KR20000016402A

KR20000016402A - 렙틴(ob단백질)의 프레그먼트

Info

Publication number: KR20000016402A
Application number: KR1019980709976A
Authority: KR
Inventors: 카말 에이. 알-바라자늬; 조나단 로버트 샌더스 아치; 패트릭 카밀레리; 윌리암 아더 네빌
Original assignee: 피터 기딩스; 스미스클라인비이참피이엘시이
Priority date: 1996-06-06
Filing date: 1997-06-04
Publication date: 2000-03-25
Also published as: JP2000512137A; NO985683L; CA2257240A1; WO1997046585A2; EP0912609A2; NO985683D0; PL330361A1; CZ397898A3; AU3337297A; BR9709529A; TR199802534T2; WO1997046585A3; IL127153A0; CN1221426A; NZ332879A; AR008765A1

Abstract

본 발명은 실질적으로 에너지 이용의 조절을 통해 체중을 조절하는 렙틴 또는 ob 펩티드, 또는 그의 관능성 유도체, 유사체 또는 변이체, 이러한 화합물을 포함하는 제약 조성물, 이러한 화합물의 제조 방법과 의약에서 이러한 화합물의 용도에 관한 것이다.

Description

렙틴(ｏｂ단백질)의 프레그먼트

본 발명은 신규 화합물, 구체적으로 신규 펩티드, 이러한 화합물을 포함하는 조성물, 및 의학에서의 이러한 화합물의 용도에 관한 것이다.

체내 음식물 섭취량 대 에너지 생산량에 있어서의 에너지 균형의 생리학적 조절 기작은 수 년 동안 논쟁의 주제가 되어 왔다. 최근에, 발간물 네이쳐[Y. Zhang et al, Nature, 372, 425-431, 1994]에서는 에너지 균형 조절에 중요한 역할을 하는 분자들 중 하나가 ob 단백질임이 제안되어 있다. 장(Zhang) 등은 또한 생쥐 및 사람의 ob 유전자 단백질 또는 렙틴(leptin)의 클로닝 및 서열 결정을 보고하였다.

사람 렙틴 또는 (사람 ob 단백질)의 구조와, 동물의 체중을 조절하는데 있어서 그의 용도는 영국 특허 출원 공개 제2292382호에 개시되어 있다. 또한, 이 출원에서는 체중을 조절할 수 있는 것으로 또한 언급되어 있는 렙틴의 특정 프레그먼트가 개시되어 있다.

콜린(Collins) 등의 문헌[Nature, Vol 380, page 677, 1996]에서는 렙틴의 체중 감소 특성이 에너지 이용의 증가는 물론 음식물 섭취량의 감소에 의한 것일 수 있는 것으로 개시되어 있다.

이제 놀랍게도 본 발명자들은 실질적으로 에너지 이용을 증가시켜 체중을 조절하는 것으로 나타나는 렙틴의 특정한 신규 프레그먼트를 발견하였다. 따라서, 이들 프레그먼트는 영양 및 대사 장애, 구체적으로는 비만 및 당뇨병 치료에 사용될 것으로 여겨진다.

따라서, 첫 번째 측면에 있어서, 본 발명은 실질적으로 에너지 이용의 조절을 통해 체중을 조절하는 펩티드 또는 그의 관능성 유도체, 유사체 또는 변이체를 제공한다.

바람직하게는, 체중 조절은 체중의 감소이다.

바람직하게는, 에너지 이용의 조절은 에너지 이용의 증가에 의한 것이다.

바람직하게는, 펩티드는 ob 단백질, 특히 사람 ob 단백질의 한 프레그먼트, 또는 그의 관능성 유도체, 유사체 또는 변이체이다.

하기에서 단백질 프레그먼트(또는 펩티드)는 사람 ob 단백질의 아미노산 서열에 관해 다음과 유사한 약자를 사용하여 언급될 것이다: '아미노산 잔기 1 내지 6으로 이루어진 단백질 프레그먼트'는 약자가 'ob 1-6'이다.

특정 펩티드로는 ob 21-26 (MVPIQK), ob 27-32 (VQDDTK), ob 33-36 (TLIK), ob 37-41 (TIVTR), ob 42-54 (INDISHTQSVSSK), ob 55-56 (QK), ob 57-74 (VTGLDFIPGLHPILTLSK), ob 93-105 (NVIQISNDLENLR), ob 106-115 (DLLHVLAFSK), ob 116-149 (SCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSR) 및 ob 150-167 (LQGSLQDMLWQLDLSPGC), 특히 ob 57-74 (VTGLDFIPGLHPILTLSK)가 있다.

적절하게는, 본 발명은 1개 이상의 어떠한 상기 특정 펩티드로부터든지 형성된 펩티드를 포함한다.

유리하게는, 본 발명은 2개의 인접한 군의 상기 특정 펩티드 중 어느 것으로부터든지 형성된 펩티드를 포함한다.

상기된 바와 같이, 본 발명은 또한 본원에 언급된 펩티드의 관능성 유도체, 유사체 및 변이체에까지 확장된다.

관능성 유도체로는 본원에 언급된 펩티드의 염 및 용매 화합물과, 또한 이 단백질의 물리적 특성, 예를 들어 안정성 또는 치료상 특성(예컨대, 약물 동력학적 특성)을 개선시키기 위해 기 또는 잔기를 결합시켜 화학적으로 변성시킨 본 발명의 펩티드가 있다.

관능성 유사체는 본원에 언급된 펩티드의 1개 이상의 아미노산이 그와 다른 아미노산으로 치환된 기능적으로 유사한 펩티드를 포함한다.

그와 다른 아미노산은 ob 단백질의 아미노산과는 입체화학이 다른 아미노산을 포함한다.

또한 관능성 유사체는 본원에 언급된 펩티드의 소분자 작용제 또는 길항제를 포함한다. 이러한 화합물은 공지된 방법, 예를 들어 영국 특허 공개 제2292382호에 개시된 것에 따라 제조되고 시험될 수 있다.

염은 제약상 허용 가능한 염, 특히 제약상 허용 가능한 산 부가염을 포함한다.

펩티드의 산 부가염은 모화합물, 및 과량의 산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 아세트산, 말레산, 숙신산 또는 메탄술폰산으로부터 적절한 용매하에서 표준 방법으로 제조된다. 아세트산염 형태가 특히 유용하다. 분자내염 또는 양쪽성 이온을 형성하는 화합물 중 어떤 것은 허용 가능할 수 있다. 양이온 염은 모화합물을 과량의 알칼리 시약, 예를 들어 적절한 양이온을 포함하는 수산화물, 탄산염 또는 알콜시드로 처리함으로써 제조된다. 양이온, 예를 들어 Na⁺, K⁺, Ca²⁺및 NH⁴⁺가 제약상 허용 가능한 염에 존재하는 양이온의 예이다.

용매 화합물은 제약상 허용 가능한 용매화합물, 예를 들어 수화물을 포함한다.

본 발명은 펩티드 및 비펩티드 화합물 모두를 포함하는 것으로 인식될 것이다.

또한, 본 발명은 특정 펩티드의 서브-프레그먼트 ob 21-26, ob 27-32, ob 33-36, ob 37-41, ob 42-54, ob 55-56, ob 57-74, ob 93-105, ob 106-115, ob 116-149 및 ob 150-167, 특히 ob 57-74; 또는 상기 1개 이상의 어떠한 것으로부터 든지 형성된 펩티드, 특히 모든 2개의 인접한 군 중 어떠한 것으로부터든지 형성된 펩티드; 또는 그의 관능성 유도체, 유사체 또는 변이체를 포함한다.

적절한 펩티드 또는 서브-프레그먼트는 4개 이상의 아미노산을 포함한다.

적절하게는, 본 발명의 펩티드는 통상적 분해 방법, 합성 기술을 이용하거나 또는 표준 발현 방법을 이용함으로써 제조된다.

즉, 추가의 측면에서, 본 발명은

펩티드, 특히 ob 단백질, 구체적으로 사람 ob 단백질을 2개 이상의 펩티드 프레그먼트로 가수분해시키는 단계;

펩티드 프레그먼트를 분리시키는 단계, 및

임의로는 이어서 그의 관능성 유도체를 제조하는 단계로 이루어진, 펩티드 또는 그의 관능성 유도체의 제조 방법을 제공한다.

적절하게는, 단백질의 가수분해는 예를 들어, 트립신을 사용하는 효소적 분해에 의해 수행된다.

편리하게는, 요구되는 펩티드의 분리는 적절한 크로마토그래피 수단, 예를 들어 칼럼 크로마토그래피를 이용함으로써 달성된다.

ob 단백질의 처리를 위한 특정 반응 조건은 이것이 요구되는 생성물의 안정성과 균형을 이루고 있다면 사용되는 특정 시약의 성질에 의해 결정되는데, 예를 들어 시약이 트립신인 경우 이때 반응은 보통 25-40 ℃의 온도 범위와, 7-9의 pH 범위 내에서, 바람직하게는 37 ℃, pH 7.4에서 수행된다.

상기와 같이, 본 발명의 펩티드는 또한 통상적인 합성 방법, 예를 들어 액체상 또는 고체상 펩티드 합성을 이용함으로써 제조될 수 있다.

따라서, 본 발명은 실질적으로 에너지 이용의 조절을 통해 체중을 조절하는 합성 펩티드 또는 그의 관능성 유도체, 유사체 또는 변이체를 제공한다.

본원에 언급된 펩티드 중 어떠한 것이든지 합성 펩티드로서 본 발명의 일부를 형성한다.

본 발명와 관련된 단백질의 펩티드 결합 단위는 펩티드 합성기[Atherton, E. and Sheppard, R.C.(eds.) (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A practical approach, LRL Press, Oxford)를 이용하는 표준 펩티드 합성 기술에 이어서 직접적인 디술피드 또는 아미드 결합 형성에 적합한 절차에 의해 제조될 수 있다.

잘 공지되어 있는 펩티드 합성 방법은 본원에 참고로 채택된 알리(Ali) 등의문헌[J.Med.Chem.,29:984 (1986) 및J.Med.Chem.,30:2291 (1987)]에 기재되어 있다. 바람직하게는, 펩티드는 메리필드(Merrifield)의 문헌[J.Am.Chem.Soc., 85:2149 (1964)]의 고체상 기술에 의해 제조된다. 그러나, 디, 트리, 테트라 또는 펜타 펩티드 프레그먼트를 고체상 합성과, 커플링시키거나 또는 용액 합성으로 추가로 변성시키는 것 중 어느 하나로 제조할 수 있는 수렴 합성에서와 마찬가지로, 고체상 및 용액 합성을 함께 사용할 수 있다.

합성 중에, 측쇄 관능기(예를 들어, -NH₂, -COOH, -OH, -SH)는 커플링 반응 동안 보호된다. 통상적으로, α-아미노기는 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)로서 일시적으로 보호되나, 다른 산 불안정 보호기 또는 염기 불안정 보호기, 예를 들어 t-부톡시카르보닐(Boc)이 사용될 수 있다. 리신의 아미노 측쇄기는 t-부톡시카르보닐, 벤질옥시카르보닐 또는 p-클로로벤질옥시카르보닐(Z 또는 Cl-Z)로서 보호된다. 아세트아미도메틸, 트리틸, t-부틸, S-t-부틸 또는 파라-메틸벤질(p-MBz) 보호는 시스테인의 경우에 사용된다. 히드록시기는 부틸 또는 벤질 에테르로서 보호되고, 카르복실기는 부틸, 벤질(Bz) 또는 클로로헥실 에스테르로서 보호된다.

펩티드는 C-말단 또는 N-말단 중 어느 하나, 바람직하게는 전자로부터 합성될 수 있다. 커플링 전에, (적절하게 보호된 아미노산의) 알파-카르보닐기가 활성화된다. 당업자는 다수의 방식으로 보호된 기를 활성화시킬 수 있다. 예를 들어, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 2(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸 우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), p-니트로페닐 에스테르(pNp), 히드록시벤조트리아졸 에스테르(HOBt), N-히드록시 숙신이미딜 에스테르(OSu) 혼합된 무수물 또는 대칭적 무수물을 사용할 수 있다.

펩티드의 용액 합성은 아미드 결합을 형성시키는 통상적 방법을 이용하여 달성된다. 통상적으로, 유리 카르복실기가 있는 보호된 Boc-아미노산을 유리 아미노기가 있는 보호된 아미노산에 적절한 카르보디이미드 커플링제, 예를 들어 N,N'-디시클로헥실 카르보디이미드(DCC)를 사용하여, 임의로는 1-히드록시벤조트리아졸(HOBT) 및 디메틸아미노 피리딘(DMAP) 존재하에서 커플링시킨다.

용액상 합성의 커플링 반응은 바람직하게는, 디클로로메탄(DCM), 디메틸 포름아미드(DMF), N-메틸 피롤리돈(NMP), 테트라히드로푸란(THF), 아세토니트릴(ACN) 또는 디옥산과 같은 용매하에서, 저온(예를 들어, -20 ℃)에서 수행된다.

고체상 방법이 사용되는 경우, 펩티드는 펩티드의 카르복시 말단으로부터 출발하고 아미노 말단쪽으로 진행시켜 순차적으로 구성된다. 고체상 합성은 보호된 아미노산의 C 말단을 적절한 수지, 예를 들어 4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)-페녹시 수지(링크(Rink) 아미드 수지, [H.Rink, Tetrahedron Letters28, 3787, (1987)]), 4-벤질옥시벤질 알콜 수지(왕(Wang) 수지, [S.S. Wang, JACS,95, 1328, (1973)]) 또는 4-히드록시메틸 페녹시 아세트산 수지에 공유결합시키는 것으로 시작된다.

고체상 합성에 있어서, 통상적으로, 첫 번째 아미노산 잔기는 난용성 중합체에 결합된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 2종의 중합체는 폴리스티렌(1% 디비닐 벤젠으로 가교 결합됨) 및 1% 가교 결합된 폴리아크릴아미드이다. 이들 중합체는 관능화되어 표적 펩티드의 첫 번째 아미노산(즉, 카르복시 말단)에 결합되는 반응성기, 예를 들어 -OH, -NH₂및 -CH₂Cl을 포함한다. 첫 번째 아미노산 및 중합체간의 결합에 대한 선택은 펩티드의 카르복시 말단에 의해 정해진다. 예를 들어, C-말단에 카르복시기가 있는 펩티드는 에스테르 결합에 의해 결합될 것이고, 카르복사미드 말단이 있는 펩티드의 경우에는 아미드 결합을 갖게 될 것이다.

일단 처음에 보호된 아미노산이 목적하는 수지에 커플링되었으면, 아미노 보호기를 2차 아민, 예를 들어 피페리딘 처리로 제거하고 그 다음으로 (보호된) 아미노산의 유리 카르복실을 이 아미노기에 커플링시킨다. 이 과정을 중간체의 분리없이 목적하는 펩티드가 형성될 때까지 연속으로 수행한다. 이어서 완성된 펩티드를 임의의 순서로 수지로부터 블록을 제거하고(하거나) 분해시킬 수 있다.

커플링 반응에 바람직한 용매로는 디클로로메탄(DCM), 디메틸 포름아미드(DMF) 및 N-메틸 피롤리돈(NMP)이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 목적하는 서열을 완성한 후, 펩티드를 탈보호시키고 트리플루오로아세트산 또는 트리플루오로메탄 술폰산을 사용하여 수지로부터 분리시킨다.

지지체 수지로부터 펩티드를 분리하는 바람직한 방법은 지지체 수지로부터의 펩티드를 적절한 양이온 및 카르보늄 이온 스케빈져, 예를 들어 페놀, 아니솔, 티오아니솔, 에탄 디올, 물 또는 에틸메틸 술피드 존재하에서 트리플루오로아세트산으로 처리하는 것이다.

본 발명의 화합물을 수득하기 위해서, 합성 펩티드를 당업계에 잘 공지된 방법을 이용하여 고리화/커플링시킬 수 있다.

예를 들어, 모두 시스테인 잔기를 포함하는 2개의 선형 펩티드간의 디술피드 결합에 의한 커플링은 한쪽 쇄 상의 유리 티올과 다른 쪽 쇄 상의 적절하게 활성화된 시스테인 유도체와의 반응에 의한 선택적 방식으로 달성될 수 있다. 치환 가능한 보호기로서 특히 유용한 기는 S-(카르보메톡시-술페닐)유도체이다. 이 방법의 예는 선형 펩티드의 시스테인 잔기 모두를 아세트아미도메틸(Acm) 기로 보호시키는 것이다. 한쪽 쇄를 수은(Ⅱ) 아세테이트에 이어서 베타 머캅토에탄올로 처리하여 아세트아미도메틸 보호기를 제거한다. 두 번째 쇄를 카르보메톡시술페닐 클로라이드로 처리하여 활성화된 종을 생성시킨다. 2개의 펩티드를 pH 약 7 내지 8의 희석된 수용액에서 교반시켜 카르보메톡시술페닐기의 치환, 및 쇄 내 디술피드의 형성을 초래한다.

분자 내 디술피드가 형성되는 경우, 이 때 상응하는 선형 펩티드는 완전히 탈보호되고 디머캅탄으로서 생성된다. 이어서 디머캅탄을 디술피드로 변환시킬 수 있는 당업계에 공지된 어떠한 산화제든지 사용될 수 있다. 이러한 산화제의 예는 알칼리 금속 페리시아나이드(예를 들어, 칼륨 페리시아나이드 또는 나트륨 페리시아나이드), 산소 가스, 디요오도메탄 또는 요오드이다. 반응은 매우 희석된 상태의 적절한 불활성 용매, 예를 들어 수성 메탄올 또는 물에서 약 0 내지 40 ℃에서 수행된다. 통상적으로 pH는 약 7 내지 8로 유지시킨다. 고리화는 펩티드가 지지체 수지에 여전히 결합되 있거나, 또는 다른 관능기가 여전히 보호되 있는 채로 펩티드 상에서 수행되나, 탈보호된 유리 펩티드 상에서 수행되는 것이 바람직하다.

2개의 디술피드가 2개의 선형 펩티드 사이에서 형성되는 경우, 2개 유형의 시스테인 티올 보호기, 예를 들어 Acm 및 트리틸이 사용될 수 있다. 각각의 펩티드는 커플링된 한 쌍의 시스테인이 트리틸기로 보호되고 다른 쌍이 Acm으로 보호되도록 배열된 각 유형 중 하나를 포함할 것이다. 각각의 펩티드로부터 트리틸기를 개별적으로 제거하여 한 펩티드 상의 티올기를 2,2'-디피리딜디술피드로 활성화시킨 후 이어서 다른 모노티올 펩티드를 첨가시켜 비스(S-아세트아미도-메틸)디술피드 결합 펩티드를 생성시킴으로써 커플링될 수 있는 2개의 별개의 모노티올 유도체를 생성시킨다. 두 번째 디술피드는 캄버(Kamber)의 문헌[B.Kamber, Helv. Chim. Acta54, 927, (1971)] 및 캄버 등의 문헌[B.Kamber et al., Helv. Chim. Acta63, 899 (1980)]에 기재된 바와 같이 이 생성물을 직접 요오드 산화시킴으로써 수득될 수 있다.

또한, 펩티드쇄를 결합기, 예를 들어 NH(CH₂)_nCO-를 사용하여 커플링시킬수 있다. 이것은 통상적인 고체상 합성 중에 상응하는 아미노산 (NH₂(CH₂)_nCOOH)의 N^a-Fmoc 유도체를 사용하여 이것을 늘어나고 있는 펩티드쇄에 혼입시킴으로써 대부분 쉽게 달성된다. 글루탐산과 같은 산성 아미노산의 측쇄 카르복실, 및 리신과 같은 염기성 아미노산의 측쇄 아미노를 사용하여 펩티드쇄를 커플링시키는데 유사 방법이 이용될 수 있다. 이 경우, 통상적인 고체상 합성 중에 하기 식의 N⁶-글루타밀리신 유도체와 같은 화합물을 늘어나고 있는 펩티드쇄에 혼입시킬 수 있다:

늘어나고 있는 펩티드쇄에 대한 커플링은 글루탐산 잔기의 카르복실과, 추가의 아미노산의 부가를 위한 출발점을 제공하는 리신의 아미노기 상의 Fmoc 군을 제거하는 것에 의한다.

이와 달리, N^a-트리틸 보호기는 글루탐산 잔기 상에 사용될 수 있고 커플링후 이것은 80% 아세트산에 의해 제거될 수 있고 아세트산 무수물에 의해 N-아세틸화될 수 있다. 추가의 커플링은 상기와 같이 진행될 수 있다.

N-말단 N-아세틸기는 아세트산 무수물을 사용하여 아미노 보호기를 제거하여 단백질화된 유리 아미노를 아세틸화함으로써 혼입될 수 있다. C-말단 카르복사미드기는 링크 아미드 수지와 같은 적절한 고체상 합성 수지를 사용함으로써 수득된다.

또한, 상기 본 발명의 펩티드는 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA를 발현시키는 재조합 DNA 기술을 이용함으로써 제조될 수 있다.

따라서, 본 발명은 실질적으로 에너지 이용의 조절을 통해 체중을 조절하는 재조합 펩티드, 또는 그의 관능성 유도체, 유사체 또는 변이체에까지 확장된다.

본원에 언급된 펩티드 중 어떠한 것이든지 재조합 펩티드로서 본 발명의 일부를 형성한다.

추가의 측면에 있어서, 본 발명은 상기 화합물을 코딩하는 DNA를 재조합 숙주 세포에서 발현시키고 그 생성물을 회수하는 것으로 이루어진 본 발명에 따른 화합물의 제조 방법을 제공한다.

본 화합물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 중합체도 또한 본 발명의 일부를 형성한다.

본 발명의 방법은 문헌[Maniatiset.al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982 및 DNA Cloning vols Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ(D.M. Glover ed., IRL Press Ltd)]에 기재된 통상적인 재조합 기술에 의해 수행될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 방법은

ⅰ) 숙주 세포에서 본 화합물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 중합체를 발현할 수 있는 복제 가능한 발현 벡터를 제조하는 단계,

ⅱ) 상기 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계,

ⅲ) 상기 DNA 중합체의 발현으로 상기 화합물을 생성시킬 수 있게 하는 조건하에서 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계,

ⅳ) 상기 화합물을 회수하는 단계로 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명은 단량체, 이량체 또는 올리고머 뉴클레오티드 단위의 축합에 의한 DNA 중합체의 제조 방법을 제공한다.

제조는 화학적으로, 효소적으로, 또는 2 가지 방법을 합하여 생체 외, 또는 적절하다면 생체 내에서 수행될 수 있다. 즉, DNA 중합체는 로버츠(D.M.Roberts) 등의 문헌[Biochemistry 1985,24, 5090-5098]에 기재된 통상적 방법으로 적절한 DNA 프레그먼트를 효소적 절단하여 제조될 수 있다.

DNA 프레그먼트는 요구되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA의 적절한 제한 효소에 의한 절단, 화학적 합성, DNA 또는 RNA 주형상에서의 효소적 중합에 의하거나, 또는 이들 방법을 조합하여 수득할 수 있다. 바람직하게는, DNA 프레그먼트의 전체 합성이 이용될 것이다.

제한 효소에 의한 절단은 바람직하게는, 50 ㎖ 이하의 부피로 0.1-10 mg의 DNA와 적절한 완충제에서 20°- 70℃에서 수행될 수 있다.

DNA의 효소적 중합은 DNA 폴리머라제, 예를 들어 DNA 폴리머라제 Ⅰ(클레나우(Klenow) 프레그먼트)을 사용하여 뉴클레오시드 3인산염 dATP, dCTP, dTTP를 포함하는 적절한 완충제에서 요구된다면 10°- 37℃에서, 일반적으로 50 ㎖ 이하의 부피로 생체 외에서 수행될 수 있다.

DNA 프레그먼트의 효소적 연결은 DNA 리가제, 예를 들어 T4 DNA 리가제를 사용하여 적절한 완충제에서 50 ㎖ 이하의 부피로 4℃ 내지 주위 온도에서 수행될 수 있다.

DNA 중합체 또는 프레그먼트의 화학적 합성은 문헌['Chemical and Enzymatic Synthesis of Protein Fragments - A Laboratory Manual'(ed. H.G. Gassen and A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982)] 또는 다른 발간물, 예를 들어 [M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M.Singh, B.S. Sproat, and R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982,10, 6243; B.S. Sproat and W.Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983,24, 5771; M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980,21, 719; M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981,103, 3185; S.P. Adamset.al., Journal of the American Chemical Society, 1983,105, 661; N.D. Sinha, J. Bierrat, J. McMannus, and H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984,12, 4539; 및 H.W.D. Mattheset.al., EMBO Journal, 1984,3, 801]에 기재된 고체상 기술을 이용하여 통상적인 포스포트리에스테르, 포스파이트 또는 포스포르아미다이트 화학에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 자동화 DNA 합성기가 이용된다.

바람직하게는, DNA 중합체는 함께 본 화합물을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 2개 이상의 DNA 분자를 연결시킴으로써 제조된다.

DNA 분자는 요구되는 코딩 서열을 포함하는 벡터를 적절한 제한 효소로 절단시킴으로써 수득될 수 있다.

DNA 분자의 정확한 구조 및 이들의 수득 방식은 목적하는 생성물의 구조에 따라 다르다. 본 화합물을 코딩하는 DNA 분자를 구성하기 위한 적절한 책략의 설계는 당업자에 있어서는 통상적인 문제이다.

본 화합물을 코딩하는 DNA 중합체의 숙주 세포에서의 발현은 숙주 세포에서 DNA 중합체를 발현할 수 있는 복제 가능한 발현 벡터에 의해 수행될 수 있다. 발현 벡터는 신규하며, 또한 본 발명의 일부를 형성한다.

복제 가능한 발현 벡터는 숙주 세포에 적합한 벡터를 절단하여 무손상 레플리콘이 있는 선형 DNA 세그먼트를 제공하고, 이 선형 세그먼트와 함께 본 화합물을 코딩하는 1개 이상의 DNA 분자를 상기 선형 세그먼트와 연결 조건하에서 합함으로써 제조될 수 있다.

선형 세그먼트 및 1개 이상의 DNA 분자의 연결은 동시에, 또는 요구된다면 순차적으로 수행될 수 있다.

따라서, DNA 중합체는 미리 형성되거나, 또는 요구된다면 벡터의 구성 중에 형성될 수 있다.

벡터의 선택은 원핵생물, 예를 들어 E. Coli, 또는 진핵생물, 예를 들어 생쥐 C127, 생쥐의 골수종, 차이니스 햄스터의 난소, 진균류(예컨대, 사상균 또는 단세포 효모) 또는 곤충 세포(예컨대, 초파리)일 수 있는 숙주 세포에 의해 부분적으로 결정될 것이다. 또한, 숙주 세포는 유전자 이식 동물일 수 있다. 적절합 벡터로는 플라스미드, 박테리오파지, 코스미드, 및 예를 들어 베큘로바이러스 또는 백시니아 바이러스로부터 유래된 재조합 바이러스가 있다.

통상적으로, 복제 가능한 발현 벡터의 제조는 예를 들어, 상기 인용된 메니아티스(Maniatis) 등의 문헌에 기재된 방법에 의해 DNA의 제한, 중합 및 연결을 위한 적절한 효소로 수행될 수 있다. 중합 및 연결은 DNA 중합체의 제조에 대해 상기된 바와 같이 수행될 수 있다. 제한 효소에 의한 절단은 일반적으로 50 ㎖ 이하의 부피로 0.1-10 mg DNA와 적절한 완충제에서 20°- 70℃의 온도에서 수행될 수 있다.

재조합 숙주 세포는 본 발명에 따라 숙주 세포를 본 발명의 복제 가능한 발현 벡터로 형질전환 조건하에서 형질전환시킴으로써 제조된다. 적절한 형질전환 조건은 통상적이며, 예를 들어 상기 인용된 메니아티스 등의 문헌, 또는 ["DNA Cloning" Vol. Ⅱ, D.M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985]에 기재되어 있다.

형질전환 조건의 선택은 숙주 세포에 의해 결정된다. 즉, E. Coli와 같은 세균 숙주는 CaCl₂용액으로 처리[Cohenet.al., Proc. Nat. Acad. Sci., 1973,69, 2110]하거나, 또는 RbCl, MnCl₂, 아세트산칼륨 및 글리세롤의 혼합물을 포함하는 용액으로 처리한 후 이어서 3-[N-모르폴리노]-프로판-술폰산, RbCl 및 글리세롤로 처리할 수 있다. 배양액 중의 포유동물 세포는 백터 DNA를 이 세포에 칼슘 공침시킴으로써 형질전환시킬 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 화합물을 포함하는 벡터에까지 확장된다.

또한, 본 발명은 본 발명의 복제 가능한 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포에까지 확장된다.

형질전화된 숙주 세포를 DNA 중합체의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하는 것은 예를 들어, 상기 인용된 메니아티스 등의 문헌 및 ["DNA Cloning"]에 기재된 바와 같이 통상적으로 수행된다. 즉, 바람직하게는 세포를 영양소로 보충하고 45℃ 이하에서 배양한다.

발현 생성물은 숙주 세포에 따른 통상적인 방법으로 회수된다. 즉, 숙주 세포가 E. Coli와 같은 세균인 경우, 이것을 물리적, 화학적 또는 효소적으로 용균시킬수 있고, 생성된 용균물로부터 단백질 생성물을 단리시킬 수 있다. 생성물이 세균 세포로부터 분비되는 경우, 주변세포질 공간 또는 영양 배지로부터 이것을 회수할 수 있다. 숙주 세포가 포유동물인 경우, 일반적으로 영양 배지로부터 생성물을 단리할 수 있다.

DNA 중합체는 생성물을 발현하는 안정하게 형질전환된 포유동물 세포주를 단리시키는데 고안된 벡터, 예를 들어 소의 파필로마바이러스 벡터 또는 차이니스 햄스터 난소 세포에서 증식된 벡터에 통합될 수 있다["DNA cloning" Vol. Ⅱ D.M. Glover ed. IRL Press, 1985; Kaufman, R.J.et.al., Molecular and Cellular Biology 5, 1750-1759, 1985; Pavlakis G.N. and Hamer, D.H., Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 80, 397-401, 1983; Goeddel, D.V.et.al., European Patent Application No. 0093619, 1983].

상기 방법을 사용하여 제조된 펩티드는 필요하다면, 다수의 기술로 정제될 수 있다. 바람직한 실시태양으로는 겔 여과, 크로마토그래피, 역상 HPLC 및 결정화가 있고, 특히 크로마토그래피가 사용된다. 이어서 정제된 생성물을 HPLC, 아미노산 분석, 아미노산 서열 결정 및 고속원자충돌 및(또는) 전기분무 질량 분석법을 이용하여 순도에 관해 분석할 수 있다.

본원에 언급된 단백질의 관능성 유도체, 유사체 및 변이체는 본원에 언급된 것과 유사한 통상적인 방법을 이용함으로써 제조될 수 있다.

상기된 바와 같이, 본 발명의 화합물은 유용한 제약 특성이 있는 것으로 나타난다. 따라서, 활성적 치료 물질로서 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 또한 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 화합물은 실질적으로 에너지 이용을 증가시켜 체중을 조절할 수 있으므로 영양 및 대사 장애, 특히 비만 및 당뇨병 치료에 사용될 가능성이 있는 것으로 여겨진다.

또한, 본 발명은 유효하며 제약상 허용 가능한 무독성량의 본 발명의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 영양 및 대사 장애의 치료 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명은 추가로 본 발명의 화합물, 및 제약상 허용 가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

사용할 때, 보통 활성 화합물은 사람 또는 수의 제약 담체, 희석제 및(또는) 부형제와 합해진 제약 조성물 형태로 사용될 것이나, 이 조성물의 정확한 형태는 투여 방식에 따라 다를 것이다. 예를 들어, 활성 화합물은 경구 투여용 정제, 캡슐, 로젠지 또는 시럽형; 흡입용 흡입제, 에어로졸 또는 분무 가능한 용액형; 비경구 투여용 멸균 용액형, 또는 국소 투여용 크림, 로숀, 리니멘트제, 겔, 연고 또는 분무제형으로 사용될 수 있다. 비경구적 경로의 투여로는 정맥 내, 근육 내, 피하, 경피 및 복강 내 투여가 있다.

또한, 피하 이식된 펌프 또는 조절 방출 장치, 경피성 패치에 사용하고, 비 강 내 투여에 적합한 초미분된 분말로서 사용하기에 적합한 상기 유도체의 제형이 있다.

본 발명의 화합물의 투여에 있어서 투여량 범위는 치료할 질병에 목적하는 효과를 일으키는 것이고, 투여량은 일반적으로 연령, 의학적 상태의 정도 또는 심도 와, 만약 있다면 금기사항에 따라 달라질 것이다. 투여량은 0.001 mg/㎏/일 내지 50 mg/㎏/일로 다양할 수 있으나, 바람직하게는 0.01 내지 1.0 mg/㎏/일이다.

고체 경구용 제형은 통상적인 부형제, 예를 들어 희석제(예컨대, 락토스, 미결정성 셀룰로스, 인산디칼슘, 만니톨, 탄산마그네슘, 글리신, 덱스트로스, 수크로스, 전분, 만니톨, 소르비톨 및 탄산칼슘); 결합제(예컨대, 액체 글루코스, 시럽, 아라비아 고무, 젤라틴, 전분 점질물, 메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 알긴산염 및 예비젤라틴 처리된 전분); 붕해제(예컨대, 전분, 알긴산, 미결정성 셀룰로스, 펙틴, 가교 결합된 폴리비닐피롤리돈, 전분 글리콜산나트륨 및 나트륨 카르복시메틸-셀룰로스); 활택제(예컨대, 활석 및 실리카); 윤활제(예컨대, 스테아르산 및 스테아르산 마그네슘); 방부제(예컨대, 소르브산 및 메틸 또는 프로필 파라히드록시벤조에이트), 또는 제약상 허용 가능한 습윤제(예컨대 라우릴 황산나트륨)를 포함할 수 있다.

캡슐은 다른 성분, 예를 들어 글리세롤, 소르비톨, 표면활성제, 불투명 충전제, 방부제, 감미제, 풍미제 및 착색제와 함께 쉘, 통상적으로는 젤라틴으로 이루어진다. 캡슐의 내용물로는 희석제, 윤활제 및 붕해제가 있을 수 있다. 압축 분말 또는 과립으로 이루어진 정제는 코팅되거나 또는 코팅되지 않을 수 있고, 환자에 투여되기 전에 용해, 분산 또는 발포되거나, 또는 삼킨 후 즉시든지, 또는 예를 들어 산에 난용성인 코팅이 있는 정제의 경우에는 더 늦게든지 위장관에서 용해 또는 분산되도록 고안될 수 있다. 통상적으로, 정제는 부형제, 예를 들어 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 윤활제를 포함하고, 착색제 및 풍미제를 포함할 수 있다. 발포성 정제는 일반적으로 탄산염 또는 중탄산염과 함께 산을 포함한다. 정제용 코팅은 천연 또는 합성 수지, 고무, 난용성 충전제, 당, 가소제, 다가 알콜 및 왁스로 이루어질 수 있고, 또한 착색제 및 풍미제를 포함할 수 있다. 로젠지 및 향정은 입에서 용해되도록 되어 있다. 로젠지는 몰딩되거나 또는 압축될 수 있고, 통상적으로는 풍미된 기재를 함유한다. 향정은 젤라틴 및 글리세롤, 또는 아라비아 고무 및 수크로스의 기재로부터 몰딩된다. 이들은 방부제는 물론 착색제 및 풍미제를 포함할 수 있다.

막 코팅 수지로는 셀룰로스 유도체, 제인, 비닐 중합체 및 아크릴계 수지와, 통상적으로 피마자유 또는 글리세롤 트리아세테이트와 같은 가소제를 포함하는 코팅 조성물이 있다. 장용피 수지로는 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 및 메타크릴산의 공중합체가 있다.

경구 투여에 적합한 고체 조성물은 블렌딩, 충전, 과립화, 정제화 등의 통상적인 방법에 의해 수득될 수 있다. 반복적인 블렌딩 실시는 다량의 충전제를 사용하여 이들 조성물 전체에 활성제를 분포시키는데 사용될 수 있다.

경구 투여에 적합한 액체 조성물은 예를 들어 엘릭서, 혼합물, 농축 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 지제형일 수 있다. 이들은 사용 전에 물 또는 다른 적절한 부형제로 재구성 하기 위한 건조 제품으로서 제공될 수 있다. 이러한 액체 조성물은 통상적인 부형제, 예를 들어 현탁화제(예컨대, 수크로스, 소르비톨, 젤라틴, 메틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로스, 알긴산나트륨, 크산탄 고무, 아라비아 고무, 실리카, 카라게난, 스테아르산 알루미늄 겔); 유화제(예컨대, 레시틴, 아라비아 고무, 소르비탄 모노-올리에이트); 식용유, 오일성 에스테르를 포함하는 수성 또는 비수성 부형제(예컨대, 글리세롤의 에스테르, 에탄올, 글리세롤); 완충제(예컨대, 알칼리 금속의 시트르산염 및 인산염); 방부제(예컨대, 벤조산나트륨, 소르브산, 메틸 또는 프로필 파라히드록시벤조에이트); 및 요구된다면, 통상적인 풍미제 및 착색제를 포함할 수 있다.

조성물은 예를 들어, 압축 정제 또는 서방성 캡슐형으로 피하로 이식될 수 있다.

별법으로, 주사에 적합한 조성물은 용액, 현탁액 또는 에멀젼형이거나, 또는 사용 전에 적절한 부형제에 용해 또는 현탁시키는 건조 분말형일 수 있다.

유체 단위 제형은 본 화합물 및 발열물질 무함유 멸균 부형제를 사용하여 제조된다. 사용되는 부형제 및 농도에 의존적인 화합물은 부형제에 용해되거나 또는 현탁화되는 것 중 어느 하나일 수 있다. 용액은 모든 비경구 투여 형태, 특히 정맥 내 주사에 사용될 수 있다. 용액 제조시, 화합물을 부형제에 용해시킬 수 있고, 필요하다면 염화나트륨을 첨가하여 등장성으로 만들고 무균 기술을 이용하여 멸균 필터로 여과시켜 멸균시키고 멸균된 적절한 바이알 또는 앰플에 충전시키고 봉합시킨다. 별법으로, 용액의 안정성이 충분하다면, 용기에 봉합된 상태의 용액을 오토클레이브로 멸균시킬 수 있다. 유리하게는, 첨가제, 예를 들어 완충제, 가용화제, 안정화제, 방부제 또는 살균제, 현탁화제 또는 유화제 및(또는) 국부 마취제를 부형제 중에 용해시킬 수 있다.

사용 전에 적합한 부형제 중에 용해시키거나 또는 현탁시키는 건조 분말은 미리살균된 약물 및 다른 성분을 멸균 영역에서 무균 기술을 이용하여 멸균 용기에 충전시킴으로써 제조될 수 있다. 별법으로, 약물 및 다른 성분을 수성 부형제에 용해시킬 수 있고, 그 용액을 멸균 영역에서 무균 기술을 이용하여 적절한 용기에 분포시킨다. 이어서 생성물을 냉동 건조시키고 용기를 무균 봉합시킨다.

근육 내, 피하 또는 피하 내 주사에 적합한 비경구용 현탁액은 멸균 화합물을 용해시키는 대신 멸균 부형제에 현탁시키는 것과, 멸균이 여과에 의해 달성될 수 없다는 것을 제외하고는 실질적으로 동일한 방법으로 제조된다. 화합물은 또한 멸균 상태에서 단리시킬 수 있거나, 이와 달리 예를 들어 감마 조사와 같이 단리 후 멸균시킬 수 있다. 유리하게는, 현탁화제, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈을 화합물의 균일한 분포를 촉진시키도록 조성물 중에 포함시킨다.

추가의 측면에서, 본 발명은 유효한 무독성량의 본 발명의 화합물을 그를 요하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 영양 및 대사 장애의 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 비만 및 당뇨병과 같은 영양 및 대사 장애을 치료하기 위한 의약을 제조하는데 있어서 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명의 화합물을 본 발명에 따라 투여하는 경우, 예기치 않은 독소 작용은 예상되지 않는다.

하기 실시예는 본 발명의 화합물을 예시한다.

약리학적 방법: 본 발명의 화합물의 활성은 하기 방법에 따라 평가된다.

SD 쥐의 음식물 섭취량에 대한 렙틴 프레그먼트의 효과

외과 처치

쥐를 시눌록스 (Synulox) (0.1 ㎖/100 g)로 마취 전 1 시간 동안 예비 처리한 후 이어서 도미토르 (Domitor) (0.04 ㎖/100 g, 근육 내) 및 서브리마제 (Sublimase) (0.9 ㎖/100g, 복강 내)로 마취시켰다. 쥐 각각에 정위뇌적으로 캐뉼러를 측뇌실에 멸균 상태하에서 이식시켰다. 이어서 안티세단(Antisedan) 및 누바인(Nubain) (50% v/v : 50% v/v 0.02 ㎖/100 g, 복강 내)을 사용하여 마취로부터 소생시켰다. 외과 처치 후 각각의 쥐에 0.05 ㎖ 젠카르프(Zenecarp)를 수여하였다.

실험 절차

실험 1 : 외과 처치 후 쥐 각각의 체중을 과정 중 내내 매일 모니터하였다. 캐뉼러가 측뇌실에 존재한다는 것을 입증하기 위해 안지오텐신 (Angiotensin) Ⅱ(100 ng/5 ㎕)를 뇌실 내 주사하고, 주사 후 5 분 동안 물 섭취량을 모니터하였다. 24 시간의 음식물 섭취량을 외과 처치 후 5 및 6 일 째에 측정하였다. 6 일 째에 동물을 그 체중에 따라 3개 군(a, b 및 c, 군당 8 마리 쥐)으로 나눈 후 이어서 밤새 굶겼다. 실험 7 일 째에 하기와 같이 쥐에 주사하였다:

a 군 - 부형제(PBS, 인산염완충 용액, 5 ㎕/쥐),

b 군 - 사람 렙틴(11.5 ㎍/5 ㎕), 및

c 군 - 렙틴의 트립신 작용 절단물(30 ㎍/5 ㎕).

1일 요구량 이상의 알려진 양의 음식물을 뇌실 내 주사가 끝난 후 즉시 쥐에 공급하였다. 이어서 음식물 섭취량 및 체중을 24 시간 후에 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타냈다.

실험 2: 별개 군의 동물을 상기와 같이 그대로 준비하되, 굶긴 후 실험 당일에 각 군의 쥐에 하기와 같이 주사하였다:

a 군 - 부형제(PBS, 5 ㎕/쥐),

b 군 - 사람 렙틴(8.75 ㎍/5 ㎕), 및

c 군 - 쥐 렙틴 (10 ㎍/5 ㎕),

d 군 - ob 57-74, 서열 VTGLDFIPGLHPILTLSK(3.33 ㎍/5 ㎕).

또 한번, 미리 중량을 구한 1일 요구량 이상의 음식물을 주사 후 재공급하였다. 체중의 변화 및 소비된 음식물량을 24 시간 후에 기록하였다. 그 결과를 표 2에 나타냈다.

결과

뇌실 내로 공급된 사람 렙틴(h-렙틴) 및 그 프레그먼트(h-렙틴의 트립신 작용 절단물)의 SD 쥐의 체중 및 음식물 섭취량에 대한 효과

	24 시간의 음식물 섭취량(g)	체중 변화(g/24 시간)
부형제 (5 ㎕/쥐, n = 8)	36.68 ± 2.5	31.44 ± 1.2
h-렙틴 (11.5 ㎍/쥐, n = 8)	30.62 ± 1.5^*	22.88 ± 2.05^*
h-렙틴의 트립신 작용 절단물 (30 ㎍/쥐, n = 8)	34.6 ± 1.99	23.88 ± 1.2^*
^*P〈0.05

뇌실 내로 공급된 사람 렙틴(h-렙틴), 쥐 렙틴(m-렙틴) 및 렙틴 프레그먼트57-74 VTGLDFIPGLHPILTLSK의 SD 쥐의 체중 및 음식물 섭취량에 대한 효과

	24 시간의 음식물 섭취량(g)	체중 변화(g/24 시간)
부형제 (5 ㎕/쥐, n = 8)	32.16 ± 0.8	30.55 ± 0.67
h-렙틴 (8.75 ㎍/쥐, n = 8)	33.7 ± 11.6	24.5 ± 3.7
m-렙틴 (10 ㎍/쥐, n = 8)	31.3 ± 1.7	23.7 ± 2.18^*
렙틴 프레그먼트 57-74 (3.33 ㎍/쥐, n = 8)	33.6 ± 0.9	26.8 ± 1.2^*
^*P〈0.05

Claims

실질적으로 에너지 이용의 조절을 통해 체중을 조절하는 펩티드, 또는 그의 관능성 유도체, 유사체 또는 변이체.
실질적으로 에너지 이용의 조절을 통해 체중을 감소시키는 펩티드, 또는 그의 관능성 유도체, 유사체 또는 변이체.
제1항 또는 2항에 있어서, ob 단백질의 한 프레그먼트인 펩티드, 또는 그의 관능성 유도체, 유사체 또는 변이체.
제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, ob 21-26, ob 27-32, ob 33-36, ob 37-41, ob 42-54, ob 55-56, ob 57-74, ob 93-105, ob 106-115, ob 116-149 및 ob 150-167의 사람 ob 단백질의 프레그먼트로부터 선택된 펩티드.
제1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열이 VTGLDFIPGLHPILTLSK인 펩티드.
제1항에 있어서, 1개 이상의 제4항의 펩티드로부터 형성된 펩티드.
제1항에 있어서, 2개의 인접한 군의 제4항의 펩티드로부터 형성된 펩티드.
제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 합성 또는 재조합 펩티드.
제1항 내지 7항 중 어느 한 항의 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
제1항 내지 7항 중 어느 한 항의 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
제9항의 복제 가능한 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
펩티드를 2개 이상의 펩티드 프레그먼트로 가수분해시키는 단계;

펩티드 프레그먼트를 분리시키는 단계, 및

임의로는 이어서 그의 관능성 유도체를 제조하는 단계로 이루어진, 제1항에 따른 펩티드 또는 그의 관능성 유도체의 제조 방법.
제1항 내지 7항 중 어느 한 항의 펩티드를 코딩하는 DNA를 재조합 숙주 세포에서 발현시키고 그 생성물을 회수하는 것을 포함하는, 제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 제조 방법.
제13항에 있어서,

ⅰ) 요구되는 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 중합체를 숙주 세포에서 발현할 수 있는 복제 가능한 발현 벡터를 제조하는 단계,

ⅱ) 상기 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계,

ⅲ) 상기 DNA 중합체의 발현으로 상기 펩티드를 생성시킬 수 있게 하는 조건하에서 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및

ⅳ) 상기 펩티드를 회수하는 단계로 이루어진 방법.
제1항에 따른 화합물 및 제약상 허용 가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
활성적 치료 물질로 사용하기 위한 제1항에 따른 화합물.
영양 및 대사 장애의 치료에 사용하기 위한 제15항에 따른 화합물.
유효한, 제약상 허용 가능한 무독성량의 제1항에 따른 화합물을 투여하는 것을 포함하는 영양 및 대사 장애의 치료 방법.
영양 및 대사 장애를 치료하기 위한 의약 제조에 있어서 제1항에 따른 화합물의 용도.