JP2022527981A - 植物での発現が最適化された組換えイリシン遺伝子及びこれを用いた組換えイリシンタンパク質の生産方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、植物での発現が最適化され、配列番号１からなる塩基配列を含む組換えイリシン遺伝子、イリシンタンパク質の生産方法及びこれを含む代謝性疾患の予防又は治療用組成物などに関する。【選択図】図５

Description

本発明は、植物での発現が最適化され、配列番号１からなる塩基配列を含む組換えイリシン遺伝子、イリシンタンパク質の生産方法及びこれを含む代謝性疾患の予防又は治療用組成物などに関する。

本出願は、２０１９年４月２日に出願された大韓民国特許出願第１０－２０１９－００３８２１１号に基づく優先権の利益を主張し、当該出願の明細書及び図面に開示されたすべての内容は本出願に援用される。

肥満は、熱量の摂取と消費の不均衡から発生する代謝性疾患であって、過剰熱量により脂肪組織が非正常的に増加した状態を言う。肥満の原因は、遺伝的影響、西欧化される食生活による環境的な影響、ストレスによる心理的な影響など多様な要因があるが、正確な発生と進行の機構に対しては明確に明かされなかった。大韓民国でも脂肪摂取の割合が速く増加するに従って肥満発生率が持続的に高くなっている。国民健康栄養調査によると、大韓民国の献立での脂肪摂取の割合は、１９９０年９．６％から２００７年１９．５％に２倍以上増加したが、動物性脂肪摂取の増加がこのような脂肪摂取増加の主な原因として明らかになった。２０１０年大韓民国内の大人肥満人口は、３人のうち１人である１２００万人に至っており、特に、体質量指数が３０以上である高度肥満の人口は、１６１万人であって、わずか十余年ぶりに２倍以上急増した状況である。

肥満は、その自体の問題点だけでなく、肥満状態が持続しながら高血圧、高インスリン血症、高脂血症、脂肪肝、動脈硬化症、心臓血管疾患、閉鎖性睡眠無呼吸症、特定癌、関節炎などのような多様な疾病と合併症が発生して最終的には生命を縮めさせるので、一層危険である。また、肥満と肥満による合併症から発生する社会経済的費用も莫大であるので、全世界的に肥満治療に多くの関心があるが、現在まで効果的な肥満又は過多脂肪蓄積による代謝性疾患の治療剤は未だない状況である。

ＵＣＰ１（Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）は、熱の生産を担当する遺伝子として褐色脂肪組織で熱発生の役割を担う。ミトコンドリア膜に存在するＵＣＰ１は、この水素イオンをＡＴＰの合成ではなく熱の生産に用いるようにして、エネルギーを熱に浪費するようにする物質である。動物では褐色脂肪細胞から発現され、体温を維持させる役割をもつことが知られている。ＵＣＰの熱生産は、自然的にエネルギー消費を促進する。

脂肪細胞から分泌されるアディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）は、抗糖尿作用を含めて多様な効能を示すものであると報告されている。すなわち、特に、糖尿病においてアディポネクチンは、インスリン感受性を増加させて血糖を低めることで糖尿病を予防する効能を示す。このようなアディポネクチンは、脂肪細胞が分化されながら発現が増加するタンパク質であると報告されている。したがって、脂肪細胞の分化過程のうちアディポネクチンの発現を増加させる物質は、肥満、糖尿を含む代謝性疾患の予防及び治療に有用な効果を示すことができる。

グリコシル化された１１２個アミノ酸のタンパク質ホルモンであるイリシン（Ｉｒｉｓｉｎ）は、ＦＮＤＣ５のタンパク質分解切断（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ）により形成される。ＦＮＤＣ５の生成は、筋肉での運動により促進され、これは転写補助活性剤であるＰＧＣ１ａによりイリシンに転換され得る。イリシンは、筋肉により分泌され、脂肪組織を循環してエネルギー代謝を調節する。イリシンは、白色脂肪組織が褐色脂肪組織に褐変する過程を促進すると知られている。イリシンは、筋肉組織で合成されて小脳のプルキンエ細胞と細胞間神経末端に存在する。

一方、このような疾病を予防するためのタンパク質を生産／開発しているが、タンパク質のフォールディング、グリコシル化過程（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）などの問題によりバクテリアを利用せず、主に動物細胞を用いて生産されている。しかし、動物細胞を用いたタンパク質の生産方法は、大量生産のための設備拡充に大きい費用が所要されるので、製造が容易ではなく、ワクチンの価格が高価となる場合が大部分である。また、動物細胞を用いて製造されたタンパク質は、貯蔵が容易でないだけでなく、動物に感染可能なウイルスに汚染する可能性が高いという短所を有している。しかし、植物の場合には、動物細胞と異なり動物に感染可能なウイルスに汚染する可能性が非常に低く、耕作面積のみ確保されると、いつでも大量生産が可能であるだけでなく、植物体を通じて長期保管が可能であるので、安定的に低価のタンパク質の生産が可能であると期待される。

本発明は、上記のような従来の問題点を解決するために導出されたもので、植物体を用いて効率的な生産が可能であるだけでなく、高い生理活性効果を示す組換えイリシン遺伝子、それを用いた組換えイリシンタンパク質の製造方法、前記タンパク質の代謝性疾患の予防又は治療用組成物などを提供することを目的とする。

しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、上記で言及した課題に制限されず、言及しなかったまた他の課題は、下の記載から当業者に明確に理解されるべきである。

本発明は、植物での発現が最適化され、配列番号１からなる塩基配列を含む組換えイリシン遺伝子を提供する。前記組換えイリシン遺伝子は、配列番号１からなる塩基配列の機能的同等物も本発明の権利範囲に含まれ、前記機能的同等物とは、塩基の付加、置換、又は欠失の結果、前記塩基配列と少なくとも６０％以上、好ましくは、７０％以上、より好ましくは、８０％以上、最も好ましくは、９０％以上の配列相同性を有するものであって、前記配列番号１からなる塩基配列と実質的に同質の活性を示す遺伝子を意味し、植物体を用いて安定的に生産され得る組換えイリシンタンパク質の遺伝子配列であれば、これに制限されない。

また、本発明は、前記組換えイリシン遺伝子を含む組換えベクターを提供する。

本発明の一具体例において、前記ベクターは、プロモーター遺伝子及び配列番号１からなる塩基配列の順に作動可能となるように順次に連結され得る。

本発明の他の具体例において、前記組換えベクターは、植物由来イリシンタンパク質を発現するためのものであってもよい。

本発明のまた他の具体例において、前記プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーター、ユビキチンタンパク質プロモーター、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＥＦ－１α（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－１ ａｌｐｈａ）プロモーター、ｐＥＭＵプロモーター、ＭＡＳプロモーター、ヒストンプロモーター、Ｃｌｐプロモーターなどであるが、これに制限されない。

本発明のまた他の具体例において、前記組換え発現ベクターは、ＢｉＰ（Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコーディングするポリヌクレオチド、６個のヒスチジンからなるペプチドをコーディングする遺伝子などをさらに含むことができる。

本発明のまた他の具体例において、前記ベクターは、図１に記載した切断地図を含むことができる.

本発明のまた他の具体例において、前記ベクターは、ＢｉＰ（Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子及びタグ用遺伝子からなる群より選択された一つ以上をコーディングする遺伝子をさらに含むことができる。

また、本発明は、前記ベクターにより形質転換された形質転換体を提供する。

本発明の一具体例において、前記形質転換体は、好ましくは、大腸菌、バチルス、サルモネラ、酵母などのような微生物、昆虫細胞、ヒトを含む動物細胞、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ウマ、ウシなどのような動物、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、植物などであってもよく、より好ましくは、イネ、コムギ、ムギ、トウモロコシ、マメ、ジャガイモ、アズキ、エンバク及びモロコシを含む食糧作物類；シロイヌナズナ、ハクサイ、ダイコン、トウガラシ、イチゴ、トマト、スイカ、キュウリ、キャベツ、マクワウリ、カボチャ、ネギ、タマネギ及びニンジンを含む野菜作物類；高麗人参、タバコ、ワタ、ゴマ、サトウキビ、テンサイ、エゴマ、ピーナッツ及びアブラナを含む特用作物類；及びリンゴの木、ナシの木、ナツメの木、モモ、ブドウ、ミカン、カキ、スモモ、アンズ及びバナナを含む果樹類；及びバラ、カーネーション、キク、ユリ及びチューリップを含む草花類などであってもよいが、本発明のベクターにより形質転換され得る生命体であれば、これに制限されない。

本発明の他の具体例において、前記形質転換体は、植物又は植物細胞であってもよいが、これに制限されるものではない。

また、本発明は、（ａ）前記形質転換体を培養するステップ；及び（ｂ）前記形質転換体又は培養液から組換えイリシンタンパク質を分離及び精製するステップを含む組換えイリシンタンパク質の生産方法を提供する。前記形質転換体は、好ましくは、細胞自体、植物体又は細胞を含む培養物であってもよく、前記培養液は、好ましくは、細胞を培養した後、細胞を除去した培養液であってもよいが、本発明の組換えタンパク質を含んでいる場合、これに制限されない。

本発明の一具体例において、前記ステップ（ｂ）の精製は、水溶性画分を用いて精製するものであってもよいが、これに制限されない。

また、本発明は、前記方法で生産された植物由来組換えイリシンタンパク質を有効成分として含む代謝性疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。

また、本発明は、前記方法で生産された植物由来組換えイリシンタンパク質を有効成分として含む代謝性疾患の予防又は改善用食品組成物を提供する。

また、本発明は、前記方法で生産された植物由来組換えイリシンタンパク質を個体に投与するステップを含む代謝性疾患を予防又は治療する方法を提供する。

また、本発明は、前記方法で生産された植物由来組換えイリシンタンパク質の代謝性疾患の予防又は治療使用を提供する。

また、本発明は、前記方法で生産された植物由来組換えイリシンタンパク質の代謝性疾患治療用薬剤の製造のための使用を提供する。

本発明の一具体例において、前記代謝性疾患は、好ましくは、肥満、糖尿、高血圧、高脂血症、高中性脂肪血症、高コレステロール症、脂肪肝又は動脈硬化症などであってもよいが、これに制限されない。

本発明の他の具体例において、前記組換えイリシンタンパク質は、グリコシル化された組換えイリシンタンパク質及び非グリコシル化された組換えイリシンタンパク質からなる群より選択された一つ以上であってもよいが、これに制限されない。

本発明のまた他の具体例において、前記組換えイリシンタンパク質は、配列番号４からなるアミノ酸配列を含むことができるが、これに制限されない。

また、本発明は、前記方法で生産された植物由来組換えイリシンタンパク質を含む褐色脂肪細胞の分化誘導用組成物を提供する。

また、本発明は、前記方法で生産された植物誘導組換えイリシンタンパク質を白色脂肪細胞に処理するステップを含む白色脂肪細胞から褐色脂肪細胞への分化誘導方法を提供する。

本発明の組換えイリシンタンパク質は、植物体でも効果的に発現されるだけでなく、高い水溶解性を有しているため分離及び精製が容易であり、また、ＵＣＰ１及びアディポネクチンの発現増加効果を示すので、代謝性疾患の治療に有用に用いられ得ると期待される。

図１は、本発明の一実施例による植物体でイリシン（Ｉｒｉｓｉｎ）の発現のための遺伝子の配列を示した図である。 図２は、本発明の一実施例による植物体でイリシンの発現をウエスタンブロッティングで確認した結果を示した図である。 図３は、本発明の一実施例による植物由来組換えイリシンの分離精製結果を示した図である。 図４は、本発明の一実施例によるエンドグリコシダーゼＨ処理を通じた組換えイリシンのグリコシル化有無を確認した結果を示した図である。 図５は、本発明の一実施例による３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞に組換えイリシンタンパク質を刺激した後、細胞内ＵＣＰ－１タンパク質の変化をウエスタンブロッティングした結果である。 図６は、本発明の一実施例による３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞に組換えイリシンタンパク質を刺激した後、細胞内アディポネクチンタンパク質の変化をウエスタンブロッティングした結果である。（＊ｐ＜０．０５ ｖｓ ｃｏｎｔｒｏｌ）

本発明では、配列番号１からなるイリシン遺伝子を用いる場合、植物体でも高い生理活性を有するイリシンタンパク質を効率的に生産及び分離が可能であるだけでなく、既存イリシンタンパク質の生理活性を維持することを確認した。したがって、本発明のイリシンタンパク質は、安定的で効率的な大量生産が可能であるので、低価で且つ安定的なイリシンタンパク質を提供し得ると期待される。

本明細書において、「組換えイリシン遺伝子」は、配列番号１からなる遺伝子塩基配列を含むものであってもよく、好ましくは、配列番号１からなる塩基配列からなるものであってもよい。また、前記遺伝子変異体が本発明の範囲に含まれる。具体的に、前記遺伝子は、配列番号１の塩基配列と７０％以上、より好ましくは、８０％以上、最も好ましくは、９０％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列相同性を有するポリヌクレオチドを含む。

本明細書において、「発現用ベクター」とは、ベクター内に挿入された異種の核酸によりコーディングされるペプチド又はタンパク質を発現できるベクターを指称するもので、好ましくは、組換えイリシンタンパク質を発現できるように製造されたベクターを意味する。前記「ベクター」は、試験管内、生体外又は生体内で宿主細胞に塩基の導入及び／又は転移のための任意の媒介物を言い、他のＤＮＡ断片が結合して結合した断片の複製をもたらすことができるレプリコン（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）であってもよく、「レプリコン」とは、生体内でＤＮＡ複製の自家ユニットとして機能する、すなわち、自らの調節により複製可能な、任意の遺伝的単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルスなど）を言う。本発明の組換え発現ベクターは、好ましくは、ＲＮＡ重合酵素が結合する転換開始因子であるプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転換を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコーディングする配列と転換及び解読の終結を調節する配列、ターミネータなどを含むことができ、より好ましくは、タンパク質の合成量を増加させるためのＭ１７の５′ＵＴＲ部位遺伝子、目的タンパク質を小胞体に移動させるためのＢｉＰ遺伝子、組換えタンパク質を容易に分離するためのタグ用遺伝子などを含むことができ、より好ましくは、形質転換体を選別するための抗生剤耐性遺伝子などの選別用マーカー遺伝子などをさらに含むことができる。

前記「ＢｉＰ遺伝子」は、発現された組換えタンパク質を小胞体に移動させるために用いられたＢｉＰ配列のうち一部であって、好ましくは、配列番号２の塩基配列を含む遺伝子であり、最も好ましくは、配列番号２からなる遺伝子であるが、配列番号２の塩基配列と８０％以上、より好ましくは。９０％以上、最も好ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性％」は、最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域でポリヌクレオチド配列の一部は、さらに、配列の最適配列に対する参考配列（追加又は削除を含まない）に比べて追加又は削除（すなわち、ギャップ）を含むことができる。前記「ＢＩＰ遺伝子」は、発現組換えタンパク質をリボソームに移動させるために用いられるものであって、植物細胞で発現された後に切られることになる。

前記「タグ用遺伝子」は、好ましくは、１個～１０個のヒスチジンからなるペプチド断片、すなわち、Ｈｉｓ－タグを用いることができる。最も好ましく、６個のヒスチジンからなるペプチド断片が付着されるものであってもよく、配列番号３の塩基配列で表示される。上記でヒスチジン残基は、組換えタンパク質を発現させた後精製時に必要なタグとして最も多く用いられるタグのうち一つであって、特異性が高くなければならず、所望するタンパク質の構造に影響を最大限少なく与えなければならない。好ましくは、ヒスチジンが１乃至１０個が連続してペプチドを構成し得るが、サイズが小さくて本来のタンパク質構造に影響もあまり与えないので、組換えタンパク質を作った後に別に切らなくても良いという便宜性がある。タグは、ベクターの種類によって標的タンパク質のＮ末端（前側）、Ｃ末端（後側）のいずれの側にも作ることができ、タンパク質の構造に影響を与えることによって前又は後側を決定することができる。

前記選別用マーカー遺伝子には、一例として、グリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）又はホスフィノスリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）のような除草剤抵抗性遺伝子、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、Ｇ４１８、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）のような抗生剤耐性遺伝子、ａａｄＡ遺伝子などが含まれ得、前記プロモーターには、一例として、ｐＥＭＵプロモーター、ＭＡＳプロモーター、ヒストンプロモーター、Ｃｌｐプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーター、ユビキチンタンパク質プロモーター、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＥＦ－１α（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－１ ａｌｐｈａ）プロモーターなどが含まれ得、前記ターミネータは、一例として、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、イネアミラーゼＲＡｍｙ１ Ａターミネータ、パセオリンターミネータ、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのオクトパイン（Ｏｃｔｏｐｉｎｅ）遺伝子のターミネータ、大腸菌のｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネータなどであるが、前記例は、例示に過ぎず、これらに制限されない。

本明細書において、前記「ベクター」は、図１に開示された切断地図を含むことができるが、これに制限されるものではない。

本明細書において、前記「ベクター」は、好ましくは、配列番号８のアミノ酸配列を含む遺伝子であり、最も好ましくは、配列番号８からなるアミノ酸配列からなるが、配列番号８の配列と８０％以上、より好ましくは、９０％以上、より好ましくは、９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

また、前記ベクターのアミノ酸配列は、配列番号７からなる遺伝子配列で暗号化されるものであってもよいが、これに制限されるものではない。具体的に、前記遺伝子は、配列番号７の塩基配列と９０％以上、より好ましくは、９５％以上、最も好ましくは、９８％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域でポリヌクレオチド配列の一部は、さらに、配列の最適配列に対する参考配列（追加又は削除を含まない）に比べて追加又は削除（すなわち、ギャップ）を含むことができる。

本明細書において、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、注入されたＤＮＡにより生物の遺伝的な性質が変わることを総称し、「形質転換体（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍ）」とは、分子遺伝学的方法で外部の遺伝子を注入して製造された生命体であって、好ましくは、本発明の組換え発現ベクターにより形質転換された生命体であり、前記生命体は、微生物、真核細胞、昆虫、動物、植物など生命がある生物であれば、制限がなく、好ましくは、大腸菌、サルモネラ、バチルス、酵母、動物細胞、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ウマ、ウシ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、植物など等であるが、これらに制限されない。

本明細書において、「植物」は、タンパク質を大量生産できる植物であれば、制限なしに用いることができるが、より具体的には、タバコ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、イネ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、アルファルファ、キビ、コムギ、ワタ、ピーナッツ、トマト、ジャガイモ、チシャ及びトウガラシからなる群より選択されるものであってもよく、好ましくは、タバコであってもよい。本発明でのタバコは、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｅｎｕｓ）植物としてタンパク質を過発現できるものであれば、特に種類は制限されず、形質転換方法とタンパク質大量生産の目的に合わせて適切した品種を選択して本発明を実施することができる。例えば、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ Ｌ．やＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．ｘａｎｔｈｉなどの品種を用いることができる。

本明細書において、前記形質転換体は、植物又は植物の細胞であってもよいが、これに制限されるものではない。

前記形質転換体は、形質転換、トランスフェクション、アグロバクテリウム媒介形質転換方法、パーティクルガン衝撃法、超音波処理法、電気穿孔法及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）－媒介形質転換方法などの方法で製造され得るが、本発明のベクターを注入できる方法であれば、制限がない。

本明細書において、「溶解性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）」とは、目的タンパク質又はペプチドが人体に投与するのに適切な溶媒に溶解され得る程度を意味する。具体的には、特定の温度で所定の溶媒に対して溶質が飽和した程度を示すものであってよい。溶解性は、溶質の飽和濃度を決定することによって測定することができ、例えば、溶媒に溶質を過量に添加し、これを撹拌し、濾過した後、濃度をＵＶ分光器又はＨＰＬＣなどを用いて測定することができるが、これに制限されるものではなく、高い溶解性は、組換えタンパク質の分離精製に有利であり、組換えタンパク質の凝集が抑制されて組換えタンパク質の生理活性又は薬理的な活性を維持するのに長所を有する。

本発明の「組換えイリシンタンパク質」は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、好ましくは、配列番号４のアミノ酸配列からなる。本発明の一実施例によると、本発明の組換えイリシン遺伝子を含むベクターにより形質転換された植物から生産された組換えイリシンタンパク質は、好ましくは、グリコシル化された組換えイリシンタンパク質及び非グリコシル化された組換えイリシンタンパク質からなる群より一つ以上選択されたものであってもよく、より好ましくは、グリコシル化された組換えイリシンタンパク質及び非グリコシル化された組換えイリシンタンパク質を全て含むものであってもよいが、これに制限されない。

本発明で用いる用語「グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」は、細胞（真核生物）のタンパク質翻訳後の過程としてＮ－グリコシル化とＯ－グリコシル化に分けられるが、これは付く作用基によって異なり、細胞から生成されたタンパク質にラクトースなどの糖が付く過程を総称して「グリコシル化」と言う。グリコシル化過程によって糖鎖がタンパク質に連結されると、タンパク質が「フォールディング」過程を経て立体的な構造物を形成し、これはタンパク質がほどけずに長い間維持され得る安定性を付与する。また、タンパク質に付加した糖鎖は細胞膜に行って細胞膜タンパク質になって抗原のような効果を示すこともある。前記のようにグリコシル化されたタンパク質を糖タンパク質と言うが、代表的な糖タンパク質には、免疫反応において重要な役目をする抗体などがある。本発明に用いられた配列番号８のベクターのアミノ酸配列を用いてグリコシル化有無予測プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／）を作動させた結果、１６番目又は６１番目のアスパラギン（Ｎ）からＮ－グリコシル化が起きると予測された。

したがって、本発明に用いられた組換えイリシンタンパク質は、グリコシル化された組換えイリシンタンパク質及び非グリコシル化された組換えイリシンタンパク質からなる群より一つ以上選択されたものであってもよく、前記グリコシル化された組換えイリシンタンパク質は、配列番号４からなる組換えイリシンタンパク質の８番目及び／又は５３番目のアスパラギン（Ｎ）からＮ－グリコシル化が起きたものであってもよいが、これに制限されるものではなく、本発明と同等の効果を有する範囲内で変形が可能である。

本発明の他の様態として、本発明は、組換えイリシンタンパク質を含む代謝性疾患の予防又は治療用薬学的組成物、及び改善用食品組成物を提供する。

本発明の他の様態として、本発明は、組換えイリシンタンパク質を含む褐色脂肪細胞分化誘導用組成物を提供する。

本発明の他の様態として、本発明は、前記方法で生産された植物由来組換えイリシンタンパク質を個体に投与するステップを含む代謝性疾患を予防又は治療する方法を提供する。

本発明の他の様態として、本発明は、前記方法で生産された植物由来組換えイリシンタンパク質の代謝性疾患の予防又は治療使用を提供する。

また、本発明は、前記方法で生産された植物由来組換えイリシンタンパク質の代謝性疾患治療用薬剤製造のための使用を提供する。

本発明の一具体例において、前記代謝性疾患は、好ましくは、肥満、糖尿、高血圧、高脂血症、高中性脂肪血症、高コレステロール症、脂肪肝又は動脈硬化症などであってもよいが、これに制限されない。

また、本発明は、前記方法で生産された植物由来組換えイリシンタンパク質を含む褐色脂肪細胞分化誘導用組成物を提供する。

また、本発明は、前記方法で生産された植物誘導組換えイリシンタンパク質を白色脂肪細胞に処理するステップを含む白色脂肪細胞から褐色脂肪細胞への分化誘導方法を提供する。

本明細書において、「代謝性疾患」は、エネルギーの過剰摂取又はホルモンの不均衡など多様な原因により体内エネルギー代謝が非正常的に行われて脂肪が過剰に合成されるか蓄積されて発生する疾患を意味する。前記代謝性疾患は、具体的には、肥満、糖尿、高血圧、高脂血症、高中性脂肪血症、高コレステロール症、脂肪肝又は動脈硬化症であってもよい。

本発明で前記組換えイリシンタンパク質は、細胞内ＵＣＰ１（Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ １）の発現を増加させることで、イリシンの機能として知られる、白色脂肪細胞を褐色脂肪細胞に変えて肥満、糖尿など代謝性疾患を治療する効果がある。

本発明で前記組換えイリシンタンパク質は、細胞内アディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）の発現を増加させることで、インスリン抵抗性を改善するなど代謝性疾患を治療することに効果がある。

本発明で、「褐色脂肪細胞（Ｂｒｏｗｎ Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ；ＢＡ）」とは、白色脂肪細胞とは反対に、脂肪酸を酸化分解してそのエネルギーを熱として放出する細胞である。これは、褐色脂肪細胞が特異的に発現するミトコンドリア内膜タンパク、ＵＣＰ１（Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １）が、酸化的リン酸化を脱共役させるためである。マウスなど齧歯類では、ＢＡ細胞は、肩胛骨間、後頚部、縦隔、腎臓周囲などに存在する。また、ＵＣＰ１ノックアウトマウスの解釈などから、ＢＡ細胞は、肥満と耐糖能異常を抑制すると知られている。

本発明による組成物のイリシンは、その自体又は塩、好ましくは、薬学的に許容可能な塩の形態で用いられ得る。本発明で用語、「薬学的に許容可能な塩」とは、薬学的に許容される無機酸、有機酸又は塩基から誘導された塩を含む。

適切な酸の例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、窒酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン－ｐ－スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、グルコン酸、ナフタリン－２－スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられる。酸付加塩は、通常の方法、例えば、化合物を過量の酸水溶液に溶解させ、この塩をメタノール、エタノール、アセトン又はアセトニトリルのような水混和性有機溶媒を用いて沈澱させて製造することができる。また、同モル量の化合物及び水中の酸又はアルコールを加熱し、引き続き、前記混合物を蒸発させて乾燥させるか、又は析出された塩を吸引濾過して製造することができる。

適切な塩基から誘導された塩は、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、マグネシウムなどのアルカリ土類金属及びアンモニウムなどを含むことができるが、これに制限されるものではない。アルカリ金属又はアルカリ土類金属塩は、例えば、化合物を過量のアルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物溶液中に溶解し、非溶解化合物塩を濾過した後、濾液を蒸発、乾燥させて得ることができる。このとき、金属塩としては、特に、ナトリウム、カリウム又はカルシウム塩を製造することが製薬上適切であり、また、これに対応する銀塩は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属塩を適当な銀塩（例えば、硝酸銀）と反応させて得ることができる。

本発明の組成物内の前記イリシンの含量は、疾患の症状、症状の進行程度、患者の状態などによって適切に調節可能であり、例えば、全体組成物重量を基準として０．０００１～９９．９重量％又は０．００１～５０重量％であってもよいが、これに限定されるものではない。前記含量比は、溶媒を除去した乾燥量を基準とした値である。

本発明によるイリシンの薬学的に有効な量としては、０．００１～３００ｍｇ／ｄａｙ／体重ｋｇ、好ましくは、０．０１～２００ｍｇ／ｄａｙ／体重ｋｇである。しかし、前記薬学的に有効な量は、疾患及びその重症度、患者の年齢、体重、健康状態、性別、投与経路及び治療期間などのような多くの因子によって適宜変更され得る。

本発明による薬学的組成物は、薬学的組成物の製造に通常的に用いる適切した担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。前記賦形剤は、例えば、希釈剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、吸着剤、保湿剤、フィルム－コーティング物質及び制御放出添加剤からなる群より選択された一つ以上であってもよい。

本発明による薬学的組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、徐放性顆粒剤、腸溶性顆粒剤、液剤、点眼剤、エシリック剤、乳剤、懸濁液剤、酒精剤、トローチ剤、芳香水剤、リモナーデ剤、錠剤、徐放性錠剤、腸溶性錠剤、舌下錠、硬質カプセル剤、軟質カプセル剤、徐放性カプセル剤、腸溶性カプセル剤、丸剤、チンキ剤、軟エキス剤、乾エキス剤、流エキス剤、注射剤、カプセル剤、灌流液、硬膏剤、ローション剤、パスタ剤、噴霧剤、吸入剤、パッチ剤、滅菌注射溶液又はエアロゾールなどの外用剤などの形態で剤形化して用いられ得、前記外用剤は、クリーム、ゲル、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、パスタ剤又はパップ剤などの剤形を有することができる。

本発明による薬学的組成物に含まれ得る担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、オリゴ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアガム、アルジネード、ゼラチン、カルシウムフォスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられる。

製剤化する場合には、通常用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調剤される。

本発明による錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤の添加剤としてトウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、コムギ澱粉、乳糖、白糖、ブドウ糖、果糖、Ｄ－マンニトール、沈降炭酸カルシウム、合成ケイ酸アルミニウム、リン酸一水素カルシウム、硫酸カルシウム、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、精製ラノリン、非晶質セルロース、デキストリン、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カオリン、尿素、コロイド性シリカゲル、ヒドロキシプロピルスターチ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、１９２８、２２０８、２９０６、２９１０、プロピレングリコール、カゼイン、乳酸カルシウム、プロモゲルなど賦形剤；ゼラチン、アラビアガム、エタノール、寒天パウダー、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ブドウ糖、精製水、カゼインナトリウム、グリセリン、ステアリン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、非晶質セルロース、デキストリン、ヒドロキシセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ヒドロキシメチルセルロース、精製セラック、澱粉糊、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどの結合剤が用いられ得、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、トウモロコシ澱粉、寒天パウダー、メチルセルロース、ベントナイト、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クエン酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、無水ケイ酸、１－ヒドロキシプロピルセルロース、デキストラン、イオン交換樹脂、酢酸ポリビニル、ホルムアルデヒド処理カゼイン及びゼラチン、アルギン酸、アミロース、グアーガム、重曹、ポリビニルピロリドン、リン酸カルシウム、ゲル化澱粉、アラビアガム、アミロペクチン、ペクチン、ポリリン酸ナトリウム、エチルセルロース、白糖、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、Ｄ－ソルビトール液、軽質無水ケイ酸などの崩壊剤；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、水素化植物油（Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｏｉｌ）、タルク、石松子、カオリン、ワセリン、ステアリン酸ナトリウム、カカオ脂、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸マグネシウム、ポリエチレングリコール４０００、６０００、流動パラフィン、水添大豆油（Ｌｕｂｒｉ ｗａｘ）、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸亜鉛、ラウリル硫酸ナトリウム、酸化マグネシウム、マクロゴ－ル（Ｍａｃｒｏｇｏｌ）、合成ケイ酸アルミニウム、無水ケイ酸、高級脂肪酸、高級アルコール、シリコーン油、パラフィン油、ポリエチレングリコール脂肪酸エーテル、澱粉、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ｄｌ－ロイシン、 軽質無水ケイ酸などの滑沢剤；が用いられ得る。

本発明による液状の添加剤としては、水、希塩酸、希硫酸、クエン酸ナトリウム、モノステアリン酸スクロース類、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル類（ツインエステル）、ポリオキシエチレンモノアルキルエーテル類、ラノリンエーテル類、ラノリンエステル類、酢酸、塩酸、アンモニア水、炭酸アンモニウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、プロラミン、ポリビニルピロリドン、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどが用いられ得る。

本発明によるシロップ剤には、白糖の溶液、他の糖類あるいは甘味剤などが用いられ得、必要に応じて、芳香剤、着色剤、保存剤、安定剤、懸濁化剤、乳化剤、粘稠剤などが用いられ得る。

本発明による乳剤には、精製水が用いられ得、必要に応じて、乳化剤、保存剤、安定剤、芳香剤などが用いられ得る。

本発明による懸濁剤には、アカシア、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、非晶質セルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、１８２８、２９０６、２９１０など懸濁化剤が用いられ得、必要に応じて、界面活性剤、保存剤、安定剤、着色剤、芳香剤が用いられ得る。

本発明による注射剤には、注射用蒸溜水、０．９％塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロース＋塩化ナトリウム注射液、ＰＥＧ、ラクテートリンゲル注射液、エタノール、プロピレングリコール、非揮発性油－ゴマ油、綿油、落花生油、マメ油、トウモロコシ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、安息香酸ベンゼンのような溶剤；安息香酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、尿素、ウレタン、モノエチルアセトアミド、ブタゾリジン、プロピレングリコール、ツイン類、ニコチン酸アミド、ヘキサミン、ジメチルアセトアミドのような溶解補助剤；弱酸及びその塩（酢酸と酢酸ナトリウム）、弱塩基及びその塩（アンモニア及び酢酸アンモニウム）、有機化合物、タンパク質、アルブミン、ペプトン、カム類のような緩衝剤；塩化ナトリウムのような等張化剤；重亜硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ_３）二酸化炭素ガス、メタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３）、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_３）、窒素ガス（Ｎ_２）、エチレンジアミン四酢酸のような安定剤；亜硫酸水素ナトリウム０．１％、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、チオウレア、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、アセトン亜硫酸水素ナトリウムのような硫酸化剤；ベンジルアルコール、クロロブタノール、塩酸プロカイン、ブドウ糖、グルコン酸カルシウムのような無痛化剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギン酸ナトリウム、ツイン８０、モノステアリン酸アルミニウムのような懸濁化剤を含むことができる。

本発明による坐剤には、カカオ脂、ラノリン、ウィテプソル、ポリエチレングリコール、グリセロールゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸とオレイン酸の混合物、スバナル（Ｓｕｂａｎａｌ）、綿油、落花生油、ヤシ油、カカオバター＋コレステロール、レシチン、ラネトワックス、モノステアリン酸グリセロール、ツイン又はスパン、イムハウゼン（Ｉｍｈａｕｓｅｎ）、モノレン（モノステアリン酸プロピレングリコール）、グリセリン、アデプスソリダス（Ａｄｅｐｓ ｓｏｌｉｄｕｓ）、ブチラムテゴ－Ｇ（Ｂｕｙｔｙｒｕｍ Ｔｅｇｏ－Ｇ）、セベスファーマ１６（Ｃｅｂｅｓ Ｐｈａｒｍａ １６）、ヘキサライドベース ９５、コトマー（Ｃｏｔｏｍａｒ）、ヒドロコート ＳＰ、Ｓ－７０－ＸＸＡ、Ｓ－７０－ＸＸ７５（Ｓ－７０－ＸＸ９５）、ヒドロコート（Ｈｙｄｒｏｋｏｔｅ） ２５、ヒドロコート ７１１、イドロポスタル（Ｉｄｒｏｐｏｓｔａｌ）、マサエストラリウム（Ｍａｓｓａ ｅｓｔｒａｒｉｕｍ、Ａ、ＡＳ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｔ）、マサ－ＭＦ、マスポル、マスポル－１５、ネオスポスタル－Ｎ、パラマウンド－Ｂ、スポシロ（ＯＳＩ、ＯＳＩＸ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、Ｌ）、坐剤基剤ＩＶタイプ（ＡＢ、Ｂ、Ａ、ＢＣ、ＢＢＧ、Ｅ、ＢＧＦ、Ｃ、Ｄ、２９９）、スポスタル（Ｎ、Ｅｓ）、ウェコビ（Ｗ、Ｒ、Ｓ、Ｍ、Ｆｓ）、テゼスタトリグリセリド基剤（ＴＧ－９５、ＭＡ、５７）のような基剤が用いられ得る。

経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記抽出物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）又はラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを交ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムスチレートタルクのような滑剤も用いられる。

経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、頻繁に用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のため製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが用いられ得る。

本発明による薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスクの割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出割合、治療期間、同時使用する薬物を含む要素及びその他医学分野によく知られた要素によって決定され得る。

本発明による薬学的組成物は、個別治療剤で投与するか、他の治療剤と併用して投与され得、従来の治療剤とは順次又は同時に投与され得、単一又は多重投与され得る。上記した要素を全て考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは本発明が属する技術分野において通常の技術者により容易に決定され得る。

本発明の薬学的組成物は、個体に多様な経路に投与され得る。投与の全ての方式は、予想できるが、例えば、経口服用、皮下注射、腹腔投与、静脈注射、筋肉注射、脊髓周り空間（硬膜内）注射、舌下投与、頬側粘膜投与、直腸内挿入、膣内挿入、眼球投与、耳投与、鼻腔投与、吸入、口又は鼻を通じた噴霧、皮膚投与、経皮投与などによって投与され得る。

本発明の薬学的組成物は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別、体重及び疾患の重症度などの多くの関連因子とともに活性成分である薬物の種類によって決定される。

本明細書において、「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」とは、本発明の組換えイリシンタンパク質が投与され得る対象を言い、より具体的には、ヒト又は非ヒトである霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ及びウソなどの哺乳類であってもよいが、これに制限されるものではない。

本発明において、「投与」とは、任意の適切な方法で個体に所定の本発明の組成物を提供することを意味する。

本発明の目的上用語「予防」は、本発明の組成物の投与により代謝性疾患の発病を抑制するか遅延させる全ての行為を意味し、「治療」は、代謝性疾患の発生又は再発抑制、症状の緩和、疾病の直接又は間接的な病理学的結果の減少、疾病進行速度の減少、疾病状態の改善、好転、緩和又は改善された予後を意味する。本発明の用語「改善」とは、本発明の組成物の投与により治療される状態と関連されたパラメーター、例えば、症状の程度を少なくとも減少させる全ての行為を意味する。

本発明の食品組成物は、機能性食品（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｏｏｄ）、栄養補助剤（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、健康食品（ｈｅａｌｔｈ ｆｏｏｄ）、健康機能食品及び食品添加剤（ｆｏｏｄ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）などの全ての形態を含む。前記類型の食品組成物は、当業界に公知された通常的な方法によって多様な形態で製造できる。

例えば、健康食品としては、本発明のイリシンを茶、ジュース及びドリンクの形態で製造して飲用するようにするか、顆粒化、カプセル化及び粉末化して摂取できる。また、本発明のイリシンを代謝性疾患に対して効果があると知られている公知の物質又は活性成分とともに混合して組成物の形態で製造することができる。例えば、本発明の食品組成物は、イリシン成分以外に微量のミネラル、ビタミン、脂質、糖類及び公知の代謝性疾患に対する治療効果を有した成分などをさらに含有することができる。前記ミネラルとしては、カルシウム、鉄など成長期に必要な栄養成分が含有され得、ビタミンとしては、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６などが含有され得る。脂質としては、アルコキシグリセロール又はレシチンなどが含有され得、糖類としては、フラクトオリ糖などが含有され得る。

また、機能性食品としては、飲料（アルコール性飲料を含む）、果実及びその加工食品（例えば、果物缶、瓶詰、ジャム、マーマレードなど）、魚類、肉類及びその加工食品（例えば、ハム、ソーセージコンビーフなど）、パン類及び麺類（例えば、うどん、そば、ラーメン、スパゲッティ、マカロニなど）、果汁、各種ドリンク、クッキー、飴、乳製品（例えば、バター、チーズなど）、食用植物油脂、マーガリン、植物性タンパク質、レトルト食品、冷凍食品、各種調味料（例えば、味噌、醤油など）などに本発明のイリシンを添加して製造することができる。

また、本発明のイリシンを食品添加剤の形態で用いるためには、粉末又は濃縮液の形態で製造して用いることができる。

本発明の食品組成物のうちイリシンの好ましい含量は、食品組成物総重量に対して食品の全体重量を基準で０．０１～１００％、好ましくは、０．１～５０％の割合で含有され得る。

本発明で用いられる用語は、本発明での機能を考慮するとともにできるだけ現在広く用いられる一般的な用語を選択したが、これは当分野の技術者の意図又は判例、新しい技術の出現などによって変わることができる。また、特定の場合は出願人が任意に選定した用語もあり、この場合、該当する発明の説明部分で詳しくその意味を記載する。したがって、本発明で用いられる用語は、単純な用語の名称ではなく、その用語が有した意味と本発明の全般にわたった内容に基づいて定義されなければならない。

本発明の明細書全体で、ある部分がある構成要素を「含む」と記載するとき、これは特別に反対される記載がない限り、他の構成要素を除外するものではなく、他の構成要素をさらに含み得ることを意味する。本発明の明細書全体で用いる程度の用語「約」、「実質的に」などは、言及された意味に固有した製造及び物質許容誤差が提示されるとき、その数値で又はその数値に近接した意味で用いられ、本発明の理解を助けるために正確であるか絶対的な数値が言及された開示内容を非良心的な侵害者が不当に用いることを防止するために用いられる。

＜発明の実施のための形態＞
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。

［実施例１：植物発現用イリシン（Ｉｒｉｓｉｎ）組換えベクターの製造］
図１のように、植物体からイリシンを発現させ得るように組み換えた植物発現ベクターを作製した。より詳しくは、ヒトイリシンホルモンに対する遺伝子情報を確保し、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）での発現に最適化された配列で遺伝子を合成した（配列番号１）。ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターのＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター遺伝子とＮＯＳ終結子（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）の間にＢｉＰ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）信号ペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）をコーディングするポリヌクレオチド（配列番号２）、６個の連続したヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎ）をコーディングするポリヌクレオチド（配列番号３）及びイリシンをコーディングするポリヌクレオチドを順に連結してイリシン植物発現ベクターを作製した。

［実施例２：組換えイリシンタンパク質の発現の確認］
（２．１．植物発現ベクターの一過性発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ））
上記の実施例１で準備した植物発現ベクターをアグロバクテリア菌株ＬＢＡ４４０４に電気穿孔法（エレクトロポレーション）を用いて形質転換させた。形質転換されたアグロバクテリアを５ｍｌのＹＥＰ（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｐｅｐｔｏｎｅ）液体培地（酵母抽出物 １０ｇ、ペプトン １０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、カナマイシン ５０ｍｇ／Ｌ、リファンピシン ２５ｍｇ／Ｌ）で２８℃の条件で１６時間の間振盪培養した後、１次培養液１ｍｌを５０ｍｌの新しいＹＥＰ培地に接種して２８℃の条件で６時間の間振盪培養した。このように培養されたアグロバクテリアは、遠心分離（７，０００ｒｐｍ、４℃、５分）して収集した後、インフィルトレーション（Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）バッファー（１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭアセトシリンゴン）に６００ｎｍの波長でＯ．Ｄ．１．０の濃度で再び懸濁した。アグロバクテリア懸濁液は、注射針を除去した注射器を用いてベンサミアナタバコの葉の裏面に注入する方法でアグロ－インフィルトレーション（Ａｇｒｏ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行った。

（２．２．植物体で組換えイリシンの発現の確認）
上記の実施例２．１で準備した植物の葉からタンパク質を抽出して遠心分離した後、溶液に含まれている水溶性画分（Ｓ）にあるタンパク質とペレット（ｐｅｌｌｅｔ；ｐ）画分にあるタンパク質をウエスタンブロッティングで確認した。より詳しくは、各画分３０μＬをＳＤＳ試料バッファーと混合した後加熱した。そして、１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに電気泳動してサイズ別にタンパク質を分離し、分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた後に、５％スキムミルクを用いてブロッキング段階を経た後に、６個のＨｉｓと反応する抗体を結合させ、ＥＣＬ溶液を製造社で提供する方法によって処理して組換えイリシンの発現を確認した。その結果は、図２に示した。

図２に示したように、植物から発現された組換えイリシンは、水溶性画分に存在することを確認し、互いに異なるサイズを有したイリシン３種類が同時に作製されることを確認した。

前記結果を通じて、本発明のイリシン発現用ベクターは、植物体で組換えイリシンタンパク質を効果的に発現させることができ、前記ベクターを用いて製造されたイリシンは、高い溶解性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）を有しているので、分離精製が容易であり、組換えタンパク質の凝集が抑制されて組換えタンパク質の生理活性又は薬理的な活性を維持するのに効果的であることが確認できた。

［実施例３：組換えイリシンの分離精製］
上記の実施例２．１で準備したベンサミアナタバコ４０ｇにタンパク質抽出溶液（５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１Ｘタンパク質加水分解酵素抑制剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ））２００ｍＬを添加してブレンダーで組織を破砕した後、１３，０００ｒｐｍで２０分間４℃で遠心分離してタンパク質抽出液を回収した。

発現されたイリシンの分離精製のために、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースレジンが充填されたカラムで親和クロマトグラフィーを実施した。カラムにレジンを５ｍＬ充填した後、洗浄溶液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）５０ｍＬで平衡化させた。回収したタンパク質抽出液をカラムに適用した後、洗浄溶液１００ｍＬを流してレジンを洗浄し、溶出溶液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール）で組換えタンパク質を溶出した。組換えタンパク質が含まれた溶出溶液は、１０ｋＤサイズのフィルターを用いて生理食塩水（ＰＢＳ）溶液で交替及び濃縮を実施して、分離精製された組換えイリシンを獲得した。分離精製されたタンパク質は、タンパク質電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）した後、クマシー染色法を通じて確認した。（図３）

図３に示したように、約１３ｋＤ乃至それ以上のサイズを有した３種類の組換えイリシンタンパク質が精製されたことを確認した。

本発明の組換えタンパク質は、既存のタンパク質との大きい差なしによく精製された。このような結果は、タンパク質を植物から発現させる場合、糖構造が変異されて生産効率が落ちる問題点が発見されなかったことを確認したものであって、本発明によるタンパク質が植物からよく生産されることを確認した結果である。

［実施例４：エンドグルコシダーゼＨ処理を通じた組換えイリシングリコシル化有無の確認］
植物から分離精製したイリシンのグリコシル化有無を確認するために、エンドグルコシダーゼＨのＮ－グリコシル化除去エッセイを行った。より詳しくは、上記の実施例３で準備した組換えイリシン１μｇに１０Ｘディナチュレーティングバッファー（５％ ＳＤＳ、０．４Ｍ ＤＴＴ）を加えた後、１００℃で１０分間加熱した。ここに、最終濃度が５０ｍＭとなるようにｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ５．５）バッファーを入れた後、５０ＵのエンドグルコシダーゼＨを添加して３７℃で１時間の間反応を進行した。エンドグルコシダーゼＨを含まない対照群の反応のためには、エンドグルコシダーゼＨの代わりに同じ体積の水を加えた。反応の終了後、タンパク質電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）した後、クマシー染色法（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）通じて組換えイリシンのＮ－グリコシル化除去による分子量変化を観察した。（図４）

図４に示したように、Ｅｎｄｏ－Ｈを処理した場合、イリシンの糖鎖（Ｇｌｙｃａｎ）が切断されて一つのサイズのイリシンが観察された。これを通じて、植物から発現されたイリシンのグリコシル化有無が確認できた。

［実施例５：植物由来イリシンタンパク質の生理活性の確認］
３Ｔ３－Ｌ１脂肪前駆細胞は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）培地に１０％ ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）と１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加した細胞培養液を用い、３７℃の湿潤のＣＯ_２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（５％ ＣＯ_２／９５％ ａｉｒ）で培養した。脂肪細胞の分化は、細胞が１００％になった二日後（ｐｏｓｔ－ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ、ｄａｙ０）に５μｇ／ｍｌインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、０．２５ｍＭ デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、０．５ｍＭ １－メチル－３－イソブチルキサンチンが添加された１０％ ＦＢＳ ＤＭＥＭに交替し、二日後に５μｇ／ｍｌ ｉｎｓｕｌｉｎが添加された１０％ ＦＢＳ ＤＭＥＭに交替し、二日後に再び１０％ ＦＢＳ ＤＭＥＭに交替して、総１０日間分化させた後に実験に用いた。脂肪分化に対する影響を実験するために、実施例３で製造された植物由来イリシンは、分化誘導が始まった日から４日間二日間隔で処理した。

実施例３で製造された組換えイリシンタンパク質は、分化された脂肪細胞に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で処理し、４８時間後に細胞から発現タンパク質を抽出してウエスタンブロットを施行した。

３Ｔ３－Ｌ１細胞のタンパク質の分析のために、ＲＩＰＡ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを処理した後、１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上層液にある総タンパク質を分離した。分離されたタンパク質は、Ｌａｅｍｍｌｉ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを交ぜた後にＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて電気泳動で分離した後、ＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）ｍｅｍｂｒａｎｅに転移させた。転移されたＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅは、５％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋを処理して非特異的なタンパク質に対するｂｌｏｃｋｉｎｇを実施し、１次抗体を４℃で一晩培養した後、２次抗体を常温で１時間培養させて、最終ＥＣＬ ｓｏｌｕｔｉｏｎ処理した後、ＬＡＳ－４０００でタンパク質の発現量を分析した。用いられた抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）とＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＡ）から購入した。

その結果、図５に示したように、イリシン処理後に細胞内ＵＣＰ１（Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １）の発現増加を観察した。ＵＣＰ １は、白色脂肪の褐色脂肪への転換基準となるバイオマーカーとして、この結果は、植物由来イリシンが脂肪細胞の褐色化（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｂｒｏｗｎｉｎｇ）活性をそのまま有していることを意味する。

また、図６に示したように、イリシン処理後に細胞から分泌されるアディポネクチンの増加を観察した。アディポネクチンは、脂肪細胞から分泌される代表的なアディポカインの一種であって、インスリン抵抗性を改善するなどの全身代謝改善を通じた抗糖尿、抗肥満効果を有することがよく知られている。したがって、植物に由来したイリシンがアディポカイン調節を通じて全身代謝調節機能を有することを意味する。

前記結果を通じて、本発明の組換えイリシンタンパク質は、植物体でも効果的に発現されるだけでなく、高い水溶解性を有しているため、分離及び精製が容易であり、また、ＵＣＰ１及びアディポネクチンの発現増加効果を示すので、代謝性疾患の治療に有用に利用可能であることが確認できた。

以下、本発明の薬学的組成物及び食品組成物の製剤例を説明するが、これは本発明を限定するものではなく、ただし、具体的に説明するためのものである。

［製剤例１．薬学的組成物の製造］
（１．１．散剤の製造）
組換えイリシンタンパク質 ２０ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ

タルク １０ｍｇ
上記の成分を混合して気密布に充填して散剤を製造する。

（１．２．錠剤の製造）
組換えイリシンタンパク質 ２０ｍｇ
トウモロコシ澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
上記の成分を混合した後に通常の錠剤の製造方法によって打錠して錠剤を製造する。

（１．３．カプセル剤の製造）
組換えイリシンタンパク質 ２０ｍｇ
結晶性セルロース ３ｍｇ
ラクトース １４．８ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ０．２ｍｇ
通常のカプセル剤の製造方法によって上記の成分を混合してゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造する。

（１．４．注射剤の製造）
組換えイリシンタンパク質 ２０ｍｇ
マンニトール １８０ｍｇ
注射用滅菌蒸溜水 ２，９７４ｍｇ
Ｎａ_２ＨＰＯ_４２Ｈ_２Ｏ ２６ｍｇ
通常の注射剤の製造方法によって１アンプル当たり（２ｍｌ）上記の成分含量で製造する。

（１．５．液剤の製造）
組換えイリシンタンパク質 ２０ｍｇ
異性化糖 １０ｇ
マンニトール ５ｇ
精製水 適量
通常の液剤の製造方法によって精製水にそれぞれの成分を加えて溶解させ、レモンの香を適正量加えた後に上記の成分を混合した後、精製水を加えて全体を１００ｍＬで調節した後、褐色瓶に充填して滅菌させて液剤を製造する。

［製剤例２．健康食品の製造］
組換えイリシンタンパク質 １００ｍｇ
ビタミン混合物 適量
ビタミンＡアセテート ７０μｇ
ビタミンＥ １．０ｍｇ
ビタミンＢ１ ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２ ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６ ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２ ０．２μｇ
ビタミンＣ １０ｍｇ
ビオチン １０μｇ
ニコチン酸アミド １．７ｍｇ
葉酸 ５０μｇ
パントテン酸カルシウム ０．５ｍｇ
無機質混合物 適量
硫酸第一鉄 １．７５ｍｇ
酸化亜鉛 ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム ２５．３ｍｇ
第一リン酸カリウム １５ｍｇ
第二リン酸カルシウム ５５ｍｇ
クエン酸カリウム ９０ｍｇ
炭酸カルシウム １００ｍｇ
塩化マグネシウム ２４．８ｍｇ
上記のビタミン及びミネラル混合物の組成比は、比較的健康食品に適切な成分を好ましい実施例で混合組成したが、その配合比を任意に変形実施しても関係なく、通常の健康食品の製造方法によって上記の成分を混合した後、顆粒を製造し、通常の方法によって健康食品組成物の製造に用いることができる。

［製剤例３．健康飲料の製造］
組換えイリシンタンパク質 １００ｍｇ
ビタミンＣ １５ｇ
ビタミンＥ（粉末） １００ｇ
乳酸鉄 １９．７５ｇ
酸化亜鉛 ３．５ｇ
ニコチン酸アミド ３．５ｇ
ビタミンＡ ０．２ｇ
ビタミンＢ１ ０．２５ｇ
ビタミンＢ２ ０．３ｇ
水 定量
通常の健康飲料の製造方法によって上記の成分を混合した後、約１時間の間８５℃で撹拌加熱し、作られた溶液を濾過して滅菌された２Ｌ容器に取得して密封滅菌した後に冷蔵保管した後、本発明の健康飲料組成物の製造に用いる。前記組成比は、比較的嗜好飲料に適切な成分を好ましい実施例で混合組成したが、需要階層や需要国、使用用途など地域的、民族的嗜好度によってその配合比を任意に変形実施しても構わない。

上述した本発明の説明は例示のためのもので、本発明が属する技術分野において通常の知識を有した者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更しなくても他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解できる。したがって、以上で記述した実施例は、全ての面で例示的なものであり、限定的ではないことで理解すべきである。

本発明の組換えイリシンタンパク質は、植物体でも効果的に発現されるだけでなく、高い水溶解性を有しているので、分離及び精製が容易であり、また、ＵＣＰ１及びアディポネクチンの発現増加効果を示すので、代謝性疾患の治療に有用に利用可能であると期待されるところ、産業上利用可能性がある。

Claims (19)

1. 植物での発現が最適化され、配列番号１からなる塩基配列を含むことを特徴とする、組換えイリシン遺伝子。
2. 請求項１に記載の遺伝子を含むことを特徴とする、組換え発現ベクター。
3. 前記ベクターが、図１に記載された切断地図を含むことを特徴とする、請求項２に記載のベクター。
4. 前記ベクターが、ＢｉＰ（Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子及びタグ用遺伝子からなる群より選択される一つ以上をコードする遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載のベクター。
5. 請求項２～４のいずれか一項に記載のベクターにより形質転換されたことを特徴とする、形質転換体。
6. 前記形質転換体が、植物又は植物細胞であることを特徴とする、請求項５に記載の形質転換体。
7. （ａ）請求項５に記載の形質転換体を培養するステップ；及び
   （ｂ）前記形質転換体又は培養液からイリシンタンパク質を分離及び精製するステップを含むことを特徴とする、組換えイリシンタンパク質の生産方法。
8. 前記ステップ（ｂ）の精製は、水溶性画分を用いて精製することを特徴とする、請求項７に記載の組換えイリシンタンパク質の生産方法。
9. 請求項７に記載の方法で生産された植物由来組換えイリシンタンパク質を有効成分として含むことを特徴とする、代謝性疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
10. 前記代謝性疾患は、肥満、糖尿、高血圧、高脂血症、高中性脂肪血症、高コレステロール症、脂肪肝又は動脈硬化症からなる群より選択されたことを特徴とする、請求項９に記載の薬学的組成物。
11. 前記組換えイリシンタンパク質は、グリコシル化された組換えイリシンタンパク質及び非グリコシル化された組換えイリシンタンパク質からなる群より選択された一つ以上であることを特徴とする、請求項９に記載の薬学的組成物。
12. 前記組換えイリシンタンパク質は、配列番号４からなるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項９に記載の薬学的組成物。
13. 請求項７に記載の方法で生産された植物由来組換えイリシンタンパク質を有効成分として含むことを特徴とする、代謝性疾患の予防又は改善用食品組成物。
14. 前記代謝性疾患は、肥満、糖尿、高血圧、高脂血症、高中性脂肪血症、高コレステロール症、脂肪肝又は動脈硬化症からなる群より選択されたことを特徴とする、請求項１３に記載の食品組成物。
15. 前記組換えイリシンタンパク質は、グリコシル化された組換えイリシンタンパク質及び非グリコシル化された組換えイリシンタンパク質からなる群より選択された一つ以上であることを特徴とする、請求項１３に記載の食品組成物。
16. 前記組換えイリシンタンパク質は、配列番号４からなるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の食品組成物。
17. 請求項７に記載の方法で生産された植物由来組換えイリシンタンパク質を個体に投与するステップを含むことを特徴とする、代謝性疾患を予防又は治療する方法。
18. 請求項７に記載の方法で生産された植物由来組換えイリシンタンパク質の代謝性疾患の予防又は治療使用。
19. 請求項７に記載の方法で生産された植物由来組換えイリシンタンパク質の代謝性疾患治療用薬剤の製造のための使用。

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