CN109851666A - 一种重组猪α-干扰素蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛋白，所述蛋白选自如下(a)或(b):(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；(b)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有干扰素活性的由(a)衍生的蛋白质。本发明实施例的重组蛋白临床使用效果好，在临床试验表明，对仔猪的腹泻病预防及治疗有明显效果，治愈率达到95％。本发明所制备的重组猪α‑干扰素蛋白可以有效地预防及治疗由多种病毒引起的猪传染病，包括猪瘟、仔猪腹泻、蓝耳病等，抗病毒范围广谱，增强动物。

Description

一种重组猪α-干扰素蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种的重组猪α-干扰素蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

猪肉是最主要和最常见的肉类产品之一，随着经济的增长、人民生活水平的提高以及出口贸易等因素，猪肉及其他猪产品的市场需求量也大大增加，从而导致养猪业的大力发展。在养猪业的巨大发展过程中，也存在着许多的问题，其中疫病的爆发成为对养殖户造成最大损失和危害的困扰。猪类传染病包括口蹄疫、猪瘟、伪狂犬病、蓝耳病等，这些病毒性猪病传染性极强，一旦有猪感染发病，将很容易传播到整个猪场甚至疫情扩散到整个地区，患病猪死亡率极高，给养猪业带来重创甚至危害人类健康。

目前，兽医临床上对于病毒类猪传染病以疫苗预防为主，治疗药物通常采用抗生素类。然而，由于毒株变异较快，血清型种类较多，一些毒株的相关疫苗目前尚未被研制出来应用于临床，因此疫苗免疫对传染病的防控作用经常难以奏效。而使用抗生素类药物治疗家畜病毒性传染病弊多利少。首先，抗生素类药物只能针对病毒性传染病期间并发的细菌感染，而不能针对病毒本身，所以，抗生素对传染病的治疗和控制效果并不是十分可观。其次，抗生素的过度使用会导致耐药菌株的增加，最终形成抗生素的滥用，从而导致肉类食品安全问题。因此，找到一类能更好地针对病毒性疾病的药物是目前临床兽医学的迫切需要。干扰素在病毒性传染病的治疗上存在着多方面的优势，为防治对畜牧业危害重大的传染病带来新的希望。

干扰素(Interferon,IFN)最初由英国科学家Isaacs于1957年发现。它是一类具有广谱抗病毒作用、增强免疫应答作用和抗肿瘤作用的糖蛋白细胞因子。干扰素分为α、β、γ等多种类型，干扰素α是抗病毒作用最强的一种。IFN结合于细胞表面的IFN受体，诱导细胞产生抗病毒蛋白(Antivirual Protein,AVP)，这些抗病毒蛋白能抑制病毒的RNA或DNA的合成。此外，干扰素也通过诱导免疫细胞的激活、增强NK细胞的杀伤能力等免疫调节机制来实现抗病毒作用。IFN作为一类新型抗病毒药物，有着抗病毒范围广谱且效果显著、无耐药性、不损害正常细胞、残留量较小等优势。猪的α-干扰素种属特异性较弱，可以作用于猪、牛、人、鼠等动物的细胞。现有猪α-干扰素蛋白，存在着抗病毒活性差，制造成本高，不一规模化制造的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组猪α-干扰素蛋白及其编码基因与应用，用以解决现有重组蛋白抗病毒活性高，治疗疾病效果好，产量高的优点。

为实现上述目的，本发明提供一种蛋白，所述蛋白选自如下(a) 或(b):

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有干扰素活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明实施例提供所述的蛋白质的编码基因。

本发明实施例提供所述的蛋白质的编码基因，所述编码基因选自如下(a)或(b):

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码基因；

(b)具有在严格条件下可与SEQ ID NO.2所示DNA序列杂交的核苷酸序列的编码基因。

本发明实施例一方面提供具有所述基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

本发明实施例还提供一种表达所述蛋白的方法，所述的蛋白基因通过表达载体导入宿主细胞，获得表达所述的蛋白质的重组细胞，通过该重组细胞表达所述重组蛋白。

优选的，所述表达载体为pET表达载体；

所述宿主细胞为大肠杆菌DH5-α或BL21。

优选的，所述重组菌的培养条件为37℃，加入IPTG诱导表达 10-25小时。

本发明实施例还提供一种预防和/或治疗猪病毒感染性疾病的药物，所述药物以权利要求1所述的蛋白为活性成分。

优选的，所述病毒性感染疾病包括猪瘟、口蹄疫、蓝耳病、伪狂犬病。

本发明实施例通过从猪的全血细胞中提取细胞总RNA并设计了重组猪α-干扰素基因的特异性引物序列，经过反转录、PCR扩增得到目的基因。构建了克隆载体及表达载体，并将大肠杆菌宿主菌在生物反应器中接种发酵，大量表达重组猪α-干扰素蛋白，最后纯化、冻干成粉针剂。

本发明实施例具有如下优点：

本发明实施例、获得具有高生物活性的重组猪α-干扰素蛋白的方法和程序简单，周期短，便于工业化生产。本发明实施例的重组菌种高表达、产量高：强启动子以及大肠杆菌的快速分裂复制，能够很高地表达目的蛋白。本发明实施例获得的重组蛋白纯度高，将所制备的重组猪α-干扰素蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果通过薄层扫描显示，重组猪α-干扰素蛋白的条带占总表达蛋白量的80％。本发明实施例的重组蛋白临床使用效果好，在临床试验表明，对仔猪的腹泻病预防及治疗有明显效果，治愈率达到95％。本发明所制备的重组猪α-干扰素蛋白可以有效地预防及治疗由多种病毒引起的猪传染病，包括猪瘟、仔猪腹泻、蓝耳病等，抗病毒范围广谱，增强动物。

附图说明

图1为本发明实施例的猪α-干扰素基因酶切回收电泳图，其中， M:DL2000DNAMarker；1:猪α-干扰素基因酶切回收片段。

图2本发明实施例的重组表达载体双酶切电泳图，其中， M:DL2000DNA Marker；1：双酶切片段；2：未酶切质粒。

图3本发明实施例的重组α-干扰素蛋白基因表达载体 pET-PoIFN-α的构建过程示意图。

图4为本发明实施例的猪α-干扰素在重组表达菌株中的表达SDS-PAGE电泳图，其中，M:蛋白Marker；1:未诱导菌体；2:诱导表达沉淀；3:诱导表达上清；4:诱导表达菌体。

图5为本发明实施例的猪α-干扰素的Western-blot结果分析图，其中，M：是蛋白Marker，1：诱导表达菌体，2：未诱导表达菌体。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下面将更详细地描述本发明的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

实施例1重组猪α-干扰素蛋白基因的合成及蛋白表达

1、重组猪α-干扰素目的基因的获取方法

参考重组猪α-干扰素基因的核苷酸序列(GENBANK号： NM_215383.1)核苷酸的序列如序列表中的序列2(SEQ ID NO.2) 所示，根据上述基因序列设计引物如下：引物上游序列(5′ CATATGTCCGACGCGCTAACCC 3′)引物下游序列(5′ TTATTCGTTCCGCAGGCGGACC 3′)两条引物带有的酶切位点分别是：5’端加上NdeI酶切位点CATATG，3’端加上XhoI酶切位点CTCGAG颈静脉采猪血，使用Qiagen公司的RNA提取试剂盒提取猪血液细胞总RNA。然后进行反转录PCR，20μL的体系里，具体加样量如下：细胞总RNA 10μL；5×反转录Buffer 4μL；Rnasin 1 μL；上下游引物各1μL；25mM MgCl₂ 1μL；10mM dNTP 2μL。之后将反应物混合好放入PCR仪里，反应温度升到65℃时，过15 分钟后加入反转录酶M-MLV 1.0μL，之后42℃一小时，94℃5分钟，反应结束。

将所得的反转录产物进行PCR扩增，50μL的体系里，加样量如下：PCR Mix 5μL；反转录产物cDNA 10μL；ddH₂O 33μL；上下游引物各1μL。PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃变性30s； 55℃退火40s；72℃延伸1min；35个循环；最后72℃延伸10min。

使用TAKARA公司胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行回收，之后对目的基因测序，测序结果与Genebank序列一致，PCR产物的电泳图如图1所示。

2、构建重组蛋白基因的克隆载体

将上述所得的目的基因连接于PUC-vector并转化大肠杆菌 DH5-α，涂布于含卡那霉素的LB固体培养板上，14小时后挑取单个菌落置于含卡那霉素LB液体培养基中，37℃振荡培养12小时，质粒小量提取，酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定，两条酶切产物位置在 5000bp处和500bp处，符合目的大小。酶切产物的电泳结果，如图 2所示。

3、重组α-干扰素蛋白基因表达载体的构建

将重组蛋白基因从上述连接好的克隆载体上双酶切下来，连接到被同样两种限制性内切酶酶切过的PET-vector上，转化BL21大肠杆菌，涂布于含卡那霉素的LB固体培养基平板过夜培养，14小时后挑取单个克隆菌落含卡那霉素LB液体培养基中，37℃振荡培养12小时，质粒小量提取，双酶切鉴定，切下条带大小为500bp的鉴定为阳性，载体连接成功，如图3，该重组菌株为大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)，于2018年12月19日，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.17005。

4、重组α-干扰素蛋白的表达

将含有重组蛋白基因表达载体的重组大肠杆菌接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，在震荡仪里小量培养14～16小时后，将所得扩增产物接种到生物反应器中发酵培养，2.5～3小时后，测OD值在4～6时，加入IPTG，37℃诱导表达约24小时后，每小时监测OD 值，当OD值刚呈现下降趋势时，立即停止发酵，收集菌液。

5、重组猪α-干扰素蛋白粗制品的制备

将步骤4中获得的菌液8500r/min离心15min，弃上清，收集菌体沉淀，在沉淀中加入破碎液混匀，超声波破碎25min，8500r/min 离心15min后弃上清，再在菌体沉淀中加入清洗液，8500r/min离心 15min后弃上清，在菌体沉淀中加入变性液，搅拌混匀，变性14小时后加入复性液，再通过超滤器过滤，得到猪α-干扰素蛋白的粗制品溶液，取蛋白溶液经过SDS-PAGE电泳检测，结果如图4。

6、重组猪α-干扰素蛋白溶液粗制品的纯化：

a.凝胶过滤层析：采用葡聚糖凝胶，将所得粗制品蛋白溶液过滤后过层析柱，洗脱收集；b.Ni柱亲和层析：10倍柱体积的Binding Buffer平衡(20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,5mM咪唑,PH8.0)，上样，洗脱；c.离子交换纤维素层析：膨胀活化纤维素，平衡，装柱上样，洗脱。

7、重组猪α-干扰素的鉴定

蛋白定量检测：采用紫外分光光度法，测定蛋白含量≥1 mg/ml。SDS-PAGE电泳：Western Blot：抗体购于义翘神州公司，一抗为兔抗猪干扰素单克隆抗体，二抗为小鼠抗兔IGg。SDS-PAGE电泳结果如图5所示。

实施例2重组猪α-干扰素蛋白的效价检测

采用CPE抑制为基础的抑制微量测定法并使用Wish细胞/VSV 病毒系统，将能保护半数细胞免受病毒感染的每毫升干扰素最大可稀释倍数的倒数定为干扰素单位，以国际单位(IU)表示，并使用国家标准品校正。在96孔细胞培养板上用RPMI-1640培养液培养Wish细胞，细胞密度为35万/mL，每孔添加量100μL，置于37℃、5％CO₂的培养箱培养5小时。加入不同稀释倍数的重组猪α-干扰素， 37℃、5％CO₂培养24小时。吸走每孔的上清液，每孔接种100CCID50/mL浓度的VSV病毒悬液100μL，继续培养24小时。显微镜下观察细胞病变，对照组中的细胞出现脱落、变圆、死亡等病变，而加了干扰素的实验组细胞状态明显优于对照组，测得效价为 1*10⁸IU/mg。

实施例3重组猪α-干扰素蛋白临床试验

1、本发明实施例的重组猪α-干扰素蛋白治疗猪瘟

取经临床鉴定为猪瘟猪瘟的患病猪的头数为2033头，分别为大约可仔猪和杜洛克主，猪龄在1-20个月，小猪为1-16个月，成年猪为16个月以上，分为试验组1304头，对照组729头，其中试验组用本发明实施例1制备的重组猪α-干扰素蛋白。治疗用量为小猪10万IU/kg，成年猪20万IU/kg，对照组为现有。治疗猪瘟临床的临床症状统计结果如表1所示。

表1

2、本发明实施例的重组猪α-干扰素蛋白治疗仔猪流行性腹泻

取经临床鉴定为仔猪流行性腹泻的患病猪的头数为3281头，分别为大约可仔猪和杜洛克主，猪龄在1-10个月，，分为试验组2631 头，对照组650头，其中试验组用本发明实施例1制备的重组猪α- 干扰素蛋白。治疗用量为小猪10万IU/kg，成年猪20万IU/kg，对照组为现有市场销售的α-干扰素蛋白。治疗猪瘟临床的临床症状统计结果如表2所示。

表2

3、本发明实施例的重组猪α-干扰素蛋白治疗伪狂犬病

取经临床鉴定为伪狂犬的患病猪的头数为4691头，分别为大约可仔猪和杜洛克主，猪龄在3-20个月，分为试验组3814头，对照组 877头，其中试验组用本发明实施例1制备的重组猪α-干扰素蛋白。治疗用量为小猪10万IU/kg，成年猪20万IU/kg，对照组为现有市场销售的α-干扰素蛋白。治疗猪瘟临床的临床症状统计结果如表3 所示。

表3

将本发明实施例的重组猪α-干扰素蛋白治疗猪瘟、仔猪流行性腹泻以及伪狂犬病的三种常见病毒性猪病的治疗数据统计结果如下所示：

表5

本发明实施例中采用的是现有市场销售的α-干扰素蛋白，猪白细胞干扰素-冻干型，兽药生字(2014)220287036。药剂用量为每头每日注射一次，乳猪10000单位，仔猪20000单位，病重者每天注射两次，连续3-5次一个疗程。

本发明实施例的重组猪α-干扰素蛋白用于预防和治疗猪的多种病毒性传染病，包括猪瘟、蓝耳病、伪狂犬病等，注射使用。预防用量，小猪为5万IU/kg，成年猪5万IU/kg。治疗用量为小猪10万 IU/kg，成年猪20万IU/kg。2～8℃可长期保存。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京宝易生物技术有限公司，烟台市宝盈生物技术有限公司

<120> 一种重组猪α-干扰素蛋白及其编码基因与应用

<130> GG18146032A

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Pro Gln Thr His Ser Leu Ala His Thr Arg Ala Leu Arg Leu Leu Ala

1 5 10 15

Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Asp His Arg Arg Asp

20 25 30

Phe Gly Ser Pro His Glu Ala Phe Gly Gly Asn Gln Val Gln Lys Ala

35 40 45

Gln Ala Met Ala Leu Thr Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser Ala

50 55 60

Ala Ala Trp Asn Glu Ser Leu Leu His Gln Phe Cys Thr Gly Leu Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Arg Asp Leu Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala Gly Leu

85 90 95

Glu Gly Thr Pro Leu Leu Glu Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys

100 105 110

Tyr Phe His Arg Leu Thr Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser Pro

115 120 125

Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Val Met Arg Ser Phe Ser Ser

130 135 140

Ser Arg Asn Leu Gln Asp Arg Leu

145 150

<210> 2

<211> 504

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtgcgacc tgccgcaaac ccacagtctg gcccacaccc gtgcactgcg cttactggcc 60

cagatgcgcc gcatcagccc gttcagctgt ctggaccacc gtcgcgactt cggtagcccg 120

cacgaagcct tcggcggtaa tcaggtgcag aaggcccagg ccatggccct ggtgcacgag 180

atgctgcagc agaccttcca gctgttcagc acagagggca gcgcagcagc atgggacgag 240

agcctgctgc accagttctg cacaggcctg gatcagcagc ctcgcgatcc ggaagcctgc 300

gtgatgcagg aagccggcct ggaaggcacc cctctgctgg aagaggatag catcctggcc 360

gtgcgcaagt acttccaccg cctgaccctg tacctgcaag agaagaacta cagcctgtgc 420

gcctgggaga tcattcgcgc cgaggttatg cgcgccttca gtagcagtac caacctgcag 480

gaccgcctgc gcaagaagga ataa 504

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catatgtgcg acctgccgca aaccc 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttattccttc ttgcgcaggc ggtcc 25

Claims (9)

1.一种蛋白，其特征在于，所述蛋白选自如下(a)或(b):

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有干扰素活性的由(a)衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述的蛋白质的编码基因。

3.如权利要求2所述的蛋白质的编码基因，其特征在于，所述编码基因选自如下(a)或(b):

(a)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码基因；

(b)具有在严格条件下可与SEQ ID NO.2所示DNA序列杂交的核苷酸序列的编码基因。

4.具有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

5.一种表达权利要求1所述蛋白的方法，其将权利要求2或3所述的蛋白基因通过表达载体导入宿主细胞，获得表达权利要求1所述的蛋白质的重组细胞，通过该重组细胞表达所述重组蛋白。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，

所述表达载体为pET表达载体；

所述宿主细胞为大肠杆菌DH5-α或BL21。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，

所述重组菌的培养条件为37℃，加入IPTG诱导表达10-25小时。

8.一种预防和/或治疗猪病毒感染性疾病的药物，其特征在于，

所述药物以权利要求1所述的蛋白为活性成分。

9.如权利要求8所述的药物，其特征在于，

所述病毒性感染疾病包括猪瘟、口蹄疫、蓝耳病、伪狂犬病。