 베타-하이드록시 부틸레이트(β-hydroxybutyrate)로 대표되는 케톤체는 정상 음식식이(NCD)를 섭식시킨 aSPTLC2 KO 마우스에서만 증가하였다(표 2). 요약하면, 지방 조직에 축적되어야 하는 지방질은 증가된 CD36-중재 FA 수송(CD36-mediated FA transport) 및 활성화된 TG 생합성을 통하여 대신에 간에 축적된 것으로 추정된다.
(6) 지방이상증의 aSPTLC2 KO 마우스는 인슐린-저항성이다.
혈장 포도당 레벨은 정상 음식식이(NCD) 또는 고지방식이(HFD)를 섭식시킨 aSPTLC2 KO 마우스에서 상승되었기 때문에, 지방이상증 환자에서 보고된 것처럼(Huang-Doran I, Sleigh A, Rochford JJ, O'Rahilly S, Savage DB., J Endocrinol, 2010, 207, 245-255, Savage DB., Dis Model Mech, 2009, 2, 554-562, Vernochet C, Damilano F, Mourier A, Bezy O, Mori MA, Smyth G, et al., FASEB journal, 2014, 28, 4408-4419), SPTLC2 KO-매개 지방간이 간 인슐린저항성을 일으키는지를 조사하였다. 우선, 본 발명의 발명자는 플록스트 및 aSPTLC2 KO 마우스에게 4 주 동안 60 kcal% 고지방식이(HFD)를 섭식시킨 후 체 조성을 측정했다. 고지방식이(HFD)를 섭식시킨 플록스트 마우스는 정상 음식식이(NCD)를 섭식시킨 마우스와 비교시 시간-의존적인 방식으로 몸무게가 증가했다(도 8A).
이 기간 동안, 플록스트 및 aSPTLC2 KO 마우스에서 식이와 관련된 음식섭취는 변하지 않았다(도 9). 반면에, aSPTLC2 KO 마우스의 몸무게는, 플록스트 마우스의 몸무게보다 약간 높았지만, 고지방식이(HFD) 동안 몸무게가 변화하지 않았다. 또한, 상기 마우스의 에너지 소비를 24 시간 동안 측정하였으나 산소 소비(VO2), 이산화탄소 생성 속도(VCO2), 호흡 에너지 교환비율(RER), 에너지 소비 또는 음식섭취에서 변화가 없었다(도 10). 단, 정상 음식식이(NCD)를 섭식시킨 aSPTLC2 KO 마우스의 활동성에서만 증가가 관찰되었다.
다음으로, 본 발명의 발명자는 1H-NMR을 사용하여 지방 및 지방제외체질량(lean body mass)으로 특징지워지는 체조성을 측정했다. 플록스트 마우스는 고지방식이(HFD)를 섭식시켰을 때, 급격히 증가된 지방 양 및 감소된 지방제외체질량을 보이는 반면에, aSPTLC2 KO 마우스는 체중 및 체조성에서 변화를 보이지 않았다(도 8B).
그 후, aSPTLC2 마우스에서 인슐린저항성을 조사하기 위해서, 고인슐린혈증 정상혈당 클램프 실험을 수행했다. 고지방식이(HFD)를 섭식시킨 플록스트 마우스의 공복 혈당 레벨과 비교했을 때, aSPTLC2 KO 마우스의 공복 혈당 레벨은 상승되었다(도 11).
또한, 고지방식이(HFD)를 섭식시킨 aSPTLC2 KO 마우스에서 포도당 주입 속도는 감소되었다(도 8C). aSPTLC2 KO 마우스에서 간 포도당 생성 억제는 감소되었고 간 포도당 생성은 증가했다(도 8C-D).
반면에, 포도당 흡수(glucose uptake), 당분해(glycolysis) 및 글라이코겐 합성(glycogen synthesis)에서 변화는 없었다(도 11B-D). 이러한 결과는 간-특이적인 인슐린저항성이 aSPTLC2 KO 마우스에서 일어난다는 것을 제시한다. 인슐린 신호전달체계가 변했는지를 더 조사하기 위해서, 인슐린(0.5 mg/kg)을 10 분 동안 주입했고 AKT의 인산화(phosphorylation) 정도를 측정했다. aSPTLC2 KO 마우스의 간 및 지방조직 양쪽에서 AKT의 인슐린-매개 인산화는 감소되었다(도 8E-F).
위의 결과를 종합적으로 정리하면, aSPTLC2 KO 마우스에서 총 체내 인슐린저항성이 증가된 것은 지방간에 수반된 간 인슐린저항성 때문으로 추정된다.
(7) aSPTLC2 결핍은 S1P 레벨을 감소시키고 S1P 1 수용체를 하향조절한다.
본 발명의 발명자는 감소된 지방 S1P 레벨이 aSPTLC2 KO 마우스에서 나타난 지방이상증과 연관되었는지 알아보고자 했다(도 4F).
선행문헌에 발표된 대로(Lee SY, Hong IK, Kim BR, Shim SM, Sung Lee J, Lee HY, et al., Hepatology, 2015, 62, 135-146), 플록스트 및 aSPTLC2 KO 마우스에 60% 고지방식이(HFD)를 2 주 동안 섭식시킨 후 SPHK2 아데노바이러스를 주사하여 추가 2주 동안 혈장 S1P를 증가시키고 체 조성을 측정하였다. GFP 대조군 아데노바이러스를 주입한 마우스와 비교했을 때, SPHK2 아데노바이러스를 주입한 플록스트와 aSPTLC2 KO 마우스의 지방세포에서 세포 크기가 증가하였다(도 12A).
aSPTLC2 KO 마우스에서의 지방 조직량은 GFP 또는 SPHK2 아데노바이러스에 의해서 변하지 않은 반면에, SPHK2 아데노바이러스를 주입한 플록스트 마우스에서 지방 조직이 현저하게 증가하였다(도 12B). 이러한 결과는 세포외(extracellular) S1P가 지방세포 비대에서 어떠한 역할을 함을 나타낸다.
다음으로 지방 조직에서의 S1P 수용체의 발현을 측정했다. 그 결과, aSPTLC2 KO WAT에서 S1P1이 급격하게 하향조절되었고 S1P2 및 S1P3는 상향조절되었음을 발견하였다(도 12C).
SPTLC2 shRNA로 처리된 3T3-L1 세포에서 S1P1 는 현저히 하향조절되었고, 반면에 S1P2 또는 S1P3의 발현에서는 특징적인 변화가 없었다(도 12D-F). 따라서, 이런 결과들은 S1P1 수용체-매개 S1P 신호전달체계는 지방세포의 증식 또는 분화에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.
(8) S1P는 PPAR ( peroxisome proliferator -activated receptor)γ의 활성화를 통해서, 전-지방세포(pre- adipocytes )의 증식 및 지방생성을 유도한다.
증가된 혈장 S1P가 지방세포 분화를 증가시킨다는 선행문헌의 보고는(Hashimoto T, Igarashi J, Kosaka H., J Lipid Res, 2009, 50, 602-610) S1P가 지방세포 증식 또는 지질생성을 증가시킬 수 있음을 시사한다. 이것을 조사하기 위해서, 3T3-L1 세포를 S1P로 처리하였고 그들의 증식을 조사하였다. S1P 레벨이 증가함에 따라, 이동성 전-지방세포(pre-adipocytes) 3T3-L1 세포는 용량-의존적인 방식으로 증가했다(도 13A).
S1P 처리에 따른 감소된 간극은 S1P가 지방세포를 증식시키는 인자라는 것을 제시한다(도 13B). 또한, 세포 생존에서의 S1P 의존적 증가는 S1P가 세포 증식을 촉진시킨다는 것을 나타낸다(도 13C).
최근 보고는 혈관상피세포(endothelial cells)에서 S1P 수용체에 독립적으로, S1P가 퍼옥시좀 프로리퍼레이터-활성화 수용체(PPAR, peroxisome proliferator-activated receptor) γ에 대한 리간드라는 것을 암시하기 때문에(Parham KA, Zebol JR, Tooley KL, Sun WY, Moldenhauer LM, Cockshell MP, et al., FASEB journal, 2015, 29, 3638-3653), 본 발명의 발명자는 6 시간동안 S1P 처리 후, 알려진 PPARγ 작용제(agonist)인 로지글리타존(rosiglitazone)을 양성 대조군으로 사용하여, 퍼옥시좀 프로리퍼레이터-활성화 수용체 반응 엘레먼트(PPRE, peroxisome proliferator-activated receptor response element) 리포터 활성을 측정했다. 그 결과, S1P 처리는 로지글리타존을 처리해서 생성된 활성 레벨과 유사한 수준까지 PPRE-루시페라제 리포터(PPRE-luciferase reporter) 활성을 증가시키는 것으로 나타났다(도 13D). 이러한 결과는 지방세포 증식 및 지방생성은 S1P에 의해 조절된다는 것을 제시한다.
3. 토의
스핑고리피드는 세포증식 및 분화에서 중요한 조절인자(regulators)이고, 스핑고리피드의 대사 조절장애는 고혈압, 고혈당증 및 이상지질혈증을 포함하는 주요한 대사 질환 및 심혈관 질환을 발생시킨다. 스핑고리피드 신생합성의 억제는 비만-연관 인슐린 저항성 및 WAT 분화를 개선하는 것으로 보고되었다.
이번 실험에서, 스핑고리피드 생합성 및 지방세포의 증식/분화 간의 연결을 설명하고자 했고, 하기 사항이 확인되었다: 1) 지방세포가 분화하는 동안, 스핑고리피드 생합성 흐름은 S1P 생합성 쪽으로 이동한다; 2) 스핑고리피드 신생합성의 억제는 지방세포 분화를 억제한다; 3) 지방세포-특이적 SPTLC2 결핍은 지방이상증, 지방간 및 전신성 인슐린저항성을 일으킨다; 4) S1P 와 S1P1 수용체는 지방세포의 증식 및 분화와 연관되어 있다. 이러한 실험은 간 및 지방 조직 사이의 FA/TG 저장에 대한 상호간섭을 설명해주고, 지방 형성에서 스핑고리피드 대사체가 중요한 역할을 함을 나타낸다.
본 발명의 발명자는 고지방식이(HFD)를 섭식시킨 마우스의 지방조직에서는 SPTLC2 및 SPHK1의 발현이 증가됨을 발견했다. 고지방식이(HFD)로 표현되는 영양과다는 지방조직에서 증가된 지방의 저장 및 지방생성 인자인 SPHK1의 유도를 가져왔다. 고지방식이(HFD)를 섭식시킨 마우스에서 3T3-L1 세포가 분화하는 동안, SPT 효소의 촉매성 단위체인 SPTLC2, DES1 및 몇몇 세라마이드들이 상향조절된다는 것은 총 스핑고리피드 생합성 흐름이 S1P를 생성하는 쪽으로 이동함을 의미한다. 흥미롭게도, SPTLC2 mRNA 및 단백질의 발현은 지방생성이 일어나는 동안에 일치하지 않았다. 이것은 아마도 증가된 단백질 분해 및 지방세포에서 스핑고리피드 풀(pool)을 보충하는 보상적 메카니즘 때문일 것으로 추정되나, 현재까지 주된 이유는 불명확하다.
본 발명의 발명자는 shRNA에 의한 SPTLC2의 유전자적 억제는 TG 합성을 위한 FA 가용성 증가로 인한, 3T3-L1 세포에서의 지방 저장을 증가시킬 것으로 기대했다. 그러나 놀랍게도, 지방 축적 및 비만유전자의 발현은 유의하게 감소된 것으로 나타났다. DES1를 억제하여 스핑고리피드 신생합성을 억제하는 것은 교란된 지방 축적 및 비만유전자의 억제에 이르게 된다는 것이 선행기술문헌에 보고된 바 있다(Barbarroja N, Rodriguez-Cuenca S, Nygren H, Camargo A, Pirraco A, Relat J, et al., Diabetes, 2015, 64, 1180-1192). 이런 결과는 스핑고리피드 조성에 대한 조절은 구조적인 생합성적 역할보다는 신호전달체계 분자로서 제어적 역할을 함을 의미한다.
3T3-L1 결과와 일치하게도, aSPTLC2 KO 마우스는 심한 지방이상증의 표현형을 나타냈다. 정상 음식식이(NCD)를 섭식시킨 aSPTLC2 KO 마우스에서 지방 조직은 거의 발견되지 않는 반면에, 고지방식이(HFD)는 aSPTLC2 KO 마우스에서 지방 조직에서의 소량 증가를 가져왔다. aSPTLC2 KO 마우스의 지방 조직에서, SPHK1와 다른 비만유전자의 발현은 뚜렷이 감소되었고 지방조직의 세포 크기는 감소되었다(도 4). 특히, aSPTLC2 KO 지방조직에서는 스핑고리피드 생합성 경로가 결핍된 상태에서도, 스핑고신(SO)과 스핑가닌(SA)을 포함하는 세라마이드와 스핑고이드 염기가 증가된 것으로 나타났다. 이것은 아마도 혈액순환 또는 다른 온전한 세포로부터의 공급 때문일 것이며, 또한 교란된 지방세포 증식 및 분화를 회복하기에는 불충분하지만, SPHK2에 대한 보상적 상향조절 때문일 것이다. 반면에, aSPTLC2 KO 마우스의 WAT 총 양은 스핑고리피드 생합성 체계가 온전한지, 또한 전신적 지방 풀(pool)에 기여할 수 있는지를 결정하기에는 너무 작다.
지방 조직이 결핍된 상태인 지방이상증은 국소화되거나, 부분적이거나, 전반적인 양상으로 나타날 수 있다. 일반적으로, 지방이상증 환자에서 지방은 말초기관으로 재분포된다. 이러한 이소성 지방은 인슐린저항성, 지방간 및 고중성지방증(hypertriglyceridemia)과 같은 대사 기능장애의 주요 원인이다. 이러한 보고와 일치하게도, aSPTLC2 KO 마우스는 간으로의 지방 재분포를 나타낸다. 정상 음식식이(NCD)를 섭식시킨 경우에도, 상향조절된 CD36를 통해서, aSPTLC2 KO 마우스의 간에서 지방간이 발생했다. 놀랍게도, 이 경우 혈장 TG와 NEFA(non-esterified fatty acid) 레벨은 변화하지 않았다. 이것은 아마도 상향조절된 CD36에 의해 간의 FA 흡수가 증가되었기 때문이며, 이것은 혈액순환에서 항상성의 유지를 가져온다. 간에서, 수송된 FA는 TG 합성에 이용되며, TG 생합성 체계는 전사적으로 활성화된다는 것이 밝혀졌다. aSPTLC2 KO 마우스 또한 지방이상증의 또 다른 특징인 고혈당증을 보였다. 이것은 주로 증가된 간 포도당 생성 및 간 억제에 대한 인슐린 작용의 억제 때문이다. 이것은 간에서 상승되지 않았던 세라마이드 때문이 아니다. 반면에, 상승된 간 DAG(diacylglycerol)는 아마도 교란된 인슐린 신호전달체계에 기여했을 것이다.
aSPTLC2 KO 마우스에 의해 나타나는 지방이상증의 표현형은 선천적 일반적 지방이상증(congenital generalized lipodystrophy, CGL)과 유사하다. 선천적 일반적 지방이상증의 가장 흔한 원인은 포스파티드 산(phosphatidic acid)을 합성하고 TG 합성에 관련된 1-아실글리세롤-3-포스페이트 O-아실트랜스퍼라제 2(1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 2, AGPAT2)에서의 돌연변이이다. 특히, PPARγ에서의 이형접합성 돌연변이는 가족성 부분적 지방이상증(familial partial lipodystrophy)을 가진 환자들에서 발견되어 왔고, 이것은 아마도 지방세포 분화를 교란시킬 것이다. 최근에, Parhan 등은 S1P가 인간 혈관상피세포(endothelial cells)에서 PPARγ에 대한 리간드라고 보고하였다(Parham KA, Zebol JR, Tooley KL, Sun WY, Moldenhauer LM, Cockshell MP, et al., FASEB journal, 2015;29:3638-3653).
본 발명의 발명자는 S1P 매개 PPARγ 활성화를 확인하였고, 따라서, aSPTLC2 결핍의 결과로 나타나는 S1P 고갈은 부분적으로 PPARγ 활성화를 방해할 것이고, 지방세포 분화의 억제로 이어질 것이다. 더욱이, S1P 수용체는 지방세포의 증식 및 분화에 독립적으로 관련되어 있다. 혈장 S1P 레벨이 간에서의 SPHK2 아데노바이러스성 과발현에 의해서 상승되었을 때, 플록스트와 aSPTLC2 KO 마우스 모두는 지방세포 비대를 보였다(도 12A). 반면에, 증가된 지방 조직 양은 aSPTLC2 KO 마우스가 아닌 단지 플록스트 마우스에서만 발견되었다. 이에 대한 정확한 이유는 현재 확실하지 않다. 기저 S1P 수용체 발현의 유지는 필수적일 수 있으며, 혈액순환으로부터의 S1P 보충은 aSPTLC2 KO 마우스에서의 지방이상증 표현형을 회복하는데에 부적절할 수 있다. 이와 일치하게, 분화하는 동안의 SPTLC2-억제된 3T3-L1 지방세포에서, 단지 S1P1 수용체만이 유전자 발현 감소하였음을 발견했다. 최근에, S1P1 /3 수용체에 대한 약리학적 억제가 지방세포 증식을 억제한다는 보고는 지방 형성에 S1P1 수용체가 관련되었음을 제시한다. 이번 결과에서는 S1P가 3T3-L1 지방세포의 증식이 용량 의존적 방식으로 활성화된다는 것이 확인되었다.
종합적으로 정리하면, aSPTLC2 KO 마우스에서 관찰된 지방이상증 및 지방간은 PPARγ-매개 지방생성 및 S1P-매개 증식이라는 두가지 작용을 억제해서 나타난 복합적인 결과이다. 향후 지방세포 형성에서 S1P 수용체의 명확한 역할을 설명하기 위해서 추가적인 연구가 필요하다.
본 발명의 발명자는 이전에 SPHK2의 아데노바이러스성 과발현이 FA 산화를 활성화시키고, 고지방식이(HFD)를 섭식시킨 마우스의 간에서 지방 적을 감소시킴을 보고한 바 있다(Lee SY, Hong IK, Kim BR, Shim SM, Sung Lee J, Lee HY, et al., Hepatology, 2015, 62, 135-146). S1P의 상승은 간에서의 FA 산화를 활성화시킨다. 반면에, S1P는 3T3-L1 세포 분화 동안에 SPHK1 및 SPHK2의 상향조절에 의해서 증가되며, 지방생성에 기여한다. 본 발명의 생체내 시험 결과에 의해, 간의 SPHK2 과발현의 결과로 증가된 S1P는 지방세포 비대와 증식을 활성화시킴이 확인되었다. 이러한 S1P의 서로 다른 역할은 간과 지방 조직 사이의 상호간섭을 통해서 FA/TG 분포와 이용의 균형에 기여한다. 추가적으로, S1P/S1P1 수용체 신호전달체계의 활성화는 음식 소비를 감소시키고 시상하부 POMC(pro-opiomelanocortin)에서 에너지 소비를 증가시키는 것으로 보고되었다. 비록 작용기작은 간, 지방 조직 및 시상하부에서 다를 수 있더라도, 이러한 보고는 S1P 신호전달체계가 전신성 대사 조절에서 중요한 역할을 한다는 것을 제시한다.
종합적으로, 본 발명의 실험결과는, 스핑고리피드 신생합성이 지방세포의 증식 및 분화에서 중요한 역할을 한다는 것을 제시한다. 스핑고리피드 신생합성의 지방세포-특이적 봉쇄는 지방생성을 억제하고 지방이상증 및 지방간을 일으킨다. 스핑고리피드 대사체 중에서, 지방 및 순환성 S1P는 수용체 매개 및 PPARγ 매개 작용을 통해서 지방세포의 증식 및 분화를 조절하는 것으로 밝혀졌다. 결론적으로, S1P가 에너지 항상성 및 간과 지방조직 사이의 기관 상호간의 상호간섭을 중재하는 신호전달체계 분자임을 제시한다.

Claims (6)

  1. 플록스트 SPTLC2 마우스 및 아디포넥틴-Cre 이식유전자를 가진 마우스를 교배하여 제작된 지방세포 특이적 SPTLC2 유전자 결손(knock-out) 마우스인 것을 특징으로 하는, 지방간 또는 전신성 인슐린저항성인 지방이상증 동물모델.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 마우스가 동형접합체(homozygote)인 것을 특징으로 하는 지방이상증 동물모델.
  3. 삭제
  4. (a) 플록스트(floxed) SPTLC2 마우스 및 아디포넥틴-Cre 이식유전자를 가진 마우스를 준비하는 단계;
    (b) 플록스트 SPTLC2 마우스 및 아디포넥틴-Cre 이식유전자를 가진 마우스를 교배하여 2세대 마우스를 얻는 단계; 및
    (c) 단계 (b)에서 얻은 상기 2세대 마우스로부터 지방세포 특이적 SPTLC2 유전자 결손 마우스를 선별하는 단계;
    를 포함하는 SPTLC2 exon1이 제거된, 제 1항의 지방이상증 동물모델의 제작방법.
  5. (i) 제 1항 또는 제 2항의 지방이상증 동물모델에 시료를 투여하는 단계;
    (ii) 시료 투여 후 상기 동물모델의 지방이상증의 증상을 측정하는 단계; 및
    (iii) 상기 시료를 투여하지 않은 대조군과 비교하여 지방이상증의 증상을 개선시키는 시료를 선별하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 지방간 또는 전신성 인슐린저항성인 지방이상증 예방 및 치료제의 스크리닝 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 단계 (ii)의 지방이상증의 증상이 부고환 WAT의 세라마이드, 스핑고마이엘린, 스핑고이드 염기 및 다이아실글리세롤의 함량; 혈장의 세라마이드, 다이하이드로 세라마이드, 스핑고마이엘린 및 스핑고이드염기 함량; 간 콜레스테롤 또는 간 트리글리세라이드(TG)의 함량, TG 생합성 유전자 또는 지방산 산화 유전자의 발현; 간의 세라마이드, 스핑고마이엘린, 스핑고이드 염기 및 다이아실글리세라이드의 함량; 및 골격근의 지방 합성 유전자의 발현으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
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KR20180034021A (ko) 2018-04-04

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